CN111024865B - 一种生物质糖化液中糖含量的检测方法 - Google Patents

一种生物质糖化液中糖含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物质糖化液中糖含量的检测方法，该方法主要包括以下步骤：将待测生物质糖化液依次进行酸处理、中和处理及衍生处理，再利用气相色谱法检测经过衍生出来后的生物质糖化液中的糖含量，并以各糖分衍生物峰面积、内标法绘制标准曲线，根据标准曲线计算糖分含量。该方法将糖衍生成易挥发且热稳定的衍生物，再利用气相色谱对生物质糖化液中糖含量进行快速准确测定。

Description

一种生物质糖化液中糖含量的检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体而言，涉及一种生物质糖化液中糖含量的检测方法。
背景技术
生物质是地球上最大的可再生资源，它的利用对人类社会的可持续发展有着巨大的影响。生物质是指以木质素、纤维素、半纤维素以及其他有机质为主的陆生植物(木材、薪材、秸秆等)和水生植物等，是一种稳定的可再生能源资源。与煤炭和石油等矿物能源相比，不仅硫、氮、灰份低，而且来源丰富，仅我国农作物秸秆产量每年约为7亿吨，可用作能源的资源量为2.8－3.5亿吨；另外还有大量的水生植物。因此生物质被喻为即时利用的绿色能源。
一般而言，采用物理方法、热化学方法和生物转化方法等可以使生物质中的主要化学成分纤维素、半纤维素和木质素等转化成具有化学反应活性的低分子或高分子液体物质，可用于制备生物燃料、生物胶黏剂、模压材料、发泡材料、碳素纤维以及饲料和有机肥料等，有利于解决能源的不合理利用与环境污染问题，提高生物质能源的利用效率。因此，对生物质中的基本化学组成进行研究有利于对生物质原料的充分利用，其中，对于生物质糖化后的糖含量的测定是目前的常见的研究方法。
目前，糖的测定最常用的主要有比色法、滴定法、高效液相色谱法。比色法和滴定法测定由于其测定过程中干扰因素较多，其测定结果稳定性差，很难得到准确的检测数据；高效液相色谱法是目前测定糖最理想的快速、方法，但是由于高效液相色谱价格较昂贵，因此大多数实验室很难普及该方法。如何快速准确的对生物质中基本物质的组成进行测定是亟待解决的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生物质糖化液中糖含量的检测方法。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种生物质糖化液中糖含量的检测方法，包括以下步骤：将待测生物质糖化液依次进行酸处理、中和处理及衍生处理，再利用气相色谱法检测经过衍生出来后的生物质糖化液中的糖含量。
对生物质中的基本化学组成进行研究有利于对生物质原料的充分利用，其中，对于生物质糖化后的糖含量的测定是目前的常见的研究方法。为了准确快速测定糖的含量，发明人经过长期的实践发提出一种气相色谱测定待测生物质糖化液中糖含量的检测方法。该检测方法采用柱前衍生的方法将生物质糖化液中的糖转化成糖衍生物，不仅可以避开其他物质的干扰，还可以提高糖的检测限，该检测方法首先将待测生物质糖化液依次进行酸处理、中和处理及衍生处理，通过以上的连续处理可以使待测生物质糖化液中的糖衍生成易挥发且热稳定的糖衍生物，然后利用气相色谱法检测经过衍生出来后的生物质糖化液中的糖含量。本发明实施例中提供的检测方法操作简单，衍生化反应迅速，适用于生物质糖化液中糖含量的快速准确的测定。
在可选的实施方式中，待测生物质糖化液的制备包括：将生物质酸化水解或酶解处理得到；
优选的，控制待测生物质糖化液中的木糖含量为1wt％－4wt％。
生物质是指以木质素、纤维素、半纤维素以及其他有机质为主的陆生植物(木材、薪材、秸秆等)和水生植物等，为了对于生物质的基本组成进行研究，可以先将生物质进行糖化处理，使生物质中的纤维素和半纤维素等被转化成糖游离出来，得到生物质糖化液，糖化处理包括多种方法，在此，可以采用酸化处理方法，如将生物质原料、金属盐和表面活性剂组成的原料浆液加热反应，反应后的溶液不经过分离，直接作为酶水解的原料，酶水解后得到含有糖的水解液。所采用的生物质原料包括但不限于：秸秆、草料、竹子、木材以及糖加工残渣中的一种或者几种。优选的，控制生物质糖化液中的木糖含量为1wt％－4wt％，以此作为后续的其他物质的用量标准，方便对于整个检测过程中所采用物质的用量进行限定和说明。
