CN115508469B

CN115508469B - 一种乳粉中四溴双酚a的高分辨率检测方法

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Publication number: CN115508469B
Application number: CN202211143009.9A
Authority: CN
Inventors: 李锦清; 綦艳; 李聪; 黄翠莉; 张娟
Priority date: 2022-09-21
Filing date: 2022-09-21
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-09-21
Also published as: CN115508469A

Abstract

本发明公开了一种乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，包括以下步骤：以乳粉为研究对象，样品用水溶解，酸化乙腈提取和沉淀蛋白，盐析分层，取上层清液，用佛罗里硅土柱净化，收集流出液和洗脱液，经浓缩、复溶、过滤等步骤后制得待测液，用LC/MS‑IT‑TOF法检测，本方法操作简单、回收率高、抗基质干扰能力强、飞行时间质谱高分辨率定性鉴别准确可靠，适合各种乳粉基质中痕量四溴双酚A的准确定性鉴别和定量测定。

Description

一种乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法。

背景技术

四溴双酚A(TBBPA)是目前全球使用最为广泛的溴系阻燃剂之一，大量应用于纺织、家电以及工业产品中以降低燃烧性能，含有四溴双酚A的产品在生产、使用和废弃过程中均有可能进入环境。四溴双酚A是一种典型环境内分泌干扰物，能在环境和生物体内积蓄，可扰乱动物体正常的内分泌系统，并具有致畸、致癌和致突变的作用，对水生生物和人体健康造成潜在的危害，已有研究表明，它对藻类、鱼体及软体动物等有明显的毒副作用。

目前四溴双酚A已成为环境和健康领域研究的热点，但动物源性食品中四溴双酚A暴露量的监测尚未开展，相关的检验标准和文献报道较少，目前仅有DBS42/004-2014建立了鱼、肉、蛋、奶等动物性食品中四溴双酚A含量的测定方法。关于四溴双酚A检测的文献报道涉及样品包括环境水样、土壤、生物、食物等，暂未见乳粉中四溴双酚A检测方法的报道。当前国家对婴幼儿配方乳粉监管力度越来越严，可能存在的潜在毒害物的检测方法不断发布和更新，而四溴双酚A作为一种环境中普遍存在的物质，容易通过食物链等途径迁移至乳粉中，因此有必要开发适用于各类乳粉的四溴双酚A的检测方法，弥补方法空白。

四溴双酚A相关检测的文献报道有分光光度法、电化学法、液相色谱-紫外检测法、气相色谱-质谱法、气相色谱-电子捕获检测法、液相色谱-串联质谱法等。分光光度法和气相色谱-电子捕获法均存在选择性和灵敏度上不足，难以应用于微量有机物的准确定量检测。气相色谱-质谱法具有较好的选择性，但方法检出限不理想，同时样品还需经繁琐的预处理以及样品衍生化，操作技术不易掌控。

飞行时间质谱法作为一种高分辨率的检测方法(质量数精确至小数点后四位)，其定性鉴别能力优于液相色谱-串联质谱法，为物质的鉴别和推断提供了更精确的质量数数据和更丰富的离子碎片信息。但目前该方法还未用于乳粉中四溴双酚A的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，该方法回收率高、抗基质干扰能力强，飞行时间质谱高分辨率定性鉴别准确可靠，适合各种乳粉基质中痕量四溴双酚A的准确定性鉴别和定量测定。

本发明的上述目的可以通过以下技术方案来实现：一种乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，包括以下步骤：

(1)样品提取：称取乳粉样品，加水溶解，再加入酸化乙腈，混匀，水浴加热超声萃取后，加入盐析试剂，涡旋，离心，取上层液体，将下层样品重复萃取，合并两次提取的上层液体，得待净化液；

(2)样品提取液净化：将步骤(1)制得的待净化液用经过活化的佛罗里硅土柱净化，收集流出液和洗脱液，经浓缩、复溶、过滤后，制得待测液；

(3)标准溶液制备：用甲醇溶解标准品四溴双酚A配制标准品储备液，用空白乳粉样品的基质提取液稀释标准品储备液，配制一组标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线；

(4)含量测定：将步骤(3)配制的一组标准溶液用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定，制作与样品基质匹配的标准工作曲线，选取步骤(2)中的待测液，以四溴双酚A的五个加合物母离子同位素峰的精确质量数和保留时间定性判断，以四溴双酚A五个加合物母离子中响应最高的同位素峰峰面积与标准工作曲线进行定量，获得乳粉中四溴双酚A含量；

