CN102212116A - 一种乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属药学领域，涉及一种可以跨过血脑屏障的乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽CDX，及该乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽形成的复合物在脑部疾病诊断与治疗中的用途。荧光素标记物的细胞特异性摄取和脑部分布结果表明，本发明的CDX具有介导复合物跨越血脑屏障的特征；将CDX修饰到聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)等聚合物材料上，并构建成包载荧光素或者药物等分子的聚合物胶束，可以介导跨越血脑屏障，将所载物质传递到脑组织；包载紫杉醇的PEG-PLA胶束经CDX修饰后，可以显著延长胶质瘤原位肿瘤模型动物的生存期。本发明的CDX可以介导药物或者递药系统用于脑部疾病的诊断与治疗。

Description

一种乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽及其应用

技术领域

本发明属药学领域，涉及乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽，尤其是一种可以跨过血脑屏障的乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽，还涉及此乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽形成的复合物在脑部疾病诊断与治疗中的用途。

背景技术

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是一种门控型离子通道受体，在中枢神经系统高度表达，在脑组织，包括组成血脑屏障的脑毛细内皮细胞均广泛表达。血脑屏障是阻碍药物进入脑部组织的主要障碍，研究和开发可以穿透血脑屏障的靶向头基，协助药物或者药物载体穿过血脑屏障，从而达到药物的脑内传输，具有现实意义。

蛇神经毒素主要分为短神经毒素和长神经毒素，前者主要是指含有60-62个氨基酸、形成4对二硫键的蛋白分子；后者指含有71-74个氨基酸、形成5对二硫键的蛋白分子。前人研究表明，一些毒蛇，例如眼镜蛇、蝮蛇和金环蛇等，其分泌毒液中的神经毒素可以与乙酰胆碱受体特异性结合(K_D＝10^-9-10^-10M)。蛇神经毒素属于三手指形结构(如图7所示)，蛇神经毒素形成的三个环中(loop I、loop II和loopIII)，loop II是与nAChRs结合的主要区域，分子水平实验结果表明，神经毒素loop II氨基酸序列与nAChRs具有高亲和力。设计具有短神经毒素Candoxin的Loop II区域氨基酸序列的多肽，使其与nAChRs具有高亲和力，并能作为穿透血脑屏障的靶分子具有十分巨大的意义。

发明内容

本发明目的是提供一种乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽(CDX)。

本发明的另一目的是将所述乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽(CDX)用于脑部疾病诊断与治疗中。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽，其特征在于，具有由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，也即氨基酸序列为FKESWREARGTRIERG，是短神经毒素Candoxin的LoopII区域氨基酸序列，包含16个氨基酸。

所述多肽CDX可与其它分子复合，形成具有介导脑靶向功能的CDX衍生物。

所述具有介导脑靶向功能的CDX衍生物，通过N端生物素化得到生物素化CDX，与亲和素衍生物耦合得到一种CDX-Avidin-X复合物。

所述的CDX-Avidin-X复合物，其特征在于，复合物中的X是荧光物质FITC或近红外染料IR820中的一种。所述的CDX-Avidin-X复合物可以进行体内外示踪，细胞特异性摄取和脑部分布结果表明，这种多肽-蛋白复合物具有脑靶向特征

所述多肽CDX的N端连接上半胱氨酸，得到巯基化的多肽，利用巯基与马来酰亚胺的加成反应，与含马来酰亚胺-聚乙二醇的两亲性高分子连接，修饰到PEG-PLA胶束材料上，得到CDX-PEG-Y复合物，该胶束可将包载荧光染料或者药物的胶束携带入脑，表明CDX可以通过乙酰胆碱受体介导将纳米递药系统输送入脑。

所述的CDX-PEG-Y复合物，复合物中的Y是聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA)、聚己内酯(PCL)或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)中的一种。

