CN115166124A - 一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法 - Google Patents

一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，包括以下步骤：S1、血浆样品预处理：将血浆样品离心得到超滤液，超滤液依次加入内标紫杉醇及第一混合液混合，离心后取上清加入第二混合液混合，得到游离紫杉醇第一测试样品；将血浆样品依次加入内标紫杉醇及第一混合液混合，离心后取上清加入第二混合液混合，得到总紫杉醇第一测试样品；S2、试样测定：取测试样品注入高效液相色谱‑串联质谱仪中检测样品中紫杉醇和内标紫杉醇的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度。该方法可提高检测速度、精度和灵敏度。

Description

一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种药物两种形态的测定方法，特别涉及一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法。
背景技术
紫杉醇(Paclitaxel)是一种天然抗肿瘤药物。其化学名称5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R，3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]，分子式：C47H51NO14，分子量：853.91，其化学结构式为：
Figure BDA0003762302650000011
紫杉醇是一种二萜类抗肿瘤药物，作为真核细胞微管的促微管蛋白聚合剂，能抑制微管的分解，增加其质量和数量，通过破坏细胞分裂和重要的间期过程正常的微管动态，抑制纺锤体的形成，使细胞分裂终止，最终导致细胞的死亡。此外，紫杉醇还能诱导肿瘤坏死因子α基因的表达，是已知的最优秀的高效低毒广谱抗癌药之一。临床上紫杉醇用于治疗卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤，且具有显著疗效。
目前国内外临床上使用的紫杉醇剂型主要三种：紫杉醇注射液、紫杉醇脂质体注射液和注射用白蛋白结合型紫杉醇。紫杉醇注射液是用聚氧乙烯蓖麻油和无水乙醇(v:v,1:1)的混合物为紫杉醇载体。这种剂型稳定性好，紫杉醇主要经肝脏代谢后经胆汁清除。然而作为载体的聚氧乙烯蓖麻油会将塑化剂(DEHP)从常规输液装置中滤出，引起过敏反应，也会导致如中性粒细胞减少症的临床不良反应，还会引起明显的痛觉过敏和痛觉超敏。此外，聚氧乙烯蓖麻油会在血浆中形成胶束，将紫杉醇包裹其中，改变了药物在血液中的分布，同时胶束太大，削弱了肿瘤对药物的摄取，影响药物对肿瘤部位的治疗。紫杉醇脂质体注射液将紫杉醇包封在磷脂双分子层中，静脉注射后，药物从脂质体中释放出来，迅速与血清蛋白结合。与传统紫杉醇注射液相比，它对血浆蛋白的亲和力高，半衰期长，具有缓释作用。但是紫杉醇脂质体存在稳定性差的缺点，保质期短，储存要求高。此外，紫杉醇脂质体注射液药动学较为复杂，可能存在药物蓄积引起肝脏毒性的风险。白蛋白结合型紫杉醇与传统机型相比不含聚氧乙烯蓖麻油，过敏反应发生风险降低，不需要特殊静脉注射输液管。此外，由于白蛋白天然的独特转运机制(gp60-窖蛋白-SPARC)，使子紫杉醇更多分布于肿瘤组织，达到更高的肿瘤细胞内浓度，从而保障药物的安全性和有效性。但是白蛋白结合型紫杉醇价格十分昂贵。紫杉醇由于其化学结构，具有高度亲脂性，在水中几乎不溶，现行的紫杉醇新型注射剂各具特点，但都存在一些问题，还不能从根本上取代现行的紫杉醇注射液，因而研制具有良好水溶性的紫杉醇新剂型一直是研究者关注的热点。
紫杉醇的血浆蛋白结合率高(89-98％)，任意剂型的紫杉醇注射液进入血液后，在血浆中释放的紫杉醇会和血浆蛋白结合，而只有游离紫杉醇才有药理活性。为研究紫杉醇在生物体内的吸收、分布、生物转化和排泄等过程的特点和规律，设计一个简单、快速、准确的定量测定血浆中游离紫杉醇及总紫杉醇浓度的方法，在人类疾病发现和治疗具有很大的社会价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，解决上述现有技术问题中的一个或者多个。
本发明提供的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，包括以下步骤：
S1、血浆样品预处理：
将血浆样品离心得到超滤液，超滤液依次加入内标紫杉醇及第一混合液混合，离心后取上清加入第二混合液混合，得到游离紫杉醇第一测试样品；
将血浆样品依次加入内标紫杉醇及第一混合液混合，离心后取上清加入第二混合液混合，得到总紫杉醇第一测试样品；
S2、试样测定：
取测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测样品中紫杉醇和内标紫杉醇的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度。
在某些实施方案中，步骤S1中血浆以K2EDTA为抗凝剂，以紫杉醇-d5为内标。
在某些实施方案中，步骤S1包括：
将血浆样品离心后，取其超滤液于96深孔板中加入内标紫杉醇-d5溶液混匀，加入乙腈和甲酸的混合溶液涡旋混合后离心，所述乙腈和甲酸的体积比为100：0.5，取上清液至96深孔板中，加入乙腈、水和醋酸铵的混合溶液涡旋混合，所述乙腈、水、1M醋酸铵的体积比为50：50：0.1，得到所述游离紫杉醇第一测试样品；
取血浆样品于96深孔板中加入内标紫杉醇-d5混匀，加入乙腈和甲酸的混合溶液涡旋混合后离心，所述乙腈和甲酸的体积比为100：0.5，取上层清液至96深孔板中，加入乙腈、水和醋酸铵的混合溶液涡旋混合后离心，所述乙腈、水、1M醋酸铵的体积比为50/50/0.1溶液，得到所述总紫杉醇第一测试样品。
在某些实施方案中，步骤S1包括：
取200μL血浆样品于Centrifree超过滤装置中，于25℃以1500g离心1h后，取50μL超滤液于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，混匀后加入400μL体积比为100：0.5的乙腈/甲酸溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min，取上层清液200μL至96深孔板中，再精密加入200μL体积比为50：50：0.1的乙腈/水/1M醋酸铵溶液，涡旋混合2min，于4℃以2600rpm离心2min，得到所述游离紫杉醇第一测试样品；
取血浆样品50μL于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，混匀后加入400μL体积比为100：0.5的乙腈/甲酸溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液30.0μL至96深孔板中，再精密加入570μL体积比为50：50：0.1的乙腈/水/1M醋酸铵溶液，涡旋混匀2min，于4℃以2600rpm离心2min，得到所述总紫杉醇第一测试样品。
