CN107987825A - 一种用于细胞成像的制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于细胞成像的制剂及其制备方法和用途，所述制剂包括溶解有AIE分子的磷脂化合物微球和用于分散磷脂化合物微球的溶剂，所述AIE分子为具有AIE效应的脂溶性分子，本发明所述的制剂制备方法非常简单，制备出来的制剂生物相容性良好，分散性均匀，粒径在100～300nm之间且大小可调，在细胞内磷脂化合物微球结构被表面活性剂降解，降解时间为5～36h，其中溶解的AIE分子释放并聚集，通过激光照射后，产生荧光，能够实现细胞成像和细胞标记，同时利用波长较长的激光激发也可以实现双光子成像，成像图像清晰，且能够避免细胞质内其他荧光物质的干扰，而且，利用肿瘤组织的EPR效应，本发明所述的制剂能够实现特异性的识别肿瘤细胞并对其进行标记。

Description

一种用于细胞成像的制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及细胞检测领域，尤其涉及一种用于细胞成像的制剂及其制备方法和用途。
背景技术
脂质体(Liposome)是一种两亲性的人工膜，以磷脂或类磷脂分子为主要成分，人体内常见的脂质体如细胞膜中的磷脂双分子层等。磷脂或类磷脂分子在水及水溶液中，亲水性的头部插入水中，疏水性的尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体结构，直径在25～1000nm不等。脂质体具有类细胞膜结构和良好的生物相容性，一些脂溶性的药物可以包封于脂质体双分子层内而形成微型泡囊体，该囊泡可以和细胞膜融合并将药物送入细胞内部，因而脂质体可以用作脂溶性药物载体广泛应用于生物医药领域。然而，尽管很多文献中将脂质体作为载体在体内运送纳米药物，然而，将其用于细胞成像或荧光标记领域却鲜有报道。
聚集诱导发光效应(AIE效应)是2001年由唐本忠院士课题组首次发现的一种荧光效应，具有AIE效应的分子(AIE分子)是一类在良溶剂中几乎不发光，而在不良溶剂中由于分子聚集而荧光大大增强的分子。当AIE分子在良溶剂中被均匀分散时，由于分子间彼此距离较远，各能级间不能相互匹配，不具有相互作用，不具有荧光效应，但是，当其在聚集程度较高的状态下，由于共轭效应等作用的影响，能级间距较小且合适，很容易被光子尤其是能量较弱的光子激发而产生荧光效应。例如，当其溶解在良溶剂中时，其荧光通常较弱甚至不发光，但是当其以固体或高浓度溶液的形式存在时却能够发出强烈的荧光，上述独特的性能使其能够作为一种优异的用于细胞成像或荧光探针的材料。
现有技术中使用AIE分子作为主要成分用于细胞成像或荧光标记的制剂已有很多文献报道，例如，Zhang等人通过将有机荧光纳米粒子或端氨基的有机染料作为AIE分子与聚乙二醇类高分子化合物向结合，提高了AIE分子的亲水和分散性能，使其更容易吸附在细胞膜表面或渗入细胞内部聚集并产生荧光效应(Zhang X,Zhang X,Yang B,et al.Facilepreparation and cell imaging applications of fluorescent organicnanoparticles that combine AIE dye and ring-opening polymerization[J].PolymerChemistry,2014,5(2):318-322.)、(Zhang X,Zhang X,Yang B,et al.A novel methodfor preparing AIE dye based cross-linked fluorescent polymeric nanoparticlesfor cell imaging[J].Polymer Chemistry,2014,5(3):683-688.)，进而使其能够用于细胞成像。然而，现有技术和上述文献中所报道的细胞成像均存在一个问题，即用于体内时，AIE分子对于需要被成像的细胞或组织不具有选择性，因而并没有实际应用的价值，而且，由于得到的制剂亲水性较弱，疏水性较强，在实际使用时，AIE分子多聚集于细胞膜附近，对于细胞内部的成像效果不明显。
