CN113125612A - 一种苦地丁高效液相特征图谱方法的构建 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种可适用于整体控制苦地丁药材、饮片、标准汤剂、提取液、配方颗粒及苦地丁其它制剂质量的高效液相特征图谱检测方法。本发明采用高效液相色谱建立了苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的特征图谱，并确定了7个特征峰，其中6号峰为紫堇灵峰。本发明所建立的HPLC特征图谱检测方法色谱条件梯度简单，色谱峰峰形好，分离度、专属性好，精密度高，稳定性、耐用性好，有利于评价苦地丁制剂生产全过程相关工艺的科学性、合理性，用于指导生产制备过程投料、规范生产操作，更能整体控制苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其它苦地丁制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保苦地丁的临床用药的安全、有效、稳定。

Description

一种苦地丁高效液相特征图谱方法的构建
技术领域
本申请涉及一种苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒和其它苦地丁制剂的特征图谱的HPLC检测方法，属于中药检测、鉴别领域。
背景技术
苦地丁是为罂粟科植物地丁紫堇的全草。具有清热解毒，活血消肿的功效。常用于流行性感冒，上呼吸道感染，支气管炎，急性肾炎，黄疸，肠炎，疔疮肿毒，淋巴结结核，眼结膜炎，角膜溃疡。
苦地丁化学成分较多且复杂，含有紫堇灵、乙酰紫堇灵、原阿片碱、黄连碱等多种生物碱。另外还含有香豆素、甾体皂甙、酚性物质、中性树脂和挥发油等。目前，《中国药典》2020年版一部项下收载了采用高效液相色谱法测定紫堇灵的含量，尚未建立特征图谱检查方法及标准。其它，有一篇文献研究了苦地丁药材（苦地丁药材超高效液相色谱指纹图谱研究）指纹图谱，但该方法存在以下问题：1）流动相梯度较多，条件过于复杂，必然导致条件难于转移；2）色谱峰分离度差，基线波动极其严重；3）未进行中间精密度和耐用性考察，即使非常微小的条件变动也可能导致方法不耐用，仅能在论文发表单位等极少数单位使用，无法实现试验室间的顺利转移，无法用来控制苦地丁药材的质量。另外，该报道是单独针对苦地丁药材建立的指纹图谱，未见苦地丁饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱研究的报道。苦地丁标准汤剂和配方颗粒均经水溶液提取、浓缩所得，化学成分主要是水溶性强的极性化合物，另外，在中药提取过程中经常存在物质之间的转化，其成分和苦地丁药材、饮片差别很大，因此，现有的检测方法无法用于苦地丁标准汤剂、配方颗粒的成分检测，无法有效对比和分析苦地丁药材、饮片、标准汤剂、苦地丁提取液、配方颗粒化学成分的差异与变化，难以深入认识苦地丁药效物质基础在从药材→饮片→提取液→浓缩液→喷干粉→配方颗粒成品的工艺过程的传递情况，难以整体评价和控制从苦地丁药材、饮片到配方颗粒成品的工艺过程。因此，建立统一的苦地丁药材、饮片、标准汤剂、提取液、浓缩液、喷干粉、配方颗粒特征图谱测定方法，可用于指导生产制备过程投料、规范生产操作，有利于评价苦地丁制剂生产全过程相关工艺的科学性、合理性，更能整体控制苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其它苦地丁制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保苦地丁的临床用药的安全、有效、稳定。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种适用于苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其它苦地丁制剂的HPLC特征图谱检测方法，该方法色谱条件梯度简单，色谱峰峰形好，分离度好，专属性好，精密度高，稳定性、耐用性好，易于验室间转移，可用于评价苦地丁制剂生产全过程工艺的合理性，更能整体控制苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其它苦地丁制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保苦地丁的临床用药的安全、有效、稳定。
本发明的苦地丁制剂全过程、整体的HPLC指纹图谱的检测方法，包括如下操作步骤：
1）参照物溶液的制备：取对照品，溶解，即得对照品参照物溶液，取对照药材，提取，即得对照药材参照物溶液。
2）供试品溶液的制备：取苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒，经提取，取续滤液，即得。
3）将苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒、参照物溶液采用高效液相色谱仪分析，得到苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱。
其中步骤1）的参照物溶液包括对照药材参照物溶液和紫堇灵对照品参照物溶液。
其中步骤2）所述提取溶剂是指甲醇、水、甲醇-水溶液中任一一种，加入溶剂量为10-60倍。
进一步的所述提取方法如下：
取苦地丁药材粉末适量，研细，取约2.0g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁药材供试品溶液。
取苦地丁饮片粉末适量，研细，取约2.0g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁饮片供试品溶液。
取苦地丁标准汤剂冻干粉样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁标准汤剂冻干粉供试品溶液。