在某些实施方案中，液相色谱的测定条件为：
色谱柱：GL Sciences,InertSustain,C18 HP，3μm，2.1×50mm(UP)；
色谱柱温：40℃；
流动相A：体积比为100：0.1：0.01的H2O/1M CH3COONH4/TFA溶液；
流动相B：体积比为95：5的ACN/H2O溶液；
洗液：体积比为85：15：0.2的ACN/H2O/FA溶液；
自动进样器温度为4℃；
梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为3μL，分析时间为3.0min。在某些实施方案中，质谱测定条件为：
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为300℃，喷雾气压力为60Psi，辅助加热气压力为60Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为9Psi，去簇电压分别为60eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
碰撞室入口电压分别为10eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
碰撞电压分别为24eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
碰撞室出口电压分别为10eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
正离子方式检测；
扫描方式为多重反应检测；
用于定量分析的离子反应分别为：m/z854.400/286.100，其为紫杉醇；和m/z859.400/291.100，其为紫杉醇-d5。
在某些实施方案中，梯度洗脱的程序为：
总时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 52 48
1.30 5 95
1.80 5 95
1.81 52 48
3.00 52 48
在某些实施方案中，步骤S2中，采用内标法，以紫杉醇和紫杉醇-d5的峰面积比值带入各自标准曲线方程计算所述血浆样品中的游离紫杉醇及总紫杉醇浓度的浓度。
在某些实施方案中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准曲线
取190μL空白血浆10份置于1.5mL离心管中，以储备液的形式添加10μL浓度分别为20.0ng/mL、40.0ng/mL、160ng/mL、500ng/mL、2000ng/mL、8000ng/mL、16000ng/mL、20000ng/mL的紫杉醇溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8中，分别加入10μL的体积比为1:1的DMSO乙腈溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别取标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本50μL于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，取50μL空白样本于96深孔板中加入50μL的体积比为1:1的DMSO乙腈混合溶液，全部混匀后加入400μL的体积比为100:0.5的乙腈甲酸混合溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液200μL至96深孔板中，再精密加入200μL的体积比为50:50:0.1的乙腈水和1M醋酸铵的混合溶液，涡旋混匀2min，于4℃以2600rpm离心2min后，得到游离紫杉醇第二测试样品；
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的标准曲线
取190μL空白血浆10份置于1.5mL离心管中，以储备液的形式添加10μL浓度分别为400ng/mL、800ng/mL、4000ng/mL、10000ng/mL、40000ng/mL、160000ng/mL、320000ng/mL、400000ng/mL的紫杉醇溶液至标样9、标样10、标样11、标样12、标样13、标样14、标样15、标样16中，分别加入10μL的体积比为1:1的DMSO乙腈溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别取标样9、标样10、标样11、标样12、标样13、标样14、标样15、标样16、零浓度样本50μL于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，取50μL空白样本于96深孔板中加入50μL的体积比为1:1的DMSO乙腈混合溶液，全部混匀后加入400μL的体积比为100:0.5的乙腈甲酸混合溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液30.0μL至96深孔板中，再精密加入570μL的体积比为50:50:0.1的乙腈水和1M醋酸铵的混合溶液，涡旋混匀2min，于4℃以2600rpm离心2min后，得到总紫杉醇第二测试样品。
在某些实施方案中，分别取3μL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中紫杉醇和紫杉醇-d5的色谱峰，并据此得到两条标准曲线，分别以用于计算所述血浆中游离紫杉醇及总紫杉醇的浓度。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)预处理方法简便，检测游离紫杉醇浓度时采用Centrifree超过率装置过滤，超滤液经过两步有机溶剂萃取即可，实验时间短，适用于常规测定；检测总紫杉醇浓度时，样品直接经过两步有机溶剂萃取即可，适用于常规测定；
(2)专属性强：在本实验所采用的色谱条件下，紫杉醇保留时间为1.189min左右，紫杉醇-d5的保留时间为1.189min左右。紫杉醇和紫杉醇-d5的峰型良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；
(3)灵敏度高：血浆最低定量限为1ng/mL，能准确测定血浆中总紫杉醇及游离紫杉醇的浓度，灵敏度高，特异性强；
(4)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为总紫杉醇及游离紫杉醇的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围分别为1.00-1000ng/mL和20.0-20000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％。
