CN110015992A - 一种用于二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针及其制备方法和应用。本发明荧光探针具有式(I)所示通式结构，其对于二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的选择性高，检测限低，检测范围广，抗干扰能力强，可用于精确定量溶液中的亚硫酸(氢)盐，并且可根据颜色变化测定溶液中的二氧化硫及亚硫酸(氢)盐含量，现象明显便于识别。本发明制备方法步骤简单，产品产率高，原料成本低，毒性小，安全性高等优点，适合规模化生产。

Description

一种用于二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针及其制备 方法和应用
技术领域
本发明涉及二氧化硫残留检测领域，具体而言，涉及一种用于二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
受传统生产方式的影响，在面粉、红酒和银耳等食品的加工过程中以及山药、牛膝和天花粉等中药的炮制过程中，都会大量的用到硫磺，从而达到防腐和漂白的目的。但是，由于缺乏基础研究及长期监管，造成了实际应用中存在随意扩大硫磺熏蒸品种范围，任意加大硫磺熏蒸剂量，重复进行硫磺熏蒸等问题。研究还发现，经硫磺熏蒸后，中药材在性状及化学成分多有改变，严重者还会导致药效的降低或散失，且熏蒸后残留的二氧化硫及其在水溶液中的衍生物(包括亚硫酸盐和亚硫酸氢盐)对呼吸道、胃肠道、神经系统等均有不同程度的危害，会引起哮喘、肺癌、腹泻、荨麻疹、中风、偏头痛以及阿尔兹海默综合征等相关疾病。
因此，中药材中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐(SO3 2-/HSO3 -)的含量和安全性已经受到了高度的重视。世界卫生组织规定每人每天SO2摄取量不能超过0.7mg/kg，中国药典对中药材及饮片中SO2残留限量为150mg/kg，在山药、牛膝、天花粉、天冬、天麻、白术、白芍、牛膝、党参、粉葛等10味药材及其饮片品种项下增加了“二氧化硫残留量”检查项目，限度为“照二氧化硫残留量测定法测定，不得超过400mg/kg”。美国药典限定亚硫酸氢盐作为药用辅料的加入量为5～80mg/kg。
目前2015版《中国药典》收录的中药材中二氧化硫的检测方法主要包括酸碱滴定法、气相色谱法和离子色谱法等，但这些方法仍存在准确度差、操作复杂、检测仪器贵重等问题。由于中药材的成分复杂，且其中二氧化硫衍生物的含量低，因而，急需开发一种灵敏度高、选择性好且成本低的方法，用于中药材、药品及食品中二氧化硫、亚硫酸盐以及亚硫酸氢盐含量的快速测定。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于二氧化硫及其衍生物亚硫酸盐和亚硫酸氢盐检测的荧光探针，所述的荧光探针具有灵敏度高，选择性好，操作简便，结果可视等优点。
本发明的第二目的在于提供一种所述的荧光探针的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种所述的荧光探针的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针，所述荧光探针具有如下式(I)所示通式结构：
其中，式(I)中，R1为H，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基，烷基取代的二取代氨基，卤素以及硝基中的一种或多种组合；n为1-3的整数；R2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；X为卤素；其中，R2中芳香环上任意的氢原子可任选的被取代或非取代。
同时，本发明还提供了所述荧光探针的制备方法，包括：将如下式(i)所示化合物与式(ii)所示化合物反应，得到荧光探针；
其中，式(i)化合物中，R1为H，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基，烷基取代的二取代氨基，卤素以及硝基中的一种；m为0-2的整数；
