CN114295758A - 检测磷酸胆碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测磷酸胆碱的方法。其中，该方法包括：S1，利用UPLC‑MS/MS联用建立磷酸胆碱的浓度和峰面积的标准曲线；S2，对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀，并取上清液作为待检测液；S3，采用UPLC‑MS/MS联用对待检测液进行检测，得到磷酸胆碱的离子谱峰；根据标准曲线和离子谱峰换算各磷酸胆碱的含量。解决了现有技术中对于磷酸胆碱的检测操作复杂的问题，适用于磷酸胆碱的检测领域。

Description

检测磷酸胆碱的方法

技术领域

本发明涉及磷酸胆碱的检测领域，具体而言，涉及一种检测磷酸胆碱的方法。

背景技术

低密度脂蛋白是一种运载胆固醇进入外周组织细胞的球形脂蛋白颗粒，在一些诱因下，如吸烟、糖尿病、高血压等，机体产生大量氧自由基，内皮下聚集的低密度脂蛋白发生过氧化反应并进一步生成氧化低密度脂蛋白。氧化低密度脂蛋白与动脉粥样硬化及肿瘤密切相关，其中2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱(POVPC)和1-棕榈酰-2-丙二酰基-sn-丙三基-磷酸胆碱(PGPC)是易于检测的主要代谢物，因此，检测POVPC和PGPC对冠心病、心力衰竭、急性脑梗死及肿瘤的检测具有重要的参考意义。

目前提取POVPC和PGPC的方法主要有液液萃取法和固相萃取法。然而，上述两种提取方法都存在一定的缺陷，例如：液液萃取法需要将两种或两种以上互不相溶或微溶的溶剂混合，之后待测物溶解至预定的溶剂中，再将该溶剂移取出来，液液萃取所需要的两种或两种以上溶剂的体积往往较大且不宜直接上机检测，需要冻干或吹干后复溶，操作步骤繁杂，重复性差，处理时间长；固相萃取法则需要萃取柱进行除杂与分离，该方法所用萃取柱价格较贵，且提取液也需要冻干或吹干后复溶，其经济性较差且操作复杂。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种检测磷酸胆碱的方法，以解决现有技术中对于磷酸胆碱的检测操作复杂的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种检测磷酸胆碱的方法该方法包括：S1，利用UPLC-MS/MS联用建立磷酸胆碱的浓度和峰面积的标准曲线；S2，对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀，并取上清液作为待检测液；S3，采用UPLC-MS/MS联用对待检测液进行检测，得到磷酸胆碱的离子谱峰；根据标准曲线和离子谱峰换算各磷酸胆碱的含量。

进一步地，待测样品为如下任意一种：血清、血浆。

进一步地，采用异丙醇乙腈水溶液对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀；优选地，采用含同位素内标的异丙醇乙腈水溶液对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀，含同位素内标的异丙醇乙腈水溶液为蛋白沉淀液。

进一步地，UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱为C18色谱柱；优选地，流动相包括A相和B相，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为含有10mM乙酸铵的异丙醇乙腈水溶液，同时含有A相和B相时，A相和B相的体积比为0:100～95:5；优选地，UPLC-MS/MS联用采用的离子源为电喷雾电离源；优选地，离子源的电压为-4500V，离子源的温度为550℃。

进一步地，磷酸胆碱包括POVPC和/或PGPC；优选地，同位素内标包括癸酸-D19；优选地，蛋白沉淀液中的同位素的浓度为0.5μg/mL；优选地，异丙醇乙腈水溶液中异丙醇与水的体积比为7:1，乙腈与水的体积比为3:1。

进一步地，制备蛋白沉淀液包括：精密称取同位素内标，用异丙醇乙腈溶液溶解得同位素母液；将同位素母液用异丙醇乙腈水溶液稀释，获得蛋白沉淀液；优选地，同位素母液的浓度为1～10mg/mL；优选地，异丙醇乙腈溶液包括50％异丙醇乙腈溶液。

进一步地，S3中采用梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相自初始流动相开始以A相逐渐减小B相逐渐增加的方式进行梯度变化，并以与初始流动相相同组成的流动相洗脱结束梯度洗脱，初始流动相中所A相与B相的体积比为95:5；优选地，梯度洗脱的流速为0.2～0.5mL/min，更优选为0.3mL/min。