取苦地丁水溶液提取液冻干粉样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁提取液冻干粉供试品溶液。
取苦地丁配方颗粒样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁配方颗粒供试品溶液。
其中，HPLC的色谱条件为：以甲醇为流动相A，以0.1%~0.3%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.8~1.2ml/min，柱温为20~40℃，检测波长为275~300nm。进样量为3~12μl。
进一步地，所述流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为289nm。
进一步地，所述色谱条件其梯度洗脱条件为：0~5min，流动相A的体积分数变化为8%~15%，流动相B的体积分数变化为92%~85%；5~25min，流动相A的体积分数变化为15%~35%，流动相B的体积分数变化为85%~65%；25~50min，流动相A的体积分数变化为35%~60%，流动相B的体积分数变化为65%~40%。
其中，所用色谱柱为Atlantis T3色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；
进一步地，按照上述检测方法，测定苦地丁药材、饮片、标准汤剂冻干粉、配方颗粒的特征图谱的特征在于：
1）供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与紫堇灵对照品参照物峰的保留时间相对应。
2）与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，依次应为：0.19，0.21，0.23，0.35，0.83，1.22，且其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
本申请的有益效果包括但不限于：
1．本申请首次建立了一种苦地丁药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒的HPLC特征图谱，可同时对7种有效成分进行鉴别。
2．本发明构建的HPLC特征图谱充分反应样品的特征峰信息，且色谱条件梯度简单，峰形好，峰分离度好、方法稳定、精密度高、专属性、重现性、耐用性好。
3．本发明为苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及苦地丁其它制剂的质量控制提供一种快速、全面的检测手段。
4．本发明可用于评价苦地丁制剂生产全过程相关工艺的科学性，指导生产过程，并可以实现苦地丁制剂全过程质量控制。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为梯度洗脱条件；
图2为表1苦地丁配方颗粒特征图谱特征峰相对保留时间；
图3为表2 苦地丁标准汤剂特征图谱特征峰相对保留时间；
图4为表3 苦地丁药材特征图谱特征峰相对保留时间；
图5为表4苦地丁饮片特征图谱特征峰相对保留时间；
图6为苦地丁药材特征图谱，峰6：紫堇灵；
图7为苦地丁饮片特征图谱，峰6：紫堇灵；
图8为苦地丁标准汤剂特征图谱。峰6：紫堇灵；
图9为苦地丁配方颗粒特征图谱。峰6：紫堇灵。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
仪器与耗材：
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国，安捷伦科技有限公司）；Waters e2695高效液相色谱仪（美国，沃特世公司）；Waters Atlantis T3色谱柱（美国，沃特世公司）；SQP-SECURA125-1CN电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；JE302电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；东京理化N-3100型旋转蒸发仪（日本EYELA公司，10L）；Eppendorf5418离心机（德国艾本德公司）；KQ-250DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；
试剂：
磷酸（国药集团化学试剂有限公司）为分析纯；甲醇（国药集团化学试剂有限公司）为色谱纯；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈有限公司）。
试药：
苦地丁对照药材（中国食品药品检定研究院，120990-201406）；
紫堇灵对照品（上海源叶生物科技有限公司，P14J7F17804）；
苦地丁配方颗粒（山东宏济堂制药集团股份有限公司，批号：2009001、2009002、2009003）。
苦地丁药材（批号：KDD-1、KDD-2、KDD-3、KDD-4、KDD-5、KDD-6、KDD-7、KDD-8、KDD-9、KDD-10、KDD-11、KDD-12、KDD-13、KDD-14、KDD-15）。
苦地丁饮片（批号：YKDD-1、YKDD-2、YKDD-3、YKDD-4、YKDD-5、YKDD-6、YKDD-7、YKDD-8、YKDD-9、YKDD-10、YKDD-11、YKDD-12、YKDD-13、YKDD-14、YKDD-15）。
苦地丁标准汤剂（批号：BKDD-1、BKDD-2、BKDD-3、BKDD-4、BKDD-5、BKDD-6、BKDD-7、BKDD-8、BKDD-9、BKDD-10、BKDD-11、BKDD-12、BKDD-13、BKDD-14、BKDD-15）。
