CN111879866A - 一种测定糖类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定糖类化合物的方法，包括以下步骤：从样品中利用提取试剂将样品中的糖进行提取，得到糖提取液；往糖提取液中加入内标后制备成干燥样品；将干燥样品、干燥的糖标准品混合物及干燥的内标标准品分别进行衍生化反应，得到待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物；将混合标准品衍生物用稀释液稀释，同时加入内标品衍生物，配制成不同浓度的混合标准品衍生物溶液，进行检测后得到标准曲线；将待测样品用稀释液稀释后进行检测；计算分析结果；本发明的有益效果在于：对提取及前处理方法进行改良，不仅操作更加方便，而且有助于提高准确率，缩短检测周期；完全分离，检测时间短，节约检测成本，保证检测结果的准确性与可靠。

Description

一种测定糖类化合物的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种测定糖类化合物的方法。
背景技术
糖类化合物是生物结构的重要组成部分，也是一切生命体维持生命活动所需要能量的主要来源。果实中糖的种类与含量直接影响果实的品质；逆境胁迫下，植物体可以通过调节糖的合成适应逆境；糖类化合物可以作为细胞识别信息分子，参与免疫保护、代谢调控、受精机制等细胞识别。糖类化合物特别是具有生物功能的糖类化合物受到人们的普遍关注，因而糖检测方法的开发与提高糖检测效率显得尤为重要。
根据糖类物质的聚合度将糖分为单糖，寡糖和多糖，随聚合度增加糖检测难度增大。目前样本糖检测中，检测物质主要为葡萄糖，果糖，蔗糖，如不同种果实中葡萄糖，果糖和蔗糖含量及含量比不同使得不同果实的甜味不同；而同种果实的不同品种中，蔗糖，果糖，葡萄糖的含量变化与含量比使不同品种果实甜度不同；种子在萌发过程中，糖的动态变化与种子的活力有关，大多数研究只具体测定葡萄糖、蔗糖与果糖的动态变化。
虽然，蔗糖、果糖、葡萄糖是可溶性糖的主要组成部分，但是，其它可溶性糖在样本中也广泛存在，如山梨醇由D-葡萄糖的羰基被还原而形成，是植物中最普遍的一种糖醇，在蔷薇科植物桃、李、梨等的果实中含量很高；另外，初生寡糖如乳糖、海藻糖、麦芽糖、棉子糖在生物体内有相当量并且以游离的形式存在，目前很少对植物样本中的多种糖类化合物分析进行研究。
发明内容
为解决现有技术中植物测试糖类化合物品种类别不多的技术缺陷，本发明提供一种测定糖类化合物的方法。
具体技术方案如下：
一种测定糖类化合物的方法，其不同之处在于，所述测定糖类化合物的方法包括以下步骤：
步骤S1：从样品中利用提取试剂将样品中的糖进行提取，得到糖提取液；
步骤S2：往所述糖提取液中加入内标后制备成干燥样品；
步骤S3：将所述干燥样品、糖标准品混合物及内标标准品分别进行衍生化反应，得到待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物；
步骤S4：将混合标准品衍生物用稀释液稀释，同时加入内标品衍生物，配制成不同浓度的含相同浓度内标品衍生物的混合标准品衍生物溶液，进行气相色谱-质谱检测后得到标准曲线；
步骤S5：将待测样品用稀释液稀释，稀释后进行气相色谱-质谱检测；
步骤S6：将步骤S5测试结果代入步骤S4的标准曲线，计算分析结果；
其中，所述糖标准品混合物包括所要检测的所有糖类化合物，所述糖类化合物包括：阿拉伯糖、木糖醇、L-鼠李糖、L-岩藻糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、D-山梨醇、肌醇、蔗糖、乳糖、海藻糖或麦芽糖中的一种或多种。
进一步，所述步骤S1中，所述提取试剂包括以下体积比的成分：
V(甲醇)：V(异丙醇)：V(水)＝3：3：1。
进一步，所述步骤S1中，20mg样品加入0.5ml～1.5ml所述提取试剂进行提取。
进一步，所述步骤S2中，干燥所述糖提取液时，将糖标准品混合物与内标标准品进行干燥；所述内标为核糖醇，将糖提取液氮吹后采用冻干制得所述干燥样品；将糖标准品混合物氮吹后采用冻干制得干燥混合标准品；将内标标准品氮吹后采用冻干制得所述干燥核糖醇。
