CN110627876A - A7r糖肽及其在制备肿瘤诊治药物中的用途 - Google Patents

A7r糖肽及其在制备肿瘤诊治药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明属药学领域，涉及A7R糖肽及其修饰的药物和高分子载体材料的制备及其在肿瘤影像和靶向治疗用递药系统构建中的应用。结果显示：A7R糖肽保留了A7R多肽靶向肿瘤新生血管内皮细胞而跨血‑肿瘤屏障，靶向肿瘤拟态血管、肿瘤细胞的能力，还增强了多肽在体内的稳定性，同时使多肽具备了靶向脑毛细血管内皮细胞而跨血‑脑屏障的功能，显著提高了多肽对肿瘤的靶向性；A7R糖肽所修饰的药物或纳米递药系统如脂质圆盘、脂质体、聚合物胶束、纳米粒等均能跨越血‑脑屏障和血‑肿瘤屏障，将所包载药物递送至肿瘤组织，显著提高肿瘤的诊断和治疗效果。所述A7R糖肽可介导药物或纳米递药系统主动寻靶，在肿瘤诊断和靶向治疗中具备良好的应用前景。

Description

A7R糖肽及其在制备肿瘤诊治药物中的用途
技术领域
本发明属药学领域，涉及A7R糖肽及其在制药中的用途，具体涉及A7R糖肽及其修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统，及其在制备脑部肿瘤或外周肿瘤诊断和靶向治疗药物中的应用。所述的A7R糖肽及其药物复合物和修饰的纳米递药系统具有高稳定性、跨血-脑屏障(BBB)和血-肿瘤屏障(BTB)，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的多功能靶向特征。
背景技术
报道公开了肿瘤是严重威胁人类生命和健康的疾病，死亡率高居所有疾病死亡率首位。传统的化疗作为肿瘤药物治疗的主要手段，存在对肿瘤组织选择性差、毒性大、治疗窗窄、易产生多药耐药等缺陷，因此，为克服传统治疗手段的局限性，近年来，主动靶向成为提高肿瘤组织靶向效率的重要策略。主动靶向策略主要针对肿瘤组织中高表达的受体或转运体，利用与特异性受体或转运体具有识别、结合能力的对应配体，将药物或纳米递药系统递送至肿瘤组织或细胞中；配体修饰后的药物或纳米递药系统可通过细胞表面受体或转运体与配体的特异性识别、结合、内化，将药物递送至肿瘤组织和细胞内，从而实现对肿瘤的主动靶向。
A7R(L型氨基酸序列为LALTLWLLLPLPLR)是噬菌体展示技术筛选得到的可与血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)以及神经纤毛蛋白-1(NRP-1)具有高度结合活性的7肽，能靶向肿瘤新生血管内皮细胞而跨BTB、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞，在体内具有良好的寻靶能力；但是A7R作为L构型氨基酸组成的多肽，其体内稳定性较差，在血循环中易降解，从而降低了其靶向能力。尽管有研究通过D构型氨基酸改造 (D型氨基酸序列为DRDPDPDLDWDTDA)解决了其稳定性问题，但是A7R难以跨BBB，因而仍然无法实现对脑部肿瘤的高效靶向。
研究显示，BBB膜上存在着若干物质转运机制，可促进营养物质的脑内转运，例如D-葡萄糖转运蛋白(GLUT)是重要的营养转运蛋白之一，在脑微血管中表现出特别高的浓度，因此本申请拟利用D-葡萄糖作为配体，通过GLUT途径实现药物的脑内递送。
针对现有技术存在的问题，本发明的申请人进一步对已有A7R多肽进行优化，利用将A7R多肽糖基化修饰，即构建A7R糖肽，达到提高多肽的稳定性、一级赋予多肽跨BBB能力，进而构建A7R糖肽修饰的诊断和治疗药物复合物、修饰的高分子载体材料及其所构建的纳米递药系统，以期实现对脑部肿瘤或外周肿瘤更为有效的靶向诊治作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种A7R糖肽(由糖基与A7R多肽共价连接而成)，并以A7R糖肽修饰药物分子或高分子载体材料，构建A7R糖肽复合物及A7R糖肽修饰的递药系统，以及用于制备提高药物对肿瘤的靶向诊疗效果的药物。所述的A7R糖肽及其药物复合物和修饰的纳米递药系统具有高稳定性、跨血-脑屏障(BBB)和血-肿瘤屏障(BTB)，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的多功能靶向特征。
具体的，本发明通过成苷反应合成糖基化氨基酸，并利用Fmoc固相多肽合成法制备A7R糖肽，通过对A7R多肽的糖基化改造提高了A7R多肽在血清的稳定性，保留 A7R的肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管、肿瘤细胞的靶向能力的同时，赋予其脑毛细血管内皮细胞靶向能力。
本发明所设计的A7R糖肽引入巯基后，可与马来酰亚胺功能化影像物质(荧光物质Fluorescein、近红外染料Cy7、IR820、DiR、磁共振影像剂Gd-DTPA、放射影像剂99mTc-DTPA等)反应形成复合物。
本发明所设计的A7R糖肽修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、 9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱和长春瑞滨等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及p53激活肽等多肽药物)的A7R糖肽-药物复合物。