以及/或者，式(ii)化合物中，R2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；X为卤素；其中，R2中芳香环上任意的氢原子可任选的被取代或非取代；
优选的，式(i)化合物与式(ii)化合物的摩尔比为：1：(0.8-1.2)；
优选的，式(i)化合物与式(ii)化合物在溶剂存在的条件下进行反应；更优选的，所述溶剂包括质子性溶剂；
优选的，式(i)化合物与式(ii)化合物在催化剂存在的条件下进行反应；更优选的，所述催化剂包括有机碱；
优选的，所述制备方法还包括：在反应后，对产物体系纯化，以得到荧光探针的步骤；更优选的，所述纯化包括：萃取和/或柱层析。
进一步的，本发明还提供了所述荧光探针在中药材或者饮片中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐残留量检测中的应用；以及/或者，所述荧光探针在药品或者食品中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐残留量检测中的应用；以及/或者，所述荧光探针在家居用品或者环境中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测中的应用；以及/或者，所述荧光探针在医学样品中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐浓度检测中的应用。
同时，本发明还提供了一种包含所述荧光探针的检测试管以及检测试纸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明荧光探针对二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的选择性高，检测限低，检测范围广，抗干扰能力强，可用于精确定量溶液中的亚硫酸(氢)盐，并且可根据颜色变化测定溶液中的亚硫酸(氢)盐含量，现象明显便于识别。
(2)本发明制备方法步骤简单，产品产率高，原料成本低，毒性小，安全性高等优点，适合大规模推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为FP荧光探针的检测机理示意图；
图2为FP探针的颜色变化图；
图3为FP探针的紫外/荧光光谱；
图4为FP探针的反应时间和不同pH下稳定性；
图5为FP探针的选择性；
图6为FP探针与不同含硫量中药反应后颜色变化；
图7为二氧化硫快速检测试管和二氧化硫快速检测比色管；
图8为二氧化硫快速检测试纸和二氧化硫快速检测试纸使用结果；
图9为快速检测比色卡；
图10为FP探针的细胞毒性实验结果示意图；
图11为FP探针的细胞成像图；
图12为FP探针的动物成像图。
其中，图3中，(a)紫外吸收光谱图，(b)FP荧光探针中加入不同浓度的SO3 2-后的荧光光谱图，(c)发射光强度与SO3 2-浓度线性关系图，(d)发射光强度与SO3 2-浓度线性关系图；
图4中，(a)FP荧光探针与SO3 2-反应后荧光强度随时间变化图(b)不同pH条件下，FP荧光探针与SO3 2-反应后荧光强度与pH值相关图；
图7中，(a)二氧化硫快速检测试管(b)二氧化硫快速检测比色管；
图8中，(a)氧化硫快速检测试纸，(b)二氧化硫快速检测试纸使用结果；
图11中，(a)20μM FP荧光探针中孵育2h；(b)20μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(c)50μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(d)100μM SO3 2-孵育2h,20μMFP荧光探针中孵育2h；
图12中，(a)20μM FP荧光探针中孵育2h；(b)1μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(c)2μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(d)5μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(e)10μM SO3 2-孵育2h，20μM FP荧光探针中孵育2h。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