在可选的实施方式中，酸处理包括以下步骤：将待测生物质糖化液依次与酸溶液和内标溶液混合后进行蒸汽加压处理，再冷却至室温。
在可选的实施方式中，酸溶液为硫酸溶液；
优选的，硫酸溶液的酸度范围为0－5％；
优选的，蒸汽加压处理的温度为121－123℃，水解时间为30－60min。
蒸汽加压处理处理可以使生物质糖化液中未被转化的纤维素和半纤维素等，以及待测生物质糖化液酸处理后未被转化的纤维素和半纤维素等物质进一步被转化糖，利于待测生物质糖化液中糖含量的准确测定。
在可选的实施方式中，内标溶液为环丁砜溶液，
优选的，控制加入内标溶液后的混合溶液中的环丁砜的含量为 0.5－2wt％。
在可选的实施方式中，中和处理包括以下步骤：将酸处理后的溶液与碳酸钙混合，然后进行固液分离，收集滤液；
优选的，将酸处理后的溶液与碳酸钙混合，然后进行离心分离处理，且离心分离的转速大于10000转/分，离心时间为2－5min。
将酸处理后的溶液与碳酸钙混合进行中和处理，可以使待测生物质糖化液中多余的酸被中和除去，以减少在色谱检测过程中对仪器的损坏，并将中和处理之后的溶液进行离心分离处理，这是由于：如采用生物质酸化处理得到待测生物质糖化液的过程中，还可能游离出其他的大分子物质如蛋白质等成分，高速过滤离心处理，可以使这些大分子成分被过滤除去，减小对于糖含量检测的影响和干扰。
在可选的实施方式中，衍生处理之前加入除水剂；
优选的，除水剂为吡啶；
优选的，控制中和处理后的滤液中吡啶的含量为2μ l 样品加入30－50μ l 吡啶。
在衍生处理之前，加入除水剂如吡啶，可以除去待测生物质糖化液中的水，减少水分对于后续测定的影响。
在可选的实施方式中，衍生处理包括以下步骤：将经过中和处理的溶液与衍生试剂混合，以使待测糖溶液中的糖转化成稳定的糖衍生物；
优选的，衍生试剂为三氟乙酰胺；
优选的，衍生试剂为三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的混合物，且三甲基氯硅烷的用量占混合物总用量的比例为0－5％；
更优选的，衍生处理的条件为：20－30℃下摇动反应50－70min，或者 50－70℃温度下反应20－30min。
将待测生物质糖化液经过酸处理以及中和处理之后，再利用衍生试剂进行处理，可以使待测生物质糖化液中的糖被成功转化成易挥发且热稳定的糖衍生物，且采用以上的衍生试剂对糖类物质进行衍生化具有操作简便、灵敏度高、对糖类物质分析专一性较好、干扰较小、速度快、衍生化产物单一等优点，适用于待测生物质糖化液中糖含量的定性、定量分析。
在可选的实施方式中，气相色谱法检测包括：采用氮气或氦气作物载气，毛细管色谱柱进行分离，氢火焰离子化检测去进行检测，内标法绘制标准曲线进行定量检测。
在可选的实施方式中，气相色谱法检测的色谱条件为：进样温度： 210－280℃；柱箱：初温：110－160℃，以每6℃/min升温到190－230℃，然后以20℃/min升高到230－280℃，保持3－5min，总运行时间15－20min；检测器：火焰离子化检测器，检测器温度：230－280℃；色谱柱：Equity－1701 毛细管气相色谱柱；载气：氦气柱流量1.34mL/min，分流比10－20：1，补充气：氦气10－40mL/min。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种生物质糖化液中糖含量的检测方法，该检测方法通过将待测生物质糖化液依次进行酸化处理、中和处理及衍生处理，使生物质糖化液中的糖衍生成易挥发且热稳定的衍生物，再利用气相色谱法检测经过衍生出来后的生物质糖化液中的糖含量。该检测方法操作简单，衍生化反应迅速，适用于生物质糖化液中糖含量的快速准确的测定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为不同种类糖的标准曲线；
图2为本发明实施例1中的样品检测的气相色谱图；
图3为本发明对比例2中的样品检测的气相色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例一种生物质糖化液中糖含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)将生物质与浓硫酸混合进行酸化处理，得到生物质糖化液，将生物质糖化液作为待测糖溶液(样品)，通常存放在冰箱中保存，样品经称重装在一系列2mL气相色谱瓶中。添加到小瓶的量取决于待测糖溶液的浓度，控制最终体积1mL里最终木糖浓度大约在1－4％的质量浓度。
