CN115109106B

CN115109106B - 一种杜仲提取物的制备方法

Info

Publication number: CN115109106B
Application number: CN202210820972.XA
Authority: CN
Inventors: 贺玉婷; 易宇阳; 曹慧璋
Original assignee: Hunan Langlin Biological Resources Co ltd
Current assignee: Hunan Langlin Biological Resources Co ltd
Priority date: 2022-07-13
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2042-07-13
Also published as: CN115109106A

Abstract

本发明公开了一种杜仲叶提取物的制备方法，属于植物提取物相关技术领域。该制备方法包括以下步骤：S1、将杜仲叶原料采用双频超声提取，收集提取液；再将提取液脱醇后，固液分离，收集液相A；S2、将液相A过大孔树脂，依次采用20℃～30℃的水、40℃～50℃的水和第一乙醇水溶液梯度洗脱，收集40℃～50℃水的洗脱液和第一乙醇水溶液洗脱液；S3、向40℃～50℃水的洗脱液中加入乙醇，使用氧化铝柱进行层析，收集流出液，随后依次采用第二乙醇水溶液、第三乙醇水溶液和酸性乙醇水溶液洗脱；收集第二乙醇水溶液洗脱液、第三乙醇水溶液洗脱液和酸性乙醇水溶液洗脱液。该制备方法能够综合提取杜仲叶中的桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸和总黄酮。

Description

一种杜仲提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及植物提取物相关技术领域，尤其是涉及一种杜仲提取物的制备方法。

背景技术

杜仲(拉丁学名为：Eucommia ulmoides Oliv)，杜仲科杜仲属单科单属植物，地质史上第四纪冰川运动残留下来的活化石古生物树种。汉代的《神农本草经》和明代的《本草纲目》记载了杜仲的药用功效：杜仲味甘微辛、甘气温平，安胎、补肝肾、强筋骨、益腰膝、除酸痛，久服轻身耐老。相关技术中使用杜仲树皮入药，但杜仲树皮资源较少、生长周期长。因杜仲叶与其皮的活性成份类似，药效也几乎无异；而且杜仲叶资源丰富，生长周期短，适宜时节定量采摘并不影响树的生长；因此相关技术中采用杜仲叶取代皮入药。

杜仲叶中含有丰富的环烯醚萜类化合物、苯丙素类化合物、木质素类化合物、黄酮类化合物等活性成分。为对杜仲叶中各成分进行利用，相关技术中采用了如下方法进行提取，包括：

1)通过采用提取剂提取，过大孔树脂分离、乙酸乙酯萃取和混合溶剂重结晶等工序提取绿原酸和杜仲总黄酮。该方法存在以下不足：①以水、甲醇或乙醇为提取剂，用水提杜仲叶绿原酸和总黄酮的提取效率都不高；②甲醇有毒，不适合工业化生产，且还是使用了乙酸乙酯、氯仿等试剂，对环境不友好；③绿原酸的精制过程中用乙酸乙酯反复萃取，操作麻烦，萃取过程易出现乳化现象，耗时长，使用乙酸乙酯-氯仿重结晶，溶剂复杂，母液回收设备要求高，不易实现产业化。

2)通过用石油醚提取经干燥粉碎后的杜仲叶，得提取液和滤渣，在提取液中加入乙醇离心取下层固体即为杜仲胶，滤渣用乙醇浸泡提取后去多糖得桃叶珊瑚苷和绿原酸粗提物，再用大孔树脂将桃叶珊瑚苷和绿原酸粗提物分离，最后分别用乙醇-乙酸乙酯溶液提取，过聚酰胺柱和硅胶柱纯化得终产物。该方法存在以下不足：①除乙醇外使用了石油醚、乙酸乙酯等易燃有毒的有机试剂，不安全；②使用乙醇-乙酸乙酯混合溶液萃取，试剂回收设备要求高，且工艺复杂不易实验产业化。

