CN103675189A - 一种连翘叶药材的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种连翘叶药材的质量检测方法，包括鉴别和含量测定两部分，其中鉴别为薄层色谱鉴别方法，含量测定方法采用高效液相色谱方法，同时本发明方法经过线性关系考察、精密度考察等一系列方法学验证均符合要求，由此建立系统完善的连翘叶质量控制标准，为连翘叶中苷类成分的进一步分离、鉴定和产品开发提供了依据。
Description
发明领域
本发明涉及一种中药材的检测方法，特别涉及一种连翘叶药材的质量检测方法。
背景技术
连翘是中医临床常用传统药物之一，通常以其果实入药，近年来，人们对连翘叶的化学成分和药理作用进行了一些研究，研究表明，连翘叶里含有连翘苷、连翘酯苷、芦丁、右旋松脂酚等化学成分，与连翘果实十分类似，而且连翘叶里相关成分的含量远高于连翘果实，其中连翘苷含量差别约10倍以上，连翘酯苷差别5～10倍；同时连翘叶提取物有较好的抑菌，抗病毒作用，在对抗肺炎、上呼吸道感染方面有较好的疗效。因此，将连翘叶开发为药品有较好的应用前景。
现有技术中与连翘叶质量检测方法相关的文献如下：
文献《HPLC测定连翘叶不同提取物中连翘苷的含量比较》.陕西农业科学.2012(3)一文建立了连翘叶不同提取物中连翘苷含量的测定方法，主要是对连翘叶不同溶剂提取，结晶所得提取物中连翘苷含量进行比较；
文献《不同部位、不同产地及不同采集时间连翘中连翘酯苷A的含量测定》.陕西中医2010年第31卷第10期一文对不同部位、不同产地及不同采集时间连翘中连翘酯苷A的含量进行了测定，其中不同部位包括连翘心、连翘叶、连翘花，但是按文献中检测连翘酯苷A的色谱条件，分离度不好；
文献《不同采收期连翘叶中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量测定》对不同采收期连翘叶中连翘苷、连翘酯苷和芦丁的含量进行了测定，其对连翘苷、连翘酯苷、芦丁的含量测定采用同一份供试品，供试品的制备均采用甲醇超声提取，但是采用甲醇提取，连翘酯苷提取不完全；
以上文献均未对连翘叶药材的质量标准进行系统性的研究，故有必要建立连翘叶药材的质量标准，为质量控制提供依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种连翘叶药材的质量检测方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明连翘叶药材的质量检测方法包括鉴别和/或含量测定中的一种或几种；
其中所述鉴别为薄层色谱鉴别方法：
供试品溶液的制备：取连翘叶粉末0.2～2g，加甲醇5～30ml，密塞，超声处理10～30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10～30ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用1～5倍体积的水饱和有机溶剂振摇萃取1～5次，合并萃取液，减压回收，残渣用1～10ml甲醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液I；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液II；
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液I、对照品溶液II各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8～30∶0.5～1.5∶0.5～1.5的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
其中所述含量测定方法包括如下方法中的一种或几种：
(1)连翘苷的含量测定：照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10～30∶60～90的乙腈-水为流动相；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末0.1～6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇5～50ml，称定重量，浸渍过夜，以功率400～600W，频率30～50kHz超声处理5～50分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2～10ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.1～1.0g拌匀，加在100～120目、1g，内径为1～1.5cm的中性氧化铝柱上，用60～80％乙醇60～90ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至2～10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘苷(C27H34O11)不得少于0.2～2.0％。
(2)连翘酯苷A的含量测定照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以8～20∶60～95的乙腈-冰醋酸溶液为流动相；检测波长为330nm；理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末30～70mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50～90％甲醇5～50ml，密塞，称定重量，以功率400～600W，频率30～50kHz超声处理5～50分钟，放冷，再称定重量，用50～90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘酯苷A(C29H36O15)不得少于2.0～8.0％。
其中所述鉴别方法优选为：
供试品溶液的制备：取连翘叶粉末1g，加甲醇20ml，密塞，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用3倍体积的水饱和有机溶剂振摇萃取3次，合并萃取液，减压回收，残渣用5ml甲醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液I；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液II；
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液I、对照品溶液II各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以18∶1∶1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
其中鉴别方法供试品溶液的制备中所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、醋酸甲酯等中的一种或几种，优选为乙酸乙酯；