本发明所设计的A7R糖肽引入巯基后，可修饰在含马来酰亚胺功能基的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，可用于A7R糖肽修饰的脂质体、脂质圆盘、聚合物胶束、纳米粒等纳米递药系统的构建。
本发明所设计的A7R糖肽修饰的纳米递药系统可包载阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、依托泊苷、吉西他滨、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、替尼泊苷、莫立替尼、埃博霉素、长春瑞滨、放线菌素D、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、伊立替康、顺铂、奥沙利铂、p53激活肽、蜂毒肽、蝎毒肽、贝伐单抗、曲妥单抗等；也可包载荧光物质和磁共振影像剂，如FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD、Gd-DTPA等。
本发明中，进行了，
1.A7R糖肽及其荧光标记物的合成
首先采用氨基酸侧链的羟基与糖分子间的成苷反应合成糖基化氨基酸，然后利用Fmoc固相多肽合成方法制备A7R糖肽。通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了荧光素Fluorescein标记的A7R糖肽、Cy7标记的A7R糖肽。HPLC表征多肽纯度，MS表征结构。
2.A7R糖肽稳定性评价
考察A7R糖肽在血清中的稳定性；将A7R糖肽与小鼠血清在37℃进行孵育，在不同时间点检测多肽的浓度评价其稳定性。
3.A7R糖肽体内外靶向能力评价
考察Fluorescein标记的A7R糖肽对脑毛细血管内皮细胞(大鼠原代毛细血管内皮细胞BCEC和bEND.3细胞)和模型肿瘤细胞(脑胶质瘤细胞U87)的体外靶向性；通过正常小鼠、荷U87皮下瘤模型裸鼠和荷U87原位瘤模型裸鼠尾静脉注射A7R糖肽考察其在体内脑组织和肿瘤部位的靶向性。
4.A7R糖肽-DTPA-Gd与A7R糖肽-DTPA-99mTc的合成
通过马来酰亚胺基团与巯基的Michael加成反应合成了A7R糖肽-DTPA，螯合Gd或99mTc得A7R糖肽-DTPA-Gd或A7R糖肽-DTPA-99mTc。
5.制备A7R糖肽-药物
引入半胱氨酸后的A7R糖肽与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物。
引入半胱氨酸后的A7R糖肽与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、伊立替康、长春新碱、长春瑞滨等含羟基或氨基的药物。
A7R糖肽通过修饰上多巴胺进而与药物的硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物。
A7R糖肽通过固相合成直接与多肽药物缩合，其中所涉及药物包括p53激活肽等多肽药物。
6.构建与表征A7R糖肽修饰的纳米递药系统
首先合成A7R糖肽修饰的高分子材料A7R糖肽-PEG-DSPE、A7R糖肽-PEG-PLA、 A7R糖肽-PEG-PLGA、A7R糖肽-PEG-PCL等。通过引入半胱氨酸的A7R糖肽上游离巯基与Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-PLGA、Mal-PEG-PCL等所含马来酰亚胺的反应实现材料的合成，即：将Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLA、Mal-PEG-PLGA、 Mal-PEG-PCL等分别溶解在乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入含巯基AG的PBS(pH 8.0) 反应制备得到A7R糖肽修饰的高分子材料，1H-NMR表征。
然后制备A7R糖肽修饰的纳米递药系统，一定量的A7R糖肽-PEG-DSPE和 mPEG-DSPE和磷脂和胆固醇、或A7R糖肽-PEG-DSPE和mPEG-DSPE、或A7R糖肽 -PEG-PLA和mPEG-PLA、或A7R糖肽-PEG-PLGA和mPEG-PLGA、或A7R糖肽 -PEG-PCL和mPEG-PCL，以及一定量药物，采用成膜水化等方法分别制备相应的A7R 糖肽修饰脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、聚合物纳米粒等纳米递药系统；激光散射粒度仪表征纳米递药系统粒径和粒径分布。
7.体内靶向性评价A7R糖肽修饰纳米递药系统
考察bEND.3细胞、U87细胞、U87肿瘤球以及体外BBB/U87肿瘤球模型对A7R 糖肽修饰纳米递药系统的摄取情况；
通过荷U87皮下移植瘤模型裸鼠尾静脉注射载DiR的A7R糖肽修饰纳米递药系统，考察其对肿瘤的靶向能力；
通过荷U87原位移植瘤模型鼠尾静脉注射载DiR的A7R糖肽修饰纳米递药系统，考察不同时间点其在脑肿瘤部位的分布。
8.A7R糖肽修饰纳米递药系统的体内外抗肿瘤效果评价
以MTT法考察包载肿瘤治疗药物的A7R糖肽修饰纳米递药系统对U87细胞的体外生长抑制；通过荷U87原位移植瘤模型裸鼠尾静脉注射包载肿瘤治疗药物的A7R糖肽修饰纳米递药系统，以裸鼠中位生存期、肿瘤组织细胞凋亡、新生血管和拟态血管数量为指标评价体内抗肿瘤效果。