进一步地，初始流动相洗脱的时间为0.5min，且初始流动相洗脱结束后在1.5min内，流动相中A相和B相的体积比自95:5逐渐变化至0:100，以B相洗脱2min后再以初始流动相进行洗脱1min。

进一步地，S2包括：将待测样品与蛋白沉淀液以体积比0.1～1:1混合，涡旋混匀后置于0～5℃下静置1～5min以进行蛋白沉淀形成蛋白沉淀体系；将蛋白沉淀体现在0～5℃下进行离心，得到上清液；优选地，待测样品与蛋白沉淀液以体积比(45～55)：(180～220)混合。

进一步地，UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱的柱温为50℃；优选地，色谱柱的柱参数为100×2.1mm，1.8μm。

进一步地，磷酸胆碱包括POVPC和/或PGPC，S1包括：S11.精密称取POVPC和/或PGPC，用异丙醇溶解得POVPC母液和/或PGPC母液；S12.将POVPC母液和/或PGPC母液用甲醇水溶液稀释，获得POVPC标准液和/或PGPC标准液；优选地，POVPC标准液和/或PGPC标准液的浓度为1～5000ng/mL；优选地，甲醇水溶液包括50％甲醇水溶液。

应用本发明的技术方案，利用蛋白沉淀法和UPLC-MS/MS联用技术，对待测样品中的磷酸胆碱进行定量分析，操作简便，分析时间短，能够在短时间内对血浆中的磷酸胆碱成分进行精确定量。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明实施例1的POVPC-1子离子的离子谱峰示意图；

图2示出了根据本发明实施例1的PGPC-1子离子的离子谱峰示意图；

图3示出了根据本发明实施例1的POVPC标准曲线示意图；

图4示出了根据本发明实施例1的PGPC标准曲线示意图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术所提到的，POVPC和PGPC是与动脉粥样硬化和肿瘤相关的代谢物，对人体冠心病、心力衰竭、急性脑梗死及肿瘤的检测有重要的意义。然而，现有技术的检测方法，是采用液液萃取法或固相萃取法对POVPC和PGPC进行提取，然后再进行检测，操作较复杂，处理成本高。

因而，在本申请中发明人尝试利用蛋白沉淀法处理待测样品，将待测样品中的蛋白沉淀后的上清液作为待检测液，利用UPLC-MS/MS联用对其中的磷酸胆碱进行定量检测，该方法不仅操作简便，而且具有优异的精密度、准确度和稳定性，在此基础上，申请人提出了本申请的一系列保护方案。

在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种检测磷酸胆碱的方法，该方法包括：S1，利用UPLC-MS/MS联用建立磷酸胆碱的浓度和峰面积的标准曲线；S2，对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀，并取上清液作为待检测液；S3，采用UPLC-MS/MS联用对待检测液进行检测，得到磷酸胆碱的离子谱峰；根据标准曲线和离子谱峰换算各磷酸胆碱的含量。

利用上述UPLC-MS/MS联用，检测磷酸胆碱。首先，将各磷酸胆碱标准品配置为相应化合物的不同浓度的标准液，利用UPLC-MS/MS联用对标准液进行检测，建立磷酸胆碱的浓度和峰面积的标准曲线。利用蛋白沉淀法，去除待测样品中的蛋白质，防止样品中的蛋白质对检测的准确度和精密度产生影响，也能防止样品中的蛋白质对UPLC-MS/MS联用设备造成损伤。在对待测样品前处理后，取上清液作为待检测液，利用UPLC-MS/MS联用进行检测，得到相应的磷酸胆碱的离子谱峰，根据上述建立的标准曲线进行计算，得出磷酸胆碱的含量。该检测方法不仅操作简便，而且具有优异的精密度、准确度和稳定性。

上述待测样品可以是任何含有磷酸胆碱的体液样品，在一种优选的实施例中，待测样品为如下任意一种：血清、血浆。

待测样品可以为不同来源的样品，利用上述蛋白沉淀的前处理方法，能够对待测样品进行处理，得到的待检测液不受到待测样品中复杂成分的影响。血清和血浆均为血液来源的样品，成分相似，均能够使用上述前处理方法进行处理。

在一种优选的实施例中，采用异丙醇乙腈水溶液对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀；优选地，采用含同位素内标的异丙醇乙腈水溶液对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀，含同位素内标的异丙醇乙腈水溶液为蛋白沉淀液。

