CN111307967B - 一种测定食品中丙酸不可交换氢位点上稳定氢同位素比值的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种测定食品中丙酸不可交换氢位点上稳定氢同位素比值的方法，属于稳定同位素分析技术领域，可用于食品真实性鉴别领域的研究与日常检验。本发明提供了一种主要利用气相色谱‑裂解‑稳定同位素比值质谱法(GC‑P‑IRMS)测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，包括：通过对样品进行前处理去除丙酸羧基上的氢和样品中其他含氢化合物的步骤，以及高温裂解转化后利用稳定同位素比值质谱仪测定丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的步骤。本发明方法测定精度高，准确性高，为丙酸氢同位素在食品真实性鉴别领域的研究与应用奠定了方法基础，本方法也可用于其他基质样品中丙酸的氢同位素分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定食品中丙酸不可交换氢位点上稳定氢同位素比值的方法，属于稳定同位素分析技术领域，可用于食品真实性鉴别领域的研究与日常检验。
背景技术
丙酸及其盐类是世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)批准使用的安全可靠的食品防霉剂，可有效抑制食品中霉菌、芽孢杆菌及革兰氏阴性菌的生长繁殖，也可抑制黄曲霉毒素的产生。
然而实际上，丙酸可天然存在于多种动物、植物及发酵食品中，多是由原料中的可发酵糖经由丙酸杆菌代谢产生。我国GB 2760-2014《食品安全国际标准食品添加剂使用标准》允许一些食品中添加丙酸(盐)，但对不同食品中丙酸及其钠盐、钙盐的最大使用量做出了明确规定。由此产生了两类问题：第一，允许使用食品添加剂的食品中，丙酸含量超过规定限量；第二，不允许使用丙酸(盐)的食品中检出了丙酸。这是否属于过量添加？还是该丙酸源自于自然发酵产生？而要回答这两个问题，确定不同来源的丙酸特征差异至关重要。
稳定同位素分析技术能否反映物质原子层面的特征，不同来源的同一种化学物质往往具有明显差异，例如不同地区的水具有氢氧同位素特征差异，玉米原料发酵生产的乙醇与水果发酵产生的乙醇具有明显不同的碳同位素特征，而化工来源的乙酸与发酵产生的乙酸中氢同位素分布特征差异明显。因此，研究食品中丙酸的同位素特征有助于分析不同来源丙酸的差异，但当前未见有相关研究报道。
根据稳定同位素的分馏原理和分析要求可知，丙酸羧基上的氢同位素特征因易与环境中氢交换而不稳定，只有食品中丙酸不可交换氢位点上稳定氢同位素比值特征具有应用价值。
发明内容
针对目前现有技术缺乏相关分析方法的现状，本发明的目的是提供一种简单、高效、可靠的测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，从而有利于氢同位素技术在食品中丙酸来源的研究与应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案概述如下：
本发明提供了一种主要利用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱法(GC-P-IRMS)测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值(δD)的方法，包括：通过对样品进行前处理去除丙酸羧基上的氢和样品中其他含氢化合物的步骤，以及高温裂解转化后利用稳定同位素比值质谱仪测定丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的步骤。
以下对本发明技术方案进行详细描述：
本发明提供了一种测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，主要包括以下步骤：
(1)用碱性试剂处理食品样品，使丙酸转变成丙酸盐；
(2)去除食品样品中的非水溶性成分，取液体待用；
(3)用物理方法除去样品中的水分，得固体样品；
(4)用稀酸溶液复溶上一步固体样品，得酸化样品；
(5)用有机试剂对酸化样品进行适当稀释，得稀释样品；
(6)使用毛细管色谱柱将稀释样品中的丙酸与其他含氢组分分离；
(7)将丙酸组分经高温裂解转化成氢气(H2)，用稳定同位素比值质谱仪(IRMS)测定氢气的氢同位素比值D/H，即样品δD；
(8)用δD值已知的丙酸标准物质为基准进行数据校正。
进一步地，所述碱性试剂包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钙中至少一种。
更进一步地，所述碱性试剂是氢氧化钙。
进一步地，所述物理方法包括但不限于烘干方法、色谱分离方法、冷冻干燥方法中至少一种。
更进一步地，所述物理方法是冷冻干燥方法。
进一步地，所述稀酸溶液包括但不限于稀硫酸、稀盐酸、稀磷酸、稀硝酸中至少一种。
更进一步地，所述稀酸溶液是稀硫酸。