附图说明
图1为本发明分析物紫杉醇的子离子扫描图；
图2为本发明内标紫杉醇-d5的子离子扫描图；
图3为本发明HPLC-MS/MS法测得的血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准曲线；
图4为本发明HPLC-MS/MS法测得的血浆中总紫杉醇浓度测定的标准曲线；
图5为本发明人空白血浆的HPLC-MS/MS图；
图6为本发明人血浆中紫杉醇及分析物紫杉醇d5的HPLC-MS/MS图。
具体实施方式
下面通过实施方式对本发明进行进一步详细的说明。
实施例1实验材料与分析设备
紫杉醇(分析物)：ZZ STANDARDS或相同、更高等级的标准品使用试剂见下表1：
表1试剂明细
试剂名称 等级 试剂名称
ACN HPLC ACN
FA 色谱级 FA
DMSO HPLC DMSO
TFA HPLC TFA
CH<sub>3</sub>COONH<sub>4</sub> ACS CH<sub>3</sub>COONH<sub>4</sub>
MeOH HPLC MeOH
Blocker Casein in PBS NA Blocker Casein in PBS
注：亦可使用相同级别或更高级别的试剂
使用分析设备见下表2：
表2使用设备明细
组件 种类 制造商
Binary pump(二元泵) AD Pump SHIMADZU
Degasser(脱气器) Degasser SHIMADZU
Column oven(恒温柱箱) AD Column oven SHIMADZU
Autosampler(自动取样器) AC Autosampler SHIMADZU
Sample rack(样本架) Rack Changer SHIMADZU
Mass spectrometer(质谱仪) TRIPLE QUAD 6500+ SCIEX
Data processor(数据处理器) Analyst(software) SCIEX
相同的LC-MS/MS系统亦可被使用。
实施例2液相条件
1、液相色谱条件
色谱柱：GL Sciences,InertSustain,C18 HP，3μm，2.1×50mm(UP)；色谱柱温：40℃；流动相A：H2O/1M CH3COONH4/TFA＝100/0.1/0.01；流动相B：ACN/H2O＝95/5；洗液：ACN/H2O/FA＝85/15/0.2；自动进样器温度为4℃；梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为3μL，分析时间为3.0min；
表3梯度洗脱程序
总时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 52 48
1.30 5 95
1.80 5 95
1.81 52 48
3.00 52 48
2、质谱条件
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为300℃，喷雾气压力为60Psi，辅助加热气压力为60Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为9Psi，去簇电压分别为60eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；碰撞室入口电压分别为10eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；碰撞电压分别为24eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；碰撞室出口电压分别为10eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；正离子方式检测；扫描方式为多重反应检测；
如图1和2所示，用于定量分析的离子反应分别为：m/z854.400/286.100，其为紫杉醇；和m/z859.400/291.100，其为紫杉醇-d5。
实施例3试验过程
1、紫杉醇标准溶液的配制
根据血浆中游离紫杉醇及总紫杉醇含量的差别分别配置游离紫杉醇及总紫杉醇的标准溶液：精密称取紫杉醇(分析物)2.000mg，加入DMSO溶解至1.00mg/mL，DMSO/乙腈＝50/50的混合溶液依次稀释配制血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准溶液，具体稀释浓度见下表4；精密称取紫杉醇(分析物)10.000mg，加入DMSO溶解至5.00mg/mL，DMSO/乙腈＝50/50的混合溶液依次稀释配制血浆中总紫杉醇浓度测定的标准溶液，具体稀释浓度见下表5：
表4血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准溶液配制浓度
Figure BDA0003762302650000081
Figure BDA0003762302650000091
表5血浆中总紫杉醇浓度测定的标准溶液配制浓度
来源溶液(ng/mL) 来源溶液体积(μL) 溶剂体积(μL) 最终浓度(ng/mL)
5000000 320 3680 400000
5000000 256 3744 320000
5000000 128 3872 160000
400000 400 3600 40000
400000 100 3900 10000
40000 400 3600 4000
40000 80 3920 800
40000 40 3960 400
游离紫杉醇的标准溶液和总紫杉醇的标准溶液于不使用时储存于棕色玻璃容器及冰箱(-20℃)保存，体积可视需要依比例增加或减少。
3、线性试验
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的线性实验
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移190μL的空白血浆10份至96深孔板中(每一个标准曲线样本、空白样本-00及零浓度样本-0)，依下表6所列，分别精密加入不同浓度的紫杉醇标准溶液10μL或体积比为1:1的DMSO乙腈稀释溶液配制每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。以峰面积值Y对血药浓度X作回归计算，结果见图3和表6。以Y对血药浓度X做回归计算，得回归方程Y＝0.821X+-0.00226,相关系数(r)为0.9996，拟合度(R2)为0.99920016。权重系数W＝1/X2，按该方法测得的血浆中游离紫杉醇浓度测定的最低定量限为：1.00ng/mL。
表6血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准曲线配制浓度
