CN113607851A - 生物检材中13种贝类毒素的检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开生物检材中13种贝类毒素的检验方法，包括如下步骤：生物检材经萃取处理后得到样品提取液；以水为溶剂，用C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、STX、NEO、dcSTX、dcNEO、dcGTX2和dcGTX3共13种贝类毒素的标准物质分别配制标准物质溶液；用13种贝类毒素的标准物质溶液分别配制标准溶液；分别用13种贝类毒素的标准物质溶液配制混合标准工作溶液；质控样品的制备；分别吸取样品提取液、空白样品提取液、添加样品提取液、标准溶液和混合标准工作溶液，采用液相色谱‑质谱仪进行检测，分析并计算检测结果。本发明具有测定方法简单、易于操作、重复性好、灵敏度高等优点，适用于法庭科学领域，实现对生物检材中多种贝类毒素的高灵敏度同时测定。
Description
技术领域
本发明涉及贝类毒素检测技术领域。具体地说是生物检材中13种贝类毒素的检验方法。
背景技术
由毒藻产生的毒素往往经贝类传播媒介造成人类中毒，因而这类毒素通常被称为贝毒。贝类毒素主要分为5类：腹泻性贝毒DSP、麻痹性贝毒PSP、神经性贝毒NSP、记忆缺损性贝毒ASP、西加鱼类毒素CTX等。其中，麻痹性贝毒主要表现包括：轻微的中毒，其症状主要表现为唇、口、舌感觉异常和麻木，而后波及脸及脖子等部位，指尖常有针刺般痛感并伴有轻微的头痛和头晕。稍微严重的中毒，出现胳膊和腿的麻痹、随意运动障碍、说话语无伦次。严重的中毒，可出现呼吸麻痹，甚至因窒息而亡。
贝类毒素的中毒机理为：麻痹性贝毒可选择性作用于肌肉和神经细胞Na+通道，阻碍Na+内流，导致动作电位无法形成，从而产生麻痹状态。Na+通道大多分布于哺乳动物的神经、骨骼肌纤维和大多数心脏的肌肉纤维兴奋细胞的细胞膜上。在安静状态下，细胞处于膜内K+浓度高、膜外Na+浓度高的状态，当细胞受到刺激后Na+快速内流产生动作电位，进而在神经细胞上开始传播。当麻痹性贝毒分子进入体内后，阻断电压门控Na+通道，从而减缓或终止动作电位的传导。
在刑侦领域及司法实践中，生物检材中各类毒素的定性和定量分析检测结果，是刑侦及司法工作中的重要依据和证据。贝类毒素在进入生物体后经过代谢后残余量通常较低，因而在取得的血液、尿液及其它生物组织中的含量也会较低，在加上可能受到基质的影响。因此，生物检测中贝类毒素的检测对实际操作和方法具有更高的要求。目前，关于贝类毒素的检测大多针对贝类本身或相关的食品原料，而对于生物检材中贝类毒素的检测鲜有报道。而对食品原料中贝类毒素的检测，其检出限往往较高(通常≥2ng/mL)，对生物检材中贝类毒素的检测来说，灵敏度不够；因而不能将现有的用于食品原料中贝类毒素的检测方法直接应用于生物检材中。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种生物检材中13种贝类毒素的检验方法，可以快速、高效且灵敏的检测出生物检材中13种贝类毒素，以改善法庭科学领域，生物检材中贝类毒素检测方法上的不足。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
生物检材中13种贝类毒素的检验方法，包括如下步骤：
步骤A、生物检材的处理：生物检材经萃取处理后得到样品提取液；
步骤B、标准物质溶液的准备：以水为溶剂，用13种贝类毒素的标准物质分别配制13种贝类毒素的标准物质溶液；
步骤C、标准溶液的准备：用13种贝类毒素的标准物质溶液分别配制13种贝类毒素的标准溶液；
步骤D、混合标准工作溶液的准备：分别用13种贝类毒素的标准物质溶液配制混合标准工作溶液；
步骤E、质控样品的制备；
步骤F、分别吸取样品提取液、空白样品提取液、添加样品提取液、标准溶液和混合标准工作溶液，采用液相色谱-质谱仪进行检测，分析并计算检测结果；
所述13中贝类毒素分别为：C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、STX、NEO、dcSTX、dcNEO、dcGTX2和dcGTX3。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，在步骤A中，所述生物检材为血液或尿液；
所述生物检材的处理方法为：取血液或尿液的生物检材样品于离心管中，用乙酸溶液调节pH至2.0-4.0，离心后吸取上清液于容量瓶中；向含有沉淀物的离心管中再加入乙酸溶液，涡旋混合，再次离心，将两次上清液合并，用乙酸溶液稀释，得到样品提取液。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，在步骤A中，所述生物检材为血液或尿液；