有鉴于现有二氧化硫及其衍生物检测方法所存在的不足，本发明特提供了一种新型荧光探针，以实现对于二氧化硫、亚硫酸盐以及亚硫酸氢盐的有效检测和含量分析。
本发明的第一方面，提供了一种用于二氧化硫、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐检测的荧光探针，所述荧光探针具有如下式(I)所示通式结构：
其中，式(I)中，R1为H，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基(即-NHR′)，烷基取代的二取代氨基(即-NR′2)，卤素以及硝基中的一种；
n为1-3的整数；
R2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；
X为卤素；
其中，R1上任意的氢原子可任选的被取代或非取代(当R2中芳香环上存在取代基时，所述取代基任选的为烷基，烷氧基，卤素以及硝基中的至少一种)。
在本发明优选的一些实施方式中，式(I)所示的荧光探针的通式结构中，R1为H，C1-C6的烷基(例如，但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，特丁基，戊基，异戊基，己基等)，C1-C6的烷氧基例如，但不限于甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，特丁氧基，戊氧基，异戊氧基，己氧基等)，氨基，C1-C6的烷基取代的单取代氨基(例如，但不限于N-甲基氨基，N-乙基氨基，N-丙基氨基，N-异丙基氨基，N-丁基氨基，N-特丁基氨基，N-戊基氨基，N-异戊基氨基，N-己基氨基等)，C1-C6的烷基取代的二取代氨基(例如，但不限于N,N-二甲基氨基，N,N-二乙基氨基，N,N-二丙基氨基，N,N-二丁基氨基，N,N-二戊基氨基，N,N-二己基氨基等)，氟，氯，溴，碘以及硝基中的一种或多种组合；
n为1-3的整数(例如，n可以为1,2或者3)；
R2为C1-C6的烷基(例如，但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，特丁基，戊基，异戊基，己基等)，C5-C12的芳基(例如，但不限于苯基，萘基，联苯基等)，C6-C12的烷基芳基(例如，但不限于亚甲基苯基(苄基)，亚乙基苯基等)以及C6-C12的芳基烷基(例如，但不限于亚苯基甲基，亚苯基乙基等)中的一种；
X为氯，溴或者碘；
其中，R2上任意的氢原子可任选的被取代或非取代(当R2上存在取代基时，所述取代基任选的为C1-C6的烷基(例如，但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，特丁基，戊基，异戊基，己基等)，C1-C6的烷氧基例如，但不限于甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，己氧基等)，氟，氯，溴，碘以及硝基中的一种或多种组合)。
在本发明更优选的一些实施方式中，所提供的荧光探针具有如下式(II)所示通式结构：
在本发明最优选的一些实施方式中，所提供的荧光探针为如下结构(III)所示化合物：
本发明所提供的如上的荧光探针化合物具有良好的荧光光谱响应性。以式(III)所示荧光探针化合物为例，其对于450-570nm范围内(特别是550nm)的激发光，以及600-850nm范围内(特别是690nm)的发射光，具有的明显响应。在对溶液中亚硫酸盐/亚硫酸氢盐检测过程中，探针化合物能够在水中与SO3 2-/HSO3 -发生反应，使得探针化合物的共轭结构发生变化。随着SO3 2-/HSO3 -浓度的增加，690nm处荧光逐渐减弱，探针荧光强度与SO3 2-/HSO3 -的浓度呈线性负相关，可以利用该原料对于溶液中的SO3 2-/HSO3 -进行定性检测和定量分析。同时，由于在与SO3 2-/HSO3 -进行反应后探针化合物的紫外光谱位于550nm的最大吸收峰逐渐消失，紫色消褪，因而也可以利用该原料，通过比色法快速检测溶液中SO3 2-/HSO3 -的浓度范围。
在本发明的另一方面，提供了上述荧光探针的制备方法，包括：将如下式(i)所示化合物与式(ii)所示化合物反应，得到荧光探针；