进一步，所述步骤S3中，往所述干燥样品、糖标准品混合物及内标标准品中分别加入甲氧铵盐吡啶溶液，涡旋30s，于60℃烘箱中孵化3h，取出后加入N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋30s后于60℃烘箱中孵化1h，取出反应后的溶液，涡旋30s，得到所述待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物。
进一步，所述样品为植物，所述步骤S1中，将所述样品研磨后，再加入提取试剂。
进一步，所述步骤S4及步骤S5中，所述稀释液为正己烷；所述测定糖类化合物的方法中，所述步骤S4中混合标准品衍生物溶液与所述步骤S5中稀释后的待测样品同时进行气相色谱-质谱检测。
进一步，所述步骤S4及所述步骤S5中，气相色谱-质谱的设置参数如下表所示：
Figure BDA0002538139860000031
Figure BDA0002538139860000041
进一步，测试的糖类及核糖醇的定量离子及定性离子如下表所示：
Figure BDA0002538139860000042
Figure BDA0002538139860000051
进一步，所述步骤S2中，所述糖提取液采用冻干干燥，干燥时间为8小时；所述糖标准品混合物及所述内标标准品采用冻干干燥，干燥时间为2小时。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)对提取及前处理方法进行改良，不仅操作更加方便，而且有助于提高准确率，缩短检测周期；(2)采用内标法可对多种糖进行同时检测，完全分离，9种单糖和4种二糖在19min内实现完全分离，检测时间短，节约检测成本，有利于实验的各个操作环节的校正，保证检测结果的准确性与可靠。
附图说明
图1为实施例番茄中混合标准品总离子流图；
图2为实施例番茄中样品的总离子流图；
图3为为实施例番茄中两个加标样本的总离子流图重叠图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一种测定糖类化合物的方法，所述测定糖类化合物的方法包括以下步骤：
步骤S1：从样品中利用提取试剂将样品中的糖进行提取，得到糖提取液；
步骤S2：往所述糖提取液中加入内标后制备成干燥样品；
步骤S3：将所述干燥样品、糖标准品混合物及内标标准品分别进行衍生化反应，得到待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物；
步骤S4：将混合标准品衍生物用稀释液稀释，同时加入内标品衍生物，配制成不同浓度的含相同浓度内标品衍生物的混合标准品衍生物溶液，进行气相色谱-质谱检测后得到标准曲线；
步骤S5：将待测样品用稀释液稀释，稀释后进行气相色谱-质谱检测；
步骤S6：将步骤S5测试结果代入步骤S4的标准曲线，计算分析结果；
其中，所述糖标准品混合物包括所要检测的所有糖类化合物，所述糖类化合物包括：阿拉伯糖、木糖醇、L-鼠李糖、L-岩藻糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、D-山梨醇、肌醇、蔗糖、乳糖、海藻糖或麦芽糖中的一种或多种。
本发明中，术语所述“气相色谱-质谱”是指在磁场(或电场)作用下，按这些离子的质荷比进行扫描记录，最后运用计算机处理资料，依据每种化合物的色谱保留时间，以及质谱的分子离子与关键碎片离子组成的断裂型式，结合标样或标准谱图，对化合物逐个作出定性鉴定与定量分析。
进一步，所述步骤S1中，所述提取试剂包括以下体积比的成分：
V(甲醇)：V(异丙醇)：V(水)＝3：3：1。
进一步，所述步骤S1中，20mg样品加入0.5ml-1.5ml所述提取试剂进行提取。
进一步，所述步骤S2中，干燥所述糖提取液时，将糖标准品混合物与内标标准品进行干燥；所述内标为核糖醇，将糖提取液氮吹后采用冻干制得所述干燥样品；将糖标准品混合物氮吹后采用冻干制得干燥混合标准品；将内标标准品氮吹后采用冻干制得所述干燥核糖醇。
糖类化合物衍生化是在一定条件下向糖分子中引入一定的光学基团、疏水基团或易于离子化的基团，使糖类物质改变原有的性质，提高检测信号，提高检测灵敏度，以满足色谱分离分析和检测的需要。