Figure BDA0003762302650000101
a：分析物的稀释溶液：体积比1:1的DMSO乙腈混合溶液
表7 HPLC-MS/MS法测得的血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准曲线(n＝3)
Figure BDA0003762302650000102
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的线性实验
将空白血浆于室温环境放入水浴解冻；转移190μL的空白血浆10份至96深孔板中(每一个标准曲线样本、空白样本-00及零浓度样本-0)，依下表6所列，分别精密加入不同浓度的紫杉醇标准溶液10μL或体积比为1:1的DMSO乙腈稀释溶液配制每一个样本并混匀，配成不同浓度的含药血浆，按“血浆样品预处理”操作。以峰面积值Y对血药浓度X作回归计算，结果见图4和表8。以Y对血药浓度X做回归计算，得回归方程Y＝0.873X+0.000412,相关系数(r)为0.9992，拟合度(R2)为0.99840064。权重系数W＝1/X2，按该方法测得的血浆中总紫杉醇浓度测定的最低定量限为：1.00ng/mL。
表8血浆中总紫杉醇浓度测定的标准曲线配制浓度
Figure BDA0003762302650000111
a：分析物的稀释溶液：体积比1:1的DMSO乙腈混合溶液
表9 HPLC-MS/MS法测得的血浆中总紫杉醇浓度测定的标准曲线(n＝3)
Figure BDA0003762302650000112
Figure BDA0003762302650000121
实施例4准确度和精密度
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的准确度和精密度评估实验
将空白血浆于室温环境解冻；转移适当体积的空白血浆至适当的容器并添加紫杉醇标准溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(LLOQ QC、LQC、GMQC、MQC、HQC)及一条随行血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准曲线，按“血浆样品预处理”中检测总紫杉醇浓度的操作，质控样品制备如下表10所示。每天做一批及一条血浆中随行游离紫杉醇浓度测定的标准曲线，连续做3天，共3批。计算紫杉醇和内标紫杉醇-d5的峰面积比，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内于批间精密度，实测浓度与理论浓度的比值即为准确度，结果见表11。血浆中游离紫杉醇浓度测定的血浆质控样品批间、批内精密度、准确度在15％以内符合要求。
表10血浆中游离紫杉醇浓度测定的质控样品配制浓度
Figure BDA0003762302650000122
依每一分析批所需，分装足够的体积至已标示的样本瓶瓶中并储存于理论温度-20℃。体积可视需要依比例增加或减少。
表11 HPLC-MS/MS法测定血浆中游离紫杉醇浓度测定的批内、批间精度和准确度
Figure BDA0003762302650000123
Figure BDA0003762302650000131
Figure BDA0003762302650000141
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的准确度和精密度评估实验
将空白血浆于室温环境解冻；转移适当体积的空白血浆至适当的容器并添加紫杉醇标准溶液制备5种不同浓度的含药血浆质控样品(LLOQ QC、LQC、GMQC、MQC、HQC)及一条随行血浆中总紫杉醇浓度测定的标准曲线，按“血浆样品预处理”中检测总紫杉醇浓度的操作，质控样品制备如下表12所示。每天做一批及一条血浆中随行总离紫杉醇浓度测定的标准曲线，连续做3天，共3批。计算紫杉醇和内标紫杉醇-d5的峰面积比，代入当天的标准曲线中求得实测浓度，由实测浓度计算批内于批间精密度，实测浓度与理论浓度的比值即为准确度，结果见表13。血浆中总紫杉醇浓度测定的血浆质控样品批间、批内精密度、准确度在15％以内符合要求。
表12血浆中总紫杉醇浓度测定的质控样品配制浓度
Figure BDA0003762302650000142
依每一分析批所需，分装足够的体积至已标示的样本瓶瓶中并储存于理论温度-20℃。体积可视需要依比例增加或减少。
表13 HPLC-MS/MS法测定血浆中总紫杉醇浓度测定的批内、批间精度和准确度
Figure BDA0003762302650000151
Figure BDA0003762302650000161
实施例5干扰性
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的干扰性评估实验
使用6个不同来源(每个来源一个)的空白血浆样品、3个不同来源(每个来源1个)的空白溶血血浆样品、3个不同来源(每个来源1个)的空白高脂样品、6个不同来源(每个来源一个)的空白血浆样品超滤液、3个不同来源(每个来源1个)的空白溶血血浆样品超滤液、3个不同来源(每个来源1个)的空白高脂样品超滤液，将24个不同来源的空白血浆样品于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇分析物及内标紫杉醇-d5的干扰。
将一个混合基质中的零浓度样品(0)(只添加内标不添加分析物)和一个在混合基质中只添加ULOQ不添加内标的样品(ULOQ without IS)依样本制备步骤制备及分析，分别评价在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中内标对分析物的干扰和分析物对内标的干扰。
12个不同来源的空白血浆样本制备分析后，在符合紫杉醇保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的紫杉醇响应的20.0％，结果见表14。结果表明该分析方法在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇的分析具有专属性。
12个不同来源空白血浆样本制备分析后，在符合内标紫杉醇-d5保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的内标紫杉醇-d5响应的5.0％，结果见表15。结果表明该分析方法在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中对内标紫杉醇-d5的分析具有选择性。
零浓度样品(0)制备分析后，在符合紫杉醇保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样品的紫杉醇响应的20.0％，结果见表16。结果表明在在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中内标紫杉醇-d5对紫杉醇的干扰可忽略。