本发明所设计的A7R糖肽具有高稳定性的，可跨BBB、BTB，靶向肿瘤新生血管、拟态血管和肿瘤细胞，提高药物跨越屏障效率并靶向肿瘤，用于制备肿瘤的靶向诊断和治疗的药物。
本发明提供了A7R糖肽制备和性质考察以及上述所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于肿瘤诊疗的物质基础。本发明的试验结果表明：A7R糖肽在血清中稳定性高，具有跨BBB和BTB，靶向肿瘤新生血管、肿瘤拟态血管和肿瘤细胞的多功能靶向作用，在模型动物体内表现出更优肿瘤靶向能力；A7R糖肽修饰的纳米递药系统显示出了良好的肿瘤靶向性能和更强的抗肿瘤效果。
附图说明
图1、Fmoc-Thr(O-β-Glu(OAc)4)的合成路线图，
利用糖的成苷反应，全乙酰化保护的葡萄糖与Fmoc保护的苏氨酸在Lewis酸的催化下，生成O-连接的糖基化苏氨酸。
图2、Fmoc-Thr(O-β-Glu(OAc)4)的ESI-MS图谱，
ESI-MS：671.4，与理论分子量相符合。
图3、A7R糖肽的合成路线，
以9G-A7R为例，利用Fmoc固相多肽合成技术制备A7R糖肽。
图4、A7R糖肽的HPLC和ESI-MS图谱
图A、B、C分别为9G-A7R、9,10G-A7R和12G-A7R的HPLC和ESI-MS图，由图可见，其纯度符合均大于95％，ESI-MS实测分子量与理论分子量相符合。
图5、荧光标记A7R糖肽的HPLC和ESI-MS图谱
图A、B、C、D、E、F分别为9G-A7R-Fluorescein、9,10G-A7R-Fluorescein、12G-A7R-Fluorescein、9G-A7R-Cy7、9,10G-A7R-Cy7和12G-A7R-Cy7的HPLC和ESI-MS图，由图可见，其纯度符合均大于95％，ESI-MS实测分子量与理论分子量相符合。
图6、9G-A7R-PEG3400-DSPE的1H-NMR和HPLC图谱
图A为HPLC图谱，图B为1H-NMR图谱，由图可见，Mal-PEG-DSPE的核磁图谱于6.7ppm显示出马来酰亚胺峰，而9G-A7R-PEG-DSPE的核磁图谱中该峰消失，显示Mal-PEG-DSPE中的马来酰亚胺基团已连接上9G-A7R。
图7、A7R糖肽的血清稳定性
图A为9G-A7R、9,10G-A7R、12G-A7R及A7R与大鼠血清孵育后残余含量随时间的变化；图B分别为A7R、9G-A7R、9,10G-A7R、12G-A7R分别与大鼠血清孵育0h和 4h时的HPLC谱图；结果表明，A7R在与大鼠血清孵育4h后几乎完全被降解，而9G-A7R，9,10G-A7R，12G-A7R的稳定性均显著提高。
图8、脑毛细血管内皮细胞bEND.3对Fluorescein标记A7R糖肽的摄取
图A和图B分别为Fluorescein标记的9G-A7R、9,10G-A7R、12G-A7R及A7R与 bEND.3细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，可见bEND.3细胞对9G-A7R、9,10G-A7R、12G-A7R的摄取明显高于游离荧光素和A7R。
图9、大鼠原代脑血管内皮细胞BCEC对Fluorescein标记A7R糖肽的摄取
图A和图B分别为Fluorescein标记的9G-A7R、9,10G-A7R、12G-A7R及A7R与BCEC 细胞作用4h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，可见BCEC细胞对9G-A7R、 9,10G-A7R、12G-A7R的摄取明显高于游离荧光素和A7R。
图10、脑胶质瘤细胞U87对Fluorescein标记A7R糖肽的摄取
图A和图B分别为Fluorescein标记的9G-A7R、9,10G-A7R、12G-A7R及A7R与U87 细胞作用1h后的激光共聚焦照片和流式细胞荧光检测结果，可见U87细胞对9G-A7R、9,10G-A7R和A7R的摄取无明显差异，均显著高于游离荧光素。
图11、Cy7标记的A7R糖肽对正常小鼠的脑靶向性
图A和图B分别为正常小鼠尾静脉注射Cy7标记的9G-A7R、9,10G-A7R、12G-A7R 及A7R后0.5h的成像照片以及荧光半定量结果，结果可见9G-A7R、9,10G-A7R和12G-A7R 在小鼠脑内具有很强的荧光，与A7R具有显著性差异，说明A7R糖肽具有良好的脑靶向能力。
图12、9G-A7R-Cy7在U87皮下瘤裸鼠的分布
图A和图B为U87皮下瘤裸鼠尾静脉注射Cy7标记的9G-A7R和A7R后1h的成像照片以及荧光半定量结果，由图可见，9G-A7R在小鼠肿瘤部位分布明显高于A7R。图13、9G-A7R-Cy7在U87原位瘤小鼠的分布
图A和图B为U87原位瘤小鼠尾静脉注射Cy7标记的9G-A7R和A7R后1h的成像照片以及荧光半定量结果，由图可见，9G-A7R在裸鼠脑内分布明显高于A7R，且主要聚集在脑肿瘤部位。
图14、bEDN.3细胞对9G-A7R-Disk-FITC的摄取
图为bEND.3细胞与脂质圆盘作用4h后的激光共聚焦照片，由图可见，bEND.3细胞对9G-A7R修饰的脂质圆盘的摄取量显著高于无靶脂质圆盘和A7R修饰的脂质圆盘。图15、U87细胞对9G-A7R-Disk-FITC的摄取