其中，式(i)化合物中，R1为H，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基烷基取代的二取代氨基，卤素以及硝基中的一种或多种组合；
m为0-2的整数；
以及/或者，式(ii)化合物中，R2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；
X为卤素；
其中，R2上任意的氢原子可任选的被取代或非取代(当R2上存在取代基时，所述取代基任选的为烷基，烷氧基，卤素以及硝基中的至少一种)；
作为优选，式(i)化合物与式(ii)化合物的摩尔比为：1：(0.8-1.2)，例如可以为，但不限于1:0.9,1:1,1:1.1等；
作为优选，式(i)化合物与式(ii)化合物在溶剂存在的条件下进行反应；更优选的，所述溶剂包括质子性溶剂，例如，但不限于甲醇，乙醇，乙腈等；
作为优选，式(i)化合物与式(ii)化合物在催化剂存在的条件下进行反应；更优选的，所述催化剂包括有机碱，例如，但不限于哌啶，二苯胺，联苯胺等；
作为优选，所述制备方法还包括：在反应后，对产物体系纯化，以得到荧光探针的步骤；更优选的，所述纯化包括：萃取和/或柱层析。
在本发明优选的一些实施方式中，化合物(i)与化合物(ii)的反应包括：
在质子性溶剂和有机碱存在条件下，化合物(i)和化合物(ii)混合反应，产物溶液经萃取后，有机相通过色柱谱洗脱纯化，得到荧光探针；
作为优选，所用柱色谱为硅胶色谱柱；
作为优选，所用洗脱液包括：二氯甲烷和甲醇的混合液。
在本发明优选的一些实施方式中，所提供的制备方法中，式(i)化合物中，R1为H，C1-C6的烷基(例如，但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，特丁基，戊基，异戊基，己基等)，C1-C6的烷氧基例如，但不限于甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，特丁氧基，戊氧基，异戊氧基，己氧基等)，氨基，C1-C6的烷基取代的单取代氨基(例如，但不限于N-甲基氨基，N-乙基氨基，N-丙基氨基，N-异丙基氨基，N-丁基氨基，N-叔丁基氨基，N-戊基氨基，N-异戊基氨基，N-己基氨基等)，C1-C6的烷基取代的二取代氨基(例如，但不限于N,N-二甲基氨基，N,N-二乙基氨基，N,N-二丙基氨基，N,N-二丁基氨基，N,N-二戊基氨基，N,N-二己基氨基等)，氟，氯，溴，碘以及硝基中的一种或多种组合；
m为0-2的整数(例如，m可以为0，1或者,2)；
R2为C1-C6的烷基(例如，但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基等)，C5-C12的芳基(例如，但不限于苯基，萘基，联苯基等)，C6-C12的烷基芳基(例如，但不限于亚甲基苯基(苄基)，亚乙基苯基等)以及C6-C12的芳基烷基(例如，但不限于亚苯基甲基，亚苯基乙基等)中的一种；
X为氯，溴或者碘；
其中，R2上任意的氢原子可任选的被取代或非取代(当R2上存在取代基时，所述取代基任选的为C1-C6的烷基(例如，但不限于甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基等)，C1-C6的烷氧基例如，但不限于甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，己氧基等)，氟，氯，溴，碘以及硝基中的至少一种)。
在本发明更优选的一些事实方式中，所提供的制备方法中，式(i)化合物结构如下式(i′)所示：
式(ii)化合物结构如下式(ii′)所示：
在本发明特别优选的一些实施方式中，所提供的制备方法中，式(i)化合物结构如下式(i″)所示：
式(ii)化合物结构如下式(ii″)所示：
本发明中，特别优选的是以4-二甲基氨基肉桂醛与1-苄基-4-甲基喹啉为原料，反应制备对应的荧光探针。
本发明的又一方面，在于提供所述荧光探针在二氧化硫/亚硫酸(氢)盐(即，所述荧光探针在二氧化硫/亚硫酸(氢)盐(SO3 2-/HSO3 -))残留/浓度监测中的应用。
