CN104965038A - 采用固相微萃取-气质联用筛查样本中毒性物质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用固相微萃取-气质联用筛查样本中毒性物质的方法。该方法包括如下步骤：采用水溶性有机溶剂和去离子水的混合溶液对样本进行提取，制得提取液；对所述提取液进行离心，收取上清液并除去上清液中的有机溶剂，再次离心并收取上清液，制得样本液；将PDMS萃取头插入所述样本液中进行固相微萃取，萃取后取出PDMS萃取头，插入气质联用仪中进行脱附，脱附样品随后进入色谱柱中进行GC-MS分析。本发明的方法能够对样本中多种结构不同的毒性物质进行快速、有效检出，特别是一次检测即可实现对60多种毒性物质的筛查，检测效率高，特别适用于法庭科学等领域，具有良好的实际应用价值。

Description

采用固相微萃取-气质联用筛查样本中毒性物质的方法

技术领域

本发明属于分析化学与材料科学领域，具体涉及一种采用固相微萃取-气质联用筛查样本中毒性物质的方法。

背景技术

法庭科学领域通常需要对新鲜器官组织、血液、体液、腐尸、腐泥等多种样本中的众多毒性物质进行检测，毒性物质范围包括农药、鼠药、医源性药物(例如安眠镇静药物、镇痛药物、麻醉药物、抗生素等)、毒品、食品添加剂、中草药等。然而，这些样本成分较为复杂，特别是所含有的油脂、色素、蛋白质、酶等杂质易对毒性物质的检测产生干扰，因此如何有效去除样本中的杂质、高效提取样本中的目标毒物成为需要研究的课题之一。

此外，由于样本的复杂性、检测目标的不确定性以及检测范围的广泛性，很难做到有针对性地对样本中的毒性物质进行检测，因此样本中毒性物质的筛查至关重要。然而，各种毒性物质的理化性质、结构特点、色谱行为等性质各异，所要求的分析检测条件各异，因此如何在同一条件下对样本中的多种毒性物质进行有效分离、灵敏检测成为目前法庭科学领域毒物筛查与分析的难点及研究热点。

固相微萃取(Solod Phase Micro-Extration，SPME)是在固相萃取基础上发展起来的一种新的萃取分离技术，与液-液萃取和固相萃取相比，具有操作时间短，样品量小，无需萃取溶剂，适于分析挥发性与非挥发性物质。例如，公开号为CN 102539609 A的中国专利公开了一种瓶内甲酯化-顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用测定啤酒中游离脂肪酸的检测方法，其利用固相微萃取纤维富集挥发性成分，并采用选择性和灵敏性良好的质谱检测器进行检测，使游离脂肪酸的检测范围扩展到C8：0～C22：0。然而，该方法主要适用于啤酒、发酵液、饮料、牛奶等液体样品，并且分析对象为仅针对结构相似的脂肪酸类物质，其无法实现对样本中多种不同结构的毒性物质的快速筛查。

发明内容

本发明提供一种采用固相微萃取-气质联用筛查样本中毒性物质的方法，用于解决现有技术方法无法对样本中多种不同结构的毒性物质进行快速筛查等技术缺陷。

本发明提供一种采用固相微萃取-气质联用筛查样本中毒性物质的方法，包括如下步骤：

采用水溶性有机溶剂和去离子水的混合溶液对样本进行提取，制得提取液；

对所述提取液进行离心，收取上清液并除去上清液中的有机溶剂，再次离心并收取上清液，制得样本液；

将PDMS萃取头插入所述样本液中进行固相微萃取，萃取后取出PDMS萃取头，插入气质联用仪中进行脱附，脱附样品随后进入色谱柱中进行GC-MS分析。

在本发明中，所述PDMS萃取头指的是聚二甲基硅氧烷固相微萃取萃取头，所述GC-MS分析指的是气相-质谱分析。在一实施方式中，所述水溶性有机溶剂为丙酮，并且所述混合溶液中水溶性有机溶剂与去离子水的体积比为4∶1。本发明人经大量研究发现：采用体积比为4∶1的丙酮和去离子水的混合溶液对样本进行提取时，不仅可以有效地去除样本中的油脂、色素、蛋白等多种杂质，从而排除其对检测的不利影响，此外还能够在最大范围内使大量结构不同的目标检测物质溶出，从而在检测目标不确定、检测范围广泛时能够实现对样本中的多种毒性物质的快速筛查。混合溶液中水溶性有机溶剂体积过少可能会导致某些目标检测物质无法溶出，而体积过大不利于对后续对有机溶剂的去除，较佳的体积比为4∶1。

