CN103705939B - 两亲性熊果酸-多糖偶联物的制备及其在肿瘤治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的两亲性熊果酸-多糖偶联物的制备及其应用。熊果酸通过化学改造将C3位的羟基取代为氨基，所生成的氨基化的熊果酸化学偶联到多糖骨架上，形成两亲性熊果酸-多糖偶联物，在水中可以自组装成纳米胶束，其特征包括：1)通过化学改造的熊果酸的抗肿瘤活性明显增强；2)疏水基团所形成的疏水内核可以物理包裹抗肿瘤药物，明显改善抗肿瘤药物的溶解性；3)通过化学偶联熊果酸及物理包裹其他抗肿瘤药物，可实现联合化疗，增强抗肿瘤活性，达到联合增效的作用，降低毒性。本发明制备方法简单，容易操作，产率较高，容易实现工业化。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及两亲性熊果酸-多糖偶联物的制备及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
在当今全球范围内，癌症已经成为人类死亡的主要原因。世界卫生组织指出，目前癌症每年在全球夺取700多万人的生命，而且这一数字还会继续上升。因此，对于癌症的治疗和研究刻不容缓，是新世纪人类急需解决的难题。目前，癌症的治疗手段主要是手术治疗和化学药物治疗，但是手术治疗只能切除肉眼可见的肿瘤，化疗药物的水溶性较差，口服生物利用度低，体内代谢较快，对癌细胞缺乏靶向性，具有较大的毒副作用。
熊果酸是一种弱酸性五环三萜类化合物，具有抗氧化、抗炎、保肝、降血脂等作用。近年来发现，熊果酸能够抑制多种恶性肿瘤细胞的生长。体外研究表明，熊果酸可抑制血管生成，是很强的血管生成抑制剂。用20％胎牛血清的培养液使血管内皮细胞(VEC)呈指数生长状态，137.06～1096.5μmol·L-1的熊果酸对VEC增殖具有抑制作用，并有剂量依赖性。李希波等人研究发现熊果酸对裸鼠肺腺癌移植瘤生长有抑制作用，其机制可能与降低移植瘤促血管生成因子VEGF的表达、抑制新生血管的形成和促进肿瘤细胞凋亡有关。此外，熊果酸对多种肿瘤细胞具有明显的诱导细胞凋亡作用而被人们重视，研究增多。例如，熊果酸通过Caspase-3，8，9诱导HT-29细胞凋亡，通过p53通路诱导人小细胞肺癌A459凋亡等。研究发现，熊果酸C3位羟基和C17位羧基是熊果酸维持抗肿瘤活性的关键基团。将熊果酸C3位羟基取代为NH2后，其对人原髓白血病HL-60细胞、人胃癌BGC细胞、人肝癌Bel-7402细胞及Hela细胞的ED50分别为2.0、2.5、1.7、和2.4mg／L，熊果酸则为72.0、53.7、45.0和49.4mg/L。因此，分析其构效关系可知，将熊果酸C3位的羟基取代为NH2后，熊果酸的抗肿瘤活性显著增强。此外，熊果酸资源广，毒性反应少，越来越受到大家的关注。但是，熊果酸难溶于水，导致其制剂制备困难和生物利用低等问题，因此提高难溶性熊果酸的溶解度，进而提高其生物利用度成为一个热点和难点。
多糖是所有生命有机体的重要组成部分，在控制细胞分裂，诱导细胞分化以及维持生命体正常代谢方面有着重要的意义。此外，由于多糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，主链结构由于存在大量的活性基团(如羧基和氨基等)易于化学修饰而改善其理化性质等优点，被越来越多的修饰成两亲性偶联物。例如，透明质酸是一种由葡萄醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖单位反复交替连接构成的线性大分子粘多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性、高粘弹性，并且能与细胞表面某些特异性受体专一性结合，因此，经透明质酸改造的药物载体具有良好的生物相容性、靶向性、缓释性以及高载药量等优势。肝素及其衍生物是由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成酸性粘多糖硫酸酯，具有良好的水溶性，因其结构上含有大量的羟基和羧基，易于进行结构修饰。
药物-多糖偶联物是将疏水性的化疗药物和水溶性多糖通过化学共价键偶联形成高分子药物，其主要优势在于：对实体瘤具有倾向性沉积作用，即EPR效应；延长药物在血液的循环时间，避免网状内皮系统的吞噬；改善疏水性药物可溶性等。例如，将熊果酸与透明质酸偶联，所形成的两亲性熊果酸-透明质酸偶联物，其不仅可以在水中发生自组装，形成内部疏水外部亲水的胶束结构，增加熊果酸的水溶性，还可以通过与细胞表面透明质酸受体特异性结合的能力以及透明质酸受体介导的内吞作用，实现药物的主动靶向传递。肝素及其衍生物具有抑制肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长和转移等作用，因此，熊果酸-肝素偶联物不仅可解决熊果酸的溶解性问题，亦可发挥协同抗肿瘤作用，增强其抑制肿瘤生长的活性。
两亲性熊果酸-多糖偶联物可以在水溶液中自组装，形成内部疏水、外部亲水的胶束结构，其疏水性的内核可以装载疏水性的药物，达到增溶的目的。多糖通过化学偶联氨基化的熊果酸，以及物理包裹其他抗肿瘤药物，可以达到协同治疗的效果，从而提高疗效。因此，两亲性熊果酸-多糖偶联物不仅可以单独用作制备高分子药物，还可以作为药学活性或药理活性分子的载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种熊果酸-多糖类两亲性偶联物，通过化学改造将熊果酸结构上的羟基取代为氨基并且通过化学偶联的方法，将疏水性的氨基化的熊果酸接枝到多糖骨架上，形成两亲性熊果酸-多糖偶联物。同时，该偶联物是是安全性好、载药量高、生物活性好的抗肿瘤药物载体。该体系显著增强了熊果酸的抗肿瘤活性，而且大大提高了熊果酸的水溶性，避免了网状内皮系统的吞噬，延长其在体内的循环时间，提高了熊果酸的生物利用度。本发明使熊果酸和多糖的应用具有更广阔的产业化前景。
本发明的另一个目的是提供上述两亲性熊果酸-多糖偶联物的制备方法。
本发明的还有一个目的是提供上述两亲性熊果酸-多糖偶联物在抗肿瘤中的应用。