在上述前处理方法中，将异丙醇乙腈水溶液加入待测样品中，其中的有机溶剂能够使待测样品中的蛋白质沉淀，待检测的磷酸胆碱不受有机溶剂的影响，稳定分布在上清液中。向异丙醇乙腈水溶液中添加同位素内标，形成蛋白沉淀液。能够在沉淀待测样品蛋白的同时，向样品中加入同位素内标，利用引入的同位素内标，结合UPLC-MS/MS联用，对待检测的磷酸胆碱进行精确定量。内标参与定量，且对该过程包括提取、转移、上机等步骤起到校准的作用，越早参与提取检测过程，校准效果越好。

在一种优选的实施例中，UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱为C18色谱柱；优选地，流动相包括A相和B相，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为含有10mM乙酸铵的异丙醇乙腈水溶液，同时含有A相和B相时，A相和B相的体积比为0:100～95:5；优选地，UPLC-MS/MS联用采用的离子源为电喷雾电离源；优选地，离子源的电压为-4500V，离子源的温度为550℃。

利用C18色谱柱，能够在UPLC中对各种磷酸胆碱进行分离，利用在后续的质谱装置中对各种磷酸胆碱分别进行精确地定性和定量。为了保证分离效率，流动相包括0.1％甲酸水溶液的A相作为水相，和含有10mM乙酸铵的异丙醇乙腈水溶液的B相作为有机相，待测样品在上述流动相中能够保持稳定。上述流动相中的甲酸和乙酸铵，能够使流动相保持一定的pH和离子强度，减少拖尾，改善峰形，利于待测样品中不同成分的分离。在色谱方法中，A相和B相的体积比为0:100～95:5，通过逐渐调整A相和B相的比例，改变流动相的极性，改变色谱柱对待检测液的保留能力。

在一种优选的实施例中，磷酸胆碱包括但不限于POVPC和/或PGPC；优选地，同位素内标包括但不限于癸酸-D19；优选地，蛋白沉淀液中的同位素的浓度为0.5μg/mL；优选地，异丙醇乙腈水溶液中异丙醇与水的体积比为7:1，乙腈与水的体积比为3:1。

上述方法能够对不同种类的磷酸胆碱分离后分别定量检测，蛋白沉淀法的前处理方法不会对磷酸胆碱在上清液中的分布和稳定性产生影响。根据具体试验需要检测的具体磷酸胆碱种类的不同，制作相应的标准曲线后即可利用上述方法进行定量检测。同位素内标可以灵活选用癸酸-D19、硬脂酸-D35、花生酸-D39或其他不与磷酸胆碱发生反应、能溶于异丙醇乙腈溶液的成分即可。蛋白沉淀液中同位素内标的浓度为0.5μg/mL，利于质谱检测器分析。异丙醇乙腈水溶液中异丙醇与水的体积比为7:1，乙腈与水的体积比为3:1，有机溶剂与水能够互溶，适宜的非极性能够将待测样品中的蛋白进行沉淀。

在一种优选的实施例中，制备蛋白沉淀液包括：精密称取同位素内标，用异丙醇乙腈溶液溶解得同位素母液；将同位素母液用异丙醇乙腈水溶液稀释，获得蛋白沉淀液；优选地，同位素母液的浓度为1～10mg/mL；优选地，异丙醇乙腈溶液包括50％异丙醇乙腈溶液。

通过分步配置蛋白沉淀液，先配置浓度较高的同位素母液，再将同位素母液进行稀释得到蛋白沉淀液。能够避免若直接配置蛋白沉淀液，由于称量同位素内标量过小而导致的误差。高浓度的同位素母液，利于储存。在后续配置蛋白沉淀液时可直接稀释配置，也能够避免由于多次称量带来的不同批次间的误差。

在一种优选的实施例中，S3中采用梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相自初始流动相开始以A相逐渐减小B相逐渐增加的方式进行梯度变化，并以与初始流动相相同组成的流动相洗脱结束梯度洗脱，初始流动相中所A相与B相的体积比为95:5；优选地，梯度洗脱的流速为0.2～0.5mL/min，更优选为0.3mL/min。

在UPLC-MS/MS联用对待检测液进行检测中，采用梯度洗脱的方法，流动相的极性由大逐渐变小，对结合在色谱柱上的样品进行梯度洗脱，极性越大的物质约容易被洗脱，出峰时间越短。在梯度洗脱结束后，利用与初始流动相相同组成的流动相洗脱，使下一次进样时色谱柱中的流动相极性与初始流动相相同，避免对下一次进样的样品保留时间产生影响。

