CN114166985B - 一种海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法 - Google Patents

一种海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋沉积物检测技术领域，公开了一种海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法。本发明通过不同pH值的磷酸钠‑柠檬酸钠‑Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液在碱性‑碱性‑中性条件下对样品进行三次萃取，经过活性HLB柱进行净化、提纯、洗脱后得到洗脱液，最后经LC‑MS/MS进行目标物的分离和检测。本发明具有准确性高、重复性好、灵敏度高等优点，同时可一次性对不同理化性质的生物毒素进行定性、定量分析，为保障我国海洋环境质量安全提供有力的技术支撑。

Description

一种海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法
技术领域
本发明属于海洋沉积物检测技术领域，具体涉及一种海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法。
背景技术
海洋生物毒素是一类存在于海洋生物体内的高活性特殊代谢成分，主要包括藻类毒素和贝类毒素。
藻类是一类具有色素、营光能自养生活、生长于淡水和咸水中的低等生物。藻类的种类繁多，有毒的约40余种，其中蓝藻是目前已知产毒素最多的藻类。蓝藻产生的毒素主要包括：微囊藻毒素(Microcystins,MC)、鱼腥藻毒素(Anatoxin,ATX)、柱胞藻毒素(Cylindrospermospin,CYN)和节球藻毒素(Nodularin,NOD)等，按毒性机制可分为肝毒素、神经毒素、内毒素和其他毒素。
水体中的有毒藻类通过食物链传递给藻食性的鱼、虾和贝类等生物，并在体内蓄积、转化，从而形成有毒高分子化合物，被称为海洋贝类毒素。贝类毒素按毒性机制可分为腹泻性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning,DSP)、麻痹性贝类毒素(ParalyticShellfish Poisoning,PSP)、记忆缺失性贝类毒素(Amnescic Shellfish Poisoning,ASP)和神经性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning,NSP)；按化学结构可分为氮杂螺环酸毒素组(Azaspiracid Group,AZA)、软骨藻酸毒素组(Domoic Acid Group,DA)、石房蛤毒素组(Saxitoxin Group,STX)、短裸甲藻毒素组(Brevetoxin Group,BTX)、大田软海绵酸毒素组(Okadaic Acid Group,OA)、扇贝毒素组(Pecenotoxin Group,PTX)、虾夷扇贝毒素组(Yessotoxin Group,YTX)、环亚胺类毒素组(Cyclic-imine Group,CI)。其中软骨藻酸毒素组(DA)和石房蛤毒素组(STX)易溶于水，属于水溶性贝类毒素(Hydrophilic ShellfishToxins)；其余6类贝类毒素易溶于甲醇和乙醚等有机溶剂，属于脂溶性贝类毒素(Lipophilic Shellfish Toxin)。
海洋生物毒素具有种类繁多、化学结构各异和低剂量高毒性等特点，其在烹饪、微波、冻结、盐腌等条件下化学结构也极难被破坏，目前无适宜的解毒剂。一旦通过食物链进入人体后，极易对肝脏、神经系统和心血管系统等产生毒副作用，从而引起人体中毒。因此，及时监测海洋生物毒素对保障人民健康安全尤为重要。现有的研究主要采用液相色谱质谱技术检测水体和水产品中生物毒素，而水体中经过沉降作用和水生生物经由活动及消亡降解到沉积物中的生物毒素检测鲜见报导；而且，现有检测毒素的方法中，多适用于同一种类或同一理化性质的毒素，对复杂体系尚未有深入研究。因而有必要系统地建立一种快速、准确、灵敏的海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，形成一套标准的检测技术体系，用于监测、评估沉积物中生物毒素的污染状况，确保海洋环境质量安全。
发明内容
本发明的目的是为了填补海洋沉积物中多种类生物毒素一次性检测的技术空白点，通过合适的样品前处理和优化的仪器参数，提供一种前处理方法简单、检测种类多、准确度高、重现性好、灵敏度高的海洋沉积物中生物毒素的检测方法。