(5)分子式预测：利用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪自带的FormulaPredictor分子式预测软件结合步骤(4)获得的加合物母离子同位素峰精确质量数推测分子式，对阳性样品作进一步确证。

本发明方法以乳粉为研究对象，样品用水溶解，酸化乙腈提取和沉淀蛋白，盐析分层，取上层清液，用佛罗里硅土柱净化，收集流出液和洗脱液，经浓缩、复溶、过滤等步骤后制得待测液，用LC/MS-IT-TOF法检测，本方法操作简单、回收率高、抗基质干扰能力强、飞行时间质谱高分辨率定性鉴别准确可靠，适合各种乳粉基质中痕量四溴双酚A的准确定性鉴别和定量测定。

本发明方法采用基于飞行时间质谱的LC/MS-IT-TOF检测，以四溴双酚A的五个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间以及分子式预测等手段对复杂乳粉基质中四溴双酚A精准鉴别和定量测定，具有现有文献或检测标准所述的气相色谱法、气相色谱质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等无法比拟的高分辨率鉴别能力，是一种新型的检测方法。

本发明基于飞行时间质谱法建立了乳粉中四溴双酚A的LC/MS-IT-TOF检测方法，弥补乳粉中四溴双酚A检测方法缺失，为乳粉中四溴双酚A检测提供一种新型的、高分辨率的检测方法。

进一步的，本发明提供的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，包括以下步骤：

(1)样品提取：称取乳粉样品，置于塑料离心管中，加水溶解，加入酸化乙腈，摇匀，水浴加热超声萃取，加入盐析试剂，剧烈涡旋振荡萃取，离心，取上层清液，样品重复萃取一次，合并两次萃取液，制得待净化液。

(2)样品提取液净化：将步骤(1)制得的待净化液用经过活化的佛罗里硅土柱净化，收集流出液和洗脱液，经浓缩、复溶、过滤膜等步骤后，制得待测液。

(3)标准溶液制备：用甲醇溶解标准品，配制标准品储备液和稀释配制标准品中间液，用阴性乳粉样品的基质提取液稀释配制四溴双酚A(TBBPA)标准工作曲线，制得与样品基质匹配的标准工作曲线(基质匹配标准工作曲线)。

(4)含量测定：将步骤(2)制得的待测液和步骤(3)制得的基质匹配标准工作曲线的系列浓度，用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法(LC/MS-IT-TOF)测定，以四溴双酚A的加合物母离子(MS¹)同位素峰的精确质量数和保留时间定性判断，以加合物母离子中响应最高的同位素峰峰面积与基质匹配标准工作曲线浓度绘制基质匹配标准工作曲线进行定量，获得乳粉中四溴双酚A含量。

(5)分子式预测：利用仪器自带的Formula Predictor软件结合步骤(4)获得的加合物母离子同位素峰精确质量数推测分子式，对阳性样品作进一步确证。

本发明研究对象为乳粉，乳粉样品用水溶解，酸化乙腈为提取液，在水浴加热超声条件下萃取四溴双酚A，加入盐析试剂，剧烈涡旋振荡，离心，取上层清液，用佛罗里硅土柱净化，经包括浓缩和复溶后，用LC/MS-IT-TOF法检测，以四溴双酚A的5个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间定性确证，用分子式预测对阳性样品作进一步确证，以542.7405～542.7455的离子峰的峰面积进行定量。

在上述乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法中：

优选的，步骤(1)中所述乳粉样品为以生牛乳或生羊乳为原料或主要原料，添加或不添加其它其它营养素、食品添加剂等，经加工制成的粉状产品，包括各类配方奶粉。

优选的，步骤(1)中所述乳粉样品与水的用量关系为1g：3～5mL～2g：7～10mL，所述水为去离子水，所述酸化乙腈中酸的体积百分含量为1～5％，其中所述酸为甲酸或冰乙酸，所述水与酸化乙腈的体积比为1：1.5～2。

进一步的，步骤(1)中样品提取时：称取乳粉质量为1～2g(精确至0.01g)；所述的水是指去离子水；所述的酸化乙腈是指色谱纯乙腈中加入优级纯的甲酸或冰乙酸，甲酸或冰乙酸与乙腈之间的体积比例为1：99～5：95；乳粉样品质量与水的体积比例为1g：3～5mL～2g：7～10mL；水与酸化乙腈的体积比例为1：1.5～2；重复萃取时乙腈用量为3～5mL。