进一步，所述步骤S3中，往所述干燥样品、糖标准品混合物及内标标准品中分别加入甲氧铵盐吡啶溶液，涡旋30s，于60℃烘箱中孵化3h，取出后加入N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋30s后于60℃烘箱中孵化1h，取出反应后的溶液，涡旋30s，得到所述待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物。
采取上述进一步的有益效果为：衍生化温度为60℃，将样本置于烘箱中即可实现，避免了水浴加热引入水分。
进一步，所述样品为植物，所述步骤S1中，将所述样品研磨后，再加入提取试剂。
进一步，所述步骤S4及步骤S5中，所述稀释液为正己烷；所述测定糖类化合物的方法中，所述步骤S4中不同浓度梯度的混合标准品衍生物溶液与所述步骤S5中稀释后的待测样品同时进行气相色谱-质谱检测。
进一步，所述步骤S4及所述步骤S5中，气相色谱-质谱的设置参数如下表所示：
Figure BDA0002538139860000081
Figure BDA0002538139860000091
进一步，测试的糖类及核糖醇的定量离子及定性离子如下表所示：
Figure BDA0002538139860000092
Figure BDA0002538139860000101
进一步，所述步骤S2中，糖提取液采用冻干干燥，干燥时间为8小时，冻干温度为-80℃；所述糖标准品混合物及所述内标标准品采用冻干干燥，冻干温度为-80℃干燥时间为2小时。
本领域通常在优化实验中，极少选择冻干时间作为优化条件，但在本发明中，实验发现，样品在冻干时间为8小时的情况下，后续分离的最好，不仅如此，标准品选用2小时优化时间，不仅效果良好，且更利于操作是节省时间。
实施例1
定性离子及定量离子的确定
利用甲醇分别配制13种糖与内标核糖醇的1000μg/mL单标溶液，分别取适量单标溶液氮吹后衍生化，得到各单标衍生化溶液，用正己烷对各单标溶液进行稀释，配制成衍生化后的10μg/mL的各单标溶液。衍生化后的各单标溶液进行全扫，得到各标准品的保留时间与碎片离子信息，结合相关文献选择碎片离子中丰度较大的3-4个碎片离子，对各标准品溶液进行选择离子监测(SIM)扫描，扫描条件如表1所示。定性与定量时，SIM扫描模式下，选择一个丰度较强的离子为定量离子，其它离子作为定性离子，如表2所示。
表1色谱质谱参数
Figure BDA0002538139860000111
表2各类糖的定性离子及定量离子
Figure BDA0002538139860000121
实施例2
测定不同品种番茄糖类化合物
步骤S1:新鲜番茄样本冷冻干燥后适当研磨，称取研磨后的样本20mg，加入500μL提取试剂(V甲醇：V异丙醇：V水，3：3：1)，冰水下超声提取15min，超声完成后取出并涡旋30s，8000rpm离心3min，得到糖提取液。
步骤S2:取离心后的提取液适量于进样瓶中，加入100μg/mL核糖醇20μL氮吹并置于冷冻干燥机中冻干8小时后，得到干燥样品，同时将糖标准品混合溶液与核糖醇内标溶液吹干并置冷冻干燥机中冻干2小时，得到干燥后的干燥混合标准品及干燥核糖醇；冻干温度均为-80℃；
其中，糖标准品混合溶液包括：
阿拉伯糖标准品、木糖醇标准品、L-鼠李糖标准品、L-岩藻糖标准品、果糖标准品、葡萄糖标准品、半乳糖标准品、D-山梨醇标准品、肌醇标准品、蔗糖标准品、乳糖标准品、海藻糖标准品及麦芽糖标准品。
步骤S3：两步衍生化反应：冻干后，向糖提取液的进样瓶、干燥混合标准品的进样瓶及干燥核糖醇内标的进样瓶中加入100μL甲氧铵盐吡啶溶液，涡旋30s，于60℃烘箱中孵化3h，取出后加入100μL N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)，涡旋30s后于60℃烘箱中孵化1h，取出衍生化溶液，涡旋30s，得到待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物。
步骤S4:取100μL干燥混合标准品衍生化溶液，稀释成4个不同浓度的混合标准品溶液，然后从4个不同浓度的混合标准品溶液中分取适量体积，同时加入一定量核糖醇内标衍生化溶液，用正己烷定容成9个不同浓度梯度的混合标准品检测液。混合标准品检测液的9个浓度梯度为0.003μg/mL，0.015μg/mL，0.03μg/mL，0.15μg/mL，0.3μg/mL，1.5μg/mL，2.4μg/mL，3μg/mL，4.5μg/mL，各梯度混合标准品检测液中，含有相同浓度的内标。