实施例1 本发明检测方法用于苦地丁标准汤剂高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取苦地丁对照药材2g，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫堇灵对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含紫堇灵100μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取苦地丁标准汤剂适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长289nm；流速为1ml/min；柱温为30℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制苦地丁标准汤剂中的特征成分。
实施例2 本发明检测方法用于苦地丁标准汤剂高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取苦地丁对照药材2g，加入水溶液25mL，超声提取1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫堇灵对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1mL含紫堇灵50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取苦地丁标准汤剂适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入30%甲醇25mL，超声处理60分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长275nm；流速为0.9ml/min；柱温为32℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各3μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制苦地丁标准汤剂中的特征成分。
实施例3 本发明检测方法用于苦地丁配方颗粒高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取苦地丁对照药材1.5g，加入30%甲醇-水溶液25mL，回流提取1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫堇灵对照品适量，精密称定，加30%甲醇制成每1mL含紫堇灵30μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取苦地丁配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入30%甲醇50mL，超声处理45分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以甲醇为流动相A，以0.3%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长296nm；流速为1.1ml/min；柱温为29℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各12μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制苦地丁配方颗粒中的特征成分。
实施例4 本发明检测方法用于苦地丁配方颗粒高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取苦地丁对照药材1g，加入50%甲醇溶液25mL，回流提取1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫堇灵对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含紫堇灵50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取苦地丁配方颗粒适量，研细，取约1g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液60mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以甲醇为流动相A，以0.25%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长292nm；流速为1.2ml/min；柱温为25℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各4μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制苦地丁配方颗粒中的特征成分。
实施例5 本发明检测方法用于苦地丁药材高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取苦地丁对照药材2g，加入水溶液25mL，回流提取1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫堇灵对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成每1mL含紫堇灵40μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取苦地丁药材粉末适量，研细，取约2g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液25mL，回流提取1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长298nm；流速为0.8ml/min；柱温为35℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制苦地丁药材中的特征成分。
