CN104215717B

CN104215717B - 山莨菪根的hplc指纹图谱检测方法

Info

Publication number: CN104215717B
Application number: CN201410484686.6A
Authority: CN
Inventors: 马逾英; 蒋运斌; 苟琰; 袁茂华
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2014-09-19
Filing date: 2014-09-19
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2034-09-19
Also published as: CN104215717A

Abstract

本发明提供了山莨菪根的HPLC指纹图谱检测方法。本发明检测方法中，各批山莨菪根样品的指纹图谱具有相似性，主要峰群的整体面貌基本一致，仅各成分的峰面积有较大差异，这与产地生态环境等因素有关。试验表明，运用本发明指纹图谱技术，能综合、全面地判别药材的品质，因此，可作为山莨菪根的鉴别和质量检测的一种手段。

Description

山莨菪根的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及山莨菪根的HPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

山莨菪Anisodus tanguticus(Maxim.)Pascher为茄科山莨菪属植物，是中国特有植物，野生分布于海拔2 800～4 200m的山坡及草坡阳处，目前尚有少量栽培。四川甘孜州和阿坝州的野生山莨菪资源极为丰富，藏医常以种子和根入药，其根的藏药名为“唐冲那保”或“唐冲纳波”，已收入2014年版《四川省藏药材标准》，具有止痛解痉、镇静镇惊、止咳平喘等功效。现代研究表明，山莨菪根主要含莨菪烷类生物碱，如樟柳碱、山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品等，具有调节植物神经功能紊乱，兴奋循环和呼吸中枢，调节免疫功能，解除平滑肌痉挛，封闭M和α受体，活化β受体，活跃和疏通微循环，增强人工膜的流动性等药理活性。

前期研究发现，由于受产地生态环境等的影响，不同来源的山莨菪根的生物碱类成分含量差异较大，目前尚未见国内外文献报道该药材的高效液相色谱指纹图谱，因此本发明将采用HPLC-DAD进行山莨菪根的指纹图谱研究，并对不同产地生态环境的山莨菪根进行比较，为其鉴别与质量控制提供依据。

发明内容

本发明的目的在于提供对山莨菪根品质的鉴别方法。

具体地，本发明提供了山莨菪根的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下操作步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待检药材，粉碎后，以甲醇提取，提取液过滤，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，在如下色谱条件下检测即可：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱；检测波长：210±3nm；流速0.8～1.2mL/min；柱温30±5℃；

流动相：A(乙腈)―B(10mmol/L KH₂PO₄缓冲液，用H₃PO₄调节pH至2.5～4.0)，流动相A的浓度变化为：0～5min，10％；5～40min，10％～25％；40～41min，25％～90％；41～50min，90％～90％；50～55min，90％～10％；55～60min，10％～10％。

进一步地，所述色谱柱尺寸为5μm,4.6×250mm。

更进一步地，所述色谱柱为Ultimate AQ C₁₈柱。

进一步地，检测波长为210nm。

进一步地，流速为1.0mL/min。

进一步地，：柱温为30℃。

进一步地，步骤(1)中，提取方法为回流、浸渍或超声。

进一步地，将供试品色谱图与对照指纹图谱进行对比，相似度为0.850的药材即为山莨菪根；所述对照指纹图谱中有15个共有峰，以阿托品为对照，各共有峰的相对保留时间为：峰1：0.281，峰2：0.336，峰3：0.353，峰4：0.413，峰5：0.493，峰6：0.576，峰7：0.613，峰8：0.724，峰9：0.793，峰10：0.897，峰11：1.000，峰12：1.235，峰13：1.346，峰4：1.439，峰15：1.569。

进一步地，所述对照指纹图谱中各共有峰的相对峰面积为：峰1：0.205～9.169、峰2：0.059～4.681、峰3：0.033～2.253、峰4：0.017～1.991、峰5：0.047～30.551、峰6：1.673～123.29、峰7：0.505～39.002、峰8：0.076～1.637、峰9：0.158～15.372、峰10：0.247～17.305、峰11：1.000、峰12：0.427～11.843、峰13：0.016～2.53、峰14：0.02～0.474、峰15：0.005～0.925。