所述生物检材的处理方法为：取血液或尿液的生物检材样品1.0mL于50mL离心管中，用1.0vt％乙酸溶液调节pH至2.0-4.0；4℃条件下7000r/min离心10min，然后吸取上清液于10mL容量瓶，向含有沉淀物的离心管中再加入3mL 1.0vt％乙酸溶液，涡旋混合，4℃条件下7000r/min再次离心10min，将两次上清液合并，用1.0vt％乙酸稀释至10.0mL，得到样品提取液。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，在步骤A中，所述生物检材为生物组织；
所述生物检材的处理方法为：取绞碎的生物组织于离心管中，加入乙酸溶液在冰水混合浴中进行组织匀浆，用乙酸溶液调节pH，涡旋混合，然后置于沸水浴中加热；水浴加热后取出离心管，再次涡旋混合，并冷却至室温，调节pH至2.0-4.0，离心后吸取上清液于容量瓶中；向含有沉淀物的离心管中加入乙酸溶液，涡旋混合，再次离心，将两次上清液合并，用乙酸溶液稀释，得到样品提取液。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，在步骤A中，所述生物检材为生物组织；
所述生物检材的处理方法为：称取绞碎的组织1.0g，于50mL离心管中，加入5mL1.0vt％乙酸溶液在冰水混合浴中进行组织匀浆，用0.1vt％乙酸溶液调节2＜pH＜4，涡旋混合，然后置于沸水浴中加热5min；水浴加热后取出离心管，再次涡旋混合，并冷却至室温，调节pH至2.0-4.0；4℃条件下7000r/min离心10min，然后吸取上清液于10mL容量瓶，向含有沉淀物的离心管中再加入3mL 1.0vt％乙酸溶液，涡旋混合，4℃条件下7000r/min再次离心10min，将两次上清液合并，用1.0vt％乙酸稀释至10.0mL，得到样品提取液。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，所述生物检材处理方法还包括如下步骤：
取所述样品提取液1mL，加入5μL25wt％氨水溶液，涡旋混合，然后转移400μL至依次用3mL含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液和3mL0.1wt％氨水溶液活化好的SupelcoENVI-Carb固相萃取柱中，用700μL超纯水淋洗，抽干弃去淋洗液，用2mL含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，并定容至5mL；取1mL洗脱液，用0.22μm的水系微孔滤膜过滤，得到待测样品提取液；所述含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液的配制方法如下：将乙腈和水按照体积比1:4配制成乙腈水溶液，每100mL乙腈水溶液中加入1mL乙酸，即得含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，在步骤B中，13种贝类毒素的标准物质中，C1和C2两种毒素的标准物质为C1/C2混合标准物质，GTX1和GTX4两种毒素的标准物质为GTX1/GTX4混合标准物质，GTX2和GTX3两种毒素的标准物质为GTX2/GTX3混合标准物质，dcGTX2和dcGTX3两种毒素的标准物质为dcGTX2/dcGTX3混合标准物质，GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO5种毒素的标准物质为单一标准物质；所述标准物质溶液包括GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO5种毒素的单一标准物质溶液，以及C1/C2混合标准物质溶液、GTX1/GTX4混合标准物质溶液、GTX2/GTX3混合标准物质溶液和dcGTX2/dcGTX3混合标准物质溶液；
所述标准物质溶液的浓度如下：GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO5种毒素的单一标准物质溶液的浓度均为1.0μg/mL；C1/C2混合标准物质溶液中C1的浓度为3.35μg/mL，C2的浓度为1.0μg/mL；GTX1/GTX4混合标准物质溶液中GTX1的浓度为3.18μg/mL，GTX4的浓度为1.0μg/mL；GTX2/GTX3混合标准物质溶液中GTX2的浓度为2.36μg/mL，GTX3的浓度为1.0μg/mL；dcGTX2/dcGTX3混合标准物质溶液中dcGTX2的浓度为3.40μg/mL，dcGTX3的浓度为1.0μg/mL；将所述标准物质溶液置于冰箱中冷藏保存，有效期为6个月；