进一步地，所述有机试剂包括但不限于乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、乙醚中至少一种。
更进一步地，所述有机试剂是丙酮。
更进一步地，所述丙酮将所述酸化样品稀释至1g/L～10g/L。
更进一步地，所述丙酮将所述酸化样品稀释至6g/L。
进一步地，所述稀释样品在低温条件下静置一段时间后除去沉淀再用于色谱柱分离。
更进一步地，所述稀释样品在4℃条件下静置12h。
进一步地，所述色谱柱包括但不限于极性色谱柱、分子筛色谱柱、多孔层开口色谱柱中的一种。
更进一步地，所述色谱柱是多孔层开口色谱柱。
进一步地，所述色谱柱通过调整参数设定色谱程序能满足水、丙酸与有机试剂的分离要求，其中丙酸与其他含氢组分的保留时间差异达50s以上。
进一步地，所述丙酸标准物质是经过步骤(1)至(7)的处理及测定后用于数据校正。
更进一步地，所述丙酸标准物质经过步骤(1)至(7)的处理及测定后，利用丙酸标准物质实测δD值与已知δD值的差值计算校正样品的δD值。
有益效果：
本发明的方法开创了食品中丙酸氢同位素分析以及丙酸不可交换氢位点的稳定氢同位素比值的分析技术，通过碱性试剂成功去除了丙酸羧基氢的影响，操作简单而且一次性可处理多个样品，成本低廉，分析时间短，分析精度优于4‰，该方法测定准确，可以排除丙酸羧基氢和其他含氢化合物的干扰，为丙酸氢同位素在食品真实性鉴别领域的研究与应用奠定了方法基础，本方法也可用于其他基质样品中丙酸的氢同位素分析。
附图说明
图1：实施例中模拟样品中丙酸不交换位点上δD值。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：
利用气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱法(GC-P-IRMS)测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值(δD)的方法，主要包括以下步骤：
(1)使待测食品样品处于水溶液状态；
(2)向离心后的样品溶液中加入氢氧化钙，离心除去过量的氢氧化钙和不溶于水的杂质，取清溶液待用；
(3)将上清液放入烘箱或冷冻干燥机中，除去水分，取固体待用；
(4)用稀硫酸溶液复溶酸化上述固体成分使之反应变成丙酸；
(5)用丙酮稀释上述含丙酸的硫酸溶液至丙酸含量1g/L～10g/L，静置一段时间后除去沉淀，取上清液待分析；
(6)设置气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪的参数，优选地，进样体积1μL，气相色谱进样口温度270℃，气相色谱流速为恒流1.2mL/min，气相色谱进样口分流比20:1，气相色谱升温程序为初始温度150℃保持12min，20℃/min升至200℃并保持14min，25℃/min升至250℃保持5min，设定高温裂解模块的温度为1420℃恒温；
(7)确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合分析要求，然后检验仪器测定H2中δD的精密度和线性，必要时调整离子源参数值；
(8)设置质谱参数：编制测定程序，使除丙酸外的含氢化合物(如水、丙酮等)流出色谱柱后排入空气中，而仅将丙酸导入裂解装置中裂解生成氢气(H2)；
(9)测定样品：在氢同位素测定模式下，选定两点标准漂移校正模式在样品盘上摆好待测样品，在计算机控制下测定样品中丙酸的δD值；
(10)选择不可交换氢位点的δD值已知的丙酸标准物质，按照样品的前处理步骤处理并测定，最终校正得出食品样品中丙酸不可交换氢位点的δD值。
实施例2：
以面包、腐乳和酱油为例，测定上述样品中丙酸不可交换氢位点上稳定氢同位素比值的方法，主要包括以下步骤：
(1)各取面包、腐乳、酱油样品15g，其中面包和腐乳样品加水稀释(1g固体用5mL水稀释)；
(2)各样品中分别加入1g氢氧化钙后涡旋震荡2h，然后8000rpm离心30min，除去上层悬浮和下层沉淀，取各样品的清溶液保存待用；
(3)将各上清液至于冷冻干燥机中冻干，保留粉末待用；
(4)向各样品粉末中加入15mL硫酸溶液(硫酸浓度1moL/L)，涡旋震荡1h；
(5)以原样品中丙酸浓度为依据，向稀硫酸处理后的样品中加入无水丙酮至丙酸浓度6g/L左右；4℃条件下静置12h后取上清液待分析；
(6)设置气相色谱-裂解-稳定同位素比值质谱仪的参数进样体积1μL，气相色谱进样口温度270℃，气相色谱流速为恒流1.2mL/min，气相色谱进样口分流比20:1，气相色谱升温程序为初始温度150℃保持12min，20℃/min升至200℃并保持14min，25℃/min升至250℃保持5min。设定高温裂解模块的温度为1420℃恒温；
(7)确认稳定同位素比值质谱仪的工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验仪器测定H2中δD的精密度和稳定性，必要时调整离子源参数值；
(8)以纯丙酸、水和丙酮为实验材料，分别进样测定确定各物质的保留时间；