例如：一个木糖质量浓度大约为5％的糖溶液，添加0.50mL；对于木糖浓度达到20－30％质量浓度的，添加0.100ml。样品取样量应不低于0.100mL 且不高于0.700mL到2mL小瓶。待测糖溶液的取样应使用移液管，添加的准确重量应使用精确到小数4位的天平进行称量记录。
根据样品糖含量准确称取0.1000－0.7000mL样品到2mL色谱瓶中，准确至小数点后四位，使木糖在最终1mL里面的浓度大约在1－4％。在小瓶中加入25％的硫酸溶液，其中第一瓶不加作为留样以确定在低聚物酸水解之前溶液中的糖单体量，其它样品瓶中加入硫酸溶液，至少有5个样品在1mL 总体积中的硫酸浓度在0－5％范围内，加入量与浓度见表1。
表1样品中酸溶液的体积和硫酸的质量浓度
Figure BDA0002353220770000061
Figure BDA0002353220770000071
糖溶液和酸溶液添加到每个小瓶后，余下的体积通过计算用移液管加入去离子水达到0.900mL。用分析天平称取0.100mL质量浓度10％的环丁砜水溶液到样品瓶中，记录重量。环丁砜为内标物，配制时应准确称取环丁砜和去离子水重量。
添加完糖溶液、酸溶液、水和内标物后，盖紧瓶盖，然后放入121℃的蒸汽压力容器中，加热时应保持瓶子直立。压力容器在几分钟内加热到 121－123℃，在此温度和压力下恒定30min，然后压力容器中的温度和瓶子里的温度逐渐下降。经过30min降温后打开蒸汽压力容器，瓶子里液相温度大约80－90℃。
(2)经过蒸汽加热处理的样品加入0.200ml约20mg的碳酸钙在spin－x 离心管过滤器里进行中和，盖紧盖子充分混合后，以10000转/分，离心2min。
(3)在每个2ml的小瓶中加入2μ l 中和反应混合滤液，添加38μ l 的吡啶到每个小瓶中，加入200μ l 衍生试剂，迅速盖上小瓶，在金属浴60℃下加热瓶子30min。然后对样品进行分析，用Equity－1701气相色谱柱。
(4)仪器条件：进样温度：260℃；柱箱：初温：140℃，以每6℃/min 升温到210℃，然后以20℃/min升高到250℃，保持4min，总运行时间 17.62min；检测器：火焰离子化检测器，温度：260℃；色谱柱：Supelco EquityTM－1701；载气：氦气(氦气压力17.8psi，总流量20.1mL/min，隔膜吹扫2.9mL/min，色谱柱1.34mL/min，分流量17.2mL/min，分流比13： 1)，补充气：氦气40mL/min；定量检测方法：内标法。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
1、色谱条件：进样温度：260℃；柱箱：初温：140℃，以每6℃/min 升温到210℃，然后以20℃/min升高到250℃，保持4min，总运行时间 17.62min；检测器：火焰离子化检测器，检测器温度：260℃；色谱柱： Supelco EquityTM－1701；载气：氦气(氦气压力17.8psi，总流量 20.1ml/min，隔膜吹扫2.9ml/min，色谱柱1.34mL/min，分流量17.2mL/min，分流比13：1)，补充气：氦气40mL/min，其中。Supelco EquityTM－1701 为美国SUPELCO公司生产。
2、供试品的制备
2.1.干样品的固含量＞85％
可以让生物质在干燥空气里散布在托盘上晾干，或者更快速方法在真空炉(不超过80℃)里或常规烤箱里105℃加热直到水分小于15％。允许干生物质平衡过夜。
2.2.干样品的磨碎：
干燥的生物质应碾磨到能通过1毫米或20目的筛子。应收集约10克研磨过的生物质。
2.3.样品的酸化水解－初始去结晶步骤：
以干物质计300mg的研磨后生物质(如：含95％固体生物质的重量是 315.8mg)到压力玻璃容器，添加3毫升72％的硫酸溶液(确保溶液与固体全部混合)，并记录重量。压力容器盖上盖子后放入30℃水浴中搅拌1h。约20min后取出彻底混合，放回30℃水浴，1h取出。添加84g含有1％环丁砜的去离子水，记录准确重量。
糖回收标准(SRS)：称量约100mg葡萄糖、70mg木糖、25mg半乳糖和阿拉伯糖、84g1％环丁砜、3毫升72％硫酸，副本(SRS)以同样方式制备。
2.4.样品的酸处理－水解步骤：
经过30℃下加热1h和1％环丁砜稀释后，将含有生物质和SRS的压力容器放入压热釜。压热釜被迅速加热到116－121℃保持60min，缓慢冷却。 1.5h后从釜中取出，此时压热釜冷却至约80℃。然后在冰上进一步冷却。