在步骤C中，所述标准溶液包括GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的单一标准溶液，以及C1/C2混合标准溶液、GTX1/GTX4混合标准溶液、GTX2/GTX3混合标准溶液和dcGTX2/dcGTX3混合标准溶液；所述标准溶液的配制方法为：移取所述标准物质溶液各1mL，分别用水稀释并定容至10mL，混匀即可；GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的单一标准溶液的浓度均为0.1μg/mL；C1/C2混合标准溶液中C1的浓度为0.335μg/mL，C2的浓度为0.1μg/mL；GTX1/GTX4混合标准溶液中GTX1的浓度为0.318μg/mL，GTX4的浓度为0.1μg/mL；GTX2/GTX3混合标准溶液中GTX2的浓度为0.236μg/mL，GTX3的浓度为0.1μg/mL；dcGTX2/dcGTX3混合标准溶液中dcGTX2的浓度为0.340μg/mL，dcGTX3的浓度为0.1μg/mL；密封后置于冰箱中冷藏保存，有效期为3个月；
在步骤D中，所述混合标准工作溶液的配制方法为：移取所述标准物质溶液各0.9mL，用水稀释并定容至10mL，混匀得到混合标准工作溶液，密封后置于冰箱中冷藏保存，有效期3个月。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，在步骤E中，质控样品的制备方法为：取等量与生物检材相同基质的空白样品2-3份于具盖离心管中，其中1份作为空白样品，另外1-2份添加13种毒素的标准物质作为添加样品；将空白样品和添加样品分别进行与检材样品相同的平行操作处理，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析；
添加样品提取液中，C1的含量为20ng/mL，C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、STX、NEO、dcSTX、dcNEO、dcGTX2和dcGTX3的浓度均为10ng/mL；或者添加样品提取液中，所述13种毒素的含量分别为所述生物检材中目标毒素含量的(100±50)％。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，在步骤F中，色谱条件为：
色谱柱：TSK-Gel
HILIC色谱柱，所述色谱柱的规格为2mm×250mm、填料粒径为5μm；或其他等效色谱柱；
流动相A：50mM甲酸和2mM甲酸铵溶液；流动相B：100％乙腈；所述流动相A的配制方法为：分别取2mmol甲酸铵用水溶解，再加入50mmol甲酸混匀，定容至1000mL，即得流动相A；
洗脱梯度：0-25.0min，所述流动相B的体积分数为90vt％-55vt％；25.0-27.0min，所述流动相B的体积分数为55vt％-30vt％；27.0-40.0min，所述流动相B的体积分数为30vt％；40.0-40.1min，所述流动相B的体积分数为30vt％-90vt％；40.1-50.0min，所述流动相B的体积分数为90vt％；
柱温：40℃；流速：0.2mL/min；进样量：5μL；
质谱条件：
离子源：电喷雾电离ESI；检测方式：正离子模式；电喷雾电压：5.5kV；离子源温度：350℃；雾化气压力：55psi；辅助气压力：50psi；气帘气压力：40psi；碰撞气压力：Medium；扫描模式：多反应离子监测模式MRM。
上述生物检材中13种贝类毒素的检验方法，所述生物检材为血、尿、肝、肾、胃或胃内容物。
本发明的技术原理：以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对检材进行提取、净化及浓缩，采用液相色谱-质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征碎片离子峰和相对丰度比作为定性判断依据；以峰面积为依据，用外标法进行定量分析。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
(1)本发明提供的生物检材中13种贝类毒素的检验方法可以实现对生物检材中13种贝类毒素的同时测定，且具有测定方法简单、易于操作、重复性好、灵敏度高等优点，适用于法庭科学领域，实现对生物检材中多种贝类毒素的高灵敏度同时测定。