为了达到上述发明目的，本发明提供一种两亲性熊果酸-多糖偶联物，该体系将熊果酸C3位上的羟基取代成氨基，形成氨基化的熊果酸。在多糖的羧基上，通过化学偶联的方法，引入氨基化的熊果酸，形成两亲性熊果酸-多糖偶联物。由于对熊果酸进行了化学改造，所形成的氨基化的熊果酸的抗肿瘤活性显著增加，并且由于在亲水性的多糖骨架上引入了疏水基团，增加了其两亲性，故两亲性熊果酸-多糖偶联物能在水中自组装形成纳米胶束，提高了熊果酸的水溶性和稳定性，延长其在血液中的循环时间，增加熊果酸的抗肿瘤作用。
所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其中多糖选自低分子量肝素、脱硫酸化肝素、未分级肝素、透明质酸、海藻酸、软骨素、多硫酸化软骨素、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、季铵化羧甲基壳聚糖、N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖、羧甲基葡聚糖或羧甲基香菇多糖。
所述的两亲性熊果酸-多糖的制备方法，包括以下步骤：
熊果酸通过氧化反应，将羟基氧化成羰基，所形成的3-羰基的熊果酸与盐酸羟胺溶解于吡啶中，反应生成白色固体，该白色固体与氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，乙酸钠(CH3COONa)和三氯化钛(TiCl3)溶解于甲醇中，反应生成氨基化的熊果酸。将多糖溶于反应溶剂中，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为活化剂，进行缩合反应将氨基化的熊果酸接枝到多糖骨架上。
所述的制备方法中，氧化反应的氧化剂为氯铬酸吡啶(PCC)，溶剂为二氯甲烷，或者氧化反应的氧化剂为琼斯(Jones)试剂，溶剂为二氯甲烷-丙酮。
所述的制备方法，其中反应溶剂选自水、或甲酰胺、或N,N-二甲基甲酰胺与水或甲酰胺与水、或N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂。
所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，可单独用作高分子药物，也可用作药学活性或者药理活性分子的药物载体。
所述的药学活性或者药理活性分子选自紫杉烷类、喜树碱类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类或维A酸类抗肿瘤药物。
所制备的高分子药物或包载疏水性药学活性或药理活性分子的两亲性熊果酸-多糖偶联物为注射剂、片剂、胶囊剂、口服溶液剂、贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或鼻用制剂。
该两亲性熊果酸-多糖偶联物制成载药纳米胶束的方法操作步骤如下：两亲性熊果酸-多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到两亲性多糖偶联物纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的抗肿瘤药物用药学上可接受的溶剂溶解，与所述的熊果酸-多糖纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂小分子得到粒径为10～1000nm的纳米胶束，得到的纳米胶束可直接应用，也可通过冷冻干燥或喷雾干燥制成固体制剂。
具体方案如下：
在多糖分子的骨架上引入氨基化的熊果酸，使其具有两亲性，在水性介质中可自组装成纳米胶束，其中疏水的氨基化熊果酸聚集成内核，而多糖分子形成亲水性外壳，故得到的纳米胶束具有性质稳定、有效地逃避网状内皮系统吞噬、高抗肿瘤活性等特征。同时，该两亲性熊果酸-多糖偶联物还是一种优良的药物载体，可物理包裹难溶性抗肿瘤药物。该偶联物作为药物载体，粒径在10～1000nm可控，均匀度好，再分散性好，载药量高。该偶联物可用于注射、口服、外用或粘膜给药。
所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物的具体制备方法如下：
一、氨基取代的熊果酸衍生物的合成
1.熊果酸用二氯甲烷溶解，一定温度下逐步滴入溶解有氧化剂的溶液中，室温搅拌一定时间。反应液经过滤，洗涤，水洗，干燥，过滤，浓缩后，硅胶柱层析洗脱、浓缩，得白色固体；
2.将反应1得到的白色固体和盐酸羟胺溶解于吡啶中，一定温度下回流一定时间。待反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体；
3.将反应2得到的白色固体、氰基硼氢化钠和乙酸钠，溶解于甲醇中，氮气保护下反应。冰浴条件下，缓慢滴加三氯化钛溶液，室温搅拌一定时间。将所得的白色浑浊液，加入适量的蒸馏水，旋去甲醇，调节溶液pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚的混合溶剂重结晶，得白色固体，即氨基化的熊果酸。
合成路线如下：
所述的反应1中，氧化剂为氯铬酸吡啶(PCC)，溶剂为二氯甲烷，或者氧化反应的氧化剂为琼斯(Jones)试剂，溶剂为二氯甲烷-丙酮。
所述的反应1中，所述的温度控制为-10～30℃。
所述的反应1中，室温搅拌时间为0.5～10h。
所述的反应1中，硅胶层洗脱条件为二氯甲烷∶甲醇=200∶1。
所述的反应2中，所述的温度控制为80～150℃。
所述的反应2中，所述的回流时间为2～24h。
所述的反应3中，所述的室温搅拌时间为2～36h。
二、两亲性熊果酸-多糖偶联物的合成
将多糖分子溶于反应溶剂，在氮气保护下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)为催化剂，加入氨基化的熊果酸，控制反应至反应完全，反应结束后，用沉淀剂沉淀，过滤得到沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得两亲性熊果酸-多糖偶联物。
合成路线如下：