在一种优选的实施例中，初始流动相洗脱的时间为0.5min，且初始流动相洗脱结束后在1.5min内，流动相中A相和B相的体积比自95:5逐渐变化至0:100，以B相洗脱2min后再以初始流动相进行洗脱1min。

利用上述流动相对结合在色谱柱上的待检测成分进行洗脱，根据不同成分的极性差异、与色谱柱结合能力差异的不同，对不同磷酸胆碱进行分离，在较短的洗脱时间内即可将不同成分进行区分，不同成分分别进入质谱检测器，分别进行定量分析，防止互相干扰，影响测定结果。利用上述洗脱方法，分析速度快，能够大大缩短检测时间。

在一种优选的实施例中，S2包括：将待测样品与蛋白沉淀液以体积比0.1～1:1混合，涡旋混匀后置于0～5℃下静置1～5min以进行蛋白沉淀形成蛋白沉淀体系；将蛋白沉淀体现在0～5℃下进行离心，得到上清液；优选地，待测样品与蛋白沉淀液以体积比(45～55)：(180～220)混合。

将待测样品与蛋白沉淀液进行混合，2种液体互溶，不发生有机相与水相的分层。含有有机溶剂的蛋白沉淀剂的加入能够降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子即蛋白质脱水，相互聚集，从而析出并沉淀。利用涡旋使待测样品与蛋白沉淀液充分混合，加速蛋白质的析出。静置、离心，使得蛋白质迅速沉淀，防止悬浮在上清液中的蛋白质，对后续分析产生影响。上述操作在0～5℃的条件下进行，能够防止过高的温度影响待检测的磷酸胆碱的稳定性。

为了提高各磷酸胆碱的分离度，在一种优选的实施例中，UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱的柱温为50℃；优选地，色谱柱的柱参数为100×2.1mm，1.8μm。

利用上述柱温和色谱柱，能够较好且较快的对不同磷酸胆碱进行分离。防止分离效果不好导致不同种的成分同时进入质谱检测器中，对待检测的磷酸胆碱的准确定量产生影响。

在一种优选的实施例中，磷酸胆碱包括POVPC和/或PGPC，S1包括：S11.精密称取POVPC和/或PGPC，用异丙醇溶解得POVPC母液和/或PGPC母液；S12.将POVPC母液和/或PGPC母液用甲醇水溶液稀释，获得POVPC标准液和/或PGPC标准液；优选地，POVPC标准液和/或PGPC标准液的浓度为1～5000ng/mL；优选地，甲醇水溶液包括50％甲醇水溶液。

通过分步配置，先配置浓度较高的各磷酸胆碱母液，再分别将各磷酸胆碱母液进行稀释得到相应的磷酸胆碱标准液。能够避免若直接配置磷酸胆碱标准液，由于称量质量过小而导致的误差。高浓度的母液，利于储存，也便于配置不同浓度的标准液，从而进行标准曲线的制作。在后续配置标准液时可直接稀释配置，也能够避免由于多次称量带来的不同批次间的误差。

下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。

实施例1

标准液的配制：

用分析天平准确称量POVPC和PGPC标准品1.0mg，用移液器移取1000μL的异丙醇溶液，溶解，混匀，得到1.0mg/mL的POVPC母液和PGPC母液。

POVPC标准液和PGPC标准液按照表1所示，用50％甲醇水溶液逐一进行配制。

表1

蛋白沉淀液的配制：

用分析天平准确称量同位素内标癸酸-D19粉末1.0mg，用移液器移取1000μL的50％异丙醇乙腈溶液，溶解，混匀，得到1.0mg/mL的同位素母液。吸取8μL同位素母液，加入39.992mL的体积比为7：3：1的异丙醇乙腈水溶液，配制成蛋白沉淀液。

线性前处理：

准确吸取8份40μL空白基质溶液(生理盐水)于1.5mL离心管内，分别加入8个浓度的标准液10μL，涡旋混匀，随即加入200μL蛋白沉淀液，涡旋混匀，12000rpm离心10min后取上清检测。根据检测结果制作标准曲线。POVPC的标准曲线参见图3，PGPC的标准曲线参见图4。