ULOQ without IS制备分析后，在符合内标保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样品的内标紫杉醇-d5响应的5.0％，结果见表17。结果表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇对内标紫杉醇-d5的干扰可忽略。
表14不同来源空白血浆在游离紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000171
Figure BDA0003762302650000181
表15不同来源空白血浆在游离紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇-d5的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000182
Figure BDA0003762302650000191
表16在游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇-d5对紫杉醇的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000192
表17在游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇对紫杉醇-d5的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000193
从表14和表15中可以看出，不同人体的空白血浆在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇的检测结果没有造成干扰；从表16可以看出在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中内标对分析物的检测结果没有造成干扰；从表17可以看出在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中分析物对内标的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中检测不同人体血浆中的紫杉醇的浓度。
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的干扰性评估实验
使用6个不同来源(每个来源一个)的空白血浆样品、3个不同来源(每个来源1个)的空白溶血血浆样品和3个不同来源(每个来源1个)的空白高脂样品，将12个不同来源的空白血浆样品于同一分析批依样本制备步骤制备及分析，来评价不同空白血浆在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇分析物及内标紫杉醇-d5的干扰，如图5所示为空白血浆的HPLC-MS/MS图代表性图谱，如图6所示为空白血浆中添加定量下限浓度的紫杉醇及分析物紫杉醇d5的HPLC-MS/MS图。
将一个混合基质中的零浓度样品(0)(只添加内标不添加分析物)和一个在混合基质中只添加ULOQ不添加内标的样品(ULOQ without IS)依样本制备步骤制备及分析，分别评价在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中内标对分析物的干扰和分析物对内标的干扰。
12个不同来源的空白血浆样本制备分析后，在符合紫杉醇保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的紫杉醇响应的20.0％，结果见表18。结果表明该分析方法在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇的分析具有专属性。
12个不同来源空白血浆样本制备分析后，在符合内标紫杉醇-d5保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样本的内标紫杉醇-d5响应的5.0％，结果见表19。结果表明该分析方法在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中对内标紫杉醇-d5的分析具有选择性。
零浓度样品(0)制备分析后，在符合紫杉醇保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样品的紫杉醇响应的20.0％，结果见表20。结果表明在在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中内标紫杉醇-d5对紫杉醇的干扰可忽略。
ULOQ without IS制备分析后，在符合内标保留时间处的干扰峰响应均低于该分析批的标准曲线中定量下限样品的内标紫杉醇-d5响应的5.0％，结果见表21。结果表明在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇对内标紫杉醇-d5的干扰可忽略。
表18不同来源空白血浆在总紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000201
Figure BDA0003762302650000211
表19不同来源空白血浆在总紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇-d5的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000212
表20在总紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇-d5对紫杉醇的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000213
表21在总紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇对紫杉醇-d5的干扰性数据对比表
Figure BDA0003762302650000221
从表18和表19中可以看出，不同人体的空白血浆在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中对紫杉醇的检测结果没有造成干扰；从表20可以看出在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中内标对分析物的检测结果没有造成干扰；从表21可以看出在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中分析物对内标的检测结果没有造成干扰。因此，该方法可以用于在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中检测不同人体血浆中的紫杉醇的浓度。