为了解决现有技术中存在的诸多问题，本领域的技术人员需要将脂质体与AIE分子相结合开发一种新型的细胞成像用制剂，利用脂质体所特有的实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)，使其对不同种类的，尤其是肿瘤细胞具有良好的选择性，并且使得该制剂需要优异的生物相容性，使得AIE分子能够进入细胞内部，进而实现对细胞内部的成像和荧光标记。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于细胞成像的制剂，所述制剂包括溶解有AIE分子的磷脂化合物微球和用于分散磷脂化合物微球的溶剂。
所述AIE分子为具有AIE效应的脂溶性分子，所述用于分散所述磷脂化合物微球的溶剂不会导致微球结构发生改变。
本领域的技术人员可以根据需要选用任意一种能够溶解在磷脂化合物中而不产生聚集的AIE分子，优选地，所述AIE分子包括双芘分子、羧基双芘分子、MC-4分子中的任意一种或至少两种的混合物，进一步优选为双芘分子。
所述双芘分子具有如下结构：
所述羧基双芘分子具有如下的结构：
所述MC-4分子具有如下结构：
本领域的技术人员可以在实现微球结构的前提下选用任意一种磷脂化合物，考虑到所述磷脂化合物在制剂中同时起到维持微球结构和溶解AIE分子的作用，因此，所述磷脂化合物需要具有较优的水油双亲性，优选地，所述磷脂化合物包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷、数均分子量为2000～20000的磷脂聚乙二醇、数均分子量为2000～20000的磷脂聚乙二醇叶酸中的任意一种或至少两种的混合物，进一步优选为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。
优选地，所述磷脂化合物微球在pH为6～8的组织液中完全降解所需的时间为5～36h，例如5.2h、6h、8h、14h、18h、26h、30h、32h、34h、35h等。
本领域的技术人员可以根据需要在能够实现的前提下选择任意的磷脂化合物微球的粒径，考虑到本发明在实际使用时需要与细胞内吞作用的极限尺寸相匹配，所述磷脂化合物微球的粒径优选为100～300nm，例如102nm、110nm、140nm、170nm、200nm、230nm、260nm、290nm、298nm等，进一步优选为180～200nm。
在能够维持AIE分子不聚集和保持微球结构的前提下，本领域的技术人员能够选择任意磷脂化合物和AIE分子的质量比来制备所述磷脂化合物微球，优选地，所述磷脂化合物微球中磷脂化合物和AIE分子的质量比为(50～400):1，例如51:1、58:1、70:1、90:1、120:1、160:1、200:1、250:1、300:1、390:1、398:1等，进一步优选为111:1。
优选地，所述磷脂化合物微球以1mg/mL～20mg/mL(例如2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、16mg/mL、18mg/mL等)的浓度分散在溶剂中，进一步优选地，所述磷脂化合物微球以2mg/mL～10mg/mL的浓度分散在溶剂中。
优选地，所述溶剂的pH为6～8，例如6.1、6.3、6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7、7.9等。
优选地，所述溶剂包括水或磷酸盐缓冲溶液中的任意一种，进一步优选为磷酸盐缓冲溶液。
本发明的目的之二在于提供一种所述制剂的制备方法，在本发明中，所述制剂通过如下步骤制备：
步骤(1)，将AIE分子分散在溶剂中，混合搅拌，之后进行超声处理，得到AIE分子分散液；
步骤(2)，取步骤(1)中得到的AIE分子分散液，加入至溶解有磷脂化合物的挥发性有机溶剂中，超声处理使其混合均匀，之后涂覆在平面上，待溶剂全部挥发之后，得到含有AIE分子的磷脂化合物膜，将所述含有AIE分子的磷脂化合物膜真空干燥处理、保存；
步骤(3)，取步骤(2)中得到的含有AIE分子的磷脂化合物膜浸泡在用于分散所述磷脂化合物微球的溶剂中，待其全部溶解后，将混合液重复性地通过聚合物多孔膜至少两次，得到所述制剂。
优选地，步骤(1)中所述混合搅拌的搅拌速率为100～800转/min，例如110转/min、150转/min、200转/min、300转/min、400转/min、500转/min、600转/min、700转/min、780转/min等，进一步优选为400转/min。