所述的反应溶剂优选自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或N，N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂；所述的控制反应为先加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺活化剂反应0.2～2h后，再加入氨基化的熊果酸，室温反应6～72h；所述的沉淀剂为为冰丙酮、冰乙醚、冰乙酸乙酯或冰乙醇。
三、两亲性熊果酸-多糖偶联物胶束的制备方法
按每1mL水中溶解3～50mg的两亲性熊果酸-多糖偶联物的比例，将制得的两亲性熊果酸-多糖偶联物溶于水中，经超声或高压均质处理，制备成粒径为10～1000nm的两亲性偶联物胶束。
四、该两亲性熊果酸-多糖偶联物制成载药纳米胶束的方法
两亲性熊果酸-多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到熊果酸-多糖纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的抗肿瘤药物用药学上可接受的溶剂溶解，与所述的熊果酸-多糖纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂小分子得到粒径为10～1000nm的纳米胶束。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明将疏水性的氨基化的熊果酸接枝到多糖骨架上形成两亲性偶联物，明显提高了熊果酸的水溶性和稳定性，延长了其在血液循环中的时间，增加了其生物利用度。制备过程简单，操作容易，减少成本，提高效率，容易实现工业化。
(2)本发明对熊果酸的结构进行了改造，对于其结构C3位的羟基进行了氨基的取代，所得的氨基化的熊果酸的抗肿瘤活性显著增强。
(3)本发明提供的两亲性熊果酸-多糖偶联物，不仅具有多糖分子的良好的生物学特性，还能更好地发挥熊果酸的抗肿瘤、抗氧化、抗炎、保肝、降血脂的功效。
(4)本发明提供的两亲性熊果酸-多糖偶联物具有良好的生物相容性和生物可降解性，还有具有临界胶束浓度低、稳定性好、抗肿瘤活性强、毒副作用低的优势，且对疏水的抗肿瘤药物具有良好的增溶作用。
(5)本发明提供的两亲性熊果酸-多糖偶联物可单独用作制备高分子药物，也可作为药学活性或药理活性分子的载体，具有更广泛的应用空间；此外，借助两亲性熊果酸-多糖偶联物自组装形成的纳米胶束载体，可实现活化学和物理等多种途径载药，是一种非常有前途的靶向联合化疗的模式。通过化学偶联熊果酸计物理包裹其他抗肿瘤药物，可实现联合化疗药物作用机制的互补，增强抗肿瘤活性，达到联合增效的作用，也有利于降低毒性。
(6)本发明提供的两亲性熊果酸-多糖偶联物可用于口服、注射、外用或粘膜给药，具有高度安全性，粒径可控制在10～1000nm。
附图说明
图1：两亲性熊果酸-多糖偶联物和羧基氨基化的熊果酸-多糖偶联物对HUVEC小管形成的影响。
图2：MTT法测定两亲性熊果酸-多糖偶联物的抗肿瘤活性。
图3：两亲性熊果酸-多糖偶联物对不同肿瘤生长及抗肿瘤作用。
图4-1、4-2：MTT法测定载抗肿瘤药物的两亲性熊果酸-多糖偶联物的抗肿瘤活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1两亲性熊果酸-低分子量肝素偶联物的合成
300mg熊果酸用二氯甲烷溶解，10℃逐步滴入溶解有280mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌1.5h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体59.2mg和80mg盐酸羟胺溶解于7ml吡啶中，上接干燥管，115℃回流约6h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体120mg，1.03g氰基硼氢化钠，1.03g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.8ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌14h。将所得的白色浑浊液加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.9mmol低分子量肝素溶于甲酰胺溶液，3.6mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入低分子量肝素溶液中，活化15min后，将2.7mmol氨基化的熊果酸加入到低分子量肝素的溶液中。室温反应24h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例2两亲性熊果酸-脱硫酸化肝素偶联物的合成
250mg熊果酸用二氯甲烷溶解，12℃逐步滴入溶解有270mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌5h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体61.3mg和81mg盐酸羟胺溶解于8ml吡啶中，上接干燥管，110℃回流约7h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体150mg，1.2g氰基硼氢化钠，1.2g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.8ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌20h。将所得的白色浑浊液加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.1mmol脱硫酸化肝素溶于甲酰胺溶液，0.4mmol1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入脱硫酸化肝素溶液中，活化30min后，将0.4mmol氨基化的熊果酸加入到脱硫酸化肝素的溶液中。室温反应36h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例3两亲性熊果酸-未分级肝素偶联物的合成