优选的，步骤(1)中所述盐析试剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁和氯化钠中的一种或两种，所述盐析试剂与水和酸化乙腈二者之和的用量关系为1g：4.5～5mL。

进一步的，步骤(1)中样品提取时：所述的盐析试剂是指无水硫酸钠、无水硫酸镁和氯化钠中的一种或两种，纯度级别为分析纯；盐析试剂质量与水和酸化乙腈体积之和)二者之间的用量关系约为1g：4.5～5mL。

盐析试剂起到促使水相和乙腈分层、辅助沉淀蛋白质的作用，对于蛋白质含量高达18.1％的乳粉样品也具有显著效果。

优选的，步骤(1)中水浴加热超声萃取时，水浴温度为45～55℃，超声波的频率为40～50khz，超声萃取时间为20～30min；涡旋时采用自动涡旋混合器在2200～2500r/min转速下圆周式剧烈旋涡振荡提取5～10min；离心为在9000～10000r/min转速下离心3～5min。

进一步的，步骤(1)中样品提取时：超声波萃取时水浴温度为45～55℃，超声波频率为40～50khz，超声萃取时间为20～30分钟；所述的剧烈涡旋振荡萃取是指使用自动涡旋混合器在2200～2500r/min转速下圆周式振荡提取5～10min；所述的离心是指在9000～10000r/min转速下离心3～5min，取上层清液；水浴加热45～55℃超声萃取可增强乙腈对样品的渗透能力，提高萃取效果。

进一步的，步骤(2)中样品提取液净化时：所述的佛罗里硅土柱是指商品化的佛罗里硅土柱或使用硅藻土作为填料自制装填的佛罗里硅土柱，柱填料质量为0.5～1g，填料上方装填无水硫酸钠2.5～4g；自制装填的佛罗里硅土柱有两种装填方式，方式一：先装填硅藻土，然后在硅藻土上方装填无水硫酸钠，制得分层式佛罗里硅土柱；方式二：将硅藻土与无水硫酸钠按质量比例0.5～1g：2.5～4g混合，用研钵研磨均匀后再装填，制得混合式佛罗里硅土柱。

步骤(1)获得的待净化液中以乙腈为主，但乙腈和水互溶，不可避免的含有少量水，因此净化时需用无水硫酸钠进行脱水，提高浓缩速度和提高回收率。

优选的，步骤(2)中活化过的佛罗里硅土柱中的活化是指采用体积比为1：9的丙酮-正己烷10～15mL活化，柱活化后，将制得的待净化液加入活化后的佛罗里硅土柱中，收集流出液和洗脱液，所述洗脱液为二氯甲烷或乙酸乙酯，用量为3～5mL。

进一步的，活化是指用丙酮-正己烷(体积比1：9)混合溶液10～15mL活化佛罗里硅土柱；柱活化后，将制得的待净化液加入活化后的佛罗里硅土柱中，用玻璃试管或鸡心瓶收集流出液和洗脱液；所述的洗脱液是指二氯甲烷或乙酸乙酯，用量为3～5mL。

优选的，步骤(2)中所述浓缩、复溶、过滤包括将收集的流出液和洗脱液在水浴温度50～55℃条件下氮气吹干或旋转蒸发至干，然后加入1～2mL体积百分含量为60～70％的含酸甲醇水溶液复溶，接着在超声波频率40～50khz条件下超声2～3min，再用孔径为0.22μm或0.45μm的有机系针式滤器过滤至样品瓶中，获得待测液，其中所述酸为甲酸，所述甲酸的体积百分含量为0.05～0.1％。

优选的，步骤(3)中所述空白乳粉样品基质提取液是指不含四溴双酚A的乳粉样品，按照步骤(1)和步骤(2)制得基质提取液；用不含四溴双酚A的空白乳粉样品基质提取液稀释配制一组浓度范围为5～1000ng/mL的标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线。

优选的，步骤(4)液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法的液相色谱条件包括：色谱柱：KinetexC₁₈，规格100×2.1mm，1.7μm；流速：0.20mL/min；柱温：25℃；进样量：50μL；流动相A为：甲醇-乙腈混合溶液(体积比8：2)；流动相B为：0.1～0.2％(体积百分含量)甲酸的水溶液；梯度洗脱程序为：0.00min：A相，45％，B相，55％；2.00min：A相，45％，B相，55％；3.10min：A相，90％，B相，10％；10.00min：A相，90％，B相，10％；10.20min：A相，45％，B相，55％；12.00min：A相，45％，B相，55％；均为体积百分含量。

