CN101953868A

CN101953868A - 蒺藜总皂苷的检测方法

Info

Publication number: CN101953868A
Application number: CN 201010283475
Authority: CN
Inventors: 沈丽娟; 邹兆鹏; 王国栋; 孙申国; 钱本余; 孙东成; 刘巍; 朱天全; 程志国
Original assignee: JILIN AODONG ZHAONAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: JILIN AODONG ZHAONAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2030-09-15
Also published as: CN101953868B

Abstract

本发明公开了一种蒺藜提取物的检测方法，该方法为：色谱条件：室温，相对湿度：25-40％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～90％乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，流速：0.4～0.6ml/min，柱温：25～45℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105～120℃，气体流速：1～3L/min。本方法具有良好的精密性、重现性、稳定性。

Description

蒺藜总皂苷的检测方法

技术领域

本发明涉及蒺藜提取物的检测方法，属于中药领域。

技术背景

白蒺藜(Tribulus Terrestris L)为蒺藜科蒺藜属植物，具有活血通络、平肝潜阳、祛湿化痰、宣痹通阳、补益肝肾等功效。历代本草多有记载，《本草纲目》日：“蒺藜气味苦温，其性宣通，治胸痹痞满，利肝肾。”《本经》载：“蒺藜主恶血，破积聚。”《本草再新》“益气化痰，散湿。”《本草汇言》谓其“去风下气，行水化瘀之药也。”蒺藜总皂苷临床已被应用多年以治疗心血管疾病。临床及实验药理学都证明可改善心功能、缩小心肌梗塞面积、缓解心绞痛的症状、延长心绞痛的发作间期、减少心绞痛的发作次数，对陈旧性心肌梗塞伴左室功能异常者亦能减轻其胸闷、气促和心悸等症状，增加左室收缩功能和排血量。

目前，现有技术并没有公开蒺藜提取物的指纹图谱的检测方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种蒺藜提取物的检测方法。

本发明目的在于提供一种蒺藜总皂苷的检测方法。

本发明提供一种蒺藜提取物的高效液相-蒸发光散射指纹图谱检测方法，该方法包括如下步骤：

色谱条件：室温，相对湿度：25-40％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～90％乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速：0.4～0.6ml/min，柱温：25～45℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105～120℃，气体流速：1～3L/min。

所述色谱条件优选室温：20℃，相对湿度：35％；

供试品溶液的制备：称取蒺藜提取物适量，加水适量，超声处理5-20分钟，放冷，滤过，制成每1ml含3-6mg的溶液，即得；其中超声优选分钟10；优选制成每1ml含5mg的溶液；

测定法：精密吸取供试品溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

本发明检测方法优选采用如下梯度洗脱：

所述蒺藜提取物为蒺藜的有机或无机溶剂提取物，包括但不限于醇提过柱精制物、水提过柱精制物、醇提物或水提物。

所述蒺藜提取物优选为：取蒺藜草分别加水5～15倍量，煎煮1～5次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩放冷，加入乙醇，搅匀，静置，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60％～85％乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，得蒺藜提取物。

本发明提供蒺藜总皂苷的检测方法，该方法包括如下步骤：

所述色谱条件优选室温：20℃，相对湿度：35％；

供试品溶液的制备：称取蒺藜皂苷适量，加水适量，超声处理5-20分钟，放冷，滤过，制成每1ml含3-6mg的溶液，即得；其中超声优选10分钟；优选制成每1ml含5mg的溶液；

对照品溶液的制备：精密称取蒺藜呋甾皂苷甲对照品适量，加水制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。

测定法：精密吸取供试品、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；

供试品指纹图谱中，指纹图谱应有10个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间：1^#0.35-0.43、2^#0.40-0.48、3^#0.40-0.50、4^#0.65-0.79、

5^#0.67-0.81、6^#0.83-1.01、7^#0.87-1.07、8^#1.00、9^#1.21-1.47、10^#1.30-1.60；相对峰面积：1^#0.4～1.0、2^#0.2～0.3、4^#0.2～0.4、6^#0.2～0.4、8^#1.00、10^#0.2～0.4。