实施例6回收率
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的回收率评估实验
将使用混合血浆和混合血浆超滤液配制的LQC、MQC和HQC来计算在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇的回收率。对于混合血浆及混合血浆超滤液配制的LQC、MQC和HQC的各6个平行样品和36个DB进行提取。DB提取后加入分析物和内标，使它们在提取后加入的DB提取物中的浓度与提取的LQC、MQC和HQC样品相同。通过比较来自于QC的分析物和内标的峰面积与DB提取后加入的分析物和内标的平均峰面积来计算提取回收率。从表22和表23中可以看出，分析物的每个浓度水平，分析物峰面积的％CV和总体％CV均在15.0％以内，其中混合血浆中的回收率为99.0％，混合血浆超滤液中的回收率为98.7％。表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中使用该前处理方法血浆中紫杉醇的提取回收率高。从表24和表25中可以看出，内标的全部提取样品的响应值％CV和全部未提取样品的响应值％CV均在15％以内，其中混合血浆中的回收率为94.8％，混合血浆超滤液中的回收率为99.0％。表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中使用该前处理方法血浆中紫杉醇-d5的提取回收率高。
表22游离紫杉醇浓度测定过程中混合血浆中的紫杉醇提取回收率
Figure BDA0003762302650000231
表23游离紫杉醇浓度测定过程中混合血浆超滤液中的紫杉醇提取回收率
Figure BDA0003762302650000232
Figure BDA0003762302650000241
表24游离紫杉醇浓度测定过程中混合血浆中的紫杉醇-d5提取回收率
Figure BDA0003762302650000242
Figure BDA0003762302650000251
表25游离紫杉醇浓度测定过程中混合血浆超滤液中的紫杉醇-d5提取回收率
Figure BDA0003762302650000252
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的回收率评估实验
将使用混合血浆配制的LQC、MQC和HQC来计算在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇的回收率。对于LQC、MQC和HQC的各6个平行样品和18个DB进行提取。DB提取后加入分析物和内标，使它们在提取后加入的DB提取物中的浓度与提取的LQC、MQC和HQC样品相同。通过比较来自于QC的分析物和内标的峰面积与DB提取后加入的分析物和内标的平均峰面积来计算提取回收率。从表26中可以看出，分析物的每个浓度水平，分析物峰面积的％CV和总体％CV均在15.0％以内，回收率为101.8％，表明在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中使用该前处理方法血浆中紫杉醇的提取回收率高。从表27中可以看出，内标的全部提取样品的响应值％CV和全部未提取样品的响应值％CV均在15％以内，内标的平均提取回收率为99.98％。表明在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中使用该前处理方法血浆中紫杉醇-d5的提取回收率高。
表26血浆中总紫杉醇浓度测试过程中紫杉醇的提取回收率
Figure BDA0003762302650000261
表27血浆中总紫杉醇浓度测试过程中紫杉醇-d5的提取回收率
Figure BDA0003762302650000271
实施例7基质效应
7.1空白基质效应
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的空白基质效应评估实验
处理来自至少6个不同来源的空白血浆样品和至少6个不同来源的空白血浆样品超滤液。在提取DB后加入分析物，确保它们在处理后DB中的浓度(每个机制每个浓度每个来源1个样品)与处理后的LQC、MQC和HQC样品浓度相同；准备包含分析物的溶液，使最终浓度与处理后的LQC、MQC和HQC样品浓度相同，每个浓度6个平行，结果见表28和表29，分析物峰面积比％CV均在15％以内，表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中不存在空白基质效应问题。
表28在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇在空白血浆中的基质效应
Figure BDA0003762302650000281
表29在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇在空白血浆超滤液中的基质效应
Figure BDA0003762302650000282
Figure BDA0003762302650000291
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的空白基质效应评估实验
处理来自至少6个不同来源的空白基质样品。在提取DB后加入分析物，确保它们在处理后DB中的浓度(每个浓度每个来源1个样品)与处理后的LQC、MQC和HQC样品浓度相同；准备包含分析物的溶液，使最终浓度与处理后的LQC、MQC和HQC样品浓度相同，每个浓度6个平行，结果见表29，分析物峰面积比％CV均在15％以内，表明在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中不存在空白基质效应问题。
表30在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇的空白基质效应
Figure BDA0003762302650000292
Figure BDA0003762302650000301
7.2溶血基质效应
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的溶血基质效应评估实验
为考察溶血基质超滤液中的基质效应，配制一份在溶血基质超滤液中LQC和HQC，每个浓度6个平行，结果见表31，分析物峰面积比％CV均在15％以内，表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中不存在溶血基质效应问题。
表31在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇的溶血基质效应
Figure BDA0003762302650000302