250mg熊果酸用二氯甲烷溶解，5℃逐步滴入溶解有270mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌4h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体61.3mg和81mg盐酸羟胺溶解于8ml吡啶中，上接干燥管，90℃回流约13h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体150mg，1.2g氰基硼氢化钠，1.2g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.8ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌8h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.15mmol未分级肝素溶于甲酰胺溶液，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.6mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入未分级肝素溶液中，活化45min后，将0.25mmol氨基化的熊果酸加入到未分级肝素的溶液中。室温反应72h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例4两亲性熊果酸-透明质酸偶联物的合成
200mg熊果酸用二氯甲烷溶解，9℃逐步滴入溶解有187mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌2h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体60mg和80mg盐酸羟胺溶解于8ml吡啶中，上接干燥管，85℃回流约10h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体120mg，1.03g氰基硼氢化钠，1.03g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.6ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌5h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.5mmol透明质酸溶于N，N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)1.5mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入透明质酸溶液中，活化50min后，将1.5mmol氨基化的熊果酸加入到透明质酸的溶液中。室温反应24h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例5两亲性熊果酸-羧甲基壳聚糖偶联物的合成
250mg熊果酸用二氯甲烷溶解，11℃逐步滴入溶解有234mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌1h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体65mg和85mg盐酸羟胺溶解于10ml吡啶中，上接干燥管，120℃回流约14h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。，取该白色固体100mg，0.86g氰基硼氢化钠，0.86g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.75ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌30h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.2mmol羧甲基壳聚糖溶于水中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.8mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入羧甲基壳聚糖溶液中，活化80min后，将0.6mmol氨基化的熊果酸加入到羧甲基壳聚糖的溶液中。室温反应48h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例6两亲性熊果酸-羧乙基壳聚糖偶联物的合成
350mg熊果酸用二氯甲烷溶解，9℃逐步滴入溶解有320mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌2h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体79mg和106.7mg盐酸羟胺溶解于7ml吡啶中，上接干燥管，115℃回流约6h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。，取该白色固体160mg，1.38g氰基硼氢化钠，1.38g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，1.2m三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌36h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.3mmol羧乙基葡聚糖用水溶解，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)1.2mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入羧乙基葡聚糖溶液中，活化90min后，将0.9mmol氨基化的熊果酸加入到羧乙基葡聚糖的溶液中。室温反应40h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例7两亲性熊果酸-羧甲基葡聚糖偶联物的合成