本发明检测方法优选采用如下梯度洗脱：

供试品指纹图谱中，指纹图谱应有13个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间：1^#0.35-0.43、2^#0.40-0.48、3^#0.40-0.50、4^#0.65-0.79、

5^#0.67-0.81、6^#0.83-1.01、7^#0.87-1.07、8^#1.00、9^#1.21-1.47、10^#1.30-1.60、11^#1.38-1.86、12^#1.44-1.94、13^#1.73-2.33；

相对峰面积：1^#0.4～1.0、2^#0.2～0.3、4^#0.2～0.4、6^#0.2～0.4、8^#1.00、10^#0.2～0.4、12^#0.5～0.9。

所述蒺藜皂苷可以为市场购买，也可以为蒺藜醇提过柱精制物、水提过柱精制物、醇提物或水提物；所述蒺藜皂苷优选由如下方法制备：取蒺藜草分别加水5～15倍量，煎煮1～5次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩放冷，加入乙醇，搅匀，静置，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60％～85％乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，得蒺藜皂苷；

所述蒺藜皂苷更优选由如下方法制备：取蒺藜草(蒺藜地上干燥部分)切段，分别加水5～15倍量，煎煮1～5次，每次1～4h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.1～1.25(50～60℃)，放冷，加入80％～99％乙醇，搅匀，静置1～5h，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，药液流速控制在400～700L/h，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60％～85％乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.05～1.15(50～60℃)，得蒺藜皂苷浓缩液，干燥，得蒺藜皂苷。

本发明对流动相进行了大量的选择工作，如考察甲醇-水溶剂系统，结果发现，在实际可行的测定时间内，很难得到完全基线分离的色谱图，且梯度的微小变化，对图谱影响较大。

本方法具有良好的精密性、重现性、稳定性。本发明展开剂在75分钟内可以获得10个有效检测峰，在75分钟后，当对展开剂进行探索性调整时，意外的获得3个有效检测峰。

下述实验用于进一步说明本发明的效果，但是对本发明范围的限制。

实验例1精密性试验

对实施例1的检测方法进行重现性试验，按照实施例1的方制成供试液，经微孔滤膜滤过注入液相色谱仪，连续进样测试五次，考察色谱峰的相对保留时间的一致性及单峰面积大于总峰面积10％的指纹峰(1、8、10号三个峰)，2、3号和4、5号未能达基线分离，分别作为峰组计算，其中30分钟以内组峰面积大于5％的指纹峰(2～3#)峰面积或峰面积比值的稳定性，结果列于表1～4。

表1精密度试验绝对保留时间

表2精密度试验相对保留时间

表3精密度试验峰面积

*只有8(s)的峰面积＞20％。

表4精密度试验相对峰面积比值

结果示出，五次测定图谱的共有峰相对保留时间非常一致，几无变化。单峰面积占总峰面积20％以上的共有峰只有对照峰(8#)，其五次测定的峰面积RSD为4.23％。其余4个考察峰(或峰组)的面积比值RSD依次为4.04、1.18、2.73、2.50％。符合国家药品审评中心于2001年发布的“中药注射液指纹图谱研讨会”纪要规定，“在方法学考察中，对峰面积大于20％的共有峰，其峰面积比值的RSD不得大于5％；峰面积小于20％的共有峰，RSD可不作规定”的意见，认证本方法具有良好的精密性。

实验例2重现性试验

对实施例1的检测方法进行重现性试验，按照实施例1的方法制成5个独立供试液，依法连续测定，结果列于表5～8

表5重现性试验绝对保留时间

表6重现性试验相对保留时间

表7重现性试验峰面积

*只有8(s)的峰面积＞20％。

表8重现性试验峰面积比值

如表所示，五次独立测定的共有峰相对保留时间非常一致，单峰面积大于20％的8#(对照峰)峰面积的RSD为2.18％，远小于5％，其余4个考察峰(或峰组)的面积比值RSD依次为3.57、4.54、3.85、5.09％。表明本方法具有良好重现性。