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的溶血基质效应评估实验
为考察溶血基质中的基质效应，配制一份在溶血基质中LQC和HQC，每个浓度6个平行，结果见表32，分析物峰面积比％CV均在15％以内，表明在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中不存在溶血基质效应问题。
表32在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇的溶血基质效应
Figure BDA0003762302650000303
Figure BDA0003762302650000311
7.3高脂基质效应
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的高脂基质效应评估实验
为考察高脂基质超滤液中的基质效应，配制一份在高脂基质超滤液中LQC和HQC，每个浓度6个平行，结果见表31，分析物峰面积比％CV均在15％以内，表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中不存在溶血基质效应问题。
表33在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇的高脂基质效应
Figure BDA0003762302650000312
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的高脂基质效应评估实验
为考察高脂基质中的基质效应，配制一份在高脂基质中LQC和HQC，每个浓度6个平行，结果见表34，分析物峰面积比％CV均在15％以内，表明在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中不存在高脂基质效应问题。
表34在血浆中总紫杉醇浓度测定过程中紫杉醇的高脂基质效应
Figure BDA0003762302650000321
实施例8游离分数及非特异性结合
在血浆中游离紫杉醇含量的测定过程中，需要采用Centrifree超过率装置将游离的紫杉醇与结合型紫杉醇分离开，紫杉醇可能与超滤管存在特异性结合。因此，需要额外考察紫杉醇的游离分数及紫杉醇与Centrifree超过率装置的非特异性结合率。
8.1游离分数
根据既往研究紫杉醇血浆蛋白结合率为90％左右，故游离分数为10％左右。在方法开发中测得游离分数大约为2％～10％，为了考察游离分数，使用混合血浆基质配制低、中、高三个浓度水平样品(每个浓度至少6个平行)，样品浓度分别为100ng/mL，4000ng/mL和7500ng/mL。将低、中、高三个浓度水平样品经过超滤后，与配制的理论值进行比较，经计算后得游离分数。结果见表35，每个浓度的测定值及游离分数的％CV均在15％以内且游离分数符合既往研究结果。表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程使用Centrifree超过率装置可以对游离紫杉醇的进行分离。
表35紫杉醇的游离分数
Figure BDA0003762302650000331
8.2非特异性结合
为考察紫杉醇与Centrifree超过率装置的非特异性结合率，使用体积比为1:1的甲醇水溶液配制LQC和HQC(每个浓度至少6个平行)。通过比较来自于经过超滤后QC的分析物和内标的平均峰面积比与未经超滤的平均峰面积比来计算非特异性结合率。结果见表36，超滤后和未超滤的分析物峰面积比％CV均在15％以内，非特异性结合率的％CV不超过15.0％，且非特异性结合率％分别为102和101。表明在血浆中游离紫杉醇浓度测定过程使用Centrifree超过率装置不会对游离紫杉醇的收集造成影响。
表36紫杉醇与Centrifree超过率装置的非特异性结合率
Figure BDA0003762302650000332
Figure BDA0003762302650000341
综上所述：本发明的一种预处理方法简便的血浆中游离紫杉醇及总紫杉醇浓度的测定方法，采用Centrifree超过率装置结合两步有机溶剂萃取法，适用于常规测定；同时，在本实验所采用的色谱条件下，紫杉醇保留时间为1.189min左右，峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中游离紫杉醇及总紫杉醇的浓度，灵敏度较高，血浆最低定量限为1.00ng/mL；同时，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为游离紫杉醇及总紫杉醇的血药浓度测定提供依据。本方法的血浆标准曲线线性范围分别为1.00-1000ng/mL和20.0-20000ng/mL，批内和批间精密度RSD均小于±15％，分析物提取回收率高且不存在基质效应。
以上表述仅为本发明的优选方式，应当指出，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些也应视为发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、血浆样品预处理：
将血浆样品离心得到超滤液，超滤液依次加入内标紫杉醇及第一混合液混合，离心后取上清加入第二混合液混合，得到游离紫杉醇第一测试样品；
将血浆样品依次加入内标紫杉醇及第一混合液混合，离心后取上清加入第二混合液混合，得到总紫杉醇第一测试样品；
S2、试样测定：
取测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中检测样品中紫杉醇和内标紫杉醇的色谱峰，并据此计算所述血浆样品中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度。
2.根据权利要求1所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，步骤S1中血浆以K2EDTA为抗凝剂，以紫杉醇-d5为内标。
3.根据权利要求2所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，步骤S1包括：
将血浆样品离心后，取其超滤液于96深孔板中加入内标紫杉醇-d5溶液混匀，加入乙腈和甲酸的混合溶液涡旋混合后离心，所述乙腈和甲酸的体积比为100：0.5，取上清液至96深孔板中，加入乙腈、水和醋酸铵的混合溶液涡旋混合，所述乙腈、水、1M醋酸铵的体积比为50：50：0.1，得到所述游离紫杉醇第一测试样品；
取血浆样品于96深孔板中加入内标紫杉醇-d5混匀，加入乙腈和甲酸的混合溶液涡旋混合后离心，所述乙腈和甲酸的体积比为100：0.5，取上层清液至96深孔板中，加入乙腈、水和醋酸铵的混合溶液涡旋混合后离心，所述乙腈、水、1M醋酸铵的体积比为50/50/0.1溶液，得到所述总紫杉醇第一测试样品。
4.根据权利要求2所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，步骤S1包括：