具体地，本发明提供了一种海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理
S01：提取
将适量海洋沉积物样品与萃取溶剂A1震荡混匀后超声辅助萃取，萃取结束后进行离心，得到固体产物Ⅰ和上清液Ⅰ；将固体产物Ⅰ与萃取溶剂A2震荡混匀后超声辅助萃取，萃取结束后进行离心，得到固体产物Ⅱ和上清液Ⅱ；将固体产物Ⅱ与萃取溶剂B震荡混匀后超声辅助萃取，萃取结束后进行离心，得到固体产物Ⅲ和上清液Ⅲ；将所述上清液Ⅰ、上清液Ⅱ和上清液Ⅲ合并之后于35～45℃水浴条件下旋蒸至近干，依次用纯水以及甲醇-水进行复溶，收集复溶溶液待上样；所述萃取溶剂A1和萃取溶剂A2各自独立地为碱性的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液，所述萃取溶剂B为中性的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液；
S02：净化
将HLB柱依次用甲醇和超纯水活化，得到活性HLB柱，所述活性HLB柱中填料干重和柱内体积与待测样品量的比值为(0.5～1)g:(6～35)mL:2g；将复溶溶液进行上样；上样结束后，将活性HLB柱用超纯水淋洗，再用隔膜真空泵抽干；然后用甲醇、二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；将所得洗脱液在35～45℃下氮吹至干，用甲醇、甲酸和水的混合溶液定容，最后经0.1～0.3μm滤膜过滤得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测；
(2)配制标准溶液
准确量取一定体积生物毒素标准品并用溶剂稀释定容，配制成1.0～100μg/L浓度梯度的混合标准溶液；
(3)样品检测
将生物毒素标准品混合溶液进行LC-MS/MS测定，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用外标法定量，得到待测水样中各待测成分的含量。
在本发明中，为了便于描述，将萃取过程中三次萃取所采用的萃取溶剂依次称为“萃取溶剂A1”、“萃取溶剂A2”和“萃取溶剂B”，并将三次萃取所得到的固体产物依次称为“固体产物Ⅰ”、“固体产物Ⅱ”和“固体产物Ⅲ”，同时将三次萃取所得到的液体产物依次称为“上清液Ⅰ”、“上清液Ⅱ”和“上清液Ⅲ”。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，萃取溶剂A1和萃取溶剂A2各自独立地为pH值为10.00～11.00(如10.00、10.10、10.20、10.30、10.40、10.50、10.56、10.60、10.70、10.80、10.90、11.00)的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，萃取溶剂B为pH值为6.50～7.00(如6.50、6.55、6.60、6.70、6.80、6.90、7.00)的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，所述萃取溶剂A1和萃取溶剂A2中缓冲液/乙腈的体积比各自独立地为(1～3)/18(如1/18、2/18、3/18)；所述萃取溶剂B中缓冲液/乙腈的体积比为(1～3)/18(如1/18、2/18、3/18)。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，相对于2.0g待测样品，所述萃取溶剂A1、萃取溶剂A2和萃取溶剂B中Na2EDTA的用量各自独立地为0.01～0.2g。
在一种优选的实施方式中，所述萃取溶剂A1和萃取溶剂A2均通过将1.5g Na2EDTA、2.76g Na3PO4·12H2O和1.29g Na3C6H5O7·2H2O溶解于100mL超纯水(Milli-Q)中获得。
在一种优选的实施方式中，所述萃取溶剂B通过将10g Na2EDTA、2.76g Na3PO4·12H2O和1.29g Na3C6H5O7·2H2O溶解于100mL Milli-Q中获得。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，所述混合溶剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为(2～5):1。
在一种优选的实施方式中，步骤(1)中，所述混合溶剂为8mL甲醇和4mL v/v＝1:1的甲醇-二氯甲烷。