图为U87细胞与脂质圆盘作用1h后的激光共聚焦照片，由图可见，U87细胞对9G-A7R修饰的脂质圆盘和A7R修饰的脂质圆盘的摄取量均显著高于无靶脂质圆盘，且两者之间无明显差异。
图16、U87肿瘤球和BBB/U87肿瘤球对9G-A7R-Disk-FITC的摄取
图A和图B分别为9G-A7R-Disk-FITC与U87肿瘤球或BBB/U87肿瘤球作用4h 后的激光共聚焦照片，由图可见，在两种模型中，U87肿瘤球对9G-A7R修饰的脂质圆盘的摄取量显著高于无靶脂质圆盘和A7R修饰的脂质圆盘。
图17、9G-A7R-Disk/DiR在U87皮下瘤裸鼠体内分布
图A和图B分别为U87皮下瘤裸鼠尾静脉注射9G-A7R-Disk/DiR后4h的离体组织荧光分布图和荧光半定量图，结果表明，9G-A7R修饰的脂质圆盘能更好地靶向至肿瘤部位。
图18、9G-A7R-Disk/DiR在U87原位瘤裸鼠体内分布
图A为U87原位瘤裸鼠尾静脉注射9G-A7R-Disk/DiR后不同时间点的U87原位瘤小鼠脑部的在体荧光分布图，图B为荧光半定量图，图C为注射12h后的离体脏器荧光图像，结果表明，9G-A7R修饰的脂质圆盘在脑肿瘤部位的分布明显高于A7R修饰的脂质圆盘和无靶脂质圆盘，且在4h左右分布达峰值。
图19、载紫杉醇脂质圆盘的粒径和电镜照片
图A-C和图D-F分别为各紫杉醇脂质圆盘的冷冻透射电镜照片和粒径分布图，由图可见，各脂质圆盘大小和形态均无显著差异，呈圆盘状，粒径约为60nm左右。
图20、载紫杉醇脂质圆盘的体外抗U87细胞活性曲线
图为9G-A7R-Disk/PTX、A7R-Disk/PTX、Disk/PTX和Taxol抗U87细胞的活性曲线，结果表明U87细胞给药72h后，其IC50分别为26.36、38.85、74.90、和43.66nM。各脂质圆盘均具能抑制U87细胞的体外生长，其中9G-A7R-Disk/PTX的体外抗U87活性最佳，分别为Disk/PTX、A7R-Disk/PTX的2.84倍和1.47倍。
图21、载紫杉醇脂质圆盘体外对新生血管和拟态血管形成的抑制
图A为9G-A7R-Disk/PTX、A7R-Disk/PTX、Disk/PTX和Taxol对新生血管和拟态血管体外模型抑制的照片，图B和图C为各组血管样结构的形成率统计结果。相比于 Disk/PTX，9G-A7R-Disk/PTX和A7R-Disk/PTX均显著抑制新生血管和拟态血管的形成 (*p<0.05，**p<0.005，***p<0.001)。
图22、载紫杉醇脂质圆盘的抗原位瘤药效
图为各组裸鼠的中位生存曲线，其中Saline、Taxol、Disk/PTX、A7R-Disk/PTX和9G-A7R-Disk/PTX组小鼠的中位生存时间分别为25.5、26.5、28.5、28和33.5天。结果表明，9G-A7R-Disk/PTX的体内抗原位瘤药效显著优于A7R-Disk/PTX(n＝9，*p<0.05， ***p<0.001)。
图23、TUNEL和CD31/PAS染色结果
图A为Saline、Taxol、Disk/PTX、A7R-Disk/PTX和9G-A7R-Disk/PTX给药组小鼠肿瘤TUNEL和CD31/PAS染色照片，图B为新生血管抑制率统计结果，图C为阳性凋亡细胞率的统计结果，结果表明9G-A7R-Disk/PTX促进肿瘤凋亡和抑制新生血管形成的效果更优。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。
实施例1
A7R糖肽、A7R糖肽-Fluorescein、A7R糖肽-Cy7、A7R糖肽-DTPA-Gd、A7R糖肽-DTPA-99mTc、A7R糖肽-药物、A7R糖肽-PEG-DSPE的合成与表征
1.葡萄糖基化苏氨酸Fmoc-Thr(O-β-Glu(OAc)4)合成与表征
Fmoc-Thr(O-β-Glu(OAc)4)的合成步骤如附图1所示，将Fmoc保护的苏氨酸(Fmoc-Thr-OH)与全乙酰化葡萄糖(2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖)溶于CH2Cl2中，冰浴条件下缓慢逐滴加入BF3·Et2O，直至溶液变为澄清，室温条件下继续搅拌，薄层色谱板监测反应程度(展开剂为CH2Cl2:CH3OH＝15：1)。冰浴条件下，逐滴加入等体积的1M盐酸溶液终止反应。萃取三次，收集下层有机相，无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸发去除有机试剂，得粘稠状黄色粗品。以甲醇/乙酸乙酯为洗脱剂，经硅胶层析柱纯化并收集纯品。以HPLC表征纯度，ESI-MS表征产物分子量，结果如图2所示； 2.A7R糖肽的合成与表征
采用Fmoc固相多肽合成法合成A7R糖肽：9G-A7R：氨基酸序列为9(Glu-Thr)8C7A6T5W4L3P2P1R；9,10G-A7R：氨基酸序列为10(Glu-Thr)9(Glu-Thr)8C7A6T5W4L3P2P1R；12G-A7R：氨基酸序列为12(Glu-Thr)11G10G9G8C7A6T5W4L3P2P1R，合成步骤如附图3所示；