实施例6 本发明检测方法用于苦地丁饮片高效液相特征图谱的检测
1.参照物溶液的制备：取苦地丁对照药材1g，加入水溶液25mL，回流提取1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫堇灵对照品适量，精密称定，加50%甲醇溶液制成每1mL含紫堇灵50μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：取苦地丁饮片粉末适量，研细，取约2g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁饮片供试品溶液。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长289nm；流速为1ml/min；柱温为30℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制苦地丁饮片中的特征成分。
实施例7 本发明检测方法用于苦地丁配方颗粒生产全过程质量控制
所述苦地丁配方颗粒生产过程为：苦地丁药材炮制成饮片，取苦地丁饮片3030g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，加入辅料适量，喷雾干燥，再加入辅料适量，混匀，制粒，制成1000g，即得。
所述中药指纹图谱检测方法包括以下步骤：
1.参照物溶液的制备：取苦地丁对照药材2g，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取紫堇灵对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1mL含紫堇灵100μg的溶液，作为对照品参照物溶液。
2.供试品溶液的制备：
取苦地丁药材，粉碎，研细，取约2g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁药材供试品溶液。
取苦地丁饮片，粉碎，研细，取约2g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁饮片供试品溶液。
取苦地丁水煎煮滤液适量，冷冻干燥，冻干粉研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁提取液供试品溶液。
取苦地丁清膏适量，冷冻干燥，冻干粉研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁清膏供试品溶液。
取苦地丁喷雾干燥粉末适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁喷干粉供试品溶液。
取苦地丁配方颗粒样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁配方颗粒供试品溶液。
3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸溶液为流动相B，按图1中的规定进行梯度洗脱；检测波长289nm；流速为1ml/min；柱温为30℃。
4.检测：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.结果：供试品特征图谱中呈现7个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，表明该方法可以准确高效的控制苦地丁配方颗粒生产全过程，检测从原料-中间体-配方颗粒的特征成分，实现全过程质量控制，并可以通过系统分析特征成分在生产过程中的转移情况，指导生产工艺参数优化。
实验例1 色谱条件与系统适用性试验
生物碱是苦地丁中的主要有效成分，然而相对于其它类型天然产物，生物碱由于具有碱性，其分离往往会出现峰形拖尾和载样量特别低的情况，由于峰形拖尾，生物碱往往峰宽较宽，峰高较矮，理论板数低，分离度较差。本方法通过充分的流动相条件考察、色谱柱选择，克服以上问题，所建立特征图谱峰形较好，峰分离度好，理论板数高。
流动相选择：考察了多种不同流动相的分离效果，分别为：乙腈-水梯度洗脱，乙腈-磷酸水梯度洗脱，甲醇-水梯度洗脱，甲醇-磷酸水梯度洗脱，甲醇-0.015mol/L磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾1.58g和磷酸氢二钾0.76g，加水1000ml溶解，混匀，用氢氧化钠试液调节pH值至6.7）梯度洗脱，乙腈-磷酸缓冲液（取磷酸二氢钾1.58g和磷酸氢二钾0.76g，加水1000ml溶解，混匀，用氢氧化钠试液调节pH值至6.7）梯度洗脱、 乙腈-水溶液（加入适量三乙胺，并以磷酸调节PH 3.0）梯度洗脱、甲醇-水溶液（加入适量三乙胺，并以磷酸调节PH3.0）梯度洗脱、乙腈-水（添加醋酸铵，并以氨水调PH 8.0)梯度洗脱，甲醇-水（添加醋酸铵，并以氨水调PH 8.0)梯度洗脱。结果表明，甲醇-磷酸水溶液梯度洗脱条件下色谱峰多，且峰形好，故将甲醇-磷酸水溶液作为苦地丁特征图谱测定方法的流动相。
波长选择：考察供试品在210nm、250nm、280nm、289nm、330nm等波长下的吸收光谱，并结合3D色谱图，筛选特征图谱最适宜波长，其中，289nm处色谱峰基线噪音低、响应强，且分离度良好。因此，确定检测波长为289nm。
色谱柱的选择：考察样品在SB-C18、Zorbax Extend C18、Atlantis T3、Kromasil100-5C18等多种色谱柱的分离作用，结果表明，Atlantis T3色谱柱条件下，峰形好，色谱峰多，故将Atlantis T3色谱柱作为苦地丁特征图谱测定方法的色谱柱。