(9)将处理好的试样进样1μL，使得丙酸经色谱柱分离后进入高温裂解装置中转化为氢气(H2)后测定氢同位素比值(D/H)，记为δD测，每个样品处理3份并分别进样，结果见表1；
(10)选择不可交换氢位点上氢同位素比值已知的丙酸作为标准物质(此处使用实验室工作标准WSD，δD＝-98.72‰)，按上述处理待测样品的方法进行相同处理后测定(重复处理3份样品)，结果见表1；
表1食品样品及丙酸工作标准的δD测(‰)测定结果
| 样品信息 | 面包 | 酱油 | 腐乳 | 丙酸工作标准 |
| 重复-1# | -103.83 | -171.37 | -267.11 | -84.94 |
| 重复-2# | -100.29 | -164.28 | -261.73 | -87.62 |
| 重复-3# | -105.50 | -168.69 | -268.36 | -88.90 |
| 标准偏差SD(‰) | 2.66 | 3.58 | 3.52 | 2.02 |
由表1数据可知，本发明方法能够分析面包、酱油、腐乳和纯丙酸工作标准的氢同位素分析，且3次测定的标准偏差均优于4‰。
数据校正：丙酸工作标准WSD的测定值与给定值之间存在11.57‰的差异，因此可知样品的δD值为实测值δD测减去11.57‰后得到的结果，结果见表2。
表2食品样品中丙酸不可交换氢位点的氢同位素比值
| 样品信息 | 面包 | 酱油 | 腐乳 |
| δD(‰) | -114.78 | -179.68 | -277.30 |
实施例3：
研究本发明方法的准确性，采用加标验证的方式进行：向酱油产品中按不同比例加入丙酸工作标准WSD，按实施例1中的步骤测定各模拟样品的丙酸不可交换氢位点的稳定氢同位素比值(δD)，结果见表3。
表3模拟样品验证方法准确性的数据结果
表3数据显示，模拟样品中丙酸不可交换氢位点上稳定氢同位素比值与预测值的绝对差异均小于4.7‰，并且以丙酸工作标准的添加比例为横坐标、δD实测值为纵坐标作图(如图1所示)，可知二者呈现良好的线性负相关(R 2＝0.9868)，这说明本发明方法能够准确测定食品中丙酸不可交接氢位点上稳定氢同位素比值。
最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (9)
1.一种测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述方法主要包括以下步骤：
(1)用碱性试剂处理食品样品，使丙酸转变成丙酸盐；
(2)去除食品样品中的非水溶性成分，取液体待用；
(3)用物理方法除去样品中的水分，得固体样品；
(4)用稀酸溶液复溶上一步固体样品，得酸化样品；
(5)用有机试剂对酸化样品进行适当稀释，得稀释样品；
(6)使用毛细管色谱柱将稀释样品中的丙酸与其他含氢组分分离；
(7)将丙酸组分经高温裂解转化成氢气，用稳定同位素比值质谱仪测定氢气的氢同位素比值D/H，即样品δD；
(8)用δD值已知的丙酸标准物质为基准进行数据校正，
其中所述丙酸标准物质经过步骤(1)至(7)的处理及测定后，利用丙酸标准物质实测δD值与已知δD值的差值计算校正样品的δD值。
2.如权利要求1所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述碱性试剂是氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钙中至少一种。
3.如权利要求1所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述物理方法是烘干方法、色谱分离方法、冷冻干燥方法中至少一种。
4.如权利要求1所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述稀酸溶液是稀硫酸、稀盐酸、稀磷酸、稀硝酸中至少一种。
5.如权利要求1所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述有机试剂是乙醇、甲醇、丙酮、丙醇、乙醚中至少一种。
6.如权利要求1所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述有机试剂是丙酮，所述丙酮将所述酸化样品稀释至1g/L～10g/L。
7.如权利要求6所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述丙酮将所述酸化样品稀释至6g/L。
8.如权利要求1所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述色谱柱是极性色谱柱、分子筛色谱柱、多孔层开口色谱柱中的一种。
9.如权利要求1所述测定食品中丙酸不可交换氢位点上氢同位素比值的方法，其特征在于，所述色谱柱通过调整参数设定色谱程序能满足水、丙酸与有机试剂的分离要求，其中丙酸与其他含氢组分的保留时间差异达50s以上。
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