首先将Fmoc树脂用DMF溶胀30min，再用20％哌啶的DMF溶液脱除树脂上的 Fmoc保护基，共两次，每次15min，接着将Fmoc保护氨基酸溶解在HBTU/HOBT的 DMF溶液中，加入DIEA，37℃条件下与树脂反应1h后，DMF洗涤，继续用20％哌啶脱保护，依次按照多肽的氨基酸序列重复反应步骤，待氨基酸反应完成后，用80％水合肼的甲醇溶液脱除Glu上的乙酰基，共2次，每次1h，以切割试剂 (TFA/TIPS/H20＝95/2.5/2.5，体积比)从树脂中切割下多肽，经冰乙醚沉淀后过滤并收集多肽粗品，用40％乙腈溶解后，经制备液相纯化、冻干后得多肽纯品；HPLC和ESI-MS 表征多肽纯度和分子量，结果如图4所示；
3.A7R糖肽-Fluorescein和A7R糖肽-Cy7的合成与表征
将A7R糖肽溶于0.1M的PBS溶液中(pH7.2)，Fluorescein-5-maleimide或 Cy7-maleimide溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC监测，待多肽反应完全后停止反应，制备液相纯化，用乙腈/水(含0.1％TFA)体系分离纯化，冷冻干燥得Fluorescein 标记或Cy7标记的A7R糖肽(9G-A7R-Fluorescein、9,10G-A7R-Fluorescein、12G-A7R-Fluorescein、9G-A7R-Cy7、9,10G-A7R-Cy7、12G-A7R-Cy7)，质谱图如图5所示；
4.制备A7R糖肽-DTPA-Gd和A7R糖肽-DTPA-99mTc
maleimide-DTPA溶于DMF，同上与A7R糖肽的PBS溶液混合搅拌反应，制备液相纯化，冷冻干燥得A7R糖肽-DTPA纯品，螯合Gd或99mTc即得A7R糖肽-DTPA-Gd 或A7R糖肽-DTPA-99mTc；
5.制备A7R糖肽-药物复合物
9G-A7R-阿霉素复合物制备作为A7R糖肽连接含酮或醛基药物的实施例：9G-A7R 溶于磷酸盐缓冲液(0.1mM，pH 7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，于 4℃搅拌20min，然后加入4倍摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h。反应液用制备液相纯化，冷冻干燥得9G-A7R-阿霉素复合物；
以9G-A7R-紫杉醇复合物作为A7R糖肽以二硫键连接含羟基或氨基药物的实施例：紫杉醇溶于氯仿中，冷却至0-5℃，先后加入DCC及3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜，反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝50:1-15:1，V/V洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物，紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在 5mLDMF中，1.5倍摩尔量的9G-A7R溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5，将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至糖肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相纯化冻干得A7R糖肽-紫杉醇复合物；
以9G-A7R-硼替佐咪复合物作为A7R糖肽连接含硼酸基团药物的实施例：依照A7R糖肽的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，20％哌啶脱去氮端的Fmoc保护。加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min，洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以HBTU/DIEA 为缩合剂，于室温反应1h。树脂用TFA切割，并经制备型HPLC纯化得9G-A7R-多巴胺衍生物，在pH7.4的缓冲液中，A7R糖肽-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1:1混合即得AT-硼替佐咪复合物；
以9G-A7R-PMI融合多肽作为A7R糖肽连接多肽药物的实施例：直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定9G-A7R-PMI多肽序列后，按与制备A7R糖肽相同的方法依次接入氨基酸，经TFA切割并纯化后得9G-A7R-PMI复合物；
6.A7R糖肽-PEG-DSPE的合成与表征
以9G-A7R-PEG-DSPE作为A7R糖肽-PEG-DSPE的实施例：将9G-A7R溶于0.1M 的PBS溶液中(pH7.2)，Mal-PEG-DSPE溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC 监测，待Mal-PEG-DSPE反应完全后停止反应，过量的9G-A7R和DMF透析(截留分子量3.5kDa)除去，冷冻干燥得9G-A7R-PEG-DSPE，NMR表征其结构(如图6所示)。
实施例2 A7R糖肽的血清稳定性考察