300mg熊果酸用二氯甲烷溶解，11℃逐步滴入溶解有280mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌6h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体79mg和106.7mg盐酸羟胺溶解于9ml吡啶中，上接干燥管，140℃回流约20h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体160mg，1.38g氰基硼氢化钠，1.38g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，1.2ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌24h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.6mmol羧甲基葡聚糖用水溶解，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)2.4mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入羧甲基葡聚糖溶液中，活化60min后，将1.8mmol氨基化的熊果酸加入到羧甲基葡聚糖的溶液中。室温反应50h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例8两亲性熊果酸-羧甲基香菇多糖偶联物的合成
400mg熊果酸用二氯甲烷溶解，13℃逐步滴入溶解有374mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌7h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体60mg和80mg盐酸羟胺溶解于7ml吡啶中，上接干燥管，100℃回流约9h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体120mg，1.03g氰基硼氢化钠，1.03g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，1.2ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌32h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.3mmol羧甲基香菇多糖用水溶解，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)1.2mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入羧甲基香菇多糖溶液中，活化100min后，将0.9mmol氨基化的熊果酸加入到羧甲基香菇多糖的溶液中。室温反应70h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例9两亲性熊果酸-N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖偶联物的合成
400mg熊果酸用二氯甲烷溶解，6℃逐步滴入溶解有374mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌2h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体120mg和160mg盐酸羟胺溶解于15ml吡啶中，上接干燥管，115℃回流约10h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。，取该白色固体160mg，1.38g氰基硼氢化钠，1.38g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，1.2ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌20h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.2mmolN-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖用水溶解，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)1.0mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖溶液中，活化105min后，将0.9mmol氨基化的熊果酸加入到N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖的溶液中。室温反应50h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例10两亲性熊果酸-软骨素偶联物的合成
270mg熊果酸用二氯甲烷溶解，8℃逐步滴入溶解有252mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌9h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体53.3mg和72mg盐酸羟胺溶解于7ml吡啶中，上接干燥管，80℃回流约23h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体108mg，0.93g氰基硼氢化钠，0.93g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.7ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌34h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.1mol软骨素溶于甲酰胺溶液，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.3mol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入软骨素溶液中，活化85min后，将0.3mol氨基化的熊果酸加入到软骨素的溶液中。室温反应12h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例11两亲性熊果酸-多硫酸化软骨素偶联物的合成