优选地，步骤(1)中所述溶剂为丙酮、二甲基亚砜、四氢呋喃、三氯甲烷、水中的任意一种至少两种的混合物。
优选地，步骤(1)中所述AIE分子分散液的浓度为0.1mg/mL～0.6mg/mL，例如0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.58mg/mL等。
优选地，步骤(1)中所述超声处理的时间为20～40min，例如21min、25min、28min、34min、36min、38min、39min等。
优选地，步骤(2)中所述的挥发性有机溶剂包括丙酮、四氢呋喃、三氯甲烷、无水乙醚中的任意一种或至少两种的混合物，进一步优选为丙酮。
优选地，步骤(2)中所述的超声处理的时间为10～40min，例如11min、15min、20min、25min、30min、35min、38min等。
优选地，步骤(2)中所述的真空干燥时间为12h～48h，例如12.5h、13h、15h、20h、25h、30h、36h、40h、45h、47h等。
优选地，步骤(2)中所述的涂覆使用旋转蒸发仪或者氮气吹扫实现。
优选地，所述旋转蒸发仪的转速为50～100转/min，例如52转/min、60转/min、65转/min、70转/min、80转/min、85转/min、93转/min、98转/min等，工作时间为15～45min，例如16min、20min、25min、30min、35min、40min、44min等。
优选地，步骤(3)中所述的浸泡时间为0.5～6h，例如0.6h、1.1h、1.8h、2.5h、3.5h、4.4h、5.4h、5.9h等，进一步优选为1～1.5h。
优选地，步骤(3)中所述的浸泡温度为20～50℃，例如22℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、48℃等，进一步优选为37～40℃。
优选地，步骤(3)中所述的聚合物多孔膜的孔径为100～300nm，例如110nm、150nm、200nm、250nm、280nm、295nm等。
优选地，步骤(3)中所述的聚合物多孔膜为聚碳酸酯多孔膜。
优选地，步骤(3)中所述的重复性地通过聚合物多孔膜的次数为10～15次，例如11次、12次、13次、14次等，进一步优选为15次。
本发明的目的之三在于提供所述制剂的一种用途，由于所述制剂中的AIE分子具有AIE效应，将AIE分子溶解在磷脂化合物微球中并将此微球分散在溶剂中注射在生物组织中后，通过细胞具有的内吞作用进入细胞内部，与细胞内含有的具有表面活性剂作用的化合物相结合而降解，降解时间为5～36h，使得磷脂化合物微球中所溶解的AIE分子释放出来，在细胞液的水相环境中聚集产生AIE效应，在单倍或双倍AIE分子激发波长的激光激发下可以实现细胞成像，成像图像清晰，且能够避免细胞质内其他荧光物质的干扰，能够用于进行细胞成像，故所述制剂可以作为荧光探针使用，同时，由于磷脂化合物微球具有EPR效应，磷脂化合物微球能够选择性的靠近肿瘤细胞或与肿瘤细胞表面向结合，所述制剂尤其适合利用其选择性作为荧光探针用于标记肿瘤细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的制剂制备方法非常简单，制备出来的制剂生物相容性良好，分散性均匀，粒径在100～300nm之间且大小可调，在细胞内磷脂化合物微球结构被表面活性剂降解，降解时间为5～36h，其中溶解的AIE分子释放并聚集，通过激光照射后，产生荧光，能够实现细胞成像和细胞标记，同时利用波长较长的激光激发也可以实现双光子成像，成像图像清晰，且能够避免细胞质内其他荧光物质的干扰，而且，利用肿瘤组织的EPR效应，本发明所述的制剂能够实现特异性的识别肿瘤细胞并对其进行标记。
附图说明
图1为实施例1得到的制剂1的TEM测试图像。
图2为实施例1得到的制剂1降解后在波长为405nm的光线激发下通过共聚焦显微镜观察得到的荧光图像。
图3为未经处理的实施例1得到的制剂1在波长为405nm的光线激发下通过共聚焦显微镜观察得到的荧光图像。
图4为实施例1得到的制剂1的荧光发射光谱图，其中的曲线(a)为双芘分子在波长为405nm的光线激发下的荧光发射光谱，曲线(b)为制剂1在波长为405nm的光线激发下的荧光发射光谱，曲线(c)为降解之后的制剂1在波长为405nm的光线激发下的荧光发射光谱。