3)采用醇提法和酶法对杜仲叶进行提取，并依次采用壳聚糖沉淀法、用活性炭吸附法、膜分离法对提取液进行了初步纯化。该方法存在以下不足：①未实现将桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸以及总黄酮进行分离，活性成分纯度低；②提取工艺并不能满足活性成分被最大化提取出来。

相关技术中对杜仲成分的开发利用主要集中在橡胶工业和医药工业。医药行业对其开发主要集中在绿原酸和桃叶珊瑚苷等单一成分的提取，且其他活性成分往往作为杂质除去，造成了杜仲资源的极大浪费，产品生产成本高。且绿原酸、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和总黄酮的提取工艺侧重于单一成分或两个成分的提取，未建立高效的多种有效成分同时提取的工艺。

因此，需开发一种杜仲提取物的制备方法，该制备方法能够综合提取桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸和总黄酮。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种杜仲提取物的制备方法，该制备方法能够综合提取桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸和总黄酮。

根据本发明的第一方面实施例的一种杜仲提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将杜仲叶原料采用双频超声提取，收集提取液；

再将所述提取液脱醇后，固液分离，收集液相A；

所述双频超声提取的溶剂为第一酸性乙醇水溶液；

S2、将所述液相A过大孔树脂，依次采20℃～30℃的水、40℃～50℃的水和第一乙醇水溶液梯度洗脱；

收集40℃～50℃水的洗脱液和第一乙醇水溶液洗脱液；

所述第一乙醇水溶液洗脱液为总黄酮提取物；

S3、向40℃～50℃水的洗脱液中加入乙醇，使用氧化铝柱进行层析，收集流出液，随后依次采用第二乙醇水溶液、第三乙醇水溶液和第二酸性乙醇水溶液洗脱；

步骤S3中，所述乙醇与所述40℃～50℃水的洗脱液的体积比为1：1～1.5；

收集第二乙醇水溶液洗脱液，所述流出液和所述第二乙醇水溶液洗脱液即为桃叶珊瑚苷提取物；

收集第三乙醇水溶液洗脱液，即得京尼平苷酸提取物；

收集第二酸性乙醇水溶液洗脱液，即得绿原酸提取物。

桃叶珊瑚苷，化学名β-D-吡喃葡萄糖苷，属于环烯醚萜类物质。白色粉末或结晶，味苦，分子式为C₅H₂₂O₉，相对分子量为346.33。不同产地、不同采摘月份以及不同品种的杜仲叶中，桃叶珊瑚苷的含量各不相同，约为0.09％～6.69％。由于桃叶珊瑚苷的分子中存在双缩醛结构，化学性质不稳定，在提取过程中容易受外界影响而发生一些变化，所以不能通过高温、强光及长时间加热提取。桃叶珊瑚苷具有广泛的生物活性，能促进胶原蛋白的合成，降低大鼠机体的衰退；对人体内产生的自由基有清除作用，对组织匀浆、线粒体、微粒体氧化损伤有保护作用，具有抗氧化延缓衰老作用；桃叶珊瑚苷有降压作用，效果持久并无副作用，故对开发护肤保健产品具有重大的意义。桃叶珊瑚苷结构式如式I所示：：

京尼平苷酸为白色或淡黄色粉末，环烯醚萜类化合物，其分子式C₁₆H₂₂O。不同产地、不同采摘月份以及不同品种的杜仲叶中，京尼平苷酸的含量各不相同，约为0.11％～2.83％。京尼平苷酸不仅具有高效的降低血糖和调节血压的功效，还在抗癌、抗肿瘤、抗辐射损害、抗氧化、抗衰老等方面也有一定效果。京尼平苷酸结构式如式II所示：

绿原酸，属于苯丙素类物质，淡黄色固体粉末，分子式为C₁₆H₁₈O₉，分子量为345.3。绿原酸在杜仲叶中的含量约为1％-5.5％。绿原酸性质不稳定，因此不能经高温、强光及长时间加热进行提取。绿原酸有很强的药用价值和生物活性，具有抗菌、抗病毒、增高白血球数量、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经等作用。绿原酸结构式如式III所示：