(2)本发明对生物检材的处理方法简单、快速，且不需要使用大量的有机试剂。通过大量试验发现，将血液、尿液、生物组织等不同的生物检材先使用1.0vt％的乙酸溶液对生物检材进行液液萃取，然后再用经含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液和0.1wt％氨水溶液活化的Supelco ENVI-Carb固相萃取柱进行固相萃取，并通过设置质控样品，可将生物检材的基质效应降至最小，使检测的准确度、灵敏度以及重复性大幅度提高；另外，本发明中通过设置质控样品，保证了检测结果的准确性。
(3)本发明的检验方法可有效降低贝类毒素的检出限，其中GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、STX、NEO、dcSTX、dcGTX2和dcGTX3九种贝类毒素的检出限在0.21-2.0ng/mL范围之内，可以满足法庭科学领域对生物检材(血、尿、肝、肾、胃及胃内容物)中贝类毒素的检测要求。
附图说明
图1本发明C1、C2、GTX2、GTX3和NEO的标准工作液色谱图；
图2本发明GTX1和GTX4的标准工作液色谱图；
图3本发明dcGTX2和dcGTX3的标准工作液色谱图；
图4本发明GTX5和STX的标准工作液色谱图；
图5本发明dcSTX的标准工作液色谱图；
图6本发明dcNEO的标准工作液色谱图。
具体实施方式
1试剂和材料
1.1试剂
本实施例用水符合GB/T6682中规定的三级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试剂包括：
a)乙腈(色谱纯)；
b)甲酸(色谱纯)；
c)乙酸(优级纯)；
d)氨水(优级纯，浓度≥25％)；
e)甲酸铵；
f)氢氧化钠；
g)标准工作溶液：
1)标准物质溶液：根据标准物质的纯度，各称取适量(13种贝类毒素的标准物质中，C1和C2两种毒素的标准物质为C1/C2混合标准物质，GTX1和GTX4两种毒素的标准物质为GTX1/GTX4混合标准物质，GTX2和GTX3两种毒素的标准物质为GTX2/GTX3混合标准物质，dcGTX2和dcGTX3两种毒素的标准物质为dcGTX2/dcGTX3混合标准物质，GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的标准物质为单一标准物质)，分别用水配制1.0μg/mL C2、GTX4、GTX3、dcGTX3、GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO以及3.35μg/mL C1、3.18μg/mL GTX1、2.36μg/mL GTX2、3.40μg/mL dcGTX2标准物质溶液，置于冰箱中冷藏保存，有效期6个月；且C1和C2两种毒素的标准物质溶液为C1/C2混合标准物质溶液，GTX1和GTX4两种毒素的标准物质溶液为GTX1/GTX4混合标准物质溶液，GTX2和GTX3两种毒素的标准物质溶液为GTX2/GTX3混合标准物质溶液，dcGTX2和dcGTX3两种毒素的标准物质溶液为dcGTX2/dcGTX3混合标准物质溶液。
2)标准溶液：移取上述标准物质溶液各1mL，分别用水稀释并定容至10mL，混匀即可；GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的单一标准溶液的浓度均为0.1μg/mL；C1/C2混合标准溶液中C1的浓度为0.335μg/mL，C2的浓度为0.1μg/mL；GTX1/GTX4混合标准溶液中GTX1的浓度为0.318μg/mL，GTX4的浓度为0.1μg/mL；GTX2/GTX3混合标准溶液中GTX2的浓度为0.236μg/mL，GTX3的浓度为0.1μg/mL；dcGTX2/dcGTX3混合标准溶液中dcGTX2的浓度为0.340μg/mL，dcGTX3的浓度为0.1μg/mL；密封后置于冰箱中冷藏保存，有效期3个月，实验中所用其他浓度的标准溶液均由标准物质溶液用水稀释得到。
3)混合标准工作溶液：移取标准物质溶液各0.9mL，用水稀释并定容至10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期3个月，实验中所用其他浓度的混合标准工作溶液均由标准物质溶液用水稀释得到。
1.2材料
材料包括：
a)具塞离心管；
b)水系微孔滤膜：0.22μm；
c)Supelco ENVI-Carb固相萃取柱：石墨化碳黑，使用前依次用3mL含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液、3mL 0.1wt％氨水溶液(即氨水溶液中氨气的质量分数为0.1wt％)活化；所述含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液的配制方法如下：将乙腈和水按照体积比1:4配制成乙腈水溶液，每100mL乙腈水溶液中加入1mL乙酸，即得含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液。