步骤S5：取50μL待测样品，加入950μL正己烷稀释，然后与步骤S4中各梯度混合标准品检测液一起进行气相色谱-质谱检测，测试仪器为：Agilent 7890A-7000D，参数设置如表1所示。
线性回归方程的建立
利用Agilent MassHunter MS定量分析软件建立标准曲线，新建批处理，选择9不同浓度混合标准品数据文件，在分析软件中确定保留时间(RT)、内标及浓度、定量离子对、外标浓度等信息，得到13个标准品的标准曲线。对每个标准曲线进行适度调整，增加权重保证标准曲线在低浓度点的准确性；每条标准曲线至少包含9个不同浓度中的5个浓度，确保每个浓度的准确度在80％-120％之间；相关系数R2在0.99以上。线性方程是标准曲线满足上述要求时线性拟合得到的方程，其中x为横坐标，是标准品浓度与内标浓度的比值；y为纵坐标，是标准品峰面积与内标峰面积的比值。线性范围是指标准曲线可以准确定量的范围。
各糖类化合物的线性回归方程如下表所示：
表3各糖类线性参数的确定
Figure BDA0002538139860000141
Figure BDA0002538139860000151
步骤S6：根据表2确认的定性离子及定量离子进行图谱比对，并计算色谱特征峰面积比带入表3的线性回归方程进行计算。
测试结果如表4所示。
表4不同样品糖类的最终浓度
Figure BDA0002538139860000152
Figure BDA0002538139860000161
注：番茄1和番茄2为两个番茄测试样本，Mix R1和Mix R2是两个技术重复样，在进行番茄样本测试时，随机挑选一个番茄样本，称取两份，向其中加入一定量的13种糖标准品，其它样本处理方法与番茄样本处理方法相同，确保检测结果的可靠性。
实施例3
梨冻干优化实验
3.1
实验过程：选取13个标准品混合物与梨样本(梨样本的糖提取液加入内标后)进行冻干时间、第一步衍生化时间、第二步衍生化时间优化。冻干时间分别为2h，4h，8h；第一步衍生化时间分别为0.5h，1h，2h；第二步衍生化时间分别为0.5h，1h，2h。三因素三水平实验表6如下：
按如下方式编号：冻干时间-第一步衍生化时间-第二步衍生化时间。
表5糖优化试验设计表
Figure BDA0002538139860000171
按表1参数方式对表6中的梨样品进行气相色谱-质谱检测，测试结果如表6A及6B所示。
实验结果：
标准品与样本冻干时间与衍生化时间优化结果见表6：
表6A：13个标准品混合物峰面积结果(N＝3)
Figure BDA0002538139860000172
Figure BDA0002538139860000181
表6B：梨样本中糖峰面积结果(N＝3)
2-0.5-0.5 2-1-1 2-2-2 4-0.5-1 4-1-2 4-2-0.5 8-0.5-2 8-1-0.5 8-2-1
Ara 55682 61443 50989 48562 66515 66556 60106 48467 52791
Xylitol 46160 51020 42172 38963 42784 41336 37117 38192 37325
Rha 6171 6883 5541 5072 5564 5137 4980 5111 5011
Fuc 75460 84601 76155 69527 59173 70883 64429 75043 71623
Fru 12397989 12813650 12658647 12551800 12624126 12747582 12577815 12676832 12694009
Gal - - - - - - - - -
Glu 2283545 2419300 2433548 2364205 2363838 2378663 2345992 2377974 2436631
Sor 132487319 135386356 136256527 134638865 134492550 135304924 132803579 2377974 135779365