取200μL血浆样品于Centrifree超过滤装置中，于25℃以1500g离心1h后，取50μL超滤液于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，混匀后加入400μL体积比为100：0.5的乙腈/甲酸溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min，取上层清液200μL至96深孔板中，再精密加入200μL体积比为50：50：0.1的乙腈/水/1M醋酸铵溶液，涡旋混合2min，于4℃以2600rpm离心2min，得到所述游离紫杉醇第一测试样品；
取血浆样品50μL于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，混匀后加入400μL体积比为100：0.5的乙腈/甲酸溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液30.0μL至96深孔板中，再精密加入570μL体积比为50：50：0.1的乙腈/水/1M醋酸铵溶液，涡旋混匀2min，于4℃以2600rpm离心2min，得到所述总紫杉醇第一测试样品。
5.根据权利要求1所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，液相色谱的测定条件为：
色谱柱：GL Sciences,InertSustain,C18 HP，3μm，2.1×50mm(UP)；
色谱柱温：40℃；
流动相A：体积比为100：0.1：0.01的H2O/1M CH3COONH4/TFA溶液；
流动相B：体积比为95：5的ACN/H2O溶液；
洗液：体积比为85：15：0.2的ACN/H2O/FA溶液；
自动进样器温度为4℃；
梯度洗脱，流速为0.5mL/min，进样量为3μL，分析时间为3.0min。
6.根据权利要求1所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，质谱测定条件为：
离子源采用电喷雾离子源，喷雾电压为5500V，雾化温度为300℃，喷雾气压力为60Psi，辅助加热气压力为60Psi，气帘气压力为30Psi，碰撞气压力为9Psi，去簇电压分别为60eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
碰撞室入口电压分别为10eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
碰撞电压分别为24eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
碰撞室出口电压分别为10eV的紫杉醇和紫杉醇-d5；
正离子方式检测；
扫描方式为多重反应检测；
用于定量分析的离子反应分别为：m/z854.400/286.100，其为紫杉醇；和m/z859.400/291.100，其为紫杉醇-d5。
7.根据权利要求5所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，梯度洗脱的程序为：
总时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0.00 52 48 1.30 5 95 1.80 5 95 1.81 52 48 3.00 52 48
8.根据权利要求2所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，步骤S2中，采用内标法，以紫杉醇和紫杉醇-d5的峰面积比值带入各自标准曲线方程计算所述血浆样品中的游离紫杉醇及总紫杉醇浓度的浓度。
9.根据权利要求8所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
(1)血浆中游离紫杉醇浓度测定的标准曲线
取190μL空白血浆10份置于1.5mL离心管中，以储备液的形式添加10μL浓度分别为20.0ng/mL、40.0ng/mL、160ng/mL、500ng/mL、2000ng/mL、8000ng/mL、16000ng/mL、20000ng/mL的紫杉醇溶液至标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8中，分别加入10μL的体积比为1:1的DMSO乙腈溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别取标样1、标样2、标样3、标样4、标样5、标样6、标样7、标样8、零浓度样本50μL于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，取50μL空白样本于96深孔板中加入50μL的体积比为1:1的DMSO乙腈混合溶液，全部混匀后加入400μL的体积比为100:0.5的乙腈甲酸混合溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液200μL至96深孔板中，再精密加入200μL的体积比为50:50:0.1的乙腈水和1M醋酸铵的混合溶液，涡旋混匀2min，于4℃以2600rpm离心2min后，得到游离紫杉醇第二测试样品；
(2)血浆中总紫杉醇浓度测定的标准曲线
取190μL空白血浆10份置于1.5mL离心管中，以储备液的形式添加10μL浓度分别为400ng/mL、800ng/mL、4000ng/mL、10000ng/mL、40000ng/mL、160000ng/mL、320000ng/mL、400000ng/mL的紫杉醇溶液至标样9、标样10、标样11、标样12、标样13、标样14、标样15、标样16中，分别加入10μL的体积比为1:1的DMSO乙腈溶液至空白样本和零浓度样本，混匀后分别取标样9、标样10、标样11、标样12、标样13、标样14、标样15、标样16、零浓度样本50μL于96深孔板中加入50μL的内标紫杉醇-d5溶液，取50μL空白样本于96深孔板中加入50μL的体积比为1:1的DMSO乙腈混合溶液，全部混匀后加入400μL的体积比为100:0.5的乙腈甲酸混合溶液涡旋混合2min，于4℃以2600g离心10min.，取上层清液30.0μL至96深孔板中，再精密加入570μL的体积比为50:50:0.1的乙腈水和1M醋酸铵的混合溶液，涡旋混匀2min，于4℃以2600rpm离心2min后，得到总紫杉醇第二测试样品。
10.根据权利要求9所述的一种测定血浆中游离紫杉醇和总紫杉醇浓度的方法，其特征在于，分别取3μL测试样品注入高效液相色谱-串联质谱仪中，检测样品中紫杉醇和紫杉醇-d5的色谱峰，并据此得到两条标准曲线，分别以用于计算所述血浆中游离紫杉醇及总紫杉醇的浓度。
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