优选地，所述对照指纹图谱如图1所示。

本发明检测方法中，各批山莨菪根样品的指纹图谱具有相似性，主要峰群的整体面貌基本一致，仅各成分的峰面积有较大差异，这与产地生态环境等因素有关。试验表明，运用本发明指纹图谱技术，能综合、全面地判别药材的品质，因此，可作为山莨菪根的鉴别和质量检测的一种手段。

附图说明

图1山莨菪根的HPLC对照指纹图谱

图2对照品(A)和样品(B)的HPLC色谱图(2.樟柳碱a.东莨菪碱8.山莨菪碱11.阿托品)

图318批山莨菪根HPLC指纹图谱

图44种生物碱的紫外光谱扫描图

图5样品的3D紫外光谱扫描图

图6不同流动相的比较[A为乙腈-水，B为乙腈-KH₂PO₄(10mmol/L，用H₃PO₄调节pH＝3.0)]

图7色谱适应性考察

具体实施方式

仪器与材料

SHIMADZU LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津)，pH计(德国Sartorius公司)，Sartorius BP211D十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)，METTLER AE240万分之一分析天平(瑞士Mettler公司)，KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Milli-Q Advantage A10超纯水机(美国Millipore公司)。乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)，水由Milli-Q Advantage A10超纯水机制得，其他试剂试药为分析纯。对照品氢溴酸樟柳碱、氢溴酸东莨菪碱、氢溴酸山莨菪碱和硫酸阿托品购于中国药品生物制品检定所(批号分别为：100399-200601，100049-201009，100051-201105，100399-200601)。

实施例1本发明检测方法

供试品溶液的制备：取待检药材粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10mL甲醇，密塞，称定重量，超声(功率300W，频率50kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

将供试品溶液注入液相色谱仪中，检测后，所得供试品指纹图谱与对照指纹图谱比对，相似度在0.850以上，即为山莨菪根。

色谱条件如下：

色谱柱为Ultimate AQ C₁₈(5μm,4.6×250mm)，流动相为A(乙腈)―B(10mmol/L KH₂PO₄缓冲液，用H₃PO₄调节pH至3.0)，流动相A的浓度变化为：0～5min，10％；5～40min，10％～25％；40～41min，25％～90％；41～50min，90％～90％；50～55min，90％～10％；55～60min，10％～10％。流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长210nm；进样量10μL。

对照指纹图谱见图1。

实施例2方法学考察

1材料

实验所用山莨菪根样品来源见表1，经成都中医药大学药学院马逾英教授鉴定，均为茄科植物山莨菪Anisodus tanguticus(Maxim.)Pascher的根。

表1 18批山莨菪根样品信息

2方法与结果

2.1色谱条件

2.2对照品溶液的制备

取氢溴酸樟柳碱、氢溴酸东莨菪碱、氢溴酸山莨菪碱和硫酸阿托品对照品各适量，精密称定，分别加甲醇溶解制成适当质量浓度的对照品贮备溶液。精密量取上述各对照品贮备溶液适量至同一量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得氢溴酸樟柳碱、氢溴酸东莨菪碱、氢溴酸山莨菪碱和硫酸阿托品的质量浓度均约为0.1mg/mL的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入10mL甲醇，密塞，称定重量，超声(功率300W，频率50kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验

取同一供试品溶液(S12)，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，计算出RSD均小于2％，表明仪器精密度良好。

2.4.2重复性试验

取同一批(S12)山莨菪根样品，共6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样分析，记录色谱图，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，计算出RSD均小于2％，表明方法重复性良好。

2.4.3稳定性试验

取同一供试品溶液(S12)，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8和24h进样分析，记录色谱图，测得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，计算出RSD均小于2％，表明样品在24h内稳定性良好。

2.5样品测定

各批样品按照“2.3”项下制备供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行分析，记录40min的色谱图。