在一种优选的实施方式中，步骤(2)中，所述生物毒素标准品包括10种贝类毒素和9种藻类毒素；所述贝类毒素包括AZA-1、DA、dcNEO、GYM、NEO、PTX2、SPX、DTX-1、DTX-2、OA；所述藻类毒素包括BTX-3、NOD、MC-LA、MC-LF、MC-LR、MC-LW、MC-HtyR、MC-RR、MC-WR。
在一种优选的实施方式中，所述LC-MS/MS检测过程中色谱条件包括：色谱柱为菲罗门C18柱和TSK-GEL Amide
Figure BDA0003388891910000051
柱串联进行色谱分离；柱温为35℃；流速为0.25mL/min；进样量为10μL；其中，10种贝类毒素和9种藻类毒素目标物分为2个检测组；BTX-3、NOD、MC-LA、MC-LF、MC-LR、MC-LW、MC-HtyR、MC-RR、MC-WR共9种藻类和AZA-1、DA、dcNEO、GYM、NEO、PTX2、SPX共7种贝类毒素的ESI﹢模式为一组，DTX-1、DTX-2和OA共3种贝类毒素的ESI﹣模式为一组；ESI﹢检测组使用的流动相为超纯水A1、含0.1％v/v甲酸的乙腈B1，ESI﹣检测组使用的流动相为超纯水A2和纯乙腈B2；采用梯度洗脱方式且梯度洗脱流程如下：
(1)ESI﹢模式下藻类、贝类毒素的梯度洗脱程序：0～2min的流动相为90％的A1相和10％的B1相，3～4min的流动相为75％的A1相和25％的B1相，6～8min的流动相为65％的A1相和35％的B1相，12～16min的流动相为50％的A1相和50％的B1相，20～25min的流动相为40％的A1相和60％的B1相，30～35min的流动相为20％的A1相和80％的B1相，36～40min的流动相为0％的A1相和100％的B1相，43～46min的流动相为90％的A1相和10％的B1相；
(2)ESI﹣模式下贝类毒素的梯度洗脱程序：0～1min的流动相为90％的A2相和10％的B2相，3min的流动相为50％的A2相和50％的B2相，4min的流动相为20％的A2相和80％的B2相，16～18min的流动相为10％的A2相和90％的B2相，20～22min的流动相为90％的A2相和10％的B2相。
在一种优选的实施方式中，所述LC-MS/MS检测过程中质谱条件包括：Agilent6490串联质谱仪，采用电喷雾离子源，多反应离子选择监测模式；鞘气温度为400℃，流速为12L/min；干燥气温度为300℃，流速为10L/min；雾化压力为35psi；喷嘴电压为1500V；毛细管电压为4000V；破碎电压为380V；四级杆温度为100℃；碰撞气为高纯氮气。
本发明具有以下技术效果：
(1)本发明提供的检测方法可同时对海洋沉积物中具有不同理化性质的生物毒素进行定性、定量分析，所有检测项目在0.1～100μg/L工作曲线范围内的相关系数R2均大于0.99，具有良好的线性关系，本检测方法准确性高、重现性好；且不同种类真菌毒素的检测限为0.025～0.1μg/kg，本检测方法灵敏度高。
(2)本发明采用磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液与乙腈的混合溶液为萃取溶剂，通过调节缓冲液的pH值，样品在碱性-碱性-中性条件下进行三次萃取，如此能够将样品中不同理化性质生物毒素萃取完全，并将会干扰LC-MS/MS测定的杂质尽可能排除，为后续的LC-MS/MS测定奠定了良好的基础。
附图说明
图1为生物毒素ESI﹢组的LC-MS/MS谱图；
图2为生物毒素ESI﹣组的LC-MS/MS谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明。
以下实施例和对比例中所采用的仪器和试剂如下：
液相色谱柱：C18柱(150mm×3mm i.d.,2.6μm,美国菲罗门公司)；液相串联质谱仪：Agilent 6490(美国安捷伦公司)；超声振荡器：KQ-300DA(苏州昆山市超声仪器有限公司)；纯水仪：Milli-Q Advantage(美国Millipore公司)；氮吹仪：DC-24-RT(上海安谱科学仪器有限公司)；HLB柱：(500mg/6mL，美国Waters公司)；有机滤膜：0.22μm PTFE针头式过滤器。
试剂：甲醇、甲酸、二氯甲烷和乙腈均为色谱纯，水为超纯水；Na2EDTA：分析纯，购自上海申博化工有限公司；磷酸钠：优级纯，购自广东汕头西陇化工有限公司；柠檬酸钠：优级纯，购自广东汕头西陇化工有限公司；19种生物毒素标准品：购自德国Dr.EhrenstorferGmbH公司。