其中所述含量测定方法优选包括如下方法中的一种或几种：
(1)连翘苷的含量测定：照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以21∶79的乙腈-水为流动相；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，以功率500W，频率40kHz超声处理25分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5g拌匀，加在100～120目、1g，内径为1～1.5cm的中性氧化铝柱上，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘苷(C27H34O11)不得少于1.0％。
(2)连翘酯苷A的含量测定 照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以14∶86的乙腈-冰醋酸溶液为流动相；检测波长为330nm；理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml，密塞，称定重量以功率500W，频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘酯苷A(C29H36O15)不得少于6.0％。
其中连翘酯苷A含量测定方法的流动相优选0.1％-2％的冰醋酸溶液，进一步优选为0.4％的冰醋酸溶液。
本发明连翘叶药材的质量检测方法，经过线性关系考察、精密度考察等一系列方法学验证均符合实验要求，由此建立系统完善的连翘叶质量控制标准，为连翘叶中苷类成分的进一步分离、鉴定和产品开发提供了依据，对促进连翘叶资源的充分开发利用提供了理论依据。
下述实验例和实施例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。
实验例1：鉴别方法学研究
试验仪器与试药：
薄层板(青岛海洋化工厂分厂)，展开缸，烘箱，乙酸乙酯(北京化工厂)，甲酸(光复)，水(纯化水)，甲醇(北京化工厂)10％硫酸乙醇溶液；
连翘叶药材：采自山西省芮城县。
方法：取本品粉末1g，加甲醇20ml，密塞，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用3倍体积的水饱和乙酸乙酯振摇萃取3次，合并萃取液，50℃减压回收，残渣用5ml甲醇溶解，作为供试品溶液。另取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以表1中的展开条件展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液。
表1 不同展开条件的展开效果
| 筛选展开条件 | 展开效果 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶2∶2 | 分离度不是很好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶1∶2 | 分离度不是很好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶2∶3 | 分离度不是很好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶2∶1 | 分离度不是很好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝20∶1∶2 | 分离度不好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝22∶2∶2 | 展开太高，分不开 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶1∶1 | 分离度不是很好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝19∶1∶1 | 分离度不好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶0.8∶2 | 分离度不是很好 |
| 乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸＝18∶2∶2 | 分离度不是很好 |
| 乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶1∶1 | 效果最佳，选此条件为最终展开条件 |
试验结果表明，在乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶1∶1展开条件下，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。因此，选择乙酸乙酯∶水∶甲酸＝18∶1∶1为最佳展开条件。
实验例2：含量测定方法学研究
1、连翘苷的含量测定 照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VID)测定。
1.1 试验仪器与试药
高效液相色谱仪Agilent Technologies 1200 series高效液相色谱仪(G1322A脱气机，G1311A高压输液泵，G1329A ALS，G1316A TCC，G1316A TCC，G1314B VWD)；色谱柱：ODS C18 5μm(4.6mm*150mm)；乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。
对照品：连翘苷，中国药品生物制品检定所，纯度按98.9％计。
连翘叶药材：采自山西省芮城县。
1.2 色谱条件及系统适用性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(21∶79)为流动相；流速：1ml/min，柱温为25℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000。(实际理论塔板数为8145，分离度为R＝5.434，不对称度为T＝1.002，符合色谱条件要求。)
连翘苷系统适用性，见表2。
表2 连翘苷系统适用性结果
试验结果表明，系统适用性较好。
1.3 对照品溶液的制备
取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。
1.4 线性范围
精密吸取对照品溶液(浓度为1.894mg/mL)0.3，0.6，1.2，2.4，4.8，9.6mL对照品溶液置于10mL量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积A值，以进样量(μg)为横坐标，峰面积A值为纵坐标，进行线性回归，结果见表3。
表3 连翘苷对照品量与峰面积A值的对应关系