与DBS42/004-2014和文献报道的方法不同，本发明使用含甲酸的流动相，有利于四溴双酚A形成加合物母离子(MS¹)同位素峰，采用加合物同位素离子及其精确质量数进行定性确证、峰面积进行定量。

优选的，步骤(4)中采用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法(使用基于飞行时间质谱技术的液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪(LC/MS-IT-TOF))时，在电喷雾负离子模式(ESI-)下对样品待测液和标准溶液进行定性定量测定，采用自动扫描采集，加热模块温度：200～250℃；CDL温度：200～250℃；雾化器流速：1.4～1.5L/min；干燥气压力：100～110kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.6～1.7kV；校准方法：自动调谐优化电压；三氟乙酸钠校准质量数；MS¹采集范围为m/z 450～600，重复扫描2～3次，离子累积时间：30～40msec；CID能量:15～20％，获得四溴双酚A的5个加合物母离子(MS¹)同位素峰的精确质量数范围为：538.7455～538.7505、540.7455～540.7505、542.7405～542.7455、544.7405～544.7455、546.7405～546.7453；以542.7405～542.7455的离子峰的峰面积进行定量，其他离子峰精确质量数和保留时间作为定性判断依据。

优选的，步骤(5)分子式预测具体包括，根据四溴双酚A分子式C₁₅H₁₂O₂Br₄，设定化合物组成元素为C、H、O、Br，原子个数范围设为C:0～15；H:0～12；O:0～2；Br:0～4；丢失电荷设为H^-；应用氮规则筛查，筛查误差为2～20ppm；在四溴双酚A的五个加合物同位素离子同时存在前提下，设置电荷数量为1，选择质量数为538.7455～538.7505的加合物离子进行分子式预测，若预测结果仅有一个分子式且与四溴双酚A分子式一致，则可验证样品中含有四溴双酚A。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明方法弥补了乳粉中四溴双酚A检测方法空白，方法适用范围广，本发明以乳粉基质作为研究对象，应用LC/MS-IT-TOF法建立了乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，本发明建立的方法尚未有标准、文献或专利报道，弥补了乳粉中四溴双酚A检测方法空白，建立的方法适用范围广，适用于各种乳粉，具有良好的回收率、精密度和灵敏度；

(2)与DBS42/004-2014前处理方法相比，本发明的前处理方法更简单快速、通用性更强、回收率更高，以水溶解样品，酸化乙腈萃取乳粉中四溴双酚A和沉淀蛋白，再以无水硫酸钠、无水硫酸镁、氯化钠为盐析试剂促使水相和乙腈分层，同时起到辅助沉淀蛋白质作用，解决了高蛋白乳粉(蛋白质含量18％或以上)回收率低、蛋白沉淀效果差、水相和有机相不分层等难题，建立的萃取方法通用性强，适用于各种类型乳粉中四溴双酚A高效快速萃取，回收率为85％以上；

(3)采用加合物母离子同位素峰及其精确质量数进行高分辨率定性鉴别和定量测定，现有的标准DBS42/004-2014或文献报道四溴双酚A的检测主要以低分辨率的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)为主，质量数仅准确至小数点后一位，与现有标准或文献不同，本发明采用基于飞行时间质谱的液相色谱-离子阱-飞行时间质谱(LC/MS-IT-TOF)法检测，以四溴双酚A的五个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间以及分子式预测对复杂乳粉基质中四溴双酚A进行高分辨率精准鉴别和定量测定，建立的方法即使无标准品，利用各同位素准分子离子峰的精确质量数和丰度比例，也能对目标化合物进行筛查和确证，是一种新型的检测手段；

(4)本发明使用的质谱检测方法与DBS42/004-2014标准和相关文献报道的完全不同，本发明并未采用质谱产生四溴双酚A的母离子与子离子碎片(542.6/447.6、542.6/417.8)的方式进行定性和定量监测，而是通过在流动相中添加甲酸和降低CID能量(设为：15～20％)的条件下，促使四溴双酚A仅形成加合物母离子(MS¹)同位素峰且不发生二级碎裂，利用获得的五个加合物同位素离子及其精确质量数(精确至小数点后四位)进行定性确证、峰面积进行定量，是一种新颖的检测方法；

(5)以酸性的水相流动相以及酸化的甲醇-水溶液复溶样品，促使四溴双酚A形成同位数离子峰，提高同位素离子峰的响应值和检测灵敏度，四溴双酚A含有2个酚羟基，一般采用电喷雾负离子模式检测，理论上碱性溶液或乙酸铵溶液作为水相流动相时，能提高离子化效率，但实际上四溴双酚A同位素离子峰较弱，因此本发明选择酸性水相流动相(0.1～0.2％(体积百分含量)甲酸的水溶液)，促使形成同位素离子峰，提高检测灵敏度，这与现有标准或文献报道的流动相存在较大的差异；