以下实施例中，所采用的萃取溶剂A1和萃取溶剂A2均通过将1.5gNa2EDTA、2.76gNa3PO4·12H2O和1.29g Na3C6H5O7·2H2O溶解于100mL Milli-Q中获得；所采用的萃取溶剂B通过将10g Na2EDTA、2.76g Na3PO4·12H2O和1.29g Na3C6H5O7·2H2O溶解于100mL Milli-Q中获得。
实施例
(1)样品前处理
称取2.0g海洋沉积物样品于离心管，加入2mL pH＝10.56的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和18mL乙腈，进行震荡混匀，超声辅助萃取10min，3500r/min离心5min；取上清液于150mL梨形瓶，再于离心管中加入2mL pH＝10.56的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和18mL乙腈重复萃取一次；取上清液于150mL梨形瓶，再于离心管中加入2mL pH＝6.55的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和18mL乙腈，再进行萃取一次；合并3次萃取液，40℃水浴锅条件下旋蒸至约0.5mL，用2mL纯水洗梨形瓶两次，2mL甲醇-水(体积比为2:8)洗一次，收集复溶溶液待上样；
将HLB柱(500mg/6mL)依次用6mL甲醇和6mL超纯水活化，得到活性HLB柱，将复溶溶液进行上样；上样结束后，10mL纯水淋洗活性HLB柱除去残留的Na2EDTA，负压真空干燥10min，然后依次用8mL甲醇、4mL甲醇-二氯甲烷(体积比1:1)混合溶剂进行洗脱，收集洗脱液；45℃下氮吹至近干，用含0.1％甲酸甲醇-水(体积比为2:8)转溶并定容至1mL，用0.22μmPTFE针头式过滤器过滤，得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测。
(2)配制标准溶液
准确量取一定体积AZA-1、BTX-3、DA、dcNEO、GYM、NEO、NOD、PTX2、SPX、DTX-1、DTX-2、OA、MC-LA、MC-LF、MC-LR、MC-LW、MC-HtyR、MC-RR、MC-WR共19种生物毒素标准品，以甲醇稀释，配制成10mg/L的单标储备液；再分别移取各标准品单标储备液于10mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度线，最终配制成1.0～100μg/L浓度梯度的混合标准溶液，混合标准溶液的浓度分别为1.0μg/L、5.0μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L和100μg/L。
(3)样品检测
对生物毒素标准品混合溶液进行LC-MS/MS检测，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS检测，采用外标法定量，并将所得检测曲线与标准工作曲线进行比对，得到海洋沉积物中各待测成分的含量。根据《GB/T 27417-2017化学分析方法确认和验证指南》，选择3倍信噪比时对应的浓度作为该目标物的仪器检测限(Method Detection Limit,MDL)。检测项目的线性范围、相关系数和检测限见表1。从表1可知，所有检测项目在0.1～100μg/L工作曲线范围内的相关系数R2均大于0.99，具有良好的线性关系，该检测方法准确性高、重现性好；本发明对生物毒素的检出限为0.025～0.25μg/kg，该检测方法具有高度灵敏性。
表1检测项目的线性范围、相关系数和检测限
Figure BDA0003388891910000081
Figure BDA0003388891910000091
LC-MS/MS检测过程中，色谱条件包括：采用菲罗门C18柱和TSK-GEL Amide
Figure BDA0003388891910000093
柱串联进行色谱分离；柱温为35℃，流速为0.25mL/min，进样量为10μL；10种贝类毒素和9种藻类毒素目标物分为2个检测组；其中，BTX-3、NOD、MC-LA、MC-LF、MC-LR、MC-LW、MC-HtyR、MC-RR、MC-WR共9种藻类和AZA-1、DA、dcNEO、GYM、NEO、PTX2、SPX共7种贝类毒素的ESI﹢模式为一组，DTX-1、DTX-2和OA共3种贝类毒素的ESI﹣模式为一组；ESI﹢检测组使用的流动相为超纯水A1、含0.1％v/v甲酸的乙腈B1，ESI﹣检测组使用的流动相为超纯水A2和纯乙腈B2；两个检测组的梯度洗脱程序见下表2和表3。