线性方程y＝600.69x+29.622(R2＝1)，结果表明连翘苷量在0.57μg～18.18μg之间，与色谱峰面积A值有良好的线性关系。
1.5 供试品溶液的制备
1.5.1 提取方法的考察
取本品粉末(过五号筛)约0.25g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，两份超声处理(功率500W，频率40kHz)25分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，另两份加热回流提取25分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量摇匀，将提取液滤过，精密量取续滤液5ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5g拌匀，加在中性氧化铝柱(100～120目、1g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定连翘苷峰面积，结果见表4。
表4 药材含量测定-连翘苷提取方法的考察
通过比较不同提取方法所提取连翘苷含量，最后选择超声为最佳提取方法。
1.5.2 提取溶剂种类的考察
取本品粉末(过五号筛)约0.25g，8份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水，50％甲醇，70％甲醇，甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理(功率500W，频率40kHz)25分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5g拌匀，加在中性氧化铝柱(100～120目、1g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，测定连翘苷峰面积，结果见表5。
表5 药材含量测定-连翘苷提取溶剂的考察
比较不同溶剂提取连翘苷的含量，最后选择甲醇为最佳提取溶剂。
供试品溶液制备：取本品粉末(过五号筛)约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理(功率500W，频率40kHz)25分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5g拌匀，加在中性氧化铝柱(100～120目、1g，内径为1～1.5cm)上，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
1.6 精密度试验
1.6.1 重复性试验
精密称定连翘叶药材粉末0.25g，6份，依法制成供试品溶液，测定连翘苷含量，计算RSD值。结果见表6。
表6 连翘苷含量测定-重复性试验结果
1.6.2 中间精密度试验
将重复性试验的样品在另外2台不同型号的仪器，由不同的操作者，不同时间依法进行测定，测定连翘苷含量，计算RSD值。岛津液相中间精密度测定结果见表7。
表7 连翘苷含量测定中间精密度-岛津液相检测结果
Agilent Technology 1260series中间精密度测定结果见表8。
表8 连翘苷含量测定中间精密度-安捷伦1260液相检测结果
1.6.3 加样回收率试验
精密称取重现性试验项下的药材细粉0.125g，9份，分别加入不同量的连翘苷对照品，依法制备成供试品溶液，测定连翘苷含量，计算加样回收率，结果见表9。
表9 连翘苷含量测定-加样回收率测定结果
结果表明本法的加样回收率符合试验要求。
1.7.测定法
分别吸取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，进行检测，即得。
1.8.耐用性
在检测波长277±2nm下测定连翘苷的含量，结果见表10。
表10 连翘苷含量测定-不同检测波长下的测定结果
在柱温25±5℃下测定连翘苷的含量，结果见表11。
表11 连翘苷含量测定-不同柱温下的测定结果
用不同型号同种类型色谱柱测定连翘苷含量，结果见表12。
表12 连翘苷含量测定-不同色谱柱的测定结果
用不同比例流动相测定连翘苷含量，结果见表13。
表13 连翘苷含量测定-不同比例流动相的测定结果
试验结果表明，连翘苷的含量测定方法在波长±2nm，柱温±5℃，用不同型号同种类型色谱柱，在流动相比例变化为+2，-5时，RSD均符合要求，耐用性较好。
1.9.11批药材含量测定
依法测定11批连翘叶的连翘苷含量，见表14。
表14 11批连翘叶药材中连翘苷含量测定结果
11批药材的平均连翘苷含量为1.43％，按下浮30％左右计算，暂规定按干燥品计算，不得少于1.0％。
2、连翘酯苷A的含量测定 照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VID)测定。
2.1 试验仪器与试药
高效液相色谱仪Agilent Technologies 1200 series高效液相色谱仪(G1322A脱气机，G1311A高压输液泵，G1329A ALS，G1316A TCC，G1316A TCC，G1314B VWD)；色谱柱：ODSC18 5μm(4.6mm*250mm)；乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。
对照品：连翘酯苷A，中国药品生物制品检定所，纯度按93.2％计。
药材：采自山西省芮城县。
2.2 色谱条件及系统适用性
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4％乙酸水(14∶86)为流动相；流速：1ml/min，柱温为30℃，检测波长为330nm。理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000。(实际理论塔板数为16232，分离度为R＝2.9，不对称度为T＝1.035，符合色谱条件要求。)
连翘酯苷A系统适用性试验，结果见表15。
表15 连翘酯苷A系统适用性结果
试验结果表明，系统适用性较好。
2.3 对照品溶液的制备
取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。
2.4 线性范围
精密吸取连翘酯苷A对照品溶液(浓度为1.703mg/mL)0.15，0.3，0.6，1.2，2.4，4.8mL对照品溶液置于5mL量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，记录连翘酯苷A峰面积A值，以进样量(μg)为横坐标，峰面积A值为纵坐标，进行线性回归。见表16。
表16 连翘酯苷A对照品量与峰面积A值的对应关系
线性方程y＝1058.7x+145.77(R2＝0.999)，结果表明连翘酯苷A量在0.51μg～16.35μg之间，与色谱峰面积A值有良好的线性关系。
2.5 供试品溶液的制备
2，5.1 提取方法的考察