图5为实施例1得到的制剂1经过细胞内吞实验得到的三维切片图图像。
图6为向MCF-7细胞中加入100μL实施例1得到的制剂1后孵育4h，12h，24h，31h，38h时经过810nm激光照射得到的各个不同时间段的细胞图像。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
通过如下步骤制备制剂1：
步骤(1)，将5mg双芘分子分散在丙酮与水以体积比为1:1混合得到的溶剂中，使用磁力搅拌器以800转/min的转速混合搅拌20min，之后超声处理40min使其双芘分子分散均匀，得到浓度为0.3mg/mL的双芘分子分散液；
步骤(2)，取步骤(1)中得到的双芘分子分散液，加入至溶解有550mg二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱丙酮溶液中，超声处理40min使其混合均匀，之后将混合液放入旋转蒸发仪，调节旋转蒸发仪以50转/min的转速工作45min，使其中的溶剂全部挥发并在旋转蒸发仪旋转平面上形成均匀透明的薄膜，该薄膜即为含有双芘分子的磷脂化合物膜，将所述含有双芘分子的磷脂化合物膜置于真空干燥器内，调节真空度＜100Pa进行真空干燥处理12h、干燥完毕后含有将所述双芘分子的磷脂化合物膜保存在阴凉干燥的环境内；
步骤(3)，取步骤(2)中得到的含有双芘分子的磷脂化合物膜在37℃下浸泡在pH为7.8的磷酸盐缓冲溶液中1.5h，待其全部溶解后，根据含有双芘分子的磷脂化合物膜的加入量继续加入所述磷酸盐缓冲溶液，调节含有双芘分子的磷脂化合物在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为10mg/mL，使用挤出器反复挤压该混合液，使其重复性地通过孔径为200nm的聚碳酸酯多孔膜15次，得到制剂1。
实施例2
通过如下步骤制备制剂2：
与实施例1的不同之处在于，将各步骤中所使用的双芘分子替换为MC-4分子。
实施例2得到制剂2。
实施例3
通过如下步骤制备制剂3：
与实施例1的不同之处在于，将各步骤中所使用的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱替换为数均分子量为5200的磷脂聚乙二醇叶酸。
实施例3得到制剂3。
实施例4
通过如下步骤制备制剂4：
与实施例1的不同之处在于，将步骤(1)中的溶剂替换为四氢呋喃，磁力搅拌器的转速调节为100转/min，超声处理的时间调节为20min。
实施例4得到制剂4。
实施例5
通过如下步骤制备制剂5：
与实施例1的不同之处在于，步骤(1)中双芘分子分散液的浓度为0.6mg/mL。
实施例5得到制剂5。
实施例6
通过如下步骤制备制剂6：
与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的加入量为250mg，超声处理的时间为10min。
实施例6得到制剂6。
实施例7
通过如下步骤制备制剂7：
与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的加入量为2000mg，且不使用旋转蒸发仪，而是通过将该混合液置于平底容器中，通过氮气吹扫使得溶剂完全挥发得到含有双芘分子的磷脂化合物膜，真空干燥处理的时间为48h。
实施例7得到制剂7。
实施例8
通过如下步骤制备制剂8：
与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中将pH为7.8的磷酸盐缓冲溶液替换为pH为6.5的水溶液且浸泡的时间为1h。
实施例8得到制剂8。
实施例9
通过如下步骤制备制剂9：
与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中调节含有双芘分子的磷脂化合物在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为2mg/mL，且重复性地通过聚碳酸酯多孔膜的次数为10次。
实施例9得到制剂9。
实施例10
通过如下步骤制备制剂10：
与实施例1的不同之处在于，步骤(3)中聚碳酸酯多孔膜的孔径为100nm。
实施例10得到制剂10。