(6)分子式匹配法验证阳性样品，利用仪器自带的Formula Predictor软件，根据四溴双酚A分子式C₁₅H₁₂O₂Br₄，设定化合物组成元素、原子个数范围、丢失电荷方式等，结合氮规则，在四溴双酚A的五个加合物同位素离子同时存在前提下，选择质量数为538.7455～538.7505的加合物离子进行分子式预测，若预测结果仅有一个分子式且与四溴双酚A分子式一致，则可验证样品中含有四溴双酚A。

附图说明

图1为实施例1中四溴双酚A的五个加合物同位素离子峰；

图2为实施例1中四溴双酚A基质匹配标准工作曲线图；

图3为实施例1中四溴双酚A标准品特征离子质谱图；

图4为实施例1中加标乳粉样品中四溴双酚A的提取特征离子图；

图5为实施例1中空白样品中四溴双酚A加合物同位素离子色谱图；

图6为实施例1中加标乳粉样品中四溴双酚A定量离子(542.7439)色谱图；

图7为实施例1中四溴双酚A标准溶液定量离子(542.7439)色谱图；

图8为实施例1中空白乳粉样品添加标准品的定性、定量离子色谱图；

图9为实施例1中空白乳粉样品四溴双酚A的定性、定量离子色谱图；

图10为实施例1中空白乳粉样品添加四溴双酚A标准品的Formula Predictor分子式预测结果图。

具体实施方式

以下列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例以高蛋白质的中老年配方奶粉(蛋白质含量为18.1％)作为检测对象，提供阳性样品制备方法和乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，具体包括如下：

1试剂和耗材

试剂：甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯均为色谱纯；甲酸为优级纯；无水硫酸钠为分析纯；使用的水为一级水。

耗材：50mL聚乙烯塑料离心管；孔径为0.22μm的聚四氟乙烯(PTFE)针式滤器过滤；1mL一次性针式注射器；硅藻土；一次性塑料吸管；玻璃试管(氮吹管)；鸡心瓶。

2仪器设备

岛津液相色谱–离子阱-飞行时间质谱仪(LC/MS-IT-TOF)，带电喷雾离子源；KEYINTECH自动涡旋混合器，最大转速3000r/min；优莱博(Julabo)SW23水浴恒温振荡器；艾本德(eppendorf)高速离心机，最大转速10000r/min；氮吹仪；得泰(Detelogy)FV64自动氮吹浓缩仪；梅特勒电子天平：精度0.01g和0.00001g；固相萃取装置。

3标准品

3.1标准品储备液：称取四溴双酚A标准品约10mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配得浓度为1000μg/mL，-18℃条件下保存。

3.2标准品中间液：吸取四溴双酚A标准储备液20μL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，配得浓度为2μg/mL标准中间溶液，4℃条件下保存。

3.3基质匹配标准工作曲线：用空白中老年配方奶粉乳粉样品基质提取液稀释配制一组浓度范围为5～1000ng/mL标准溶液，用于制作基质匹配标准工作曲线。

4样品前处理

(1)制备样品提取液：称取乳粉样品2g(精确至0.01g)，置于50mL聚乙烯离心管中，加入8mL水，用自动涡旋混合器以2200r/min涡旋2min，使样品完全溶解，然后加入12mL含甲酸1％的乙腈溶液，摇匀，45℃水浴超声(超声频率40khz)提取20min，加入4g无水硫酸钠，用自动涡旋混合器2200r/min涡旋提取5min，以9000r/min离心5min获得分层液体，取上层液体转移至另一个50mL聚乙烯塑料离心管中，再用3mL含甲酸1％的乙腈溶液重复萃取样品一次，合并两次萃取于50mL聚乙烯塑料离心管中，制得样品待净化液。

(3)样品提取液的净化：将步骤(1)制得的样品待净化液分次转移至活化的佛罗里硅土柱中，控制液体流出速度不超过1mL/min，用鸡心瓶收集全部流出液，用3mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，合并流出液和洗脱液于同一鸡心瓶中。在水浴温度50℃条件下旋转蒸发至干，加入1mL70％(体积百分含量)甲醇水溶液(含0.1％甲酸，体积百分含量)复溶，在超声波频率为40khz条件下超声2min，用一次性注射器吸取复溶液，用孔径为0.22μm的有机系针式滤器过滤至样品瓶中，获得待测液，供LC/MS-IT-TOF检测。