本发明对所述样本不作严格限制，特别是可以为器官组织、血液、体液、腐尸、腐泥等生物样本。在一实施方式中，所述样本可以为体液或血液等液态样本，并且可以控制所述混合溶液与所述样本的体积比为(1.5-2.5)∶1；此外，本发明对所述提取的温度和时间不作严格限制，其可以根据样本的种类、目标检测物质等进行确定，提取温度例如可以为室温，提取时间例如可以为1-10min。

在另一实施方式中，所述样本还可以为器官组织等固态样本，所述提取为超声波提取，超声波提取有利于固态样本中目标检测物质的释放和溶出；并且可以控制所述混合溶液与所述样本的体积/质量比为(1.5-2.5)∶1，例如样本质量为1g时，混合溶液的体积为1.5-2.5mL。此外，超声波提取的温度可以为室温，提取时间可以为20-40min。

本发明对上清液中有机溶剂的去除方式不作严格限定，例如可以采用温度为40-60℃气体流除去上清液中的有机溶剂，所述气体流为空气流或氮气流，优选为45℃的氮气流。进一步地，可以控制除去有机溶剂后的上清液的体积与样本的质量或体积比为(0.5-1)∶1，例如样本体积为2mL时，除去有机溶剂后的上清液的体积可控制在1-2mL，较佳的为1mL，从而保证无有机溶剂残留而影响目标毒性物质的检测。进一步地，再次离心并收取上清液后，加去离子水稀释，去离子水稀释的稀释倍数可以为2-10倍。

在一实施方式中，可以调节所述样本液的pH值为6.5-7.5后在室温下进行所述固相微萃取，在该pH值下进行固相微萃取有利于在最大范围内使大量结构不同的目标检测物质溶出；并且，可以控制所述固相微萃取的时间为20-40min，所述脱附的时间为1-5min。

在本发明中，进行所述GC-MS分析时的色谱条件为：HP-5MS、HP-1MS或HP-35MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度280℃；柱温：起始温度80℃，保持2min，以20℃/min的速率升至280℃，保持16.5min；载气为氦气，流速1mL/min，分流比10∶1。起始温度过低时毒性物质的检测灵敏度降低，起始温度过高时部分毒性物质保留时间短，易受干扰而不易准确检出，较佳的起始温度为80℃。

进一步地，进行所述GC-MS分析时的质谱条件为：传输线温度250℃；四极杆温度200℃；检测器电压1.1kV；离子化方式：EI源；溶剂延迟时间3min；扫描模式：全扫描模式，扫描质量范围50-600m/z。

在上述色谱条件下进行检测有利于同时在最大范围内检出大量结构不同的目标检测物质，并且提高检测的灵敏度，从而有利于实现对样本中多种不同结构的毒性物质的快速筛查。

本发明对所述毒性物质的具体种类及成分不作严格限制，特别是所述毒性物质可以选自农药、鼠药、医源性药物、毒品、食品添加剂和中草药中的一种或多种，尤其是所述毒性物质包括农药、鼠药、医源性药物和毒品。

进一步地，所述毒性物质选自异丙威、灭多威、仲丁威、甲拌磷、呋喃丹、五氯硝基苯、二嗪磷、百菌清、特草灵、乙草胺、敌稗、甲草胺、甲基对硫磷、甲萘威、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、三氯杀螨醇、杀扑磷、丁草胺、硫丹、噻嗪酮、三唑硫磷、氯氟吡氧乙酸酯、胺菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、奎禾灵、氰戊菊酯、毒鼠强、敌敌畏、芬氟拉明、巴比妥、布洛芬、非那西丁、异戊巴比妥、戊巴比妥、杜冷丁、司可巴比妥、丁卡因、氯胺酮、利多卡因、曲马多、萘普生、扑尔敏、美沙酮、舍曲林、阿米替林、可卡因、多虑平、布比卡因、异丙嗪、保泰松、地芬尼多、地西泮、氯丙嗪、氯氮卓、多虑平、硝苯地平、咪达唑仑、酮替芬、三氟拉嗪、芬太尼、氯氮平、艾司唑仑和阿普唑仑中的一种或多种。特别是，所述毒性物质包括上述物质中的30种以上；尤其是，所述毒性物质包括上述物质中的60种以上。