在本发明的一些实施方式中，可以将本发明荧光探针用于山药、牛膝、天花粉，以及天冬等中药材或者中药材饮片中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐残留的检测。
在本发明的一些实施方式中，可以将本发明荧光探针用于中药饮剂，红酒，面粉等药物制剂或者食品中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐残留的检测。
在本发明的一些实施方式中，可以将本发明荧光探针用于家具，水体，空气等家居用品或者环境中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐浓度的检测。
在本发明的一些实施方式中，可以将本发明荧光探针用于尿样，血样，人体内环境样品等医学样品中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐浓度的检测。
在本发明的一些事实方式中，可以将本发明荧光探针作为荧光成像试剂用于细胞以及生物体内的荧光成像。由于本发明荧光探针的干扰小，毒副作用小，因而可以利用激光共聚焦显微镜对探针与组织孵育后进行成像，并根据荧光强度判断生物样本中的二氧化硫/亚硫酸(氢)盐含量。
本发明的另一方面，提供了包含本发明荧光探针的检测试管以及检测试纸。
在本发明优选的一些实施方式中，包含本发明荧光探针的检测试管主要由如下方法得到：
将荧光探针溶于有机溶剂(优选为乙醇)中，然后将所得溶液加入离心管中，有机溶剂挥发后封口，得到检测试管。
在本发明优选的一些实施方式中，包含本发明荧光探针的检测试纸主要由如下方法得到：
将荧光探针溶于有机溶剂(优选为乙醇)中，然后以所得溶液浸泡基材(优选为滤纸)，晾干后得到检测试纸。
实施例1荧光探针的合成
在100ml的圆底烧瓶中，加入4-二甲基氨基肉桂醛(180.0mg,1.03mM)和1-苄基,4-甲基喹啉(456.4mg,1.23mM)，然后加入20ml含0.1％哌啶乙醇，室温反应12h。TLC监测反应完全后，减压下除去溶剂，以二氯甲烷溶解后加水萃取三次，以无水硫酸钠脱水。以CH2Cl2/MeOH(v/v 1:50,Rf＝0.30)作为展开剂，对粗产物进行硅胶柱层析纯化，得到紫红色固体(320mg，产率60％)，记为FP荧光探针，并在如下实验例1-11中，以其为实验探针，进行检测试验。
FP荧光探针的核磁检测结果如下：
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.91(d,J＝6.7Hz,1H),8.62(d,J＝8.0Hz,1H),8.21(d,J＝6.8Hz,1H),8.08(d,J＝8.8Hz,1H),7.94–7.86(m,2H),7.79(t,J＝7.8Hz,1H),7.72(d,J＝8.9Hz,2H),7.64(d,J＝15.5Hz,1H),7.30(s,5H),6.75(d,J＝9.0Hz,2H),6.25(s,2H),3.12(s,6H)；
13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ149.25,148.05,142.86,140.96,133.51,129.84,128.89,126.87,124.57,124.11,123.73,122.24,121.80,121.44,118.22,114.21,109.98,107.63,107.34,55.06,35.44。
实验例1 FP荧光探针与不同浓度亚硫酸钠反应后的颜色变化
将FP荧光探针以二甲亚砜为溶剂溶解，得到浓度为1mM的探针母液，将亚硫酸钠以pH7.4PBS溶解，得到10mM的亚硫酸钠母液。然后在10ml容量瓶中加入探针母液100μL以及亚硫酸钠母液0、30、60、90、120、150、210、270μL，以PBS将母液定容，使探针终浓度为10μM，不同浓度的亚硫酸钠终浓度为0μM、30μM、60μM、90μM、120μM、150μM、210μM、270μM，然后对反应后所得不同反应液的颜色进行记录和比对，结果如图1所示。随着亚硫酸钠溶液浓度的提高，反应液的颜色由紫色逐渐消褪，与270μM亚硫酸钠反应后的溶液颜色几乎变为无色。由此可见，可通过探针溶液反应后的颜色变化，来判断中不同检测试样中亚硫酸盐的浓度范围。
FP荧光探针检测的机理如图2所示。由图2可知，反应后FP荧光探针化合物由于共轭结构发生了变化，从而使得反应后探针溶液的颜色消褪。