水解混合物的过滤：混合液用G4玻璃坩埚过滤，一部分滤液用于碳水化合物分析采用气相色谱衍生方法。混合液及残渣应全部转移到坩埚，然后用大量的水冲洗，在真空烘箱中80℃下干燥(2小时或过夜)，称重。干燥后的酸不溶物即为木质素，用残余的重量除以最初用于分析的样品 (300mg)的质量即为木质素含量。SRS溶液不需要过滤。
2.5.样品的中和处理－中和步骤：
分别将滤液和SRS溶液0.2ml加入spin－x离心管过滤器中，然后分别加入约20mg碳酸钙。在漩涡振荡器上充分混匀后在离心机上以转速10K保持2min。中和后的滤液用于衍生反应。
2.6.样品的衍生处理－衍生步骤：
样品衍生化：将中和后的滤液和SRS溶液分别移取2μ l 于2ml气相瓶中，然后每个小瓶中添加38μ l 吡啶，最后在每个小瓶中加入200微升N， O－双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)。将试样在漩涡振荡器上充分混匀，在室温下反应60min或在60℃条件下反应30min。
3、标曲线及精密度试验
1.标准溶液的配制
分别以葡萄糖－木糖、阿拉伯－半乳糖，甘露糖作为标准品，用环丁砜做内部标准的分析溶液按下表2配制后，移取2μ l 标液，添加38μ l 的吡啶到每个小瓶中，加入衍生试剂，迅速盖上小瓶，在金属浴60℃下加热瓶子30min。然后对样品进行分析，用Equity－17气相色谱柱。
表2标准溶液的配制
Figure BDA0002353220770000101
2.标准曲线的绘制
以进样量和峰面积作标准曲线，建立标准线性方程，见附图1。标准曲线相关系数R2均高于0.997，各曲线呈现良好的线性关系。
3.检测方法准确度的验证
以D－木糖标准溶液的检测方法准确度的验证为例
回收率实验：准确移取待测糖溶液0.3mL，于5个2mL色谱瓶中，分别加入10mg/mL的D－木糖标准溶液0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL，按上述条件处理，用气相色谱进行测定，计算回收率，结果见下表3。
表3回收率实验
Figure BDA0002353220770000111
从表3可以确定，连续进样5次的RSD在0.65％，平均回收率在99.75％，具有良好的回收率，符合分析要求，同时也表明了该检测方法具有较高的准确度，可以用于实际样品的检测。
4、样品中糖含量的测定：
以下表4为样品中糖含量的测定结果：
表4样品中糖含量的测定结果
Figure BDA0002353220770000112
通过以上的表4可以看出：利用本发明实施例提供的检测方法，可以准确测出样品中所含有的各糖分的含量。进一步的，以上样品中各个糖分的谱图可以参见图2。
对比例1
与实施例1的步骤相同，不同之处仅在于：采用不同的衍生时间进行测定。
(1)60℃条件下不同衍生时间的测定结果如以下的表5所示：
表5 60℃条件下不同衍生时间的测定结果
Figure BDA0002353220770000121
(2)室温条件下不同衍生时间的测定结果如以下的表6所示：
表6室温条件下不同衍生时间的测定结果
Figure BDA0002353220770000122
从以上两个表格可以看出60℃条件下衍生时间少于20min测定值与标准值结果差异较大，室温条件下衍生时间少于50min时出的结果差异较大。
对比例2
与实施例1的步骤相同，不同之处仅在于色谱条件的不同，对比例2 中的色谱条件如下：进口温度：200℃，分流比：21：1，隔垫吹扫：2ml/min 柱箱：100℃以10℃/min升到210℃保持1min以20℃/min升到250℃，检测器：200℃，空气流量：360ml/min，氢气：36ml/min，补充气：5ml/min。
采用以上的色谱条件对于同一样品进行检测，得到的色谱图参见附图 3，可见：对于同一样品的测定，采用对比例2中的色谱条件进行测定的测定结果与实施例1中的测定结果相比，明显看出对比例2中的测定灵敏度低，且对比例2中的色谱条件下很多衍生物未能检测出来。
综上，本发明实施例提供了一种生物质糖化液中糖含量的检测方法，该检测方法通过将待测生物质糖化液依次进行酸化处理、中和处理及衍生处理，使待测生物质糖化液中的糖衍生成易挥发且热稳定的衍生物，然后利用气相色谱法检测经过衍生出来后的生物质糖化液中的糖含量。该测定方法克服了目前常见的糖分析方法的缺陷，如常见的糖分析方法有纸层析法、薄层层析法、高效液相色谱法。前两种方法属定性方法，定量效果不理想。高效液相色谱法是最常见的定量分析方法，但当样品中糖类组分较多时，其分离效果往往很差，检测灵敏度差，重现性不好，而且分析时间长，消耗流动相多，天然糖组分往往杂质多，对色谱柱寿命影响很大。