杜仲中的黄酮类物质主要以苷类的形式存在，主要为糖苷形式。杜仲不同部位中总黄酮含量有很大的差别，杜仲叶中的总黄酮含量最高，约为6％～13.8％。黄酮类化合物中大部分都具有一定的生物活性，可用作食品、化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等。杜仲叶黄酮类化合物对羟自由基、超氧阴离子均有较强的清除作用，是一种天然有效的抗氧化剂，可用于治疗骨病和骨质疏松、可保护肝细胞、具有降低营养性高血脂和抗氧化作用。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述杜仲叶原料还需要进行前处理。所述前处理包括粉碎过筛。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述杜仲叶原料的粒度为50～70目。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述杜仲叶原料的粒度为60目。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述杜仲叶原料与所述第一酸性乙醇水溶液的料液比为1g：12mL～15mL。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述杜仲叶原料与所述第一酸性乙醇水溶液的料液比为1g：12mL。

在本发明中，术语“双频超声”是指二列超声波以相同和不同的频率共同作用在同一物系上，产生一个波形更复杂和范围更宽的频率谱。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声中，所述低频脉冲超声的频率为20kHz～25kHz。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声中，所述高频脉冲超声的频率为35kHz～40kHz。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声中，所述双频超声提取的时间为30min～40min。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声中，所述双频超声提取的温度为50℃以下。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声中，所述双频超声提取的温度为40℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声的功率为80W～120W。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声的功率为90W～110W。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声的功率为100W。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声的超声脉冲工作时间为3s～5s，超声脉冲间歇时间为1s～3s。

根据本发明的一些实施方式，所述双频超声的超声脉冲工作时间为4s，超声脉冲间歇时间为2s。

超声波的热效应可以提升溶剂溶解有效成分的能力，机械效应可以促进溶液流动，增强提取过程中的传质效果，空化效应可以破坏中药的细胞壁，加速有效成分溶解。因此超声波可以提髙中药有效成分提取效果。低频超声以增加超声空化效应，髙频超声以增加提取过程中的传质效果。双频超声具有协同效应，可以产生更为均匀的声场，扩大了超声作用范围，减少了没有空化作用的死角，作用效果大于两个单频超声的作用效果相加。双频超声中，一频率超声波产生的空化泡破裂后，形成新的空化泡的同时，也可以为另一频率超声波提供新的空化基础，使得空化效应显著，能够提高超声提取效率。

双频超声提取具体为复合双频逆流超声辅助提取，2支超声换能器同时工作，超声脉冲工作时间4s，超声脉冲间歇时间2s。逆流提取技术是在提取的过程中，杜仲叶原料和第一酸性乙醇溶液同时连续运动，但运动方向相反。逆流提取技术可使超声能量较均匀的分布到原料中，提高提取效率，且能提高能量的利用率，有利于节约能源。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述除醇的温度为50℃以下。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述除醇的温度为40℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，步骤S1中，所述除醇通过浓缩进行。

根据本发明的一些实施方式，所述浓缩为减压浓缩。

根据本发明的一些实施方式，所述减压浓缩的压力为0.07MPa～0.09MPa。

根据本发明的一些实施方式，所述第一酸性乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50％～70％。

根据本发明的一些实施方式，所述第一酸性乙醇水溶液的pH为3～4.5。

根据本发明的一些实施方式，所述第一酸性乙醇水溶液的pH为4～4.5。由此，能够在保证绿原酸和京尼平苷酸得率的前提下，提高桃叶珊瑚苷的提取转移率，减少桃叶珊瑚苷的损耗。

根据本发明的一些实施方式，所述大孔树脂为LSA-21、S-8、LX-207中的一种。由此，能够富集目标化合物(桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、绿原酸以及黄酮)。而桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸与绿原酸的极性均大于黄酮，较黄酮更易被水洗脱，通过水进行洗脱能够使得桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸与黄酮分离开。