实施例2 FP荧光探针在不同浓度SO3 2-下的荧光图谱
取FP荧光探针DMSO母液(10mM)100μL加入10ml容量瓶中，再分别加入亚硫酸钠母液(10mM)0、10、20、50、100、150、200μL，以pH 7.4PBS定容至10ml。FP探针浓度终为10μM，不同浓度的亚硫酸钠终浓度分别为：0、10、20、50、100、150、200μM。
以荧光分光光度计分别检测不同反应溶液在激发波长550nm，发射波长690nm下的荧光强度，通过分析Na2SO3的浓度与荧光强度的线性关系，得出FP荧光探针测量亚硫酸盐浓度的性能，结果如图3所示。随着Na2SO3浓度的增强，荧光探针在690nm处的荧光强度直线减弱，线性关系良好(R2＝0.9908)，定量测定的线性范围为0-200μM(以HSO3 -/SO3 2-浓度计)，且最低检测限为0.46μM。
实施例3 FP荧光探针的反应时间和pH稳定性测试
(1)FP荧光探针反应时间考察
取探针母液(1mM)100μL加入10ml容量瓶中，再加入亚硫酸钠母液(10mM)500μL，以pH 7.4的PBS溶液定容至10ml，使探针终浓度为10μM，亚硫酸钠终浓度为500μM。测定不同时间点反应溶液的荧光强度，评价FP荧光探针的反应时间。结果如图4(a)所示。由图4(a)所示结果可知，在探针(10μM)与SO3 2-(500μM)反应30min后，荧光强度达到稳定。
(2)考察反映溶液中pH值对探针识别性能的影响
通过加入1M盐酸和1M氢氧化钠调整稀释FP荧光探针的磷酸缓冲液的pH值，使pH分别为3、4、5、6、7、7.4、8、9、10，检测不同pH下FP荧光探针的荧光强度，结果如图4(b)所示。由图4(b)可知，探针(10μM)在pH 6-10下均能保持稳定，并且在其与SO3 2-(500μM)反应后，在不同pH条件下的反应液均表现出明显的荧光减弱。由此可见，FP荧光探针能适应弱酸或弱碱性溶液中HSO3 -/SO3 2-的检测，适合用作检测成分复杂的中药材中的含硫量。
实施例4 FP荧光探针的选择性
取探针母液(1mM)100μL加入10ml容量瓶中，再加入不同干扰物母液(10mM)500μL，以pH 7.4的PBS溶液定容至10ml，使探针终浓度为10μM，干扰物浓度为500μM，反应30min后测定FP荧光探针的荧光强度变化。各样品标号和对应的干扰物质为：0：空白；1：PO4 3-；2：CN-；3：I-；4：S2-；5：SO4 2-；6：HPO4 2-；7：Cl-；8：H2PO4 -；9：Br-；10：F-；11：Ac-；12：NO2 -；13：Hcy；14：Cys,15：HCO3 -；16：N3 -；17：GSH；18：SO3 2-。
由图5所示的检测结果可知，FP荧光探针对3种生物硫醇(Hcy，GSH，Cys)以及13种阴离子(Cl-，I-，F-，NO2 -，SO4 2-，Ac-，HCO3 -，HPO4 2-，H2PO4 -，N3 -，ClO-，S2-，PO4 3-)没有响应。然而，在每份样品中再加入亚硫酸钠母液(10mM)500μL之后，使亚硫酸钠终浓度为500μM，反应30min后，探针FP出现明显的荧光变化。该结果表明FP荧光探针对SO3 2-具有很好的选择性，能够实现在复杂体系中对SO3 2-的检测。
实施例5 FP探针对中药中二氧化硫衍生物残留定性检测
称取10g粉葛粉末，溶于50ml蒸馏水中，超声提取30min，真空抽滤，得粉葛提取液。取粉葛提取液1ml，加入100uL浓度为1mM的FP荧光探针母液，以PBS定容至10ml。如图6所示，反应30min后溶液颜色发生变化，紫色消退。由此可见，粉葛中有一定的量的二氧化硫残留，并证明了本发明FP荧光探针能够对于粉葛中的二氧化硫残留进行定性检测。
FP探针检测中药含硫量标准比色液的制备：通过在中药中添加不同含量的亚硫酸钠，采用FP探针与不同含量的亚硫酸钠的中药提取液反应，其溶液颜色将随着中药中亚硫酸钠含量的增加而变浅。因此，可在中药中添加不同总量的亚硫酸钠，建立中药含硫量标准比色液。通过图6所示的对比样品溶液和图7所示的标准比色液的颜色对比可知，粉葛溶液颜色与标准比色液60μg/L的颜色接近，即粉葛溶液中HSO3 -/SO3 2-的浓度不高于60μg/L，换算后，粉葛药材中SO2的含量不高于150mg/kg。