实验例2 供试品溶液的制备方式考察
提取方式考察：取苦地丁配方颗粒适量，分别进行加热回流和超声处理，测定各标识峰峰面积，结果表明超声和回流提取所获得的特征图谱所呈现的物质信息基本相同，且各峰峰面积差异不大，考虑到超声提取方式更为简便，故选择提取方式为为超声提取。
提取溶剂考察：考察提取溶剂分别为30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇时各标识峰的峰面积，结果表明，50%甲醇提取所获得的色谱图峰面积较大，最终选择提取溶剂为50%甲醇。
超声时间考察：设置超声时间分别为15分钟、30分钟、45分钟，考察各标定峰峰面积，结果表明，不同超声时间所获得的特征图谱所呈现的物质信息基本相同，选择超声时间为30分钟。
称样量的考察：分别取约0.25g、0.5g、0.75g苦地丁配方颗粒，测定各标定峰峰面积，结果表明，折合成相同取样量后进行峰面积进行比较，标识峰峰面积基本相同，最终选择称样量为0.5g。
实验例3 专属性考察
取苦地丁配方颗粒所使用的辅料（糊精）适量，按照供试品溶液的制备方法制备成阴性对照溶液；取苦地丁配方颗粒供试品溶液、苦地丁对照药材溶液、紫堇灵对照品溶液、阴性对照溶液按正文方法获得其色谱图，结果表明阴性对照无干扰，方法专属性良好。
实验例4 重复性考察
取苦地丁配方颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，取6份，按供试品溶液的制备方法制备供试液，注入Agilent 1260高效液相色谱仪测定。以第6个峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果显示：7个标识峰的相对保留时间RSD≤0.17%，相对峰面积的RSD≤2.69%，该方法的重复性较好。
实验例5 中间精密度考察
由另一试验人员于不同时间再次进行重复性试验，注入另一台Agilent 1260高效液相色谱仪进行测定。以第6个峰为参照峰，计算各标识峰相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。结果显示：不同仪器测定相对保留时间RSD≤1.07%；不同仪器测定相对峰面积RSD≤8.73%，表明该特征图谱的方法中间精密度良好。
实验例6 稳定性考察
分别在0、2、4、8、12、24h测定同一供试品溶液，记录各标识峰保留时间和峰面积，并计算相对保留时间、相对峰面积、RSD值。结果显示：标识峰的相对保留时间RSD≤0.26%，相对峰面积的RSD≤9.96%，供试品溶液在24小时内保持稳定。
实验例7 耐用性考察
柱温：柱温变化（30℃、32℃）对特征图谱的峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间（RSD≤1.03%）没有明显的影响。
流速：流速变化（0.9、1.0、1.1ml/min）对特征图谱的峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间（RSD≤2.48%）没有明显的影响。
色谱柱：不同Atlantis T3色谱柱对特征图谱的峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间没有明显影响（RSD≤1.61%）。
仪器：不同仪器检测（不同Agilent高效液相色谱仪）对特征图谱峰信息、峰形、分离度、标识峰相对保留时间没有明显的影响（RSD≤1.25%）。
实验例8 苦地丁特征图谱的建立
1. 苦地丁配方颗粒特征图谱的建立
取3批苦地丁配方颗粒，按照拟定的方法本别制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见图2。
将3批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果3批苦地丁配方颗粒与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定苦地丁配方颗粒的特征图谱中应呈现7个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
2. 苦地丁标准汤剂特征图谱的建立
取15批苦地丁标准汤剂，按照拟定的方法本别制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见图3。
将15批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果15批苦地丁标准汤剂与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定苦地丁标准汤剂的特征图谱中应呈现7个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
3. 苦地丁药材特征图谱的建立
取15批苦地丁药材粉末，按照拟定的方法本别制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见图4。
将15批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果15批苦地丁药材与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定苦地丁药材的特征图谱中应呈现7个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
4. 苦地丁饮片特征图谱的建立
取15批苦地丁饮片粉末，按照拟定的方法本别制备供试品溶液，再按照拟定的色谱条件进行测定，记录HPLC色谱图，结果见图5。
将15批供试品色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版），进行相似度计算，结果15批苦地丁饮片与对照特征图谱的相似度均在0.90以上。