根据本发明的一些实施方式，所述20℃～30℃的水的用量为1.5BV～2.5BV。

根据本发明的一些实施方式，所述20℃～30℃的水的用量为1.8BV～2BV。

根据本发明的一些实施方式，所述40℃～50℃的水的用量为5BV～6BV。

40℃～50℃的水可以显著提高解析率，使桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸与绿原酸等极性大的物质富集在一起，与黄酮分离开，从而达到分离的效果，还保证了收率和纯度，进一步降低后续分离的难度。

根据本发明的一些实施方式，所述第一乙醇水溶液的体积分数为50％～70％。

根据本发明的一些实施方式，所述第一乙醇水溶液的用量为2BV～2.5BV。

根据本发明的一些实施方式，步骤S2中，所述梯度洗脱的流速为1.5BV/h～2BV/h。

根据本发明的一些实施方式，所述氧化铝柱为酸性氧化铝柱或中性氧化铝柱。

根据本发明的一些实施方式，所述氧化铝柱为酸性氧化铝柱。

根据本发明的一些实施方式，所述40℃～50℃的水的洗脱液中的固含物与所述氧化铝的质量比为1：15～18。

根据本发明的一些实施方式，所述第二乙醇水溶液的体积分数为40％～50％。

根据本发明的一些实施方式，所述第二乙醇水溶液的用量为1.5BV～2BV。

根据本发明的一些实施方式，所述第三乙醇水溶液的体积分数为70％～80％。

根据本发明的一些实施方式，所述第三乙醇水溶液的用量为2BV～2.5BV。

根据本发明的一些实施方式，所述第二酸性乙醇水溶液的体积分数为80％～90％。

根据本发明的一些实施方式，所述第二酸性乙醇水溶液的用量为2.5BV～3BV。

根据本发明的一些实施方式，所述第二酸性乙醇水溶液的pH为2.5～3.5。

桃叶珊瑚苷与氧化铝可形成氢键作用力，但酸性氧化铝带微弱正电荷，可削弱对桃叶珊瑚苷的氢键作用力，减少桃叶珊瑚苷的吸附，部分吸附的桃叶珊瑚苷也极易被洗脱；京尼平苷酸与绿原酸因带有羧基可与酸性氧化铝中的Cl^-或NO₃ ^-发生交换作用而被吸附，高浓度的乙醇水能够洗脱酸性氧化铝所吸附的京尼平苷酸，而绿原酸含有邻二酚羟基，可与铝离子络合而被牢固吸附到酸性氧化铝上，通过酸性乙醇水溶液进行解络，能进一步洗脱绿原酸，从而实现了桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸的分离。

根据本发明的一些实施方式，步骤S3中，40℃～50℃水的洗脱液还需要预浓缩。

根据本发明的一些实施方式，所述预浓缩的温度为50℃以下。

根据本发明的一些实施方式，所述预浓缩的温度为40℃～50℃。

根据本发明的一些实施方式，所述预浓缩的程度为：至原体积的1/18～1/15。

根据本发明的一些实施方式，所述预浓缩为减压浓缩。

通过限定合适的减压浓缩的温度和压力，减少了热敏性活性成分(包括桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸)在浓缩过程中的损耗。

根据本发明的一些实施方式，所述第一酸性乙醇水溶液和第二酸性乙醇水溶液的pH分别独立采用盐酸调节。

根据本发明实施例的一种杜仲提取物的制备方法，具备如下有益效果：

采用复合双频逆流超声辅助低温提取可使有效成分尽可能被提取出来，降低热敏活性成分的损耗。且采用乙醇水溶液进行提取可有效地降低多糖、蛋白质等亲水性的大分子物质的提取率，降低后期除杂难度。

通过依次进行复合双频逆流超声提取、大孔树脂粗分离、氧化铝柱层析分离，能够分离得到杜仲叶中的总黄酮、绿原酸、桃叶珊瑚苷和京尼平苷酸，且纯度均大于85％。除乙醇外本发明实施例的制备方法未使用其他有机试剂，且工艺简单，利于实现工业化生产。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例1的桃叶珊瑚苷提取物的色谱图；