实施例6 中药中SO2定量检测
精密称取10g粉葛粉末，置于50ml蒸馏水中，超声提取30min，真空抽滤，得粉葛提取液。取粉葛提取液1ml，加入1mM的FP探针母液100uL，以PBS定容至10ml。反应30min后测量溶液的荧光值。测定条件为激发波长550nm发射波长690nm。
测试结果如下表1所示。
表1.荧光探针FP检测粉葛样品中的SO2分析结果
由如上表1结果可知，5批粉葛药材中SO2均未超标，且采用本法与2015版《中国药典》气相色谱法比较，测定结果没有显著性差异。
实施例7 快速检测试管的制备与应用
快速检测试管的制备：将FP荧光探针以1mg/ml浓度溶于乙醇中，取40ul加入5ml离心管中，乙醇晾干后封口，成品如图7(a)所示。
快速检测试管的应用：称取10g粉葛样品，溶于50ml蒸馏水中，超声提取10min或浸泡30min，取上清液，得中药材提取液。取提取液1ml，加入快检试剂试管中，以PBS定容至10ml刻度线。反应30min后进行颜色对比。不同反应药材与比色卡或比色液比色，结果如图7(b)所示。
由图7的对照检测可知，显示粉葛溶液颜色与准比色液60μg/L的颜色接近，即粉葛溶液中HSO3 -/SO3 2-的浓度不高于60μg/L，换算后，粉葛药材中SO2的含量不高于150mg/kg。
实施例8 快速检测试纸的制备与应用
快速检测试纸的制备：将FP荧光探针以1mg/ml浓度溶于乙醇中，滤纸浸泡30min后晾干，剪成1*1厘米正方形大小，用胶水贴于1*8厘米长方形塑料纸片尖端。成品如图8(a)所示。
快速检测试纸的应用：以塑料吸管吸取样品滴入5ml样品管中，并滴入约10滴，加纯净水至2.5ml刻度线处，上下振摇5次，然后将试纸反应端浸入样品上层溶液中5s，取出晾干待显色后出现颜色变化(如图8(b)所示)，与二氧化硫标准色阶卡(图9)进行比较，读出被测样品中二氧化硫的含量。
实验例9 FP荧光探针的细胞安全性研究
使用CCK8检测法在HepG2细胞株上测定了FP荧光探针的安全性，结果如图10所示。
由图10所示结果可知，HepG2在与探针在使用浓度下(10μM，DMSO<0.1％)孵育24小时后，仍然有80％以上的存活率，由此可见，本发明FP荧光探针能安全地在细胞中使用。
实验例10 FP荧光探针在细胞内荧光成像
将HepG细胞在不同浓度的亚硫酸盐(0，20μM,50μM,100μM)下孵育2h，然后在FP荧光探针(20μM)中孵育2h，之后进行细胞荧光成像，结果如图11所示。
其中，图11中，各图所示处理条件为：(a)20μM FP荧光探针中孵育2h；(b)20μMSO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(c)50μM SO3 2-孵育2h，20μM FP荧光探针中孵育2h；(d)100μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h(激发光波长550nm，发射光波长600-660nm)。
如图11(a)所示，处理后细胞呈现明显的红色轮廓，证明FP荧光探针能很好的透过细胞膜进入细胞内；同时，由图11(b)-(d)所示，随着亚硫酸盐浓度增加，红色荧光逐渐减弱，特别在图11(d)中，红色荧光几乎消失。由此可见，FP荧光探针能检测出细胞中的亚硫酸盐。
试验例11 FP荧光探针在斑马鱼体内荧光成像
将斑马鱼在不同浓度的亚硫酸盐(0，1μM,2μM,5μM,10μM)下孵育2h，然后在探针FP(20μM)中孵育2h，之后进行荧光成像，结果如图12所示。
其中，图12中，各图所示处理条件为：(a)20μM FP荧光探针中孵育2h；(b)1μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(c)2μM SO3 2-孵育2h,20μM FP荧光探针中孵育2h；(d)5μM SO3 2-孵育2h，20μM FP荧光探针中孵育2h；(e)10μM SO3 2-孵育2h，20μM FP荧光探针中孵育2h(激发光波长550nm，发射光波长600-660nm)。