Inositol 1038289 1062394 1035694 1005035 1021325 1016649 928467 946571 940669
Suc 5958048 6318634 6217526 5916859 6113854 6280554 6235181 6815927 6736014
Lac - - - - - - - - -
Mal 13688 14393 13539 10111 11244 11409 9113 11059 11068
Tre 64619 63557 54822 49564 52789 47086 43243 46874 47864
三因素三水平实验数据分析表明：三因素中影响标准品峰面积值的第一因素为冻干时间，冻干时间为2h；三因素中影响梨样品峰面积值的第一因素也为冻干时间，梨样本中果糖、葡萄糖、蔗糖的冻干时间为8h时，峰面积最大。因此，在实际样本检测时，选择冻干时间为8h以提高检测结果的准确性。
实施例4
按实施例2方法测试梨的糖类化合物
其中，标准线性方程如表7所示，结果如表8所示。
表7：梨测试线性方程表
NO. 名称 中文名称 RT 线性方程 相关系数R2 权重 线性范围(ppm)
1 Ara 阿拉伯糖 4.56 y＝1.393193*x-5.303304E-004 0.99749 1/x 0.003-4.5
2 Xylitol 木糖醇 5.28 y＝0.566743*x-3.025195E-004 0.99647 1/x 0.003-4.5
3 Rha L-鼠李糖 5.06 y＝0.141231*x+1.161750E-004 0.99774 1/x 0.003-4.5
4 Fuc L-岩藻糖 4.95 y＝0.630911*x+4.833399E-004 0.99995 1/x 0.003-1.5
5 Fru 果糖 6.45 y＝0.115155*x+0.002317 0.99668 1/x 0.003-4.5
6 Gal 半乳糖 6.62 y＝1.610556*x-0.002201 0.99738 1/x 0.003-4.5
7 Glu 葡萄糖 6.68 y＝0.034043*x-6.867555E-006 0.99742 1/x 0.003-4.5
8 Sorbitol D-山梨醇 7.07 y＝2.145540*x+0.002827 0.99803 1/x 0.003-4.5
9 Inositol 肌醇 8.46 y＝0.539454*x+1.780604E-004 0.99769 1/x 0.003-4.5
10 Suc 蔗糖 14.65 y＝0.384986*x-0.006006 0.99481 1/x 0.015-4.5
11 Lac 乳糖 15.28 y＝0.495577*x-0.006469 0.99545 1/x 0.02-6
12 Mal 麦芽糖 14.01 y＝0.564759*x-2.509866E-004 0.99695 1/x 0.003-4.5
13 Tre 海藻糖 15.35 y＝3.154690*x+0.001511 0.99687 1/x 0.003-4.5
表8：梨测试结果表
Figure BDA0002538139860000191
Figure BDA0002538139860000201
注：梨1和梨2为两个梨测试样本，R1和R2是两个技术重复样，在进行梨样本测试时，随机挑选一个梨样本，称取两份，向其中加入一定量的13种糖标准品，其它样本处理方法与梨样本处理方法相同，确保检测结果的可靠性。
实施例5
方法验证
从低、中、高三个水平考察方法的精密度与稳定性，不同水平重复3次。向梨样本中分别加入一定量的13种混合标准品，使样本检测时的浓度分别为0.01μg/mL,0.1μg/mL,1μg/mL,连续3天重复实验，计算日内精密度、日间精密度及回收率
测试结果如表9所示。
表9方法验证结果
Figure BDA0002538139860000202
Figure BDA0002538139860000211
其中，Linear Range为线性范围；R2为决定系数；LOD为检测限；LOQ为定量限；Intra-day precision为日内精密度，Inter-day precision为日间精密度；Recovery为回收率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述测定糖类化合物的方法包括以下步骤：