将9G-A7R、9,10G-A7R和12G-A7R分别配置成1mg/mL的PBS溶液，取0.1mL加入0.9mL的25％大鼠血清，再加入10μL的1％TCEP的EDTA溶液，置于37℃摇床中 100rpm振摇，分别在0、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24h取0.1mL反应液，加20μL 15％的TCA沉淀蛋白，涡旋，4℃静置20min后，12000rpm离心10min，取上清液20μL进行HPLC定性及定量分析，血清稳定性结果(如图7所示)表明，9G-A7R、9,10G-A7R 和12G-A7R具有比A7R更好的血清稳定性。
实施例3 A7R糖肽的体外细胞靶向性验证
A7R糖肽对脑毛细血管内皮细胞的体外靶向性：取对数生长期的脑毛细血管内皮细胞(bEND.3)，用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×105个细胞接种于12孔培养板中，每孔体积1mL，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养24h后，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制浓度为5μM的9G-A7R-Fluorescein、9,10G-A7R-Fluorescein、12G-A7R-Fluorescein，将培养板中的培养液吸出，分别加入上述溶液，37℃孵育4h。用 PBS溶液洗三次，甲醛固定液固定细胞，DAPI进行细胞核染色后，激光共聚焦观察细胞摄取情况，另用PBS洗三次后，进行流式细胞仪分析，结果如图8所示；
A7R糖肽对脑毛细血管内皮细胞的体外靶向性：提取大鼠原代脑毛细血管内皮细胞 (BCEC)，同上试验，结果如图9所示；
A7R糖肽对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性：取对数生长期的单层培养的脑胶质瘤细胞(U87细胞)，同上试验，结果如图10所示。
实施例4
A7R糖肽正常小鼠体内脑靶向性验证：
将9G-A7R-Cy7、9,10G-A7R、12G-A7R和A7R-Cy7分子配置成100μM的溶液，ICR 小鼠尾静脉注射100μL。0.5h后，麻醉小鼠，用生理盐水灌流，小动物活体成像仪观察脑肿瘤的荧光分布(如图11A所示)并进行荧光半定量计算(如图11B所示)；
A7R糖肽体内皮下瘤靶向性验证：
首先构建皮下瘤动物模型，将处于对数生长期的U87细胞胰酶消化，以100μL细胞浓度为3×107个/mL接种至裸小鼠右背侧近腋部皮下，定期观察肿瘤大小，待肿瘤大小为200mm3时，筛选出无坏死、肿瘤形状规则的荷瘤裸鼠，分组进行试验。以0.15μmoL/ 只的剂量将9G-A7R-Cy7及A7R-Cy7溶液通过尾静脉注入荷瘤裸鼠动物模型体内，1h 后处死裸鼠，取出肿瘤，用活体成像仪检测肿瘤的荧光分布(如图12A所示)并进行荧光半定量计算(如图12B所示)；
A7R糖肽体内原位瘤靶向性验证：
将20g左右的裸鼠用8％的水合氯醛麻醉后，固定于脑立体定位仪上，微量注射器吸取5μL的U87细胞悬液(6×105个细胞)，接种于小鼠纹状体部位(前囟向前0.6mm，向右1.8mm，纵深3mm)，构建胶质瘤原位小鼠模型，种瘤后第7天，分别尾静脉给予小鼠相同荧光强度的9G-A7R-Cy7和A7R-Cy7的溶液。1h后，麻醉小鼠，用生理盐水灌流，小动物活体成像仪观察脑肿瘤的荧光分布(如图13A所示)并进行荧光半定量计算(如图13B所示)。
实施例5 A7R糖肽修饰脂质圆盘体外细胞靶向性验证
制备FITC标记脂质圆盘：
FITC标记的9G-A7R修饰的脂质圆盘(9G-A7R-Disk-FITC)膜材料处方为 POPC/Chol/mPEG2000-DSPE/FITC-PEG3400-DSPE/9G-A7R-PEG-DSPE(35:40:21:2:2， mol/mol)，FITC标记的A7R修饰的脂质圆盘(A7R-Disk-FITC)膜材料处方为 POPC/Chol/mPEG2000-DSPE/FITC-PEG3400-DSPE/A7R-PEG-DSPE(35:40:21:2:2， mol/mol)，FITC标记的空白脂质圆盘(Disk-FITC)膜材料处方组成为 POPC/Chol/mPEG2000-DSPE/FITC-PEG3400-DSPE(35:40:23:2,mol/mol)。采用薄膜水化法制备脂质圆盘，将处方量的膜材混合溶于三氯甲烷中，于40℃水浴中缓慢旋转蒸发去除有机试剂，在瓶壁上形成均匀的薄膜，置于真空干燥箱内干燥24h，加入1mL的PBS，于37℃摇床中振摇水化30min，探头超声45min，最后经0.22μm滤膜过滤，得到各FITC 标记的脂质圆盘；
脂质圆盘对脑毛细血管内皮细胞(bEND.3)的体外靶向性：
用含10％FBS的DMEM配置浓度为5μM的9G-A7R-Disk-FITC、A7R-Disk-FITC 和Disk-FITC，以A7R糖肽相同的方法考察脂质圆盘对脑毛细血管内皮细胞(bEND.3) 的体外靶向性，结果如图14所示；
脂质圆盘对脑胶质瘤细胞U87的体外靶向性：
取对数生长期的单层培养的人脑胶质瘤细胞U87，同上试验，结果如图15所示；
脂质圆盘被U87肿瘤球的摄取：
用无血清培液配置2％的低分子琼脂糖溶液，于高压灭菌30min后，趁热铺入48 孔板中，每孔150μL，置于紫外下继续照射30min使之降温凝固。消化U87细胞，每孔接种4000个细胞，沿同一方向振摇孔板使细胞成团，将48孔板置于培养箱中继续培养7天，即可形成U87肿瘤球。吸弃肿瘤球的培养液，加入相同荧光强度的9G-A7R-Disk-FITC、A7R-Disk-FITC和Disk-FITC。于37℃孵育4h后取出肿瘤球，PBS 洗涤3次后，用4％多聚甲醛固定30min，将肿瘤球置于共聚焦皿中，采用共聚焦显微镜断层扫面拍照，结果如图16A所示；