取本品粉末(过五号筛)约50mg，4份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml，密塞，称定重量，两份超声处理(功率500w，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量；另外两份80℃加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，液相检测连翘酯苷A的峰面积。结果见表17。
表17 含量测定-连翘酯苷A的提取方法考察
通过比较不同提取方法所提取连翘酯苷A含量，最后选择超声为最佳提取方法。
2.5.2 提取溶剂种类的考察
取本品粉末(过五号筛)约50mg，8份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水，50％甲醇，70％甲醇，甲醇15ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，液相检测连翘酯苷A的峰面积。结果见表18。
表18 含量测定-连翘酯苷A的提取溶剂考察
比较不同溶剂提取连翘酯苷A的含量，最后选择70％甲醇为最佳提取溶剂。
2.5.3 提取溶剂倍数的考察
取本品粉末(过五号筛)约50mg，12份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇5ml，10ml，15ml，20ml，25ml。平行两份。密塞，称定重量，超声处理(功率500w，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，液相检测连翘酯苷A的峰面积。
结果见表19。
表19 含量测定-连翘酯苷A提取溶剂倍数的考察
从以上结果看，选择300倍体积的溶剂量提取效果最佳，故选择300倍为溶剂体积。
2.5.4 提取时间的考察
取本品粉末(过五号筛)约50mg，10份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml。平行两份。密塞，称定重量，分别超声处理(功率500w，频率40kHz)10分钟，20分钟，30分钟，40分钟，60分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，液相检测连翘酯苷A的峰面积。
结果见表20。
表20 含量测定-连翘酯苷A提取时间考察
结果表明超声提取30min较好。
2.5.5 提取次数的考察
取本品粉末(过五号筛)约50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml。密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，药渣再超声处理2次，分别测定滤液中连翘酯苷A的峰面积，计算连翘酯苷A的转移率，结果见表21。
表21 含量测定-连翘酯苷A提取时间考察
第一次提取率已达98％以上，故只需提取一次即可。
供试品溶液的制备：取本品粉末(过五号筛)约50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.6 精密度试验
2.6.1 重复性试验
精密称定连翘叶药材粉末50mg，6份，依法制成供试品溶液，测定连翘酯苷A含量，计算RSD值。结果见表22。
表22.连翘酯苷A含量测定-重复性试验结果
2.6.2 中间精密度试验
将重复性试验的样品在另外2台不同型号的仪器，由不同的操作者，不同时间依法进行测定，测定连翘酯苷A含量，计算RSD值。
岛津液相中间精密度测定结果见表23。
表23 连翘酯苷A含量测定中间精密度-岛津液相检测结果
Agilent Technology 1260series中间精密度测定结果见表24。
表24 连翘酯苷A含量测定中间精密度-安捷伦1260液相检测结果
2.6.3 加样回收率试验
精密称取重现性试验项下的药材细粉25mg，9份，分别加入不同量的连翘酯苷A对照品，依法制备成供试品溶液，测定连翘酯苷A含量，计算加样回收率，结果见表25。
表25 连翘酯苷A加样回收率试验结果
结果表明本法的加样回收率符合试验要求。
2.7.稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液10μl，分别在不同时间测定连翘酯苷A的峰面积A值，并计算其连翘酯苷A含量及RSD值，结果见表26。
表26 药材含量测定-连翘酯苷A稳定性试验结果
结果表明供试品溶液在24小时内是稳定性的。
2.8.测定法
分别吸取连翘酯苷A对照品溶液和供试品溶液10μl，注入液既相色谱仪，进行检测，即得。
2.9.耐用性
在检测波长330±2nm下测定连翘酯苷A的含量，结果见表27。
表27 连翘酯苷A含量测定-不同检测波长检测结果
不同波长检测的RSD值为6％，说明波长在±2nm范围内耐用性不好，应控制检测波长为330nm。
在柱温30±5℃下测定连翘酯苷A的含量，结果见表28。
表28 连翘酯苷A含量测定-不同柱温检测结果
不同柱温检测的RSD值为4.58％，说明柱温在±5nm范围内耐用性不好，故一般需要控制柱温为30℃。
用不同流动相比例测定连翘酯苷A含量，结果见表29。
表29 连翘酯苷A含量测定-不同流动相比例测定结果
试验结果表明，流动相比例在±2％时，RSD不符合要求，耐用性不好，故要控制流动相比例。
耐用试验结果表明，变动上述因素对测定结果有影响，应严格控制连翘酯苷A的检测条件。
2.10.11批药材含量测定
测定11批连翘叶的连翘酯苷A含量，见表30。
表30 11批连翘叶的连翘酯苷A含量
11批药材的平均连翘酯苷A含量为7.96％，按下浮25％左右计算，暂规定按干燥品计算，不得少于6.0％。
具体实施方式
实施例1：连翘叶的鉴别
取连翘叶粉末1g，加甲醇20ml，密塞，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用3倍体积的水饱和乙酸乙酯振摇萃取3次，合并萃取液，减压回收，残渣用5ml甲醇溶解，作为供试品溶液；取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液I；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液II；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液I、对照品溶液II各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以18∶1∶1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例2：连翘叶的鉴别