实验例3稳定性试验

对实施例1的检测方法进行稳定性试验，每间隔90分钟测定一次，连续测定6小时(5次)，结果列于表9～12。

表9稳定性试验绝对保留时间

表10稳定性试验相对保留时间

表11稳定性试验峰面积

*只有8(s)的峰面积＞20％。

表12稳定性试验相对峰面积比值

如表所示，单峰面积大于20％的8#(对照峰)峰面积的RSD为2.88％，远小于5％，其余4个考察峰(或峰组)的面积比值RSD依次为2.64、5.23、6.16、7.75％。结果表明，本供试液具有可行的稳定性。

实验例4指纹图谱相似度分析

选用中南大学指纹图谱相似度评价软件，对10批蒺藜粗皂苷(制备方法同实施例3的方法)的采用实施例1高效液相-蒸发光散射指纹图谱方法，取其平均色谱或中位数色谱作为对比标样，进行全谱相似度分析。蒺藜粗皂苷指纹图谱的全谱相似度，均大于0.9，表明各组内10批样品的指纹图谱具有良好的相似性。

实验例5展开剂调整后的指纹图谱

取蒺藜粗皂苷(制备方法同实施例3的方法)2批，根据实施例2的方法测定指纹图谱，计算共有峰相对保留时间、峰面积及峰面积比值13，结果示出，十批粗皂苷的共有峰及其相对保留时间基本一致，其峰面积比值基本相同，也与蒺藜草的指纹图谱相吻合。

具体实施方式

实施例1：

色谱条件：室温：20℃，相对湿度：35％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～90％乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速：0.4～0.6ml/min，柱温：25～45℃；蒸发光散射检测器：漂移管温度：105～120℃，气体流速：1～3L/min。

供试品溶液的制备：精密称取实施例3的蒺藜粗皂苷适量，加水适量，超声处理10分钟，放冷，滤过，制成每1ml含5mg的溶液，即得。

测定法：精密吸取供试品、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

蒸发光散射检测器检测，经HPLC分离的液体组分，进入检测器，经雾化，流动相被气化，检测组分形成的微小颗粒，对检测光形成散射作用，进而转化为电信号，转变为响应值。

供试品指纹图谱中，指纹图谱应有10个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间为0.38，0.45，0.47，0.75，0.79，0.93，0.98，1.00，1.30，1.42。相对保留面积：1^#0.62、2^#0.4、4^#0.3、6^#0.32、8^#1.00、10^#0.26。

实施例2：

测定法：精密吸取对照品、供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

供试品指纹图谱中，指纹图谱应有13个共有峰，与对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，0.37，0.45，0.46，0.75，0.78，0.92，0.98，1.00，1.29，1.41，1.59，1.65，1.99。相对峰面积比值：1^#0.62、2^#0.4、4^#0.3、6^#0.32、8^#1.00、10^#0.26、12^#0.69。

实施例3：蒺藜皂苷制备

取蒺藜草(蒺藜地上干燥部分)切段，分别加水5～15倍量，煎煮1～5次，每次1～4h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.1～1.25(50～60℃)，放冷，加入80％～99％乙醇，搅匀，静置1～5h，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，药液流速控制在400～700L/h，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60％～85％乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至相对密度1.05～1.15(50～60℃)，得蒺藜皂苷浓缩液，干燥，得蒺藜皂苷。

实施例4：

供试品溶液的制备：精密称取实施例5的蒺藜提取物适量，加水适量，超声处理10分钟，放冷，滤过，制成每1ml含5mg的溶液，即得。

测定法：精密吸取供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

实施例5：

取蒺藜草(蒺藜地上干燥部分)切段，分别加水5～15倍量，煎煮1～5次，每次3h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度1.1～1.25(50～60℃)，放冷，加入85％乙醇，搅匀，静置4h，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，干燥即得提取物。