5 仪器条件

5.1 液相色谱条件

色谱柱：Kinetex C₁₈，规格100×2.1mm，1.7μm；

流速：0.2mL/min；

柱温：25℃；

进样量：50μL；

流动相A为：甲醇-乙腈混合溶液(体积比8：2)；流动相B为：0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

时间/min	A相/％	B相/％
			0.00	45	55
2.00	45	55
			3.10	90	10
10.00	90	10
			10.20	45	55
12.00	45	55

均为体积百分含量。

5.2质谱条件

离子源：ESI，负离子模式检测；采用自动扫描采集，加热模块温度：200℃；CDL温度：200℃；雾化器流速：1.4L/min；干燥气压力：100kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.6kV；校准方法：自动调谐优化电压；三氟乙酸钠校准质量数；MS¹采集范围为m/z 450～600，重复扫描2～3次，离子累积时间：30msec；CID能量:15％。主要质谱参数见表2。

表2 质谱参数

注：带“*”的为定量离子。

6线性范围和方法检出限

向空白高蛋白质中老年配方奶粉样品中添加四溴双酚A添加浓度为5μg/kg，按照本实施例检测，获得色谱图，对定量离子的色谱峰计算信噪比(S/N)大于10，因此，乳粉中四溴双酚A的检出限为5μg/kg。

用空白高蛋白质中老年配方奶粉基质提取液配制四溴双酚A的基质匹配标准工作曲线，线性范围为5ng/mL～1000ng/mL，线性方程为Y＝21497.47X+586998.1，相关系数R为0.9986，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F.2校准曲线要求。四溴双酚A的五个加合物同位素离子峰如图1所示，四溴双酚A基质匹配标准工作曲线图见图2，四溴双酚A标准品特征离子质谱图见图3，加标乳粉样品中四溴双酚A的提取特征离子图见图4。

7加标回收率及精密度

阳性样品制备方法：选择不含四溴双酚A的乳粉样品，通过添加标准品的方式制备阳性样品。具体操作步骤为：称取三份不含四溴双酚A的乳粉样品置于玻璃离心管中，编号定为样品A、样品B、样品C，每个编号称取6份样，每份样品2g，分别加入5～10mL无水乙醇和1～2mL水，向样品A、样品B、样品C中添加标准溶液，加标量相当于干基乳粉样品中四溴双酚A含量分别为5μg/kg、10μg/kg、50μg/kg，充分涡旋分散均匀，置于恒温鼓风干燥箱中50～60℃烘干，将样品粉碎混合均匀，制得含有四溴双酚A的阳性样品。

按本实施例方法，对制得的阳性样品进行检测，结果表明，回收率范围在91.2％～103.3％之间，相对标准偏差范围在5.9％～6.5％之间，具体回收率、精密度见表3。

图5为空白乳粉样品中四溴双酚A加合物同位素离子色谱图，图6为加标乳粉样品中四溴双酚A定量离子(542.7439)色谱图，图7为四溴双酚A标准溶液定量离子(542.7439)色谱图，图8为空白乳粉样品添加标准品的定性、定量离子色谱图，图9为空白乳粉样品四溴双酚A的定性、定量离子色谱图。

表3 加标回收率与精密度

8定性鉴别

以四溴双酚A标准物质的五个加合物母离子同位素峰的精确质量数(精确至小数点后四位)、保留时间以及分子式预测结果作为定性标准。定性判定的三个条件：当样品中同时存在与四溴双酚A标准物质一致的五个加合物母离子同位素峰，且五个加合物母离子对应的精确质量数分别在538.7455～538.7505、540.7455～540.7505、542.7405～542.7455、544.7405～544.7455、546.7405～546.7453范围内；保留时间与标准物质的保留时间比较在±2.5％范围内；分子式预测结果仅有一个分子式且与四溴双酚A分子式一致，同时满足上述三个条件时，即可判定乳粉样品中含有四溴双酚A。