取连翘叶粉末0.3g，加甲醇25ml，密塞，超声处理25分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用2倍体积的水饱和甲醇振摇萃取4次，合并萃取液，减压回收，残渣用8ml甲醇溶解，作为供试品溶液；取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液I；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液II；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液I、对照品溶液II各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以10∶1.5∶1.5的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例3：连翘叶的鉴别
取连翘叶粉末1.8g，加甲醇25ml，密塞，超声处理15分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水30ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用5倍体积的水饱和石油醚振摇萃取2次，合并萃取液，减压回收，残渣用4ml甲醇溶解，作为供试品溶液；取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液I；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液II；照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液I、对照品溶液II各8μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以25∶0.8∶0.6的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
实施例4：连翘叶的含量测定
连翘苷的含量测定：照高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以21∶79的乙腈-水为流动相；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，以功率500W，频率40kHz超声处理25分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5g拌匀，加在100～120目、1g，内径为1～1.5cm的中性氧化铝柱上，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘苷(C27H34O11)不得少于1.0％。
(2)连翘酯苷A的含量测定 照高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以14∶86的乙腈-0.4％冰醋酸溶液为流动相；检测波长为330nm；理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml，密塞，称定重量以功率500W，频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘酯苷A(C29H36O15)不得少于6.0％。
实施例5：连翘叶的含量测定
连翘苷的含量测定：照高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以12∶85的乙腈-水为流动相；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇8ml，称定重量，浸渍过夜，以功率400W，频率50kHz超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.3g拌匀，加在100～120目、1g，内径为1～1.5cm的中性氧化铝柱上，用75％乙醇85ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各6μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘苷(C27H34O11)不得少于0.6％。
(2)连翘酯苷A的含量测定 照高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90的乙腈-0.1％冰醋酸溶液为流动相；检测波长为330nm；理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末60mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇8ml，密塞，称定重量以功率600W，频率50kHz超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘酯苷A(C29H36O15)不得少于3.5％。
实施例6：连翘叶的含量测定
(1)连翘苷的含量测定：照高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以28∶65的乙腈-水为流动相；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30ml，称定重量，浸渍过夜，以功率600W，频率40kHz超声处理40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.8g拌匀，加在100～120目、1g，内径为1～1.5cm的中性氧化铝柱上，用65％乙醇70ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘苷(C27H34O11)不得少于2.0％。
(2)连翘酯苷A的含量测定 照高效液相色谱法测定
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以18∶65的乙腈-1.8％冰醋酸溶液为流动相；检测波长为330nm；理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末40mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入85％甲醇40ml，密塞，称定重量以功率400W，频率30kHz超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用85％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘酯苷A(C29H36O15)不得少于8.0％。
Claims (8)
1.一种连翘叶药材的质量检测方法，其特征在于该方法中连翘叶的鉴别方法为：
供试品溶液的制备：取连翘叶粉末0.2～2g，加甲醇5～30ml，密塞，超声处理10～30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水10～30ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用1～5倍体积的水饱和有机溶剂振摇萃取1～5次，合并萃取液，减压回收，残渣用1～10ml甲醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液I；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液II；