表2ESI﹢条件下的藻类、贝类毒素HPLC梯度洗脱程序
Figure BDA0003388891910000092
注：表2中，A1相和B1相的洗脱比例为体积比，且未提及时间段的洗脱比例参照上一时间点。
表3ESI﹣条件下贝类毒素的HPLC梯度洗脱程序
Figure BDA0003388891910000101
注：表3中，A2相和B2相的洗脱比例为体积比，且未提及时间段的洗脱比例参照上一时间点。
LC-MS/MS检测过程中，质谱条件包括：采用Agilent 6490串联质谱仪，采用电喷雾离子源(Electrospray Ionization,ESI)，多反应离子选择监测模式(Multiple ReactionMonitoring,MRM)；使用氮气发生器提供鞘气和干燥气，鞘气温度为400℃，流速为12L/min；干燥气温度为300℃，流速为10L/min；雾化压力为35psi；喷嘴电压为1500V；毛细管电压为4000V；破碎电压为380V；四级杆温度为100℃；碰撞气为高纯氮气(99.999％)；其他质谱参数采集条件见表4，其中标注*为定量离子。
表4检测项目特征离子
Figure BDA0003388891910000102
生物毒素ESI﹢组的LC-MS/MS谱图如图1所示，生物毒素ESI﹣组的LC-MS/MS谱图如图2所示。从图1～2可以看出，各生物毒素检测项目在优化的质谱参数下具有强质谱信号，灵敏度高、峰形对称，有利于定性、定量分析。本测定方法的回收率和精密度：以海洋沉积物为基底进行低、中、高三个浓度的加标实验，同时做平行试验(n＝3)，其中测定回收率(RE)及相对标准偏差(RSD)见表5。从表5可知，海洋沉积物除藻类毒素MC-RR的回收率在30.1％、相对标准偏差在9.2％～13.8％外，其他项目的回收率在54.5％～105.2％，相对标准偏差在0.6％～20.1％，测定结果符合检测准确度的要求。
表5海洋沉积物中19种生物毒素的RE和RSD
Figure BDA0003388891910000111
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (7)

1.一种海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）样品前处理
S01：提取
将适量海洋沉积物样品与萃取溶剂A1震荡混匀后超声辅助萃取，萃取结束后进行离心，得到固体产物Ⅰ和上清液Ⅰ；将固体产物Ⅰ与萃取溶剂A2震荡混匀后超声辅助萃取，萃取结束后进行离心，得到固体产物Ⅱ和上清液Ⅱ；将固体产物Ⅱ与萃取溶剂B震荡混匀后超声辅助萃取，萃取结束后进行离心，得到固体产物Ⅲ和上清液Ⅲ；将所述上清液Ⅰ、上清液Ⅱ和上清液Ⅲ合并之后于35~45 ℃水浴条件下旋蒸至近干，依次用纯水以及甲醇-水进行复溶，收集复溶溶液待上样；所述萃取溶剂A1和萃取溶剂A2各自独立地为碱性的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液，所述萃取溶剂B为pH值为6.50~7.00的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液；
S02：净化
将HLB柱依次用甲醇和超纯水活化，得到活性HLB柱，所述活性HLB柱中填料干重和柱内体积与待测样品量的比值为(0.5~1)g:(6~35)mL:2 g；将复溶溶液进行上样；上样结束后，将活性HLB柱用超纯水淋洗，再用隔膜真空泵抽干；然后用甲醇、二氯甲烷的混合溶剂作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；将所得洗脱液在35~45 ℃下氮吹至干，用甲醇、甲酸和水的混合溶液定容，最后经0.1~0.3 μm滤膜过滤得到待测样品溶液，待LC-MS/MS检测；
（2）配制标准溶液
准确量取一定体积生物毒素标准品并用溶剂稀释定容，配制成1.0~100 μg/L浓度梯度的混合标准溶液；
（3）样品检测
将生物毒素标准品混合溶液进行LC-MS/MS测定，得到标准工作曲线；将待测样品溶液进行LC-MS/MS测定，采用外标法定量，得到待测样品溶液中各待测成分的含量；
步骤（2）中，所述生物毒素标准品包括10种贝类毒素和9种藻类毒素；所述贝类毒素包括AZA-1、DA、dcNEO、GYM、NEO、PTX2、SPX、DTX-1、DTX-2、OA；所述藻类毒素包括BTX-3、NOD、MC-LA、MC-LF、MC-LR、MC-LW、MC-HtyR、MC-RR、MC-WR；