本发明的实施，至少具有以下优势：

1、本发明的方法在采用有机溶剂和去离子水的混合溶液对样本进行提取后再进行固相微萃取，不仅可以有效地去除样本中的多种杂质，从而排除其对检测的不利影响，此外还能够在最大范围内使大量结构不同的目标检测物质溶出，从而在检测目标不确定、检测范围广泛时能够实现对样本中的多种毒性物质的快速筛查。

2、本发明的方法能够实现对农药、鼠药、医源性药物、毒品、食品添加剂和中草药中的多种结构不同的毒性物质的快速、有效检出，特别是一次检测即可实现对70种左右毒性物质的筛查，检测效率高，特别适用于法庭科学等领域，具有良好的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1的空白样本的GC-MS分析总离子流图；

图2为本发明实施例1的样本1-1的GC-MS分析总离子流图；

图3为本发明实施例1的样本1-2的GC-MS分析总离子流图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中所采用的试剂、样本及仪器：

各种毒性物质标准品：来自国家标准物质研究中心、生物药品制品鉴定研究院、农药检定所、sigma公司；

血液、猪肝样本：血液来自健康人血，猪肝为普通市购；

PDMS萃取头：Supelco SPME 57308；

气质联用仪：岛津GC/MS 2010，Labsolution GC/MS Solution Release2010工作站。

实施例1

1、准备样本

取三份相同的血液样品各100mL，将第一份血液样品设为空白样本。

向100mL第二份血液样品中分别加入异丙威、灭多威、仲丁威、甲拌磷、呋喃丹、五氯硝基苯、二嗪磷、百菌清、特草灵、乙草胺、敌稗、甲草胺、甲基对硫磷、甲萘威、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、三氯杀螨醇、杀扑磷、丁草胺、硫丹、噻嗪酮、三唑硫磷、氯氟吡氧乙酸酯、胺菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、奎禾灵、氰戊菊酯、毒鼠强和敌敌畏标准品，其中控制各标准品的添加浓度均为100ng/mL，随后在室温下放置3周，使其高度腐败，制得样本1-1。

向100mL第三份血液样品中分别加入芬氟拉明、巴比妥、布洛芬、非那西丁、异戊巴比妥、戊巴比妥、杜冷丁、司可巴比妥、丁卡因、氯胺酮、利多卡因、曲马多、萘普生、扑尔敏、美沙酮、舍曲林、阿米替林、可卡因、多虑平、布比卡因、异丙嗪、保泰松、地芬尼多、地西泮、氯丙嗪、氯氮卓、多虑平、硝苯地平、咪达唑仑、酮替芬、三氟拉嗪、芬太尼、氯氮平、艾司唑仑和阿普唑仑标准品，其中控制各标准品的添加浓度均为100ng/mL，随后在室温下放置3周，使其高度腐败，制得样本1-2。

2、毒性物质的提取和分析

取上述空白样本、样本1-1和样本1-2各2mL，分别加入4mL由丙酮和去离子水组成的混合溶液室温提取5min左右，其中混合溶液中丙酮与去离子水的体积比为4∶1，制得提取液。

将上述提取液离心后，收取上清液，采用45℃左右的氮气流挥干该上清液中的丙酮，剩余上清液2mL左右；对该剩余上清液进行高速冷冻离心并收取上清液，加去离子水稀释至5mL左右，并调节pH值约为7，制得样本液。

将100μm的PDMS萃取头插入上述样本液中进行固相微萃取，萃取30min后取出PDMS萃取头，插入气质联用仪的进样口中脱附1min，脱附样品随后进入色谱柱中进行GC-MS分析，分析条件如下：

色谱条件为：

色谱柱：HP-5MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；

进样口温度280℃；

柱温：起始温度80℃，保持2min，以20℃/min的速率升至280℃，保持16.5min；

载气为高纯氦气(纯度＞99.999％)，流速1mL/min，分流比10∶1；

质谱条件为：

传输线温度250℃；四极杆温度200℃；

检测器电压1.1kV；离子化方式：EI源；溶剂延迟时间3min；

扫描模式：全扫描模式，扫描质量范围50-600m/z。

采集数据，得到空白样本、样本1-1和样本1-2的GC-MS分析总离子流图，分别如图1至图3所示。由图1至图3可知：本实施例的方法能够同检测出血液样品中的30多种结构不同的毒性物质，并且空白样本对毒性物质的检测基本不产生干扰，检测结果准确。