2.6特征指纹图谱的建立

2.6.1色谱峰的指认

通过对对照品和样品的色谱图和紫外光谱进行比对，对样品中的色谱峰进行确认，指认了4个色谱峰(樟柳碱、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品)，结果见图2。

2.6.2参照色谱峰的选择

在18批野生山莨菪根样品色谱图中，樟柳碱、东莨菪碱、山莨菪碱和阿托品的含量在不同批次之间都存在较大的差异，并且东莨菪碱在有些批次样品中含量太少，未能检出，因而没有选其作共有峰。根据其余三个对照品在不同批次之间的含量差异、出峰时间和分离度，最后选择阿托品作为参照色谱峰(图1中的11号峰)。

2.6.3对照指纹图谱的建立

将18批山莨菪根样品色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统(版本：2012.130723)”软件，以12号样品为参照图谱，图谱生成方法设为中位数，时间窗设为0.5min。通过多点校正，分析寻找共有峰，建立了具有15个共有峰的对照指纹图谱(其中2号峰为樟柳碱，8号峰为山莨菪碱，11号峰位阿托品)，结果见图1和图3。15个共有峰的出峰时间和相对保留时间见表2。18批山莨菪根的15个共有峰面积见表3。

表2共有峰的出峰时间和相对保留时间

以11号峰位阿托品为参照峰，计算各峰的相对峰面积如下：

表4各峰的相对峰面积

2.6.4相似度评价

采用“中药指纹图谱相似度评价系统(版本：2012.130723)”软件对18批山莨菪根样品的色谱图和对照图谱的相似度进行评价，结果见表5。结果显示18批山莨菪根的相似度在0.891～0.987之间，表明其化学成分整体上大致相同，但由于18批样品的产地生态环境(如海拔高度、光照、土壤因子和伴生植物)等因素，导致不同批次样品在化学成分的量上有较大的差异，如表6所示。

表5 18批山莨菪根指纹图谱与对照指纹图谱的相似度

表6 18批山莨菪根的15个共有峰的相对标准偏差(RSD)

2.7主成分分析

对18批山莨菪根样品的15个共有峰进行KMO统计量和Bartlett检验，结果表明可以进行主成分分析。通过主成分分析，共获得5个主成分，累计贡献率为86.279％，结果见表7。计算18批山莨菪根样品的5个主成分得分(fac)，并通过个体综合评判函数(C)对18批样品进行综合评判，结果见表8[其中C＝(λ₁/m)×fac₁+(λ₂/m)×fac₂+(λ₃/m)×fac₃+(λ₄/m)×fac₄+(λ₅/m)×fac₅，λ₁，λ₂，λ₃，λ₄，λ₅和m分别为6.029，2.454，1.986，1.428，1.096和12.993]。从表8可知18批山莨菪根样品的综合评判得分在－0.85～0.89之间，根据综合评判得分可以在一定的标准上对山莨菪根进行质量评价。

表7 5个主成分的方差解释

表8 18批山莨菪根的主成分和综合评判得分

3结论

实验结果表明，18批山莨菪根样品的指纹图谱具有相似性，但又不完全一致，主要峰群的整体面貌基本一致，但各成分的峰面积有较大差异。分析原因，认为与产地生态环境等因素有关。运用指纹图谱和主成分分析相结合的方法，能综合、全面地判别药材的品质，因此，可作为山莨菪根的鉴别和质量检测的一种手段。

4讨论

4.1检测波长：

根据参考文献和樟柳碱、东莨菪碱、山莨菪碱以及阿托品的吸收最大吸收波长(210nm)，和样品的3D光谱图，最终把检测波长设为210nm，以充分反映山莨菪药材中生物碱的图谱信息(见图4和图5)。

4.2流动相的选择：

在有机流动相上，使用乙腈。与甲醇相比，乙腈与水混合后黏度较小，在210nm处吸收为甲醇的二十六分之一，能保证在梯度洗脱时基线的平稳。

在水相上，选用纯水和10mmol/LKH₂PO₄(用H₃PO₄调节pH＝3)缓冲液。考察这两种水相给出的信息，以在具有丰富信息的KH₂PO₄缓冲液为基础进一步调整比例，使各色谱峰具有好的分离度和对称性。