9定量计算

计算公式为：

X＝C×V×F×1000/m×1000

其中：

X：乳粉中四溴双酚A的含量(μg/kg)；

C：从标准工作曲线得到四溴双酚A浓度(ng/mL)；

m：称样质量(g)；

V：定容体积(mL)；

F：稀释因子；

1000：换算系数；

计算结果保留两位有效数字。

10实际样品检测

应用本实施例方法对20批乳粉样品(婴幼儿配方乳粉1段6批次，2段6批次，3段4批次，中老年乳粉4批次)和添加了四溴双酚A标准品的空白乳粉样品进行检测，然后按“8定性鉴别”条件进行判断，经鉴别20批次乳粉样品均未检出四溴双酚A；添加了四溴双酚A标准品的空白乳粉样品符合“8定性鉴别”三个条件，检出四溴双酚A，说明方法准确可靠。图10为空白乳粉样品添加四溴双酚A标准品的Formula Predictor分子式预测结果图。

对比例1

本对比例比较本发明的样品提取方法与DBS42/004-2014的样品提取方法对乳粉中四溴双酚A回收率差异，本次方法比较均采用外标法定量。

按实施例1的阳性样品制备方法制备阳性样品，然后分别按照实施例1和DBS42/004-2014样品提取方法进行平行测定(n＝2)，平均回收率结果见表4，结果表明，本发明回收率为91.4％～101.5％优于DBS42/004-2014的回收率45.3％～64.5％，其原因可能是DBS42/004-2014以正己烷-丙酮作为提取试剂无法将包裹在固体颗粒中的四溴双酚A充分萃取出来，即使索氏提取24小时，回收率也不高，因此，DBS42/004-2014标准采用内标法进行修正，解决回收率低问题。DBS42/004-2014的样品提取方法存在提取步骤繁琐、耗时长、回收率低、试剂消耗量大、内标法成本高等缺点，与之相比，本发明建立的方法具有简便、效率高、有机试剂用量少、回收率高、无需内标，成本更低。

表4 方法回收率比较

对比例2

本对比例比较本发明的佛罗里硅土柱净化与DBS42/004-2014的酸化硅胶柱净化对乳粉中四溴双酚A回收率差异。

具体步骤为：按照本发明的标准溶液配制方法和DBS42/004-2014标准溶液配制方法，分别配制浓度均为100ng/mL的四溴双酚A标准溶液，按各自的样品净化方法操作，LC/MS-IT-TOF检测，外标法定量，比较回收率差异。结果表明，本发明采用佛罗里硅土柱净化回收率为90.8％～98.3％，DBS42/004-2014的酸化硅胶柱回收率为80％～86％，表明本发明中佛罗里硅土柱净化回收率优于酸化硅胶柱。

表5 方法回收率比较

对比例3

本对比例比较不同盐析试剂(无水硫酸钠、无水硫酸镁、氯化钠)对检测过程以及回收率影响。按实施例1的阳性样品制备方法制备阳性样品。除样品前处理的制备样品提取液步骤使用不同盐析试剂外，其他步骤或方法与实施例1相同。在酸性提取液中四溴双酚A以分子形式存在，在盐析作用下，更容易被乙腈萃取，提高萃取回收率。无水硫酸钠、无水硫酸镁、氯化钠是常用的盐析试剂，起到促使提取液中水相和有机相分层、辅助沉淀蛋白和初步净化等作用。试验结果表明，无水硫酸钠和无水硫酸镁作盐析试剂时提取液分层比氯化钠效果更好，但两者容易吸水，吸水后容易结块，因此，加入无水硫酸钠或无水硫酸镁后必须马上摇匀，避免结块而导致吸附四溴双酚A。

不同盐析试剂回收率平均结果见表6，结果显示，无水硫酸钠做盐析试剂回收率最高，无水硫酸镁和氯化钠的回收率较低，分析原因可能是无水硫酸镁对四溴双酚A存在一定的吸附作用，因此回收率比无水硫酸钠低。由于氯化钠的钠离子和氯离子都只带一个电荷，盐析作用偏弱，使得含有四溴双酚A的少量乙腈仍残留在水相中，无法被完全萃取至上层，导致含量和回收率偏低。

表6 不同盐析试剂回收率

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是包括以下步骤：

(5)分子式预测：利用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪自带的Formula Predictor分子式预测软件结合步骤(4)获得的加合物母离子同位素峰精确质量数推测分子式，对阳性样品作进一步确证。

2.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(1)中所述乳粉样品与水的用量关系为1g：3～5mL～2g：7～10mL，所述水为去离子水，所述酸化乙腈中酸的体积百分含量为1～5％，其中所述酸为甲酸或冰乙酸，所述水与酸化乙腈的体积比为1：1.5～2。

3.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(1)中所述盐析试剂为无水硫酸钠、无水硫酸镁和氯化钠中的一种或两种，所述盐析试剂与水和酸化乙腈二者之和的用量关系为1g：4.5～5mL。