2仪器和设备
仪器和设备包括：
液相色谱质谱仪：配有电喷雾离子源(ESI)和三重四极杆或离子阱质量分析器、分析天平、组织均质器、pH计、涡旋混合器、水浴锅、冷冻离心机、移液器、固相萃取装置、真空泵和氮吹仪。
3操作方法
3.1定性分析
3.1.1生物检材的处理
(1)血液液液萃取
取血液生物检材样品1.0mL于50mL离心管中，用1.0vt％乙酸溶液调节pH至2.0-4.0,4℃条件下3000r/min离心10min，然后吸取上清液于10mL容量瓶，向含有沉淀物的离心管中再加入3mL 1.0vt％乙酸溶液，涡旋混合，4℃条件下3000r/min再次离心10min，将两次上清液合并，用1.0vt％乙酸稀释至10.0mL；所得样品溶液作为检材样品提取液供仪器分析。
(2)组织液液萃取
称取绞碎的肝组织1.0g，于50mL离心管中，加入5mL 1.0vt％乙酸溶液在冰水混合浴中进行组织匀浆，用0.1vt％乙酸溶液调节2＜pH＜4，涡旋混合，然后置于沸水浴中加热5min。从水浴中取出，重新混合，冷却至室温，调节pH至2.0-4.0，4℃条件下3000r/min离心10min，然后吸取上清液于10mL容量瓶，向含有沉淀物的离心管中再加入3mL 1.0vt％乙酸溶液，涡旋混合，4℃条件下3000r/min再次离心10min，将两次上清液合并，用1.0vt％乙酸稀释至10.0mL；所得样品溶液作为检材样品提取液供仪器分析。
(3)生物检材样品的固相萃取
取上述(1)或(2)中所得溶液1mL，加入5μL 25wt％氨水溶液，涡旋混合，然后转移400μL至依次用3mL含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液、3mL0.1wt％氨水溶液活化好的Supelco ENVI-Carb固相萃取柱中，用300μL超纯水淋洗，抽干弃去淋洗液，用2mL含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，并定容至5mL，取1mL洗脱液，用0.22μm的水系微孔滤膜过滤，得到待测样品提取液，供仪器分析。
(4)质控样品制备
取等量相似基质的空白样品两份于具盖离心管中，一份作为空白样品，另一份添加C1、C2、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、dcGTX2、dcGTX3、GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO标准物质，使C1含量为20ng/mL(或ng/g)，其他为10ng/mL(或ng/g)，作为添加样品；将空白样品和添加样品进行与检材样品平行的操作处理，具体操作方法参见“(1)血液液液萃取、(2)组织液液萃取和(3)生物检材样品的固相萃取”，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析。
3.1.2仪器检测
(1)仪器条件(液相色谱-质谱仪条件)
以下为本实施例的仪器条件，在其它实施例中可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整：
a)色谱柱：TSK-Gel
HILIC色谱柱(2mm×250mm,5μm)，在其它实施例中可以使用他等效色谱柱；
b)流动相：A：50mM甲酸和2mM甲酸铵溶液，B：100％乙腈；所述流动相A的配制方法为：分别取2mmol甲酸铵用水溶解，再加入50mmol甲酸混匀，定容至1000mL，即得流动相A。
c)洗脱：梯度洗脱，梯度见表1；
表1
| 时间/min | 流动相A(体积分数％) | 流动相B(体积分数％) |
| 0 | 10％ | 90％ |
| 25.0 | 45％ | 55％ |
| 27.0 | 70％ | 30％ |
| 40.0 | 70％ | 30％ |
| 40.1 | 10％ | 90％ |
| 50.0 | 10％ | 90％ |
d)柱温：40℃；
e)流速：0.2mL/min；
f)进样量：5μL；
g)离子源：电喷雾电离(ESI)；
h)检测方式：正离子；
i)电喷雾电压：5.5kV；
j)离子源温度：350℃；
k)雾化气压力：55psi；
l)辅助气压力：50psi；
m)气帘气压力：40psi；
n)碰撞气压力：Medium
o)扫描模式：多反应离子监测模式(MRM)；
p)MS参考条件(定性、定量离子对和去簇电压、碰撞能量)见表2。
表2
(2)进样
分别吸取生物检材样品提取液、空白样品提取液和添加样品提取液、以及标准工作溶液，按“(1)仪器条件(液相色谱-质谱仪条件)”的分析条件进行定性分析。