图2为本发明实施例1的京尼平苷酸提取物的色谱图；

图3为本发明实施例1的绿原酸提取物的色谱图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

若无特别说明，本发明中“室温”代表20℃～30℃。下述实施例中所用的水，如无特别说明，则使用的为常温水，即20℃～30℃的水。

杜仲叶原料供应商：张家界国健中药材开发有限公司。杜仲叶原料中，桃叶珊瑚苷含量为2.62％，京尼平苷酸含量为1.57％，绿原酸含量为3.56％，总黄酮含量为9.84％。

桃叶珊瑚苷(纯度：99.50％)标准品供应商：海诗丹德标准技术服务有限公司；

京尼平苷酸(纯度：100.0％)标准品供应商：海诗丹德标准技术服务有限公司；

绿原酸(纯度：96.10％)标准品供应商：中国食品药品检定研究院；

芦丁(纯度：98.0％)标准品供应商：中国食品药品检定研究院。

LSA-21、S-8、LX-207大孔树脂供应商：西安蓝晓科技新材料股份有限公司。

酸性氧化铝：淄博硕仁氧化铝科技有限公司。

下述实施例中，桃叶珊瑚苷的HPLC检测方法如下：

色谱柱：WONDASILTMC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

进样量：20μL；

柱温：25℃；

流动相：甲醇：水的体积比为10：90；

流速：1mL/min；

检测波长：212nm。

桃叶珊瑚苷检测样品溶液的制备方法由如下步骤组成：

称取检测样品适量至50mL容量瓶中，加体积分数为10％的甲醇水溶液超声溶解，冷却至室温，再用体积分数为10％的甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，备用。

下述实施例中，京尼平苷酸的HPLC检测方法如下：

色谱柱：WONDASILTMC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

进样量：20μL；

柱温：25℃；

流动相：乙腈：质量分数为0.1％磷酸水溶液的体积比为17：83；

流速：1mL/min；

检测波长：208nm。

京尼平苷酸检测样品溶液制备方法，由如下步骤组成：

称取检测样品适量至25mL容量瓶中，加体积分数为50％的甲醇水溶液超声溶解，冷却至室温，用体积分数为50％的甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，备用。

下述实施例中，绿原酸的HPLC检测方法如下：

色谱柱：WONDASILTMC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；

进样量：20μL；

柱温：25℃；

流动相：乙腈：质量分数为0.4％的磷酸水溶液的体积比为13：87；

流速：1mL/min；

检测波长：327nm。

绿原酸检测样品溶液制备：称取样品适量至25mL容量瓶中，加50％甲醇溶液超声溶解，冷却至室温，用体积分数为50％的甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，备用。

下述实施例中，杜仲叶总黄酮检测方法(硝酸铝比色法)如下：

(1)芦丁标准溶液的制备：称取芦丁标准品10.0mg于50mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理使溶解，冷却后，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

(2)标准曲线的制备：精密量取芦丁标准溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL和6.0mL，分别置于25mL容量瓶中，各加入5％亚硝酸钠溶液1mL，并加水补足至7mL，使混匀，放置6min；加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；加4％氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min。用乙醇替代芦丁标准溶液，参照上述步骤制备得到空白对照。在510nm的波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(3)样品测定：精密称取样品适量，置于25mL容量瓶中，加适量30％乙醇以溶解样品，超声30min，冷却后，加30％乙醇至刻度，摇匀，过滤后，得滤液；取3.0mL滤液于25mL容量瓶中，加5％亚硝酸钠溶液1mL，并加水补足至7mL，使混匀，放置6min；加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min；加4％氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，得到样品溶液。用30％乙醇替代滤液，参照上述步骤制备得到空白对照。在510nm的波长处测定吸收度(A_510nm)，代入步骤(2)的标准曲线，计算得到样品溶液中芦丁的质量。

下述实施例中，HPLC检测方法中，含量计算公式如下：

其中，A_样指进样的样品溶液中某成分(如绿原酸)的对应峰面积；A_对指标准品溶液中某成分(如绿原酸)的峰面积；W_样指样品的称样量(mg)；W_对指标准品的称样量(mg)；V_样指样品溶液进样的体积(mL)；V_对指标准品溶液进样的体积(mL)；K指标准品的纯度。