300mg熊果酸用二氯甲烷溶解，8℃逐步滴入溶解有280mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌3h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体53.3mg和72mg盐酸羟胺溶解于7ml吡啶中，上接干燥管，115℃回流约6h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体120mg，1.03g氰基硼氢化钠，1.03g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.7mlTiCl3溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌22h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.15mmol多硫酸化软骨素溶于甲酰胺溶液，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.6mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入多硫酸化软骨素溶液中，活化60min后，将0.45mmol氨基化的熊果酸加入到多硫酸化软骨素的溶液中。室温反应52h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例12两亲性熊果酸-季铵化羧甲基壳聚糖偶联物的合成
250mg熊果酸用二氯甲烷溶解，10℃逐步滴入溶解有234mg氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌1h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体49.4mg(0.11mmol)和66.7mg(0.97mmol)盐酸羟胺溶解于7ml吡啶中，上接干燥管，115℃回流约7h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。取该白色固体100mg，0.86g氰基硼氢化钠，0.86g乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.75ml三氯化钛溶液缓慢滴加到反应液中，。滴加完毕后，室温搅拌30h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.2mmol季铵化羧甲基壳聚糖用水溶解，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)0.8mmol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入季铵化羧甲基壳聚糖溶液中，活化110min后，将0.6mmol氨基化的熊果酸加入到季铵化羧甲基壳聚糖的溶液中。室温反应66h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例13两亲性熊果酸-海藻酸偶联物的合成
240mg(0.53mmol)熊果酸用二氯甲烷溶解，9℃逐步滴入溶解有224mg(1.04mmol)氯铬酸吡啶的二氯甲烷溶液中。滴加完毕后，室温搅拌1.5h。反应液经过滤、洗涤、水洗、干燥、过滤、浓缩后，硅胶柱层析，洗脱、浓缩，得白色固体。取该白色固体47.4mg(0.11mmol)和64.02mg(0.93mmol)盐酸羟胺溶解于7ml吡啶中，上接干燥管，125℃回流约4h。反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体。，取该白色固体96mg(0.22mmol)，0.83g(7.69mmol)氰基硼氢化钠，0.83g(10mmol)乙酸钠，溶解于甲醇中，反应体系处于氮气保护下，排除体系内空气。体系置于冰浴中，0.72mlTiCl3溶液缓慢滴加到反应液中。滴加完毕后，室温搅拌36h。将所得的白色浑浊液，加入适量蒸馏水，旋去甲醇，用2M的NaOH溶液调节pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩。用甲醇、二氯甲烷和石油醚混合溶剂重结晶，得白色固体，即为氨基化的熊果酸。称取0.25mol海藻酸用氢氧化钠溶解，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)1.0mol溶于甲酰胺。在N2保护下，将EDC缓慢加入海藻酸溶液中，活化15min后，将0.75mol氨基化的熊果酸加入到海藻酸的溶液中。室温反应24h。停止反应后，加入过量的冷丙酮沉淀产物，抽滤，即得。产物用超纯水复溶，冰浴，探头超声30min，在蒸馏水中透析2d(MWCO=3500)，过0.8μm微孔滤膜，冷冻干燥，即得产物。
实施例14两亲性熊果酸-多糖偶联物纳米胶束的制备和表征
1.熊果酸-多糖纳米胶束的制备：称取两亲性熊果酸-多糖偶联物18mg溶解在3ml水中，于室温搅拌30min，然后冰浴下超声或高压均质后，0.8μm滤膜过滤，即得。
2.将1制备得到的两亲性熊果酸-多糖纳米胶束，取1mL用水稀释至3mL，用粒径仪(MalvemInstruments，Malvem，UK)进行测定，结果见表1。
表1熊果酸-多糖纳米胶束的表征
实施例15：两亲性熊果酸-多糖偶联物溶解度的考察
两亲性熊果酸-多糖偶联物的溶解度考察方法：避光条件下，称取研成细粉的两亲性熊果酸-多糖偶联物适量溶解在1ml水中，室温搅拌观察是否能完全溶解。
表2两亲性熊果酸-多糖偶联物溶解度
注：几乎不溶：-；可以溶解：++；溶解度较好：+++；易溶：++++