质控溶液配制：

低、中、高质控溶液配制方法与标准液3、标准液5、标准液7配制方法相同。

质控样品前处理：

准确量取3份40μL空白基质溶液(生理盐水)，从8个浓度点的线性梯度中选取低(7)、中(5)、高(3)3个浓度，配置上述低、中、高质控溶液。分别吸取10μL加入到空白基质溶液中制成质控品，涡旋混匀，随即加入200μL蛋白沉淀液，涡旋混匀，12000rpm离心10min后取上清待检测，平行制备3组。

质控样品是线性范围内的不包含线性最低点与最高点的其余按低中高浓度设置的质控点，作用是计算该方法验证中的验证项，如准确度，是用线性计算出低中高质控的检测数值与理论值进行比较计算得出，其余验证项也包括精密度。此外，在检测实际样本队列中插入质控品，可以质控样品的偏差和准确度来判断样本检测正常与否，起到监控整个检测流程的作用。

待测样品的前处理：

准确移取50μL待测样本，随即加入200μL蛋白沉淀液，涡旋混匀，12000rpm离心10min后取上清待检测。

待测样品的分析：

根据上机得到的数据结果，带入标准曲线的线性方程中，得到样本浓度值。

色谱方法：

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，100x2.1mm，1.8μm

流动相：A相：0.1％甲酸水溶液

B相：10mM乙酸铵-异丙醇/乙腈/水(v/v/v＝7/3/1)

柱温：50℃

进样量：2μL

色谱梯度如表2所示：

时间min	流速mL/min	A％	B％
				0	0.3	95	5
0.5	0.3	95	5
				2.0	0.3	0	100
4.0	0.3	0	100
				4.1	0.3	95	5
5.0	0.3	95	5

质谱方法：

电喷雾电离(ESI)源，正(负)离子电离模式。离子源温度550℃,离子源电压4500V(负模式-4500V)，气帘气35psi，雾化气60psi，辅助气60psi。采用多重反应监测(MRM)进行扫描。表3为POVPC、PGPC和同位素内标的质谱检测参数。对于POVPC的定量分析，选择594.3-184.0的离子对进行计算；对于PGPC的定量分析，选择610.3-184.1的离子对进行计算。POVPC-1子离子的离子谱峰参见图1，PGPC-1子离子的离子谱峰参见图2，相应的离子谱峰面积结果见表6。表3中其他离子对作为辅助定性使用。

表3

母离子	子离子	样品名称	去簇电压	碰撞电压
					594.3	184.0	POVPC-1	60	35
594.3	86.2	POVPC-2	60	80
					594.3	125.2	POVPC-3	60	85
610.3	184.1	PGPC-1	60	35
					610.3	86.1	PGPC-2	60	90
610.3	125.0	PGPC-3	60	90
					190.2	190.2	癸酸-D19	-40	-12

方法学验证：

定量下限：样品中目标物能被定量测定的最低量，一般为标准曲线最低点。要求信噪比值大于等于10(S/N≥10)；定量下限平行3组检测结果CV≤20％。

相对标准偏差(RSD)可用CV％表示，公式为：

其中S为标准偏差，

为均值。

线性：在给定的测量范围内，测量结果与样品中目标物浓度成比例关系的程度。要求相关系数r≥0.9900；各个目标物最低点的3组线性点检测结果CV≤20％，其他点的3组线性点检测结果CV≤15％。

方法学验证的参数见表4、表5。

表4

准确度：该检测方法测定的结果与真实值或参考值的接近程度。要求各个目标物回收率R％在85％至115％范围内；各个目标物的3组回收点检测结果CV≤15％。

计算公式：R％＝(QC回收样–B空白)/S加标量×100％；

注：R％为回收率、QC回收样为基质加回收点样品、B空白为空白基质样品、S加标量为理论加入浓度。

精密度：相互独立的测量结果间的一致程度，要求日内各个目标物的3组检测结果CV≤15％。

表5

对比例1

利用固相萃取法对待测样品进行预处理

准确移取50μL待测样本，随即加入200μL异丙醇，涡旋混匀，12000rpm离心10min，吸取上清200μL至固相萃取柱中，加压吸附，再加入300μL的5％甲醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，再次向固相萃取柱中加入300μL的异丙醇进行洗脱，收集洗脱液，将两部分洗脱液合并，冻干，加入50μL的异丙醇/乙腈/水-体积比7/3/1进行复溶。

待测样品的前处理、色谱方法和质谱方法同实施例1，峰面积结果见表6。

对比例2

利用液液萃取法对待测样品进行预处理

准确移取50μL待测样本，随即加入400μL甲醇，涡旋混匀，加入1.5mL甲基叔丁基醚MTBE，摇匀1小时，再加入400μL质谱水，混匀，静置10min，1000g离心10min，收集上层有机相，冻干，加入50μL的异丙醇/乙腈/水-体积比为7/3/1复溶。