所述的CDX-PEG-Y复合物具有在形成微粒递药系统，包载难溶性药物中的用途。

所述的CDX-PEG-Y复合物，所述的微粒递药系统包载的难溶性药物，还包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑或银杏内酯之中的一种。CDX修饰的具有脑靶向特征的的递药系统不仅限于包载紫杉醇、阿霉素和伊曲康唑等抗肿瘤药物，还可以包载治疗神经退行性疾病的药物如银杏内酯脑内递药。

所述的CDX-PEG-Y复合物具有脑靶向特征，具有在脑部疾病诊断与治疗中的用途。

本发明根据神经毒素Candoxin的Loop II区域，设计了与nAChRs具有高亲和力的多肽CDX，氨基酸序列为FKESWREARGTRIERG，将其作为穿透血脑屏障的靶分子。CDX与乙酰胆碱受体具有高亲和力，同时可以被组成血脑屏障的脑毛细内皮细胞特异性摄取，动物体内分布表明CDX自身或者携带胶束递送系统可跨越血脑屏障。

附图说明

图1是CDX的HPLC和ESI-MS图谱

色谱方法：色谱柱(YMC，C18)：150×4.6mm；流动相A：水(含0.1％三氟乙酸)，流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱程序：0-45分钟5％B-65％B；流速：0.7ml/分钟；柱温：40℃；检测：UV280nm，TCDX：12.72分钟，CDX纯度为98％。

ESI-MS：CDX：1979。

图2是CDX对α-Bungarotoxin与乙酰胆碱受体结合的竞争抑制曲线

CDX的浓度为10-5～10-12M时，对α-Bungarotoxin与乙酰胆碱受体结合竞争抑制效果，IC50值为301.99nM。

图3是CDX体内生物分布结果

A、B分别为阴性对照FITC-Avidin脏器成像和荧光半定量结果，C、D分别为FITC-Avidin-CDX脏器成像和荧光半定量结果。脏器从左至右分别为0.5h，1h，2h和4h。

图4是载coumarin-6的CDX-PEG-PLA胶束体内药动学和脑分布结果

A、B分别为载Coumarin-6的CDX-PEG-PLA和PEG-PLA胶束体内药动学和脑部分布曲线，表格为相关药动学参数(a，p＜0.05)。

图5是包载NIR染料Dir的CDX-PEG-PLA胶束在胶质瘤原位肿瘤模型上的活体成像

A为肿瘤种植5天后注射载Dir的CDX-PEG-PLA(右)和PEG-PLA(左)胶束的活体成像2h-4d分布结果；B为肿瘤种植15天后注射载Dir的CDX-PEG-PLA胶束的活体和离体成像结果。

图6是胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠的生存曲线

生理盐水组、Taxol组、载紫杉醇PEG-PLA和CDX-PEG-PLA胶束组平均生存时间为34，38.5，41.5和48天。

图7是三手指形蛇神经毒素结构示意图。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。

实施例1CDX的制备与表征

采用固相合成法，制备了氨基酸序列为FKESWREARGTRIERG的多肽(CDX)。将PAM-Gly-Boc树脂用三氟乙酸(TFA)脱保护1分钟，两次，将Boc保护氨基酸溶解在0.5M的HBTU(溶剂为DMF)中，室温反应15min，DMF洗涤，TFA脱除Boc保护，按照氨基酸序列依次反应，反应完成后，用20％的哌啶DMF溶液脱除CHO保护基15分钟，两次。三氟乙酸脱Boc保护后，用氢氟酸将多肽从树脂上切割下来，乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化。HPLC和ESI-MS结果如附图1所示，CDX的纯度为98％，分子量为1979。