实施例2

取六份相同的血液样品，向各份血液样品中分别加入表1中的各种毒性物质标准品，其中控制第一份至第六份血液样品中各毒性物质标准品的添加浓度均分别为500ng/mL、200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、5ng/mL、1ng/mL，将各试样在室温下放置3周，使其高度腐败后，按照实施例1中毒性物质的提取和分析方法进行GC-MS分析，得到各毒性物质的检测限及线性关系，结果见表1。

表1 血液样品中各毒性物质的检测限及线性关系

由表1可知：

本发明的方法能够同时检测出血液中的上述60多种结构不同的毒性物质，并且各毒性物质在血液中的检出限在0.01-100ng/mL，定量限在1.2-100ng/mL，各毒性物质的相关系数均在0.99以上，线性关系良好。

实施例3

取三份相同的血液样品，向各份血液样品中分别加入表2中的各种毒性物质标准品，其中控制第一份至第三份血液样品中各毒性物质标准品的添加浓度均分别为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL，将各试样在室温下放置3周，使其高度腐败后，按照实施例1中毒性物质的提取和分析方法进行GC-MS分析，并计算各毒性物质的回收率，结果见表2。

表2 血液样品中各毒性物质的回收率

由表2可知：

本发明的方法能够检测出血液中的上述60多种毒性物质，并且血液中毒性物质的回收率基本在60％以上，特别是其中部分毒性物质的回收率可达90％以上。

实施例4

1、准备样本

取六份相同的猪肝样品，向各份猪肝样品中分别加入表3中的各种毒性物质标准品，其中控制第一份至第六份猪肝样品中各毒性物质标准品的添加浓度均分别为500ng/g、200ng/g、100ng/g、50ng/g、5ng/g、1ng/g，将各试样在室温下放置3周，使其高度腐败，制得样本4-1至样本4-6。

2、毒性物质的提取和分析

取上述样本4-1至样本4-6各2g，分别加入4mL由丙酮和去离子水组成的混合溶液，室温超声波提取30min左右，其中混合溶液中丙酮与去离子水的体积比为4∶1，制得提取液。

将上述提取液离心后，收取上清液，采用60℃左右的氮气流挥干该上清液中的丙酮，剩余上清液1mL左右；对该剩余上清液进行高速冷冻离心并收取上清液，加去离子水稀释至5mL左右，并调节pH值约为7，制得样本液。

将100μm的PDMS萃取头插入上述样本液中进行固相微萃取，萃取30min后取出PDMS萃取头，插入气质联用仪的进样口中脱附1min，脱附样品随后进入色谱柱中进行GC-MS分析，分析条件同实施例1，得到各毒性物质的检测限及线性关系，结果见表3。

表3 猪肝样品中各毒性物质的检测限及线性关系

由表3可知：

本发明的方法能够同时检测出器官组织(例如猪肝)中的上述60多种结构不同的毒性物质，并且各毒性物质在组织中的检出限在0.01-100ng/g，定量限在1.2-100ng/g，各毒性物质的相关系数均在0.99以上，线性关系良好。

实施例5

取三份相同的猪肝样品，向各份猪肝样品中分别加入表4中的各种毒性物质标准品，其中控制第一份至第三份猪肝样品中各毒性物质标准品的添加浓度均分别为200ng/g、100ng/g、50ng/g，将各试样在室温下放置3周，使其高度腐败后，按照实施例4中毒性物质的提取和分析方法进行GC-MS分析，并计算各毒性物质的回收率，结果见表4。

表4 猪肝样品中各毒性物质的回收率

由表4可知：

本发明的方法能够检测出器官组织(例如猪肝)中的上述60多种毒性物质，并且组织中毒性物质的回收率基本在60％以上，特别是其中部分毒性物质的回收率可达90％以上。

实施例6

除采用甲醇和去离子水组成的混合溶液进行提取，混合溶液中甲醇与去离子水的体积比为4∶1之外，其余与实施例3相同，结果表明：采用甲醇和去离子水组成的混合溶液对样本进行提取时，毒物检出灵敏度低、杂质干扰大，毒物种类减少，部分毒性物质(例氯氰菊酯、氟氯氰菊酯等)无法提取出来，样本中毒性物质的检出范围相比实施例3有所缩小。