提取大鼠原代脑血管内皮细胞铺于transwell上室。再将U87肿瘤球放置在transwell 下室、构建体外BBB/U87肿瘤球模型，用细胞配液配置相同荧光强度的Disk-FITC、 A7R-Disk-FITC和9G-A7R-Disk-FITC溶液，加入transwell上室，给药4h后，取出下室肿瘤球，PBS洗涤3次后，用4％多聚甲醛固定30min，将肿瘤球置于共聚焦皿中，采用共聚焦显微镜断层扫面拍照，结果见如图16B所示。
实施例6A7R糖肽修饰脂质圆盘体内靶向性验证
载DiR脂质圆盘的制备：
载DiR的9G-A7R修饰的脂质圆盘(9G-A7R-Disk/DiR)膜材料处方为 POPC/Chol/mPEG2000-DSPE/9G-A7R-PEG-DSPE(35:40:23:2，mol/mol)，载DiR的A7R 修饰的脂质圆盘(A7R-Disk/DiR)膜材料处方为 POPC/Chol/mPEG2000-DSPE/A7R-PEG-DSPE(35:40:23:2，mol/mol)，载DiR的空白脂质圆盘(Disk/DiR)膜材料处方为POPC/Chol/mPEG2000-DSPE/(35:40:25，mol/mol)：将上述膜材料及DiR溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥24h，加入1mL的PBS，于37℃摇床中振摇水化30min，探头超声45min，经0.22μm滤膜过滤，然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50柱分离除去未包封的DiR，得到各载DiR的脂质圆盘；
9G-A7R-Disk/DiR体内皮下瘤靶向性验证：
构建皮下瘤动物模型，待肿瘤大小为200mm3时，筛选出无坏死、肿瘤形状规则的荷瘤裸鼠，分组进行试验，分别尾静脉给予小鼠相同荧光强度的9G-A7R-Disk/DiR、 A7R-Disk/DiR和Disk/DiR溶液，4h后处死裸鼠，取出肿瘤，用活体成像仪检测肿瘤的荧光分布(如图17A所示)并进行荧光半定量计算(如图17B所示)；
9G-A7R-Disk/DiR体内原位瘤靶向性验证：
构建胶质瘤原位小鼠模型，种瘤后第7天开始实验，分别尾静脉给予小鼠相同荧光强度的9G-A7R-Disk/DiR、A7R-Disk/DiR和Disk/DiR溶液，分别在1、2、4、8、12h 时用小动物活体成像仪观察小鼠脑部荧光分布情况，并记录脑肿瘤部位荧光强度随时间变化并进行荧光半定量计算，解剖小鼠并检测小鼠主要脏器的荧光分布(如图18所示)。
实施例7载紫杉醇的A7R糖肽修饰脂质圆盘体外药效学试验
载紫杉醇脂质圆盘的制备及表征：
脂质圆盘膜材料处方同上述DiR脂质圆盘的制备，将DiR替换为紫杉醇即制备得各载紫杉醇的脂质圆盘(9G-A7R-Disk/PTX、A7R-Disk/PTX和Disk/PTX)，冷冻透射电镜法观察脂质圆盘形态(如图19A-C所示)，动态光散射法测定粒径分布(如图19D-F 所示)；
载紫杉醇脂质圆盘的体外药效试验：
采用MTT法评价载药脂质圆盘对U87细胞的抑制作用：取对数期生长的U87细胞，消化并计数，以每孔5000个细胞接种于96孔板中，置于培养箱中孵育24h，加入不同 PTX浓度的Taxol、Disk/PTX、A7R-Disk/PTX和9G-A7R-Disk/PTX，PTX浓度范围为 0.03～500ng/mL，每个浓度设立三个复孔，同时预留不加任何样品的细胞培养液作为阴性对照，将96孔板置于培养箱中孵育72h后，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续孵育4h，吸弃孔内培养液并在每孔中加入150μL DMSO，振荡15min使孔底部蓝紫色结晶充分溶解，酶标仪测定各孔在490nm波长下的吸光度，计算各孔细胞存活率和半数抑制浓度(IC50)，U87细胞体外生长抑制曲线如图20所示；
载紫杉醇脂质圆盘对小管形成抑制试验：
预先将Matrigel置于4℃中使之融化，向24孔板中每孔加100μL的Matrigel，将 24孔板放置于37℃培养箱中使Matrigel固化，消化U87或HUVEC细胞，以20万细胞/孔接种于铺有Matrigel的孔板中，分别加入PTX浓度为100nM的Taxol、Disk/PTX、 A7R-Disk/PTX和9G-A7R-Disk/PTX溶液，以生理盐水为对照，细胞与药物共培养12h 后，观察小管形成抑制情况，结果如图21所示。
实施例8载紫杉醇脂质圆盘体内药效试验
载紫杉醇脂质圆盘对原位瘤抑制试验：
取5×105个对数期生长的U87细胞分散于5μL PBS中，接种在裸鼠的纹状体部位(前囟向前0.6mm，向右1.8mm，纵深3mm)，建立U87原位移植瘤模型，将小鼠随机分成Saline、Taxol、Disk/PTX、A7R-Disk/PTX和9G-A7R-Disk/PTX 5组，每组9只。在种瘤后第6天开始尾静脉给药，PTX的总剂量为25mg/kg，每两天给药一次，共给药 5次，每天观察小鼠生存状态，绘制生存曲线(如图22所示)；