4.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(1)中水浴加热超声萃取时，水浴温度为45～55℃，超声波的频率为40～50khz，超声萃取时间为20～30分钟；涡旋时采用自动涡旋混合器在2200～2500r/min转速下圆周式剧烈旋涡振荡提取5～10min；离心为在9000～10000r/min转速下离心3～5min。

5.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(2)中所述的佛罗里硅土柱是指商品化的佛罗里硅土柱或使用硅藻土作为填料自制装填的佛罗里硅土柱，柱填料质量为0.5～1g，填料上方装填无水硫酸钠2.5～4g；自制装填的佛罗里硅土柱有两种装填方式，方式一：先装填硅藻土，然后在硅藻土上方装填无水硫酸钠，制得分层式佛罗里硅土柱；方式二：将硅藻土与无水硫酸钠按质量份配比为0.5～1：2.5～4混合，用研钵研磨均匀后再装填，制得混合式佛罗里硅土柱；所述活化的佛罗里硅土柱是指用体积比为1：9的丙酮-正己烷混合溶液10～15mL活化佛罗里硅土柱，柱活化后，将制得的待净化液加入活化后的佛罗里硅土柱中，收集流出液和洗脱液，所述洗脱液为二氯甲烷或乙酸乙酯，用量为3～5mL。

6.根据权利要求1所述的种乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(2)中所述浓缩、复溶、过滤包括将收集的流出液和洗脱液在水浴温度50～55℃条件下氮气吹干或旋转蒸发至干，然后加入1～2mL体积百分含量为60～70％的含酸甲醇水溶液复溶，接着在超声波频率40～50khz条件下超声2～3min，再用孔径为0.22μm或0.45μm的有机系针式滤器过滤至样品瓶中，获得待测液，其中所述酸为甲酸，所述甲酸的体积百分含量为0.05～0.1％。

7.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(3)中所述空白乳粉样品基质提取液是指不含四溴双酚A的乳粉样品，按照步骤(1)和步骤(2)制得基质提取液；用不含四溴双酚A的空白乳粉样品基质提取液稀释配制一组浓度范围为5～1000ng/mL的标准溶液，用于制作与样品基质匹配的标准工作曲线。

8.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(4)中采用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定时，其液相色谱条件包括：色谱柱：KinetexC₁₈，规格100×2.1mm，1.7μm；流速：0.20mL/min；柱温：25℃；进样量：50μL；流动相A为：体积比为8：2的甲醇-乙腈混合溶液；流动相B为：体积百分含量为0.1～0.2％的甲酸水溶液；梯度洗脱程序为：0.00min：A相，45％，B相，55％；2.00min：A相，45％，B相，55％；3.10min：A相，90％，B相，10％；10.00min：A相，90％，B相，10％；10.20min：A相，45％，B相，55％；12.00min：A相，45％，B相，55％；均为体积百分含量。

9.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(4)中采用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱法测定时，在电喷雾负离子模式(ESI-)下对样品待测液和标准溶液进行定性定量测定，采用自动扫描采集，加热模块温度：200～250℃；CDL温度：200～250℃；雾化器流速：1.4～1.5L/min；干燥气压力：100～110kPa；离子源电压：4.5kV；检测器电压：1.6～1.7kV；校准方法：自动调谐优化电压；三氟乙酸钠校准质量数；MS¹采集范围为m/z450～600，重复扫描2～3次，离子累积时间：30～40msec；CID能量:15～20％，获得四溴双酚A的五个加合物母离子MS¹同位素峰的精确质量数范围为：538.7455～538.7505、540.7455～540.7505、542.7405～542.7455、544.7405～544.7455、546.7405～546.7453；以542.7405～542.7455的离子峰的峰面积进行定量，其他离子峰精确质量数和保留时间作为定性判断依据。

10.根据权利要求1所述的乳粉中四溴双酚A的高分辨率检测方法，其特征是：步骤(5)分子式预测具体包括：根据四溴双酚A分子式C₁₅H₁₂O₂Br₄，设定化合物组成元素为C、H、O、Br，原子个数范围设为C:0～15；H:0～12；O:0～2；Br:0～4；丢失电荷设为H^-；应用氮规则筛查，筛查误差为2～20ppm；在四溴双酚A的五个加合物同位素离子同时存在前提下，设置电荷数量为1，选择质量数为538.7455～538.7505的加合物离子进行分子式预测，当预测结果仅有一个分子式且与四溴双酚A分子式一致，则验证待测样品中含有四溴双酚A。