通过如下实验对上述实施例中得到的制剂进行表征。
实施例11
通过如下步骤制备制剂11：
与实施例1的不同之处在于，将各步骤中所使用的双芘分子替换为羧基双芘分子。
实施例11得到制剂11。
(1)微观结构分析
将上述制剂滴在铜网上，待其自然风干后使用2wt的％磷钨酸溶液进行染色，之后使用JEM-1011型透射电子显微镜(TEM)观察其形貌结构，其中，TEM的测试参数为：测试电压为1200kv，放大倍数为1.2×104倍。
(2)荧光性能测试
取1mL上述实施例中的制剂，向其中加入40μL浓度为10wt％的细胞外用表面活性剂辛基酚聚氧乙烯醚(Trixon-100)，使用磁力搅拌器以400转/min的转速搅拌1h，使得制剂中的磷脂化合物微球结构降解，AIE分子暴露在分散液中。
将上述降解后的制剂均匀涂覆在载玻片上，待其自然风干后利用Olympus FV1000型共聚焦显微镜观察其在相应激发光坡长下的荧光图像，其中，共聚焦显微镜的测试参数为：激发波长为405nm，接收波长为480～550nm，电压为700V，激光强度为12％。
将上述制剂、制剂中所使用的AIE分子和降解后的制剂分别配制成浓度为0.3mg/mL的溶液，使用FL4800型荧光光谱仪测试上述三者的发射光谱，其中，荧光光谱仪的测试参数为：激发波长为405nm，发射波长为515nm，电压为700V，狭缝宽度为5nm。
(3)细胞内吞实验
在35mm玻璃共聚焦培养皿中培养乳腺癌细胞MCF-7，在癌细胞达到对数生长期之后，取100μL上述实施例中得到的制剂，与其共孵育4h，培养4h之后，将癌细胞分别用染色剂Hoechst 33342和Alexa488WGA进行染色，之后采用与荧光性能测试中相同的测试参数使用Olympus FV1000型激光共聚焦显微镜进行扫描，依次得到细胞膜和荧光粒子的图像、细胞核以及纳米粒子叠加图像、荧光纳米粒子图像和三维切片图图像。
(4)细胞成像性能测试
采用与细胞内吞实验中相同的实验方法将制剂与MCF-7细胞共孵育4h，之后在波长为AIE分子激发波长双倍的激光照射下，采用与荧光性能测试中相同的测试参数使用Olympus FV1000型激光共聚焦显微镜进行扫描，得到孵育4h，12h，24h，31h，38h后，各个不同时间段的细胞图像。
以实施例1中得到的制剂1为例，图1为制剂1的TEM测试图像，可以直观的看出其中的溶解有AIE分子的磷脂化合物微球的平均粒径为180nm左右。
图2为降解后的制剂1在波长为405nm的光线激发下通过共聚焦显微镜观察得到的荧光图像。图3为未经处理的制剂1在波长为405nm的光线激发下通过共聚焦显微镜观察得到的荧光图像。图4中的曲线(a)为双芘分子在波长为405nm的光线激发下的荧光发射光谱，曲线(b)为未经处理的制剂1在波长为405nm的光线激发下的荧光发射光谱，曲线(c)为降解后的制剂1在波长为405nm的光线激发下的荧光发射光谱。通过上述荧光实验的图像可以直观的验证本发明所得到的制剂的荧光性能，可以看出当本发明所制备的制剂在没有表面活性剂存在的情况下其荧光强度很弱，而当体系内存在表面活性剂时，由于磷脂化合物微球降解，其中的AIE分子释放出来，聚集并产生强烈的荧光现象，荧光强度与同浓度的纯AIE分子溶液相差不大。
图5为制剂1经过细胞内吞实验得到的三维切片图图像。从中可以看出，本发明所制备的制剂与细胞之间结合紧密，并且能够将AIE分子运送至在细胞内部进行成像。
图6为向MCF-7细胞中加入100μL制剂1后孵育4h，12h，24h，31h，38h时经过810nm激光照射得到的各个不同时间段的细胞图像，其中荧光依次增强，可以看出本发明所制备的制剂在细胞内降解的时间在5～36h之间，且双光子荧光成像得到的图像十分清晰，能够避免细胞质内其他荧光物质的干扰。
通过对于上述实施例的制备及相应的表征分析可以得出，本发明所制备得到的制剂制备方法非常简单，制备出来的制剂生物相容性良好，分散性均匀，粒径在100～300nm之间且大小可调，利用肿瘤组织的EPR效应能够特异性的识别肿瘤细胞并很容易被肿瘤细胞内吞，在肿瘤细胞内磷脂化合物微球结构被表面活性剂降解，其中溶解的AIE分子释放并聚集，通过激光照射后，产生荧光，能够实现细胞成像和细胞标记，同时利用波长较长的激光激发也可以实现双光子成像，成像图像清晰，且能够避免细胞质内其他荧光物质的干扰。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于细胞成像的制剂，其特征在于，所述制剂包括溶解有AIE分子的磷脂化合物微球和用于分散磷脂化合物微球的溶剂；