本发明实施例提供的检测方法，采用衍生化法配合气相色谱，具有速度快、灵敏度高等优点。采用气相色谱分析生物质糖化液中的糖含量需要解决两个问题：一是要有合适的衍生化方法，二是合适的操作控制条件，使之具有较高的理论塔板数和良好的柱效。由本发明实施例中对于实际样品的检测过程中可以看出，本发明实施例中的检测方法在将待测生物质糖化液中的糖转化成糖衍生物之后，检测过程中各个物质的峰的分离度较好，峰形尖锐，因此，利用该检测方法对待测生物质糖化液中的糖含量进行检测好似准确可靠的，进而得到生物质的基本组成，有利于对于生物质资源的充分利于和开发。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物质糖化液中糖含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测生物质糖化液依次进行酸处理、中和处理及衍生处理，再利用气相色谱法检测经过衍生出来后的生物质糖化液中的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的含量；
所述酸处理包括以下步骤：将所述待测生物质糖化液依次与酸溶液和内标溶液混合后进行蒸汽加压处理，再冷却至室温，所述酸溶液为硫酸溶液，所述内标溶液为环丁砜溶液；
所述中和处理包括以下步骤：将所述酸处理后的溶液与碳酸钙混合，然后进行固液分离，收集滤液；
所述衍生处理包括以下步骤：将经过所述中和处理的溶液与衍生试剂混合，以使所述待测生物质糖化液中的糖转化成稳定的糖衍生物；所述衍生处理的条件为：20-30℃下晃动反应50-70min，或者50-70℃温度下反应20-30min；所述衍生试剂为N，O-双（三甲基硅基）三氟乙酰胺；所述衍生试剂的添加量为2μl 样品加入200μl ；
所述气相色谱法检测的色谱条件为：进样温度：210-280℃；柱箱：初温：140℃，以每6℃/min升温到210℃，然后以20℃/min升高到250℃，保持3-5min，总运行时间15-20min；检测器：火焰离子化检测器,检测器温度：230-280℃；色谱柱：Equity-1701毛细管气相色谱柱；载气：氦气柱流量1.34mL/min，分流比10-20：1，补充气：氦气10-40mL/min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待测生物质糖化液的制备包括：将生物质酸化水解或酶解处理后得到；控制待测生物质糖化液中木糖的含量为1-4wt%。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述硫酸溶液的酸度范围为0-5%。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蒸汽加压处理的温度为121-123℃，水解时间为30-60min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，控制加入所述内标溶液后的混合溶液中的环丁砜的含量为0.5-2wt%。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述酸处理后的溶液与碳酸钙混合，然后进行离心处理，且离心处理的转速大于10000转/分，离心时间为2-5min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生处理之前加入除水剂。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述除水剂为吡啶。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，控制所述中和处理后的滤液中吡啶的含量为2μl 样品加入30-50μl 吡啶。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述气相色谱法检测包括:内标法绘制标准曲线进行定量测定。
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