3.2定性分析
3.2.1生物检材的处理
移取血液液体生物检材样品1.0mL，或称取绞碎的肝脏固体检材样品1.0g两份，分别按“3.1.1生物检材的处理”进行操作。
另取等量相似基质的空白样品三份，其中两份分别添加C1、C2、GTX1、GTX4、GTX2、GTX3、dcGTX2、dcGTX3、GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO标准物质作为添加样品，且添加样品中目标物含量为检材样品中目标物含量的(100±50)％，另一份作为空白样品；将其与检材样品平行操作得到空白样品提取液和添加样品提取液，供仪器检测。
3.2.2仪器检测
(1)仪器条件(液相色谱-质谱仪条件)
按照“3.1.2仪器检测”中“(1)仪器条件(液相色谱-质谱仪条件)”规定的条件分析。
(2)进样
分别吸取生物检材样品提取液、空白样品提取液和添加样品提取液、以及标准工作溶液进行色谱分析；每个样品进样分析2～3次；若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于6次。
3.2.3结果计算
(1)含量的计算
记录各样品提取液平行进样2～3次的目标物保留时间和峰面积值，按式(1)计算含量：
式中：
W——生物检材样品中目标物的含量，单位为微克每克(μg/g)或微克每毫升(μg/mL)；
A样——生物检材样品提取液中目标物峰面积平均值；
M添——添加样品提取液中目标物添加量，单位为微克(μg)；
V样——生物检材样品的定容体积，单位为毫升(mL)；
A添——添加样品提取液中目标物峰面积平均值；
M样——生物检材样品的取样量，单位为克(g)或毫升(mL)；
V添——添加样品提取液的定容体积，单位为毫升(mL)。
(2)相对相差的计算
记录两份平行操作的检材样品中目标物的含量，按式(2)计算相对相差：
式中：
RD——相对相差，用百分比(％)表示；
X1、X2——两个生物检材样品平行定量测定的含量数值；
4结果评价
4.1定性结果评价
4.1.1阳性结果评价
在相同条件下进行样品测定时，生物检材样品中目标物的色谱峰保留时间与标准溶液一致(相对误差在士2.5％之内)、目标物的定性离子(至少两对定性离子)与标准溶液一致，且离子丰度比与浓度接近的标准溶液相比，相对偏差不超过表3规定的范围，空白样品无干扰，则可判断检材样品中检出目标物。
表3
| 离子丰度比 | >50％ | >20％～50％ | >10％～20％ | ≤10％ |
| 最大允许相对偏差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
在本实施例中，13种贝类毒素标准工作溶液的色谱峰保留时间见图1-6。
4.1.2阴性结果评价
生物检材样品未出现与标准工作溶液一致的色谱峰，且添加样品中出现与标准工作溶液一致的色谱峰，空白样品无干扰，则可判断检材样品中未检出目标物。
4.2定量结果评价
如果目标毒素含量的RD≤20％，说明定量数据可靠，其含量按两份生物检材的平均值计算。如果生物检材样品中目标毒素含量的RD>20％，定量数据不可靠，则需要按本实施例的方法重新提取检验。本实施例，对血液和肝脏两种生物检材样品进行定量检测，确定了13种贝类毒素的检出限，见表4，平均回收率及RSD结果见表5。
从表4和表5中可以看出，对于血液样品的检测，13种贝类毒素的平均回收率在77.23％-98.19％之间，相对标准偏差(RSD)在1.83％-13.2％之间；对于肝组织样品的检测，13种贝类毒素的平均回收率在78.91％-90.60％之间，相对标准偏差(RSD)在2.25％-8.77％之间。说明检测结果具有良好的精密度。
表4
表5平均回收率及RSD
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。
Claims (10)
1.生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A、生物检材的处理：生物检材经萃取处理后得到样品提取液；
步骤B、标准物质溶液的准备：以水为溶剂，用13种贝类毒素的标准物质分别配制13种贝类毒素的标准物质溶液；
步骤C、标准溶液的准备：用13种贝类毒素的标准物质溶液分别配制13种贝类毒素的标准溶液；
步骤D、混合标准工作溶液的准备：分别用13种贝类毒素的标准物质溶液配制混合标准工作溶液；
步骤E、质控样品的制备；
步骤F、分别吸取样品提取液、空白样品提取液、添加样品提取液、标准溶液和混合标准工作溶液，采用液相色谱-质谱仪进行检测，分析并计算检测结果；