所述AIE分子为具有AIE效应的脂溶性分子。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述AIE分子包括双芘分子、羧基双芘分子、MC-4分子中的任意一种或至少两种的混合物，优选为双芘分子。
3.根据权利要求1或2所述的制剂，其特征在于，所述磷脂化合物包括二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰基三甲基铵丙烷、数均分子量为2000～20000的磷脂聚乙二醇、数均分子量为2000～20000的磷脂聚乙二醇叶酸中的任意一种或至少两种的混合物，优选为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱。
4.根据权利要求1～3之一所述的制剂，其特征在于，所述磷脂化合物微球在pH为6～8的组织液中完全降解所需的时间为5～36h；
优选地，所述磷脂化合物微球的粒径为100～300nm，进一步优选为180～200nm；
优选地，所述磷脂化合物微球中磷脂化合物和AIE分子的质量比为(50～400):1，进一步优选为111:1；
优选地，所述磷脂化合物微球以1mg/mL～20mg/mL的浓度分散在溶剂中，进一步优选地，所述磷脂化合物微球以2mg/mL～10mg/mL的浓度分散在溶剂中。
5.根据权利要求1～4之一所述的制剂，其特征在于，所述溶剂的pH为6～8；
优选地，所述溶剂包括水或磷酸盐缓冲溶液中的任意一种，优选为磷酸盐缓冲溶液。
6.一种如权利要求1～5之一所述的制剂的制备方法，其特征在于，所述制剂通过如下步骤制备：
步骤(1)，将AIE分子分散在溶剂中，混合搅拌，之后进行超声处理，得到AIE分子分散液；
步骤(2)，取步骤(1)中得到的AIE分子分散液，加入至溶解有磷脂化合物的挥发性有机溶剂中，超声处理使其混合均匀，之后涂覆在平面上，待溶剂全部挥发之后，得到含有AIE分子的磷脂化合物膜，将所述含有AIE分子的磷脂化合物膜真空干燥处理、保存；
步骤(3)，取步骤(2)中得到的含有AIE分子的磷脂化合物膜浸泡在用于分散所述磷脂化合物微球的溶剂中，待其全部溶解后，将混合液重复性地通过聚合物多孔膜至少两次，得到所述制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合搅拌的搅拌速率为100～800转/min，优选为400转/min；
优选地，步骤(1)中所述溶剂为丙酮、二甲基亚砜、四氢呋喃、三氯甲烷、水中的任意一种至少两种的混合物；
优选地，步骤(1)中所述AIE分子分散液的浓度为0.6mg/mL～1.2mg/mL；
优选地，步骤(1)中所述超声处理的时间为20～40min。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的挥发性有机溶剂包括丙酮、四氢呋喃、三氯甲烷、无水乙醚中的任意一种或至少两种的混合物，优选为丙酮；
优选地，步骤(2)中所述的超声处理的时间为10～40min；
优选地，步骤(2)中所述的真空干燥时间为12h～48h；
优选地，步骤(2)中所述的涂覆使用旋转蒸发仪或者氮气吹干实现；
优选地，所述旋转蒸发仪的转速为50-100转/min，工作时间为15～45min。
9.根据权利要求6～8之一所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的浸泡时间为0.5～6h，优选为1～1.5h；
优选地，步骤(3)中所述的浸泡温度为20～50℃，优选为37～40℃；
优选地，步骤(3)中所述的聚合物多孔膜的孔径为100～300nm；
优选地，步骤(3)中所述的聚合物多孔膜为聚碳酸酯多孔膜；
优选地，步骤(3)中所述的重复性地通过聚合物多孔膜的次数为10～15次，进一步优选为15次。
10.一种如权利要求1～5之一所述的制剂的用途，其特征在于，所述制剂作为荧光探针使用；
优选地，所述制剂作为荧光探针用于标记肿瘤细胞。
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