待测样品的前处理、色谱方法和质谱方法同实施例1，峰面积结果见表6。

表6

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请利用蛋白沉淀法对待测样品进行前处理，利用UPLC-MS/MS联用对样品中的磷酸胆碱进行定量分析，操作简便，分析时间短，能够在短时间内对血浆中的磷酸胆碱成分进行精确定量。相较于现有技术中利用固相萃取法或液液萃取法进行前处理，利用蛋白沉淀法进行测定，峰面积CV％小，测定的精密度高。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种检测磷酸胆碱的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1，利用UPLC-MS/MS联用建立所述磷酸胆碱的浓度和峰面积的标准曲线；

S2，对待测样品进行前处理，使蛋白沉淀，并取上清液作为待检测液；

S3，采用所述UPLC-MS/MS联用对所述待检测液进行检测，得到所述磷酸胆碱的离子谱峰；根据所述标准曲线和所述离子谱峰换算各所述磷酸胆碱的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品为如下任意一种：血清、血浆。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用异丙醇乙腈水溶液对所述待测样品进行前处理，使蛋白沉淀；

优选地，采用含同位素内标的异丙醇乙腈水溶液对所述待测样品进行前处理，使蛋白沉淀，所述含同位素内标的异丙醇乙腈水溶液为蛋白沉淀液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱为C18色谱柱；

优选地，流动相包括A相和B相，所述A相为0.1％甲酸水溶液，所述B相为含有10mM乙酸铵的异丙醇乙腈水溶液，同时含有所述A相和所述B相时，所述A相和所述B相的体积比为0:100～95:5；

优选地，所述UPLC-MS/MS联用采用的离子源为电喷雾电离源；

优选地，所述离子源的电压为-4500V，所述离子源的温度为550℃。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磷酸胆碱包括POVPC和/或PGPC；

优选地，所述同位素内标包括癸酸-D19；

优选地，所述蛋白沉淀液中的所述同位素的浓度为0.5μg/mL；

优选地，所述异丙醇乙腈水溶液中异丙醇与水的体积比为7:1，乙腈与所述水的体积比为3:1。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，制备所述蛋白沉淀液包括：

精密称取所述同位素内标，用所述异丙醇乙腈溶液溶解得同位素母液；将所述同位素母液用所述异丙醇乙腈水溶液稀释，获得所述蛋白沉淀液；

优选地，所述同位素母液的浓度为1～10mg/mL；

优选地，所述异丙醇乙腈溶液包括50％异丙醇乙腈溶液。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3中采用梯度洗脱，所述梯度洗脱过程中，流动相自初始流动相开始以A相逐渐减小B相逐渐增加的方式进行梯度变化，并以与所述初始流动相相同组成的流动相洗脱结束所述梯度洗脱，所述初始流动相中所A相与所述B相的体积比为95:5；

优选地，所述梯度洗脱的流速为0.2～0.5mL/min，更优选为0.3mL/min。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述初始流动相洗脱的时间为0.5min，且初始流动相洗脱结束后在1.5min内，所述流动相中A相和B相的体积比自95:5逐渐变化至0:100，以所述B相洗脱2min后再以所述初始流动相进行洗脱1min。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2包括：

将所述待测样品与所述蛋白沉淀液以体积比0.1～1:1混合，涡旋混匀后置于0～5℃下静置1～5min以进行蛋白沉淀形成蛋白沉淀体系；

将所述蛋白沉淀体现在0～5℃下进行离心，得到所述上清液；

优选地，所述待测样品与所述蛋白沉淀液以体积比(45～55)：(180～220)混合。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱的柱温为50℃；

优选地，所述色谱柱的柱参数为100×2.1mm，1.8μm。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸胆碱包括POVPC和/或PGPC，所述

S1包括：

S11.精密称取所述POVPC和/或PGPC，用异丙醇溶解得POVPC母液和/或PGPC母液；

S12.将所述POVPC母液和/或所述PGPC母液用甲醇水溶液稀释，获得POVPC标准液和/或PGPC标准液；

优选地，所述POVPC标准液和/或所述PGPC标准液的浓度为1～5000ng/mL；

优选地，所述甲醇水溶液包括50％甲醇水溶液。

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