Claims

1.一种蒺藜提取物的指纹图谱检测方法，其特征在于该方法为：

色谱条件为：室温，相对湿度：25-40％；以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以60～90％乙腈溶液为流动相A，以水为流动相B，梯度洗脱，流速：0.4～0.6ml/min，柱温：25～45℃；蒸发光散射检测器的条件为：漂移管温度：105～120℃，气体流速：1～3L/min；取蒺藜提取物制成每1ml含3-6mg的溶液；注入液相色谱仪，记录色谱图。

2.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于梯度洗脱过程为：第0.01分钟：流动相A乙腈溶液为24％，流动相B水为76％；第8分钟：流动相A乙腈溶液为32％，流动相B水为68％；第45分钟：流动相A乙腈溶液为40％，流动相B水为60％；第75分钟：流动相A乙腈溶液为55％，流动相B水为45％。

3.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备方法为：称取蒺藜提取物适量，加水适量，超声处理5-20分钟，放冷，滤过，制成每1ml含3-6mg的溶液。

4.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于色谱条件中室温为：20℃；相对湿度为：35％。

5.如权利要求3所述的指纹图谱检测方法，其特征在于供试品溶液的制备中超声处理10分钟；制成每1ml含5mg的溶液。

6.如权利要求2所述的指纹图谱检测方法，其特征在于梯度洗脱过程为：

第0.01分钟：流动相A乙腈溶液为24％，流动相B水为76％；第8分钟：流动相A乙腈溶液为32％，流动相B水为68％；第45分钟：流动相A乙腈溶液为40％，流动相B水为60％；第75分钟：流动相A乙腈溶液为55％，流动相B水为45％；第80分钟：流动相A乙腈溶液为75％，流动相B水为25％；第120分钟：流动相A乙腈溶液为75％，流动相B水为25％。

7.如权利要求2所述的指纹图谱检测方法，其特征在于蒺藜提取物指纹图谱中为10个共有峰，与蒺藜呋甾皂苷甲为对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间：1^#0.35-0.43、2^#0.40-0.48、3^#0.40-0.50、4^#0.65-0.79、5^#0.67-0.81、6^#0.83-1.01、7^#0.87-1.07、8^#1.00、9^#1.21-1.47、10^#1.30-1.60；相对峰面积：1^#0.4～1.0、2^#0.2～0.3、4^#0.2～0.4、6^#0.2～0.4、8^#1.00、10^#0.2～0.4。

8.如权利要求6所述的指纹图谱检测方法，其特征在于蒺藜提取物指纹图谱中为13个共有峰，与蒺藜呋甾皂苷甲为对照品色谱峰相对应的8号峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积比值，相对保留时间：1^#0.35-0.43、2^#0.40-0.48、3^#0.40-0.50、4^#0.65-0.79、5^#0.67-0.81、6^#0.83-1.01、7^#0.87-1.07、8^#1.00、9^#1.21-1.47、10^#1.30-1.60、11^#1.38-1.86、12^#1.44-1.94、13^#1.73-2.33；相对峰面积：1^#0.4～1.0、2^#0.2～0.3、4^#0.2～0.4、6^#0.2～0.4、8^#1.00、10^#0.2～0.4、12^#0.5～0.9。

9.如权利要求1所述的指纹图谱检测方法，其特征在于所述蒺藜提取物由如下方法制备：取蒺藜草分别加水5～15倍量，煎煮1～5次，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩放冷，加入乙醇，搅匀，静置，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60％～85％乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩，即得蒺藜提取物。

10.如权利要求9所述的指纹图谱检测方法，其特征在于所述蒺藜提取物由如下方法制备：所述蒺藜皂苷更优选由如下方法制备：取蒺藜草切段，分别加水5～15倍量，煎煮1～5次，每次1～4h，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至50～60℃相对密度1.1～1.25，放冷，加入80％～99％乙醇，搅匀，静置1～5h，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，滤过，滤液通过已处理好的大孔吸附树脂柱，药液流速控制在400～700L/h，再用水洗至流出液近无色澄清，继用60％～85％乙醇洗脱至洗脱液无苦味，收集洗脱液，减压回收乙醇，浓缩至50～60℃相对密度1.05～1.15，得蒺藜皂苷浓缩液，干燥，得蒺藜皂苷。