如图12(a)所示，斑马鱼呈现明显的红色轮廓，证明探针能很好的透过细胞膜进入斑马鱼内；同时，如图12(b)-(e)所示，随着亚硫酸盐浓度增加，红色荧光逐渐减弱，在图12(e)中，红色荧光几乎消失，证明探针能检测出斑马鱼中的亚硫酸盐。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (8)

1.一种用于二氧化硫/亚硫酸(氢)盐检测的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有如下式(I)所示通式结构：
其中，式(I)中，R1为H，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基，烷基取代的二取代氨基，卤素以及硝基中的一种或多种组合；
n为1-3的整数；
R2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；
X为卤素；
其中，R2上任意的氢原子可任选的被取代或非取代。
2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有如下式(II)所示通式结构：
其中，式(II)中，R1为H，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基，烷基取代的二取代氨基，卤素以及硝基中的一种或多种组合；
R2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；
X为氯，溴或者碘；
其中，R2上任意的氢原子可任选的被取代或非取代。
3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包含如下式(III)所示化合物：
4.权利要求1-3中任一项所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括：
将如下式(i)所示化合物与式(ii)所示化合物反应，得到荧光探针；
其中，式(i)化合物中，R1为H，烷基，烷氧基，氨基，烷基取代的单取代氨基，烷基取代的二取代氨基，卤素以及硝基中的一种或多种组合；
m为0-2的整数；
以及/或者，式(ii)化合物中，R2为烷基，芳基，烷基芳基以及芳基烷基中的一种；
X为卤素；
其中，R2上任意的氢原子可任选的被取代或非取代；
优选的，式(i)化合物与式(ii)化合物的摩尔比为：1：(0.8-1.2)；
优选的，式(i)化合物与式(ii)化合物在溶剂存在的条件下进行反应；
更优选的，所述溶剂包括质子性溶剂；
优选的，式(i)化合物与式(ii)化合物在催化剂存在的条件下进行反应；
更优选的，所述催化剂包括有机碱；
优选的，所述制备方法还包括：在反应后，对产物体系纯化，以得到荧光探针的步骤；
更优选的，所述纯化包括：萃取和/或柱层析。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，式(i)化合物结构如下式(i′)所示：
以及/或者，式(ii)化合物结构如下式(ii′)所示：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，式(i′)化合物结构如下式(i″)所示：
以及/或者，式(ii′)化合物结构如下式(ii″)所示：
7.权利要求1-3中任一项所述的荧光探针在中药材或者饮片中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐残留量检测中的应用；
以及/或者，权利要求1-3中任一项所述的荧光探针在药品或者食品中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐残留量检测中的应用；
以及/或者，权利要求1-3中任一项所述的荧光探针在家居用品或者环境中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐浓度检测中的应用；
以及/或者，权利要求1-3中任一项所述的荧光探针在医学样品中二氧化硫/亚硫酸(氢)盐浓度检测中的应用；
以及/或者，权利要求1-3中任一项所述的荧光探针在细胞和生物体内荧光成像中的应用。
8.一种包含权利要求1-3中任一项所述的荧光探针的检测试管以及检测试纸。
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