所述LC-MS/MS检测过程中色谱条件包括：色谱柱为菲罗门C18柱和TSK-GEL Amide 80®柱串联进行色谱分离；柱温为35℃；流速为0.25 mL/min；进样量为10 μL；其中，10种贝类毒素和9种藻类毒素目标物分为2个检测组；BTX-3、NOD、MC-LA、MC-LF、MC-LR、MC-LW、MC-HtyR、MC-RR、MC-WR共9种藻类和AZA-1、DA、dcNEO、GYM、NEO、PTX2、SPX共7种贝类毒素的ESI﹢模式为一组，DTX-1、DTX-2和OA共3种贝类毒素的ESI﹣模式为一组；ESI﹢检测组使用的流动相为超纯水A1、含0.1%v/v甲酸的乙腈B1，ESI﹣检测组使用的流动相为超纯水A2和纯乙腈B2；采用梯度洗脱方式且梯度洗脱流程如下：
（1）ESI﹢模式下藻类、贝类毒素的梯度洗脱程序：0~2 min的流动相为90%的A1相和10%的B1相，2~3 min的流动相为90%~75%的A1相和10%~25%的B1相，3~4 min的流动相为75%的A1相和25%的B1相，4~6 min的流动相为75%~65%的A1相和25%~35%的B1相，6~8 min的流动相为65%的A1相和35%的B1相，8~12 min的流动相为65%~50%的A1相和35%~50%的B1相，12~16 min的流动相为50%的A1相和50%的B1相，16~20 min的流动相为50%~40%的A1相和50%~60%的B1相，20~25 min的流动相为40%的A1相和60%的B1相，25~30 min的流动相为40%~20%的A1相和60%~80%的B1相，30~35 min的流动相为20%的A1相和80%的B1相，35~36 min的流动相为20%~0%的A1相和80%~100%的B1相，36~40 min的流动相为0%的A1相和100%的B1相，40~43 min的流动相为0%~90%的A1相和100%~10%的B1相，43~46 min的流动相为90%的A1相和10%的B1相；
（2）ESI﹣模式下贝类毒素的梯度洗脱程序：0~1 min的流动相为90%的A2相和10%的B2相，1~3 min的流动相为90%~50%的A2相和10%~50%的B2相，3~4 min的流动相为50%~20%的A2相和50%~80%的B2相，4~16 min的流动相为20%~10%的A2相和80%~90%的B2相，16~18 min的流动相为10%的A2相和90%的B2相，18~20 min的流动相为10%~90%的A2相和90%~10%的B2相，20~22min的流动相为90%的A2相和10%的B2相。
2.根据权利要求1所述的海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述萃取溶剂A1和萃取溶剂A2各自独立地为pH值为10.00~11.00的磷酸钠-柠檬酸钠-Na2EDTA缓冲液和乙腈的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述萃取溶剂A1和萃取溶剂A2中缓冲液/乙腈的体积比各自独立地为(1~3)/18；所述萃取溶剂B中缓冲液/乙腈的体积比为(1~3)/18。
4.根据权利要求1所述的海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，相对于2.0 g待测样品，所述萃取溶剂A1、萃取溶剂A2和萃取溶剂B中Na2EDTA的用量各自独立地为0.01~0.2 g。
5.根据权利要求1所述的海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述混合溶剂中甲醇和二氯甲烷的体积比为(2~5):1。
6.根据权利要求5所述的海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述混合溶剂为8 mL甲醇和4mL v/v=1:1的甲醇-二氯甲烷的混合物。
7.根据权利要求1所述的海洋沉积物中多种类生物毒素的检测方法，其特征在于，所述LC-MS/MS检测过程中质谱条件包括：Agilent 6490 串联质谱仪，采用电喷雾离子源，多反应离子选择监测模式；鞘气温度为400℃，流速为12 L/min；干燥气温度为300℃，流速为10L/min；雾化压力为35 psi；喷嘴电压为1500 V；毛细管电压为4000 V；破碎电压为380 V；四级杆温度为100℃；碰撞气为高纯氮气。
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