UV检测方法中，含量计算公式如下：

其中，C指样品溶液的A_510nm检测值代入标准曲线后得到的样品溶液浓度；V₁指配制的滤液体积(在本申请实施例中为25mL)；V₂指样品溶液与其中滤液的体积比(在本申请实施例中为25/3)；W指样品的称样量。

收率的计算公式如下：

其中，m指提取物的质量；w1指提取物中某成分(如绿原酸)的含量；M指原料的质量；w2指原料中某成分(如绿原酸)的含量。

下面详细描述本发明的具体实施例。

实施例1

本实施例提供一种提取杜仲提取物的制备方法，由以下步骤组成：

S1、将杜仲叶原料破碎500g至60目，用12倍体积(体积与质量比12：1)的50％乙醇(pH＝4，盐酸调)进行复合双频逆流超声辅助提取(低频频率为20KHz，高频频率为35KHz，超声功率为100W，工作方式为2支超声换能器同时工作，超声脉冲工作时间4s，超声脉冲间歇时间2s)，50℃提取40min，收集提取液；

将提取液减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)至无醇味，进行固液分离，收集液相A。

S2、将液相A过LSA-21大孔树脂，依次用1.8BV水、5BV 50℃水、2.5BV 50％乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，收集50℃水洗脱液和50％乙醇水溶液洗脱液。

S3、将50℃水洗脱液减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)至原体积的1/16，加95％乙醇使溶液的乙醇浓度为50％，得到浓缩液；再将浓缩液过酸性氧化铝柱层析，收集流出液，随后依次用1.5BV 50％乙醇水溶液、2.5BV 70％乙醇水溶液、2.5BV酸性90％乙醇水溶液(pH＝3，盐酸调)进行洗脱，收集50％乙醇水溶液洗脱液、70％乙醇水溶液洗脱液、酸性90％乙醇水溶液洗脱液；

其中，酸性氧化铝柱层析时，浓缩液中固含物与氧化铝的质量比为1：15。

将上述步骤S2制得的50％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)，干燥得47.93g总黄酮提取物；

将流出液与上述步骤S3制得的50％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)，干燥得12.52g桃叶珊瑚苷提取物(检测图谱见图1，保留时间：5.897min)；

将上述步骤S3制得的70％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)，干燥得7.67g京尼平苷酸提取物(检测图谱见2，保留时间：11.823min)；

将上述步骤S3制得的酸性90％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)，干燥得16.62g绿原酸提取物(检测图谱见3，保留时间：8.277min)。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为90.29％，收率为87.96％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为90.35％，收率为86.37％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为85.99％，收率为83.99％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为92.39％，收率为86.27％。

实施例2

S1、将杜仲叶500g原料破碎至40目，用15倍体积(体积与质量比12：1)的70％乙醇(pH＝4.5，盐酸调)进行复合双频逆流超声辅助提取(低频频率为20KHz，高频频率为35KHz，超声功率为150W，工作方式为2支超声换能器同时工作，超声脉冲工作时间4s，超声脉冲间歇时间2s)，40℃提取30min，收集提取液；

将提取液减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)至无醇味，进行固液分离，收集液相A。

S2、将液相A过S-8极性大孔树脂，依次用2BV水、6BV 40℃水、2BV 70％乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为2BV/h，收集40℃水洗脱液和70％乙醇水溶液洗脱液。

S3、将40℃水洗脱液减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)至原体积的1/17，加95％乙醇使溶液的乙醇浓度为45％，得到浓缩液；再将浓缩液过酸性氧化铝柱层析，收集流出液，随后依次用2BV 45％乙醇水溶液、2.5BV 80％乙醇水溶液、3BV酸性80％乙醇水溶液(pH＝2.5，盐酸调)洗脱，收集45％乙醇水溶液洗脱液、80％乙醇水溶液洗脱液、酸性80％乙醇水溶液洗脱液；