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液I、对照品溶液II各1～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以8～30∶0.5～1.5∶0.5～1.5的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
2.如权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于该方法中连翘叶的鉴别方法为：
供试品溶液的制备：取连翘叶粉末1g，加甲醇20ml，密塞，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，将不溶物过滤，收集滤液，用3倍体积的水饱和有机溶剂振摇萃取3次，合并萃取液，减压回收，残渣用5ml甲醇溶解，作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：取连翘苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.25mg的溶液，作为对照品溶液I；取连翘酯苷A对照品，加甲醇制成1ml含0.2mg的溶液，作为对照品溶液II；
照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液I、对照品溶液II各3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以18∶1∶1的乙酸乙酯-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
3.如权利要求1或2所述的质量检测方法，其特征在于该方法供试品溶液的制备中所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、醋酸甲酯等中的一种或几种。
4.如权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于该方法供试品溶液的制备中所述有机溶剂为乙酸乙酯。
5.如权利要求1-4所述的质量检测方法，其特征在于该方法中所述含量测定方法包括如下方法中的一种或几种：
(1)连翘苷的含量测定：照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10～30∶60～90的乙腈-水为流动相；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末0.1～6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇5～50ml，称定重量，浸渍过夜，以功率400～600W，频率30～50kHz超声处理5～50分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2～10ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.1～1.0g拌匀，加在100～120目、1g，内径为1～1.5cm的中性氧化铝柱上，用60～80％乙醇60～90ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至2～10ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘苷(C27H34O11)不得少于0.2～2.0％；
(2)连翘酯苷A的含量测定 照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以8～20∶60～95的乙腈-冰醋酸溶液为流动相；检测波长为330nm；理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末30～70mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50～90％甲醇5～50ml，密塞，称定重量，以功率400～600W，频率30～50kHz超声处理5～50分钟，放冷，再称定重量，用50～90％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘酯苷A(C29H36O15)不得少于2.0～8.0％。
6.如权利要求5所述的的质量检测方法，其特征在于该方法中所述含量测定方法包括如下方法中的一种或几种：
(1)连翘苷的含量测定：照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以21∶79的乙腈-水为流动相；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备 取连翘苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，以功率500W，频率40kHz超声处理25分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，蒸至近干，加中性氧化铝0.5g拌匀，加在100～120目、1g，内径为1～1.5cm的中性氧化铝柱上，用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘苷(C27H34O11)不得少于1.0％；
(2)连翘酯苷A的含量测定 照高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以14∶86的乙腈-冰醋酸溶液为流动相；检测波长为330nm；理论板数按连翘酯苷A峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备 取连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备 取连翘叶粉末50mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml，密塞，称定重量以功率500W，频率40kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本品按干燥品计算，含连翘酯苷A(C29H36O15)不得少于6.0％。
7.如权利要求5或6所述的质量检测方法，其特征在于该方法中连翘酯苷A的含量测定方法中流动相为0.1％～2％的冰醋酸溶液。
8.如权利要求7所述的质量检测方法，其特征在于该方法中连翘酯苷A的含量测定方法中流动相为0.4％的冰醋酸溶液。
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