所述13中贝类毒素分别为：C1、C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、STX、NEO、dcSTX、dcNEO、dcGTX2和dcGTX3。
2.根据权利要求1所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，在步骤A中，所述生物检材为血液或尿液；
所述生物检材的处理方法为：取血液或尿液的生物检材样品于离心管中，用乙酸溶液调节pH至2.0-4.0，离心后吸取上清液于容量瓶中；向含有沉淀物的离心管中再加入乙酸溶液，涡旋混合，再次离心，将两次上清液合并，用乙酸溶液稀释，得到样品提取液。
3.根据权利要求2所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，在步骤A中，所述生物检材为血液或尿液；
所述生物检材的处理方法为：取血液或尿液的生物检材样品1.0mL于50mL离心管中，用1.0vt％乙酸溶液调节pH至2.0-4.0；4℃条件下7000r/min离心10min，然后吸取上清液于10mL容量瓶，向含有沉淀物的离心管中再加入3mL 1.0vt％乙酸溶液，涡旋混合，4℃条件下7000r/min再次离心10min，将两次上清液合并，用1.0vt％乙酸稀释至10.0mL，得到样品提取液。
4.根据权利要求1所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，在步骤A中，所述生物检材为生物组织；
所述生物检材的处理方法为：取绞碎的生物组织于离心管中，加入乙酸溶液在冰水混合浴中进行组织匀浆，用乙酸溶液调节pH，涡旋混合，然后置于沸水浴中加热；水浴加热后取出离心管，再次涡旋混合，并冷却至室温，调节pH至2.0-4.0，离心后吸取上清液于容量瓶中；向含有沉淀物的离心管中加入乙酸溶液，涡旋混合，再次离心，将两次上清液合并，用乙酸溶液稀释，得到样品提取液。
5.根据权利要求4所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，在步骤A中，所述生物检材为生物组织；
所述生物检材的处理方法为：称取绞碎的组织1.0g，于50mL离心管中，加入5mL1.0vt％乙酸溶液在冰水混合浴中进行组织匀浆，用0.1vt％乙酸溶液调节2＜pH＜4，涡旋混合，然后置于沸水浴中加热5min；水浴加热后取出离心管，再次涡旋混合，并冷却至室温，调节pH至2.0-4.0；4℃条件下7000r/min离心10min，然后吸取上清液于10mL容量瓶，向含有沉淀物的离心管中再加入3mL 1.0vt％乙酸溶液，涡旋混合，4℃条件下7000r/min再次离心10min，将两次上清液合并，用1.0vt％乙酸稀释至10.0mL，得到样品提取液。
6.根据权利要求3或5所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，所述生物检材处理方法还包括如下步骤：
取所述样品提取液1mL，加入5μL 25wt％氨水溶液，涡旋混合，然后转移400μL至依次用3mL含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液和3mL 0.1wt％氨水溶液活化好的Supelco ENVI-Carb固相萃取柱中，用700μL超纯水淋洗，抽干弃去淋洗液，用2mL含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，并定容至5mL；取1mL洗脱液，用0.22μm的水系微孔滤膜过滤，得到待测样品提取液；所述含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液的配制方法如下：将乙腈和水按照体积比1:4配制成乙腈水溶液，每100mL乙腈水溶液中加入1mL乙酸，即得含1.0vt％乙酸的20vt％乙腈水溶液。
7.根据权利要求1所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，在步骤B中，13种贝类毒素的标准物质中，C1和C2两种毒素的标准物质为C1/C2混合标准物质，GTX1和GTX4两种毒素的标准物质为GTX1/GTX4混合标准物质，GTX2和GTX3两种毒素的标准物质为GTX2/GTX3混合标准物质，dcGTX2和dcGTX3两种毒素的标准物质为dcGTX2/dcGTX3混合标准物质，GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的标准物质为单一标准物质；所述标准物质溶液包括GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的单一标准物质溶液，以及C1/C2混合标准物质溶液、GTX1/GTX4混合标准物质溶液、GTX2/GTX3混合标准物质溶液和dcGTX2/dcGTX3混合标准物质溶液；