其中，酸性氧化铝柱层析时，浓缩液中固含物与氧化铝的质量比为1：18。

将上述步骤S2制得的70％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)，干燥得48.66g总黄酮提取物；

将流出液与上述步骤S3制得的45％乙醇水溶液进行减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)，干燥得12.40g桃叶珊瑚苷提取物；

将上述步骤S3制得的80％乙醇水洗脱进行减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)，干燥得7.63g京尼平苷酸提取物；

将上述步骤S3制得的酸性80％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)，干燥得16.84g绿原酸提取物。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为91.15％，收率为90.14％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为90.65％，收率为84.33％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为86.80％，收率为84.41％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为91.23％，收率为86.33％。

实施例3

S1、将杜仲叶500g原料破碎至40目，用12倍体积(体积与质量比12：1)的70％乙醇(pH＝4，盐酸调)进行复合双频逆流超声辅助提取提取(低频频率为20KHz，高频频率为35KHz，提取时间30min，超声功率为100W，工作方式为2支超声换能器同时工作，超声脉冲工作时间4s，超声脉冲间歇时间2s)，40℃提取30min，收集提取液；

将提取液减压浓缩(压力：0.08Mpa，温度：45℃)至无醇味，进行固液分离，收集液相A。

S2、将液相A过LX-207极性大孔树脂，依次用2BV水、5BV 40℃水、2BV 60％乙醇水溶液洗脱，洗脱流速为1.5BV/h，收集40℃水洗脱液和70％乙醇水溶液洗脱液。

S3、将40℃水洗脱液减压浓缩(压力：0.08Mpa，温度：45℃)至原体积的1/18，加95％乙醇使溶液的乙醇浓度为40％，得到浓缩液；再将浓缩液过酸性氧化铝柱层析，收集流出液，随后依次用2BV 40％乙醇水溶液、2BV 75％乙醇水溶液、2.5BV酸性90％乙醇水溶液(pH＝3.5，盐酸调)洗脱，收集40％乙醇水溶液洗脱液、75％乙醇水溶液洗脱液、酸性90％乙醇水溶液洗脱液；

其中，酸性氧化铝柱层析时，浓缩液中固含物与氧化铝的质量比为1：16。

将上述步骤S2制得的70％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)，干燥得48.71g总黄酮提取物；

将流出液与上述步骤S3制得的40％乙醇水溶液进行减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)，干燥得12.10g桃叶珊瑚苷提取物；

将上述步骤S3制得的75％乙醇水洗脱进行减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)，干燥得7.53g京尼平苷酸提取物；

将上述步骤S3制得的酸性90％乙醇水溶液洗脱液进行减压浓缩(压力：0.09Mpa，温度：40℃)，干燥得16.43g绿原酸提取物。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为91.67％，收率为90.76％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为91.31％，收率为84.33％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为86.35％，收率为82.84％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为91.83％，收率为84.78％。

对比例1

相比于实施例1，区别仅在于：将步骤S2中的5BV 50℃水替换为5BV 20％乙醇水溶液。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为92.14％，收率为82.87％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为87.36％，收率为86.56％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为80.88％，收率为84.38％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为84.52％，收率为86.69％。20％乙醇水洗脱能力强，目标成分转移率虽然偏高，但在该处理下，黄酮与杂质均被部分洗脱，反而使得目标成分纯度偏低，进一步导致了氧化铝纯化获得的产品的纯度偏低，收率略高；而黄酮与杂质被部分洗脱也使得后续高浓度乙醇(50％乙醇水溶液)洗脱获得的黄酮纯度偏高，而收率下降。

对比例2

相比于实施例1，区别仅在于：将步骤S2中的5BV 50℃水替换为5BV常温水(26℃)。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为87.52％，收率为89.15％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为91.03％，收率为82.08％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为87.60％，收率为79.14％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为93.16％，收率为80.70％。