实施例16：：两亲性熊果酸-多糖偶联物和羧基氨基化的熊果酸-多糖偶联物对HUVEC小管形成的影响
取4℃下液态Matrigel胶200μL加入24孔板，平铺后置于37℃培养箱中1h固定，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞混悬液(4×104／孔)加入到Matrigel胶中，将样品与20％胎牛血清混合后，加入到培养板中，终体积为1mL。样品为(a)熊果酸；(b)两亲性熊果酸-低分子量肝素偶联物；(c)两亲性熊果酸-透明质酸偶联物；(d)两亲性熊果酸-羧甲基壳聚糖偶联物；样品的浓度为100μg／mL。同时设置阴性对照组只含有20％胎牛血清。在37℃，5％CO2条件下，培养12h，随机选取3个视野，100倍镜下重复观察拍照，计算每个视野下小管形成数目。结果见图1。由图可知，相比熊果酸，两亲性熊果酸-多糖偶联物抑制血管生成的作用增强。
实施例17：MTT法测定两亲性熊果酸-多糖偶联物的抗肿瘤活性
将处于对数生长期的B16F10，MCF-7，OS-RC-2和HepG2细胞用0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，分别以1×105／ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100μl，设五复孔，置37℃5％CO2孵箱内培养24h左右。分别加入不同浓度的用培养基稀释的各种样品：(a)熊果酸，(b)两亲性熊果酸-未分级肝素偶联物，(c)两亲性熊果酸-软骨素偶联物，(d)两亲性熊果酸-季铵化羧甲基壳聚糖偶联物，(e)两亲性熊果酸-脱硫酸化肝素偶联物，(f)两亲性熊果酸-羧甲基葡聚糖偶联物。稀释后的制剂的浓度分别为10μg／mL，，孵育72h后，弃去全部上清液，用PBS洗涤一次，加入四甲基偶氮唑蓝(MTT，5mg／mL)10μL，37℃孵育4h，弃去上清液，各孔加入150μLDMSO溶解甲瓒结晶于酶联仪570nm波长处测定吸光度值(Atest)。并以相同方法测定空白组(无细胞株)以及对照组(无样品)的吸收度，分别记为Ablank和Acontrol，按公式1计算细胞存活率，评价样品的细胞毒性。结果见图2。
结果表明，两亲性熊果酸-多糖偶联物的抗肿瘤活性相比熊果酸有所增强。
实施例18：两亲性熊果酸-多糖偶联物对不同肿瘤生长及抗肿瘤作用
将A549荷瘤小鼠，OS-RC-2荷瘤小鼠，B16F10荷瘤小鼠，MCF-7荷瘤小鼠和HepG2荷瘤小鼠分别随机分组，5只／组，分组和给药剂量如下：(a)5％葡萄糖空白对照组，(b)熊果酸，(c)氨基化熊果酸，(d)两亲性熊果酸-羧乙基壳聚糖偶联物，(e)两亲性熊果酸-低分子量肝素偶联物，(f)两亲性熊果酸-透明质酸偶联物。给药剂量为25mg／kg／day(以熊果酸计)。按照隔天给药的方式，以第一天给药计为第0天，按照上述剂量，分别于0，2，4，6天经尾静脉注射上述组制剂。停药后第2天处死解剖小鼠，剥离肿瘤，称取瘤重，根据公式(2)计算肿瘤生长抑制百分率。结果见图3。
结果表明，相比熊果酸，氨基化的熊果酸的抗肿瘤活性明显增强，两亲性熊果酸-多糖偶联物的抗肿瘤活性较熊果酸也有一定的提高。
实施例19：包含紫杉醇两亲性熊果酸-多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
(1)透析法
将两亲性熊果酸-多糖偶联物18mg，溶解在3ml蒸馏水中搅拌1h。紫杉醇10mg溶解在乙醇(甲醇、乙腈)中。然后两者混合，探头超声30min后，双蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
(2)乳化溶剂挥发法
将两亲性熊果酸-多糖偶联物18mg，溶解在3ml蒸馏水中搅拌1h。紫杉醇10mg溶解在二氯甲烷中。然后二者混合，探头超声30min，室温敞口搅拌过夜，使二氯甲烷挥发，离心(3000rpm)15min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性熊果酸-多糖偶联物自组装纳米胶束中紫杉醇含量的测定
用HPLC(LC-2010C，Shimadzu，Japan)方法进行含量测定。流动相为甲醇∶水=75∶25(v／v)，色谱柱为LichrospherC18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm柱。流速为1.0mL／min，检测波长为227nm(SPD-10A，UVdetector，Shimadzu，Japan)，柱温为30℃，注射样品体积为20μl。以公式(3)计算样品的载药量。结果见表3。
表3载有紫杉醇的两亲性熊果酸-多糖偶联物自组装纳米胶束
实施例20：包含阿霉素两亲性多糖偶联物自组装纳米胶束组合物的制备和表征
1、制备工艺
两亲性熊果酸-多糖偶联物18mg，溶解在3mL蒸馏水中搅拌1h。阿霉素9mg溶解在二甲基亚砜(N，N-二甲基甲酰胺)中。然后二者混合，探头超声30min后，双蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性熊果酸-多糖偶联物自组装纳米胶束中阿霉素含量的测定
用紫外分光光度法，于480nm波长处测定阿霉素的含量。以公式(3)计算样品的载药量。结果见表4。
表4载有阿霉素的熊果酸-多糖类两亲性偶联物自组装纳米胶束
实施例21：包含羟基喜树碱两亲性多糖偶联物自组装纳米胶束的制备和表征
1、制备工艺
两亲性熊果酸-多糖偶联物20mg，溶解在3mL蒸馏水中搅拌1h。羟基喜树碱10mg溶解在N，N-二甲基甲酰胺(二甲基亚砜)中。然后二者混合，探头超声30min后，双蒸水透析过夜，离心(3000rpm)15min，用0.8μm滤膜过滤，冷冻干燥。
2、两亲性熊果酸-多糖偶联物自组装纳米胶束羟基喜树碱含量的测定
用高效液相-荧光检测方法进行含量测定。流动相为枸橼酸缓冲液∶乙腈∶75nmol／ml磷酸二氢钾=70∶23∶7(v／v)，色谱柱为LichrospherC18(150×4.6μm)，柱子粒径为5μm。流速为1.0ml／min，荧光检测波长为λex363nm和λex530nm，柱温为50℃，注射样品体积为20μl。以公式(3)计算样品的载药量。结果见表5。