所述标准物质溶液的浓度如下：GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的单一标准物质溶液的浓度均为1.0μg/mL；C1/C2混合标准物质溶液中C1的浓度为3.35μg/mL，C2的浓度为1.0μg/mL；GTX1/GTX4混合标准物质溶液中GTX1的浓度为3.18μg/mL，GTX4的浓度为1.0μg/mL；GTX2/GTX3混合标准物质溶液中GTX2的浓度为2.36μg/mL，GTX3的浓度为1.0μg/mL；dcGTX2/dcGTX3混合标准物质溶液中dcGTX2的浓度为3.40μg/mL，dcGTX3的浓度为1.0μg/mL；将所述标准物质溶液置于冰箱中冷藏保存，有效期为6个月；
在步骤C中，所述标准溶液包括GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的单一标准溶液，以及C1/C2混合标准溶液、GTX1/GTX4混合标准溶液、GTX2/GTX3混合标准溶液和dcGTX2/dcGTX3混合标准溶液；所述标准溶液的配制方法为：移取所述标准物质溶液各1mL，分别用水稀释并定容至10mL，混匀即可；GTX5、STX、NEO、dcSTX和dcNEO 5种毒素的单一标准溶液的浓度均为0.1μg/mL；C1/C2混合标准溶液中C1的浓度为0.335μg/mL，C2的浓度为0.1μg/mL；GTX1/GTX4混合标准溶液中GTX1的浓度为0.318μg/mL，GTX4的浓度为0.1μg/mL；GTX2/GTX3混合标准溶液中GTX2的浓度为0.236μg/mL，GTX3的浓度为0.1μg/mL；dcGTX2/dcGTX3混合标准溶液中dcGTX2的浓度为0.340μg/mL，dcGTX3的浓度为0.1μg/mL；密封后置于冰箱中冷藏保存，有效期为3个月；
在步骤D中，所述混合标准工作溶液的配制方法为：移取所述标准物质溶液各0.9mL，用水稀释并定容至10mL，混匀得到混合标准工作溶液，密封后置于冰箱中冷藏保存，有效期3个月。
8.根据权利要求1所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，在步骤E中，质控样品的制备方法为：取等量与生物检材相同基质的空白样品2-3份于具盖离心管中，其中1份作为空白样品，另外1-2份添加13种毒素的标准物质作为添加样品；将空白样品和添加样品分别进行与检材样品相同的平行操作处理，得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器分析；
添加样品提取液中，C1的含量为20ng/mL，C2、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、STX、NEO、dcSTX、dcNEO、dcGTX2和dcGTX3的浓度均为10ng/mL；或者添加样品提取液中，所述13种毒素的含量分别为所述生物检材中目标毒素含量的(100±50)％。
9.根据权利要求1所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，在步骤F中，色谱条件为：
色谱柱：TSK-Gel
HILIC色谱柱，所述色谱柱的规格为2mm×250mm、填料粒径为5μm；或其他等效色谱柱；
流动相A：50mM甲酸和2mM甲酸铵溶液；流动相B：100％乙腈；所述流动相A的配制方法为：分别取2mmol甲酸铵用水溶解，再加入50mmol甲酸混匀，定容至1000mL，即得流动相A；
洗脱梯度：0-25.0min，所述流动相B的体积分数为90vt％-55vt％；25.0-27.0min，所述流动相B的体积分数为55vt％-30vt％；27.0-40.0min，所述流动相B的体积分数为30vt％；40.0-40.1min，所述流动相B的体积分数为30vt％-90vt％；40.1-50.0min，所述流动相B的体积分数为90vt％；
柱温：40℃；流速：0.2mL/min；进样量：5μL；
质谱条件：
离子源：电喷雾电离ESI；检测方式：正离子模式；电喷雾电压：5.5kV；离子源温度：350℃；雾化气压力：55psi；辅助气压力：50psi；气帘气压力：40psi；碰撞气压力：Medium；扫描模式：多反应离子监测模式MRM。
10.根据权利要求1所述的生物检材中13种贝类毒素的检验方法，其特征在于，所述生物检材为血、尿、肝、肾、胃或胃内容物。
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