实施例2CDX竞争抑制α-Bungarotoxin对乙酰胆碱受体结合活性试验

Wister大鼠(220～260克)断头处死后迅速分离出海马，称量后加入10倍体积的Tris-HCl缓冲液(50mM Tris-HCl，5mM MgCl₂·6H₂O，1mM EDTA，0.5％(W/V)BSA，1mMPMSF，3μg/ml蛋白酶抑制剂，0.1％NaN₃，0.32M sucrose，pH7.4)，用匀浆器15000转/分钟进行匀浆，每次30秒，共5次。匀浆液经1000×g离心10分钟，取上清液再用39000×g离心10分钟，收集沉淀，用原重量的10倍体积Tris-HCl缓冲液pH7.4重新悬液，再用39000×g离心10分钟，沉淀再用相同缓冲液洗涤，39000×g离心10分钟，最后得神经源性乙酰胆碱受体蛋白，用以上缓冲液悬浮后分装，在-80℃保存备用。用Fotin法测定蛋白质含量。

在所有试管中加入50μg乙酰胆碱受体(nAChRs)蛋白量。测试管中依次加入20μl一定浓度的CDX，非特异结合管中加入50μl非标记配体α-Bungarotoxin(α-Bgt，终浓度10μM)，预先反应50分钟。全部试管依次加入30μl ¹²⁵I-α-Bgt，终浓度为2nM。用Tris-HCl缓冲液pH7.4补足所有反应管体积至200μl。在37℃反应条件下反应2小时。点样于49型玻璃纤维滤膜上，负压抽滤，再用冰冷的缓冲液洗涤10次，每次2ml，抽干滤膜，烘干后放在闪烁瓶中，加1ml闪烁液，用LS6500型液闪计数器测定放射性强度。CDX在不同浓度时对nAChRs与¹²⁵I-α-Bgt结合竞争性抑制作用结果如附图2所示。CDX具有竞争抑制α-Bgt对乙酰胆碱受体结合活性，其IC₅₀为301.99nM。

实施例3CDX的体内生物分布试验

昆明种小鼠(～25克)尾静脉分别注射FITC-Avidin和FITC-Avidin-CDX复合物溶液100μl(CDX浓度为2.5μM)，分别在0.5、1、2和4小时用乙醚麻醉，生理盐水心脏灌流，分别取心、肝、脾、肺、肾和脑等主要器官，活体成像仪(in-vivo Imaging System，FX Pro，Kodak，USA)检测各个脏器的荧光分布，同时根据荧光强度进行半定量计算，实验结果如附图3所示。结果表明，尾静脉注射FITC-Avidin-CDX复合物，在0.5-4小时内主要分布在脑和肾脏，其中肾脏是其主要代谢途径，而阴性对照FITC-Avidin在脑内没有分布，说明CDX具有脑靶向特性。

实施例4CDX-聚乙二醇-聚乳酸(CDX-PEG-PLA)胶束体内生物分布试验

在CDX上连接半胱氨酸，得到巯基化的CDX(CDX-Cys)。CDX-Cys在pH8.0的PBS中与马来酰亚胺-聚乙二醇-聚乳酸(Maleimide-PEG-PLA)反应，反应完成后凝胶柱纯化除去小分子，冻干备用。制备的CDX-PEG-PLA(1mg)与PEG-PLA(19mg)溶解在3ml乙腈中，加入15μg 6-香豆素(Coumarin-6)，减压成膜2h，水化，CL-4B柱除去游离Coumarin-6，制备得到包载Coumarin-6的CDX修饰胶束，同法制备PEG-PLA载Coumarin-6普通胶束。在KM鼠(～25克)尾静脉分别注射包载Coumarin-6的CDX-PEG-PLA胶束、PEG-PLA胶束各100μl，分别在5分钟～12小时用乙醚麻醉，取血后，生理盐水心脏灌流，取脑组织，生物样品通过HPLC分析coumarin-6含量，制备血药-时间曲线和脑分布-时间曲线(如表1、图4所示)，计算各药动学参数。脑分布中，载Coumarin-6的CDX-PEG-PLA胶束AUC值显著大于PEG-PLA胶束，说明CDX-PEG-PLA可以介导胶束递药系统穿透血脑屏障。