表5载有羟基喜树碱的两亲性熊果酸-多糖偶联物自组装纳米胶束
实施例22：MTT法测定载抗肿瘤药物的两亲性熊果酸-多糖偶联物的抗肿瘤活性
将处于对数生长期的MCF-7细胞、HepG2细胞和B16F10细胞用0.02％EDTA消化，制成细胞悬液，分别以1×105／ml细胞浓度加入96孔酶标板内，每孔100μl，设五复孔，置37℃5％CO2孵箱内培养24h左右。分别加入不同浓度的用培养基稀释的各种样品：(a1)紫杉醇；(a2)包含紫杉醇的两亲性熊果酸-低分子量肝素偶联物；(b1)阿霉素；(b2)包含阿霉素的两亲性熊果酸-透明质酸偶联物。稀释后的制剂的浓度分别为10μg／mL，，孵育72h后，弃去全部上清液，用PBS洗涤一次，加入四甲基偶氮唑蓝(MTT，5mg／mL)10μL，37℃孵育4h，弃去上清液，各孔加入150μLDMSO溶解甲瓒结晶于酶联仪570nm波长处测定吸光度值(Atest)。并以相同方法测定空白组(无细胞株)以及对照组(无样品)的吸收度，分别记为Ablank和Acontrol，按公式(1)计算细胞存活率，评价样品的细胞毒性。结果见图4-1，4-2。结果表明，相比抗肿瘤药物，载抗肿瘤药物的两亲性熊果酸-多糖偶联物的抗肿瘤活性更强。
Claims (8)
1.一种两亲性熊果酸-多糖偶联物，其特征在于该两亲性熊果酸-多糖偶联物是通过以下方法制备得到的：将熊果酸C3位上的羟基取代成氨基，形成氨基化的熊果酸；在多糖上的羧基引入氨基化的熊果酸，使其具有两亲性，在水性介质中可自组装形成纳米胶束。
2.根据权利要求1所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其特征在于该两亲性熊果酸-多糖偶联物中所述的多糖包括低分子量肝素、脱硫酸化肝素、未分级肝素、透明质酸、海藻酸、软骨素、多硫酸化软骨素、羧甲基壳聚糖、羧乙基壳聚糖、季铵化羧甲基壳聚糖、N-辛基-O，N-羧甲基壳聚糖、羧甲基葡聚糖或羧甲基香菇多糖。
3.根据权利要求1所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其特征在于该两亲性熊果酸-多糖偶联物的制备方法包括以下步骤：
①熊果酸用二氯甲烷溶解，一定温度下逐步滴入溶解有氧化剂的溶液中，室温搅拌一定时间，反应液经过滤，洗涤，水洗，干燥，过滤，浓缩后，硅胶柱层析洗脱、浓缩，得白色固体；
②将反应①得到的白色固体和盐酸羟胺溶解于吡啶中，一定温度下回流一定时间，待反应液冷却至室温后，蒸馏水洗涤，过滤，水洗，干燥，得白色固体；
③将反应②得到的白色固体、氰基硼氢化钠和乙酸钠，溶解于甲醇中，氮气保护下反应，冰浴条件下，缓慢滴加三氯化钛溶液，室温搅拌一定时间，将所得的白色浑浊液，加入适量的蒸馏水，旋去甲醇，调节溶液pH至中性，用二氯甲烷萃取，有机层水洗，干燥，过滤，滤液浓缩，用甲醇、二氯甲烷和石油醚的混合溶剂重结晶，得白色固体，即氨基化的熊果酸；
④将多糖溶于反应溶剂，在氮气保护下，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺为催化剂，加入氨基化的熊果酸，控制反应至反应完全，反应结束后，用沉淀剂沉淀，过滤得到沉淀物，复溶，超声，透析，冷冻干燥，即得熊果酸-多糖类两亲性偶联物。
4.根据权利要求3所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其特征在于：
步骤①中，所述的氧化反应的氧化剂为氯铬酸吡啶，溶剂为二氯甲烷，或者氧化反应的氧化剂为琼斯试剂，溶剂为二氯甲烷-丙酮；所述的温度控制为-10～30℃，所述的室温搅拌时间为0.5～10h；
步骤②中，所述的温度控制为80～150℃；所述的回流时间为2～24h；
步骤③中，所述的室温搅拌时间为2～36h；
步骤④中，所述的反应溶剂选自水、或甲酰胺、或N，N-二甲基甲酰胺与水或甲酰胺与水、或N，N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂，所述的控制反应为先加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺活化剂反应0.2～2h后，再加入氨基化的熊果酸，室温反应6～72h；所述的沉淀剂选自冰丙酮、冰乙醚、冰乙酸乙酯或冰乙醇。
5.权利要求1所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其特征在于：在制备高分子药物中的应用、或者在制备药学活性或药理活性分子的载体中的应用。
6.根据权利要求5所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其应用的特征在于：制备的高分子药物的剂型选自注射剂、片剂、胶囊剂、口服溶液剂、贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或鼻用制剂；制备的药学活性或药理学活性分子的载体的剂型选自注射剂、片剂、胶囊剂、口服溶液剂、贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂、喷雾剂、气雾剂或鼻用制剂。
7.根据权利要求5所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其应用的特征在于：所述的药学活性或药理活性分子选自紫杉烷类、喜树碱类、长春新碱类、蒽醌类、鬼臼毒素类、阿霉素类或维A酸类抗肿瘤药物中的任一药物。
8.根据权利要求6所述的两亲性熊果酸-多糖偶联物，其应用的特征在于：制备的药学活性或药理学活性分子的载体为纳米胶束，其制备方法为：两亲性熊果酸-多糖偶联物与水按重量比为3～50∶1000的比例溶解，得到熊果酸-多糖纳米胶束；将治疗有效量的难溶或微溶于水的抗肿瘤药物用药学上可接受的溶剂溶解，与所述的熊果酸-多糖纳米胶束混合后，经超声或高压均质处理，溶液用透析法或超滤法或柱分离法除去有机溶剂小分子得到粒径为10～1000nm的纳米胶束；得到的纳米胶束可直接应用，也可通过冷冻干燥或喷雾干燥制成固体制剂复溶后再利用。
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