载紫杉醇脂质圆盘促凋亡试验：
上述荷瘤裸鼠经过五次给药后，处死取出原位肿瘤固定，石蜡包埋切片，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TDT)介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidylTransferase-mediated dUTPnick endlabeling，TUNEL)检测肿瘤细胞的凋亡程度，步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水；PBS漂洗3次，每次3min；0.3％H2O2溶液室温处理20min； 20μg/mL蛋白酶K 37℃消化20min；PBS漂洗3次，每次3min；每张切片滴加TUNEL 混合液(TDT和biotin-dNTP)30μL置于湿盒中37℃孵育60min；PBS漂洗3min共3 次；Streptavidin-HRP(1:200)37℃孵育30min；PBS漂洗3次，每次3min；0.04％DAB +0.03％H2O2溶液显色10min，水洗；苏木素衬染1min，水洗蓝化；吹干后常规树脂封片，阳性结果为细胞核呈棕黄色或棕褐色细胞核内棕色颗粒阳性即判定为凋亡细胞，普通光学显微镜下连续观察5个高倍视野计数阳性细胞数，视野内细胞中阳性细胞数所占的百分比为凋亡指数，结果如图23A、C所示；
载紫杉醇脂质圆盘对肿瘤血管抑制试验：
同上取出皮下瘤固定，石蜡包埋切片，进行CD31免疫组化染色与PAS双染，在普通光学显微镜下连续观察3个高倍视野计数CD31阳性血管数，结果如图23A、B所示。

Claims (13)

1.一种A7R糖肽，其特征为，所述的A7R糖肽由糖基和A7R多肽两部分共价连接组成；所述的糖基是单糖或寡糖，选自半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖或葡萄糖；所述的A7R多肽是包含L构型氨基酸序列LALTLWLLLPLPLR和D构型氨基酸序列DRDPDPDLDWDTDA的多肽及其衍生物。
2.按权利要求1所述的A7R糖肽，其特征在于，引入巯基后与含有马来酰亚胺基团的影像物质反应，制得A7R糖肽-X复合物。
3.按权利要求2所述的A7R糖肽，其特征在于，所述的A7R糖肽-X复合物中，X是荧光物质Fluorescein，近红外染料Cy7、IR820、DiR，磁共振影像剂Gd-DTPA或放射影像剂99mTc-DTPA，用作脑部肿瘤或外周肿瘤的影像诊断和示踪。
4.按权利要求1所述的A7R糖肽，其特征是，通过pH敏感的腙键、pH敏感的硼酸脂键或二硫键与治疗药物连接，或直接与多肽药物缩合，获得A7R糖肽-Y复合物。
5.按权利要求4所述的A7R糖肽，其特征是，所述的A7R糖肽-Y复合物中，Y是抗肿瘤药物，选自阿霉素和表阿霉素蒽环类药物、紫杉醇和多烯紫杉醇和卡巴他赛紫杉烷类药物、喜树碱和羟基喜树碱和伊立替康喜树碱类药物、长春新碱和长春瑞滨长春花碱类药物、硼替佐米佐米类药物或p53激活肽多肽类药物，用作脑部肿瘤或外周肿瘤的靶向治疗。
6.按权利要求1所述的A7R糖肽，其特征是，引入巯基后与马来酰亚胺化的聚乙二醇-Z复合物连接，制得A7R糖肽-聚乙二醇-Z复合物。
7.按权利要求6所述的A7R糖肽，其特征是，所述的A7R糖肽-聚乙二醇-Z复合物中，Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)和/或聚己内酯(PCL)。
8.按权利要求7所述的A7R糖肽，其特征是，所述的A7R糖肽-聚乙二醇-磷脂复合物用于制备脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统或脂质圆盘递药系统。
9.按权利要求7所述的A7R糖肽，其特征是，所述的A7R糖肽-聚乙二醇-聚乳酸复合物、A7R糖肽-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物、A7R糖肽-聚乙二醇-聚己内酯复合物用于制备聚合物胶束递药系统或纳米粒递药系统。
10.按权利要求8或9所述的A7R糖肽，其特征是，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、脂质圆盘递药系统或纳米粒递药系统用于包载诊断药物。
11.按权利要求10所述的A7R糖肽，其特征是，所述的递药系统包载的诊断药物是荧光物质香豆素6、FAM，近红外染料Cy7、IR820、DiR、DiD或磁共振影像剂Gd-DTPA，用于脑部肿瘤或外周肿瘤的影像诊断和示踪。
12.按权利要求8或9所述的A7R糖肽，其特征是，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、脂质圆盘递药系统或纳米粒递药系统包载肿瘤治疗药物。
13.按权利要求12所述的A7R糖肽，其特征是，所述的递药系统所包载的肿瘤治疗药物是阿霉素或表阿霉素蒽环类药物、紫杉醇或多烯紫杉醇或卡巴他赛紫杉烷类药物、喜树碱或羟基喜树碱或伊立替康喜树碱类药物、长春新碱或长春瑞滨长春花碱类药物、硼替佐米或卡非佐米蛋白酶体抑制剂、小白菊内酯内酯类药物、p53激活肽或蜂毒肽、蝎毒肽或抗菌肽多肽类药物，用于脑部肿瘤或外周肿瘤的靶向治疗。
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