步骤S1：从样品中利用提取试剂将样品中的糖进行提取，得到糖提取液；
步骤S2：往所述糖提取液中加入内标后制备成干燥样品；
步骤S3：将所述干燥样品、干燥的糖标准品混合物及干燥的内标标准品分别进行衍生化反应，得到待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物；
步骤S4：将混合标准品衍生物用稀释液稀释，同时加入内标品衍生物，配制成不同浓度的但含相同浓度内标品衍生物的混合标准品衍生物溶液，进行气相色谱-质谱检测后得到标准曲线；
步骤S5：将待测样品用稀释液稀释，稀释后进行气相色谱-质谱检测；
步骤S6：将步骤S5测试结果代入步骤S4的标准曲线，计算分析结果；
其中，所述糖标准品混合物包括所要检测的所有糖类化合物，所述糖类化合物包括：阿拉伯糖、木糖醇、L-鼠李糖、L-岩藻糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、D-山梨醇、肌醇、蔗糖、乳糖、海藻糖或麦芽糖中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述提取试剂包括以下体积比的成分：
V(甲醇)：V(异丙醇)：V(水)＝3：3：1。
3.根据权利要求1所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S1中，20mg样品加入0.5ml～1.5ml所述提取试剂进行提取。
4.根据权利要求1所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S2中，干燥所述糖提取液时，将糖标准品混合物与内标标准品同时进行干燥，所述内标为核糖醇；将糖提取液氮吹后采用冻干制得所述干燥样品；将糖标准品混合物氮吹后采用冻干制得干燥混合标准品；将内标标准品氮吹后采用冻干制得所述干燥核糖醇。
5.根据权利要求1所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S3中，往所述干燥样品、糖标准品混合物及内标标准品中分别加入甲氧铵盐吡啶溶液，涡旋30s，于60℃烘箱中孵化3h，取出后加入N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺，涡旋30s后于60℃烘箱中孵化1h，取出反应后的溶液，涡旋30s，得到所述待测样品、混合标准品衍生物及内标品衍生物。
6.根据权利要求1～5任一项所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述样品为植物，所述步骤S1中，将所述样品研磨后，再加入提取试剂。
7.根据权利要求1～5任一项所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S4及步骤S5中，所述稀释液为正己烷；所述测定糖类化合物的方法中，所述步骤S4中不同浓度梯度的混合标准品衍生物溶液与所述步骤S5中稀释后的待测样品同时进行气相色谱-质谱检测。
8.根据权利要求1所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S4及所述步骤S5中，气相色谱-质谱的设置参数如下表所示：
Figure FDA0002538139850000031
Figure FDA0002538139850000041
9.根据权利要求1所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，测试的糖类及核糖醇的定量离子及定性离子如下表所示：
Figure FDA0002538139850000042
10.根据权利要求4所述一种测定糖类化合物的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述糖提取液采用冻干干燥，-80℃干燥时间为8小时；所述糖标准品混合物及所述内标标准品采用冻干干燥，-80℃干燥时间为2小时。
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