表1

实施例5载近红外染料Dir的CDX-PEG-PLA胶束体内分布

将CDX-PEG-PLA(1mg)与PEG-PLA(19mg)溶解在3ml乙腈中，加入15μg DiR(Invitrogen，USA)，减压成膜2h，水化，CL-4B柱除去游离DiR，制备得到包载DiR的胶束，同法制备PEG-PLA载DiR普通胶束，4℃避光保存，备用。胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠种植后第5天和第15天，尾静脉分别均注射包载DiR的CDX-PEG-PLA和PEG-PLA胶束各100μl，活体成像观察近红外染料DiR的体内分布(附图5)。试验结果表明，在肿瘤种植5天后，CDX-PEG-PLA胶束可以携带包载的Dir入脑，而普通的PEG-PLA胶束不入脑；肿瘤种植15天后，CDX-PEG-PLA胶束可以携带包载的Dir在肿瘤区域蓄积明显。结果提示，CDX可以介导PEG-PLA胶束携带包载的药物跨越血脑屏障。

实施例6载紫杉醇CDX-PEG-PLA胶束体内药效学试验

CDX-PEG-PLA(1mg)与PEG-PLA(19mg)溶解在3ml乙腈中，加入10mg紫杉醇，减压成膜2h，水化，0.22μm水膜过滤除去游离紫杉醇，制备得到包载紫杉醇的CDX修饰胶束，同法制备PEG-PLA载紫杉醇普通胶束。胶质瘤原位肿瘤模型裸鼠尾静脉分别注射载紫杉醇的CDX-PEG-PLA和PEG-PLA胶束、Taxol(生理盐水稀释)和生理盐水各100μl。紫杉醇制剂的给药剂量为10mg/千克，分别在肿瘤种植后第7、12、17和22天给药，记录裸鼠的生存时间。裸鼠生存曲线如附图6所示，与其他组别相比，载紫杉醇CDX-PEG-PLA胶束显著延长原位肿瘤裸鼠生存时间。

一种乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽及其应用.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学

 

<120>一种乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽及其应用

 

<130>memo

 

<160>1

 

<170>PatentIn version 3.3

 

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>多肽

 

<400>1

 

Phe Lys Glu Ser Trp Arg Glu Ala Arg Gly Thr Arg Ile Glu Arg Gly

1          5              10             15

Claims (10)

1.一种乙酰胆碱受体介导脑靶向多肽，其特征在于，其具有由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽可与其它分子复合，形成具有介导脑靶向功能的CDX衍生物。

3.一种CDX-Avidin-X复合物，其特征在于，由权利要求2所述具有介导脑靶向功能的CDX衍生物，通过N端生物素化得到生物素化CDX，与亲和素衍生物耦合得到。

4.如权利要求3所述的CDX-Avidin-X复合物，其特征在于，复合物中的X是荧光物质FITC或近红外染料IR820中的一种。

5.权利要求4所述的CDX-Avidin-X复合物在制备脑部疾病的诊断和示踪分子制剂中的用途。

6.一种CDX-PEG-Y复合物，其特征在于，由权利要求1所述的多肽的N端连接半胱氨酸后，得到巯基化多肽，与含马来酰亚胺-聚乙二醇的两亲性高分子连接制得。

7.如权利要求6所述的CDX-PEG-Y复合物，其特征在于，复合物中的Y是聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、聚己内酯或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种。

8.权利要求7所述的CDX-PEG-Y复合物在制备微粒递药系统中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，CDX-PEG-Y复合物，其特征在于，所述的微粒递药系统包载难溶性药物，包括紫杉醇、阿霉素、伊曲康唑或银杏内酯中的一种。

10.权利要求7所述的CDX-PEG-Y复合物在制备诊断与治疗脑部疾病的脑靶向制剂中的用途。

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