对比例3

相比于实施例1，区别仅在于：步骤S2中，将50℃水洗脱液减压浓缩(压力：0.07Mpa，温度：50℃)至原体积的1/16后，直接过酸性氧化铝柱层析。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为90.39％，收率为87.88％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为86.11％，收率为87.74％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为80.51％，收率为78.11％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为85.39％，收率为80.88％。水溶液直接过酸性氧化铝柱层析，会使得杂质与目标成分更易被洗脱，导致桃叶珊瑚苷部分存在少量被洗脱下来的京尼平苷酸，使得桃叶珊瑚苷的收率偏高，纯度反而偏低；京尼平苷酸部分存在少量被洗脱下来的绿原酸，使得京尼平苷酸的收率与纯度均偏低；绿原酸由于少量被洗脱至京尼平苷酸部分，使得纯度与收率均偏低。

对比例4

相比于实施例1，区别仅在于：将步骤S3中的酸性氧化铝柱层析替换为中性氧化铝柱层析。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为90.89％，收率为87.84％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为83.70％，收率为78.79％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为79.85％，收率为75.93％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为83.94％，收率为77.34％。

对比例5

相比于实施例1，区别仅在于：将步骤S1中的50％乙醇(pH＝4，盐酸调)替换为50％乙醇(pH＝3，盐酸调)。

经UV检测，总黄酮提取物中，总黄酮含量为90.56％，收率为87.66％。经HPLC检测，桃叶珊瑚苷提取物中，桃叶珊瑚苷含量为81.34％，收率为77.56％；京尼平苷酸提取物中，京尼平苷酸含量为86.13％，收率为83.92％；绿原酸提取物中，绿原酸含量为93.66％，收率为87.25％。

上面结合具体实施方式对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种从杜仲叶中提取总黄酮、桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和绿原酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将杜仲叶原料采用双频超声提取，收集提取液；

再将所述提取液脱醇后，固液分离，收集液相A；

所述双频超声提取的溶剂为第一酸性乙醇水溶液；

所述第一酸性乙醇水溶液的pH为4~4.5，所述第一酸性乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50%~70%，所述杜仲叶原料与所述第一酸性乙醇水溶液的料液比为1g：12mL~15mL；

S2、将所述液相A过大孔树脂，依次采20℃~30℃的水、40℃~50℃的水和第一乙醇水溶液梯度洗脱；

所述大孔树脂为LSA-21、S-8、LX-207中的一种；

所述第一乙醇水溶液的体积分数为50%~70%；所述第一乙醇水溶液的用量为2BV~2.5BV；

收集40℃~50℃水的洗脱液和第一乙醇水溶液洗脱液；

所述第一乙醇水溶液洗脱液浓缩、干燥得总黄酮提取物；

S3、向所述40℃~50℃水的洗脱液中加入乙醇，使用氧化铝柱进行层析，收集流出液，随后依次采用第二乙醇水溶液、第三乙醇水溶液和第二酸性乙醇水溶液洗脱；

所述氧化铝柱为酸性氧化铝柱；

所述第二乙醇水溶液的体积分数为40%~50%；所述第二乙醇水溶液的用量为1.5BV~2BV；

所述第三乙醇水溶液的体积分数为70%~80%；所述第三乙醇水溶液的用量为2BV~2.5BV；

所述第二酸性乙醇水溶液的体积分数为80%~90%；所述第二酸性乙醇水溶液的pH为2.5~3.5；所述第二酸性乙醇水溶液的用量为2.5BV~3BV；

步骤S3中，所述乙醇与所述40℃~50℃水的洗脱液的体积比为1：1~1.5；

收集第三乙醇水溶液洗脱液浓缩、干燥得京尼平苷酸提取物；

收集第二酸性乙醇水溶液洗脱液浓缩、干燥得绿原酸提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双频超声中，低频脉冲超声的频率为20kHz~25kHz；高频脉冲超声的频率为35kHz~40kHz，所述双频超声提取的时间为30min~40min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S3中，40℃~50℃水的洗脱液还需要预浓缩；所述预浓缩的温度为50℃以下；所述预浓缩为减压浓缩；所述减压浓缩的压力为0.07MPa~0.09MPa。