从乙腈-水、乙腈-KH₂PO₄(10mmol/L，用H₃PO₄调节pH＝3.0)缓冲液的色谱图可以看出乙腈-KH₂PO₄缓冲液所提供的信息增多。因此确定流动相系统为乙腈-KH₂PO₄缓冲液(见图6)。

4.3提取溶剂和方法的考查：

水超声、40％甲醇超声、60％甲醇超声、甲醇超声(考虑到水是作为中药材煎煮的溶剂)，结果表明不同浓度的甲醇所呈现的信息较为相近，只是量的差别，最后提取溶剂定为甲醇。使更多的信息在图谱上能得以展示，即使提出的物质不止是生物碱，也能在图谱上与生物碱存在相互依存的关系，为山莨菪指纹图谱的建立提供丰富的信息。

对回流和超声2种不同的提取方法进行比较，结果表明2种方法的色谱峰的个数和大小基本一致，最后选择操作较为简便的超声法作为提取方法。

4.4色谱适应性

分别对不同品牌C₁₈柱进行实验，结果表明色谱条件能在Inertsil ODS-SP C₁₈、SymmetryShield RP₁₈、Ultimate AQ C₁₈、XSelect HSS C₁₈、Kromasil 100-5C₁₈柱上重现，但是不同品牌色谱柱在出峰时间、分离度上存在一定的差异(见图7)。最后选用分离度较高的Ultimate AQ C₁₈柱。

4.5柱温考查：

对25,30和35℃进行考察。考察不同柱温对分离度的影响，结果表明不同柱温对分离度影响小，对出峰时间有影响，最后选择柱温为30℃。

4.6流动相梯度洗脱的优化过程

在“流动相的选择”的选择时利用乙腈-水或乙腈-KH₂PO₄(10mmol/L，用H₃PO₄调节pH＝3.0)进行一个全梯度洗脱(见表9)，结果(图6)显示分离效果较差。进一步优化为梯度洗脱2(见表10)进行“色谱适应性”的考察，但是由于梯度洗脱时间较长(85min)，从节约时间出发对梯度洗脱进一步优化，即优化到方法中的梯度洗脱(见表11)。

表9梯度洗脱1

表10梯度洗脱2

表11梯度洗脱最终条件

Claims

1.山莨菪根的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

流动相：A乙腈―B 10mmol/L KH₂PO₄缓冲液，用H₃PO₄调节pH至2.5～4.0，梯度洗脱程序为：流动相A的浓度变化为0～5min，10％；5～40min，10％～25％；40～41min，25％～90％；41～50min，90％～90％；50～55min，90％～10％；55～60min，10％～10％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述色谱柱尺寸为5μm,4.6×250mm。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述色谱柱为Ultimate AQ C₁₈柱。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：检测波长为210nm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：流速为1.0mL/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：柱温为30℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，提取方法为回流、浸渍或超声。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将供试品色谱图与对照指纹图谱进行对比，相似度大于0.850的药材即为山莨菪根；所述对照指纹图谱中有15个共有峰，以阿托品为对照，各共有峰的相对保留时间为：峰1：0.281，峰2：0.336，峰3：0.353，峰4：0.413，峰5：0.493，峰6：0.576，峰7：0.613，峰8：0.724，峰9：0.793，峰10：0.897，峰11：1.000，峰12：1.235，峰13：1.346，峰4：1.439，峰15：1.569。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述对照指纹图谱中各共有峰的相对峰面积为：峰1：0.205～9.169、峰2：0.059～4.681、峰3：0.033～2.253、峰4：0.017～1.991、峰5：0.047～30.551、峰6：1.673～123.29、峰7：0.505～39.002、峰8：0.076～1.637、峰9：0.158～15.372、峰10：0.247～17.305、峰11：1.000、峰12：0.427～11.843、峰13：0.016～2.53、峰14：0.02～0.474、峰15：0.005～0.925。