根据考察结果，规定苦地丁饮片的特征图谱中应呈现7个共有峰，其中1个峰应与对照品参照物峰的保留时间相对应。与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算其余各峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
综上，本发明的苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其它苦地丁制剂HPLC特征图谱的检测方法色谱条件梯度少，特征共有峰信息多，色谱峰峰形好，分离度好，专属性好，精密度高，稳定性、重复性、耐用性好，有利于评价苦地丁制剂生产全过程相关工艺的科学性、合理性，用于指导生产制备过程投料、规范生产操作，更能整体控制苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒及其它苦地丁制剂的内在质量，实现全过程质量控制，确保苦地丁的临床用药的安全、有效、稳定，且本发明针对分离难度较大的生物碱类化合物建立特征图谱，在行业属于先进水平，对其它研究提供参考作用。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC的特征图谱检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
1）参照物溶液的制备：取对照品，溶解，即得对照品参照物溶液，取对照药材，提取，即得对照药材参照物溶液；
2）供试品溶液的制备：取苦地丁药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒，经提取，取续滤液，即得；
3）将苦地丁药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒、参照物溶液采用高效液相色谱仪分析，得到苦地丁药材、饮片、标准汤剂、提取液冻干粉、配方颗粒的HPLC特征图谱。
2.根据权利要求1所述的参照物溶液，其特征在于参照物溶液包括对照药材参照物溶液和紫堇灵对照品参照物溶液。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述提取溶剂是指甲醇、水、甲醇-水溶液中任一一种，加入溶剂量为10-60倍。
4.根据权利要求1、3所述的检测方法，其特征在于：步骤2）所述提取方法如下：
取苦地丁药材粉末适量，研细，取约2.0g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁药材供试品溶液；
取苦地丁饮片粉末适量，研细，取约2.0g，置具塞锥形瓶中，加入水溶液25mL，加热回流1h，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁饮片供试品溶液；
取苦地丁标准汤剂冻干粉样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁标准汤剂冻干粉供试品溶液；
取苦地丁水溶液提取液冻干粉样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁提取液冻干粉供试品溶液；
取苦地丁配方颗粒样品适量，研细，取约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇25mL，超声处理30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得苦地丁配方颗粒供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的苦地丁药材、饮片、标准汤剂、配方颗粒的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于，所述HPLC的色谱条件为：以甲醇为流动相A，以0.1%~0.3%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.8~1.2ml/min，柱温为25~35℃，检测波长为275~300nm；进样量为3~12μl。
6.根据权利要求1和5所述的HPLC特征图谱的检测方法，其特征在于，所述HPLC的色谱条件为：流速为1.0ml/min，柱温为30℃，检测波长为289nm。
7.的检测方法，其特征在于梯度洗脱条件为：0~5min，流动相A的体积分数变化为8%~15%，流动相B的体积分数变化为92%~85%；5~25min，流动相A的体积分数变化为15%~35%，流动相B的体积分数变化为85%~65%；25~50min，流动相A的体积分数变化为35%~60%，流动相B的体积分数变化为65%~40%。
8.根据权利要求1、5、6和7所述的HPLC特征图谱检测方法，其特征在于：所用色谱柱为Atlantis T3色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）。
9.根据权利要求1、5、6、7和8所述的检测方法，其特征在于：苦地丁药材、饮片、标准汤剂冻干粉、提取液冻干粉、配方颗粒的特征图谱的特征在于：
1）供试品色谱中应呈现7个特征峰，并应与对照药材参照物色谱中的7个特征峰保留时间相对应，其中1个峰应与紫堇灵对照品参照物峰的保留时间相对应；
2）与紫堇灵参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰1、2、3、4、5、7与S峰的相对保留时间，依次应为：0.19，0.21，0.23，0.35，0.83，1.22且其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。
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