实施例7

除采用57302萃取头或57304萃取头对pH值为9左右的样本液(即不调节样本液的pH值至7左右)进行固相微萃取之外，其余与实施例3相同，结果表明：采用57302萃取头或57304萃取头对pH值为9左右的样本液进行固相微萃取时毒物检出灵敏度低，毒物种类减少，部分毒性物质(例如部分菊酯类农药、部分氨基甲酸酯类农药等)无法萃取出来，样本中毒性物质的检出范围相比实施例3有所缩小。

实施例8

除色谱条件中，柱温：起始温度100℃，保持2min，以10℃/min的速率升至280℃，保持16.5min之外，其余与实施例3相同，结果表明：部分毒性物质(例如灭多威、甲胺磷、敌敌畏等)保留时间在4分钟以内，检测易受到干扰而不易检出，样本中毒性物质的检出范围相比实施例3有所缩小。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种采用固相微萃取-气质联用筛查样本中毒性物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

采用水溶性有机溶剂和去离子水的混合溶液对样本进行提取，制得提取液；

对所述提取液进行离心，收取上清液并除去上清液中的有机溶剂，再次离心并收取上清液，制得样本液；

将PDMS萃取头插入所述样本液中进行固相微萃取，萃取后取出PDMS萃取头，插入气质联用仪中进行脱附，脱附样品随后进入色谱柱中进行GC-MS分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶性有机溶剂为丙酮，并且所述混合溶液中水溶性有机溶剂与去离子水的体积比为4∶1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样本为体液或血液，并且控制所述混合溶液与所述样本的体积比为(1.5-2.5)∶1，所述提取的温度为室温，提取时间为1-10min。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样本为器官组织，所述提取为超声波提取，并且控制所述混合溶液与所述样本的体积/质量比为(1.5-2.5)∶1，所述提取的温度为室温，提取时间为20-40min。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，采用温度为40-60℃气体流除去上清液中的有机溶剂，所述气体流为空气流或氮气流。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，调节所述样本液的pH值为6.5-7.5后在室温下进行所述固相微萃取，并且控制所述固相微萃取的时间为20-40min，所述脱附的时间为1-5min。

7.根据权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于，进行所述GC-MS分析时的色谱条件为：HP-5MS、HP-1MS或HP-35MS色谱柱，30m×0.25mm×0.25μm；进样口温度280℃；柱温：起始温度80℃，保持2min，以20℃/min的速率升至280℃，保持16.5min；载气为氦气，流速1mL/min，分流比10∶1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进行所述GC-MS分析时的质谱条件为：传输线温度250℃；四极杆温度200℃；检测器电压1.1kV；离子化方式：EI源；溶剂延迟时间3min；扫描模式：全扫描模式，扫描质量范围50-600m/z。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述毒性物质选自农药、鼠药、医源性药物、毒品、食品添加剂和中草药中的一种或多种。

10.根据权利要求1至9任一所述的方法，其特征在于，所述毒性物质选自异丙威、灭多威、仲丁威、甲拌磷、呋喃丹、五氯硝基苯、二嗪磷、百菌清、特草灵、乙草胺、敌稗、甲草胺、甲基对硫磷、甲萘威、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、三氯杀螨醇、杀扑磷、丁草胺、硫丹、噻嗪酮、三唑硫磷、氯氟吡氧乙酸酯、胺菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、奎禾灵、氰戊菊酯、毒鼠强、敌敌畏、芬氟拉明、巴比妥、布洛芬、非那西丁、异戊巴比妥、戊巴比妥、杜冷丁、司可巴比妥、丁卡因、氯胺酮、利多卡因、曲马多、萘普生、扑尔敏、美沙酮、舍曲林、阿米替林、可卡因、多虑平、布比卡因、异丙嗪、保泰松、地芬尼多、地西泮、氯丙嗪、氯氮卓、多虑平、硝苯地平、咪达唑仑、酮替芬、三氟拉嗪、芬太尼、氯氮平、艾司唑仑和阿普唑仑中的一种或多种。