CN105344310B - 一种多分散dna提取磁珠的制备方法及其应用 - Google Patents
一种多分散dna提取磁珠的制备方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105344310B CN105344310B CN201510758801.9A CN201510758801A CN105344310B CN 105344310 B CN105344310 B CN 105344310B CN 201510758801 A CN201510758801 A CN 201510758801A CN 105344310 B CN105344310 B CN 105344310B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polydispersion
- magnetic bead
- added
- dna
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Compounds Of Iron (AREA)
Abstract
一种多分散DNA提取磁珠的制备方法，其制备步骤为：将FeCl3·6H2O与FeSO4·7H2O按比例混合于去离子水中，搅拌溶解后，通入氮气，持续搅拌；加入反应制剂，在100℃‑200℃条件下反应10小时；冷却至室温后，将反应物移出反应釜，清洗后至上清液PH值为7，得多分散裸珠；将多分散裸珠加入含有表面活性剂的溶液中，搅拌后；磁分离，将上清倒掉，加入盐酸溶液，同时超声处理，加入柠檬酸钠水溶液，同时辅助超声处理；加入氨水，超声处理；加入硅酸乙酯和无水乙醇混合液，超声处理；然后再次加入硅酸乙酯和无水乙醇混合液20ml，超声处理搅拌后，制得多分散磁珠。
Description
技术领域
本发明涉及磁性纳米微球制备技术领域，尤其是多分散DNA提取磁珠的制备方法及其应用。
背景技术
磁珠是纳米磁性微球的简称，具有磁性材料和纳米材料的双重特点，是20世纪70年代末兴起的一种新型材料。其表面可连接多种化学官能基团，从而达到与各类生物大分子的吸附或偶联的目的，由于磁珠本身具有较高的磁响应性，可通过控制外界磁场实现磁珠的集中与分离，这就使得整个操作过程变得简单快捷，尤其针对DNA提取技术，磁珠配合带有磁分离装置的设备，可在最大程度上实现DNA提取的自动化。目前，磁珠法DNA提取已广泛应用于农业、畜牧业、医学诊断、司法鉴定等各个领域中。
磁珠的制备方法有很多，如球磨法、沉淀法、微乳液法、水热法等等，用这类方法的制备的磁珠可分为两种：单分散磁珠和多分散磁珠。单分散磁珠的制备工艺复杂，操作繁琐，耗时长，较难实现大批量的工业生产，且单分散磁珠的应用领域集中在细胞分离纯化、免疫诊断及肿瘤靶向治疗等方面，就DNA提取而言，单分散磁珠并无较大的优势，而且其成本较高，无法良好的推广于实际应用中。多分散磁珠的制备工艺相对简单，易于批量化生产，但磁珠本身较易团聚，使其悬浮性降低，而且在制备过程中，磁珠较易被其他化学试剂氧化，导致表面官能基团缺失，严重影响了DNA提取效率，使其较难普及到整个DNA提取领域。
发明内容
针对背景技术中指出的磁珠本身较易团聚，使其悬浮性降低，而且在制备过程中，磁珠较易被其他化学试剂氧化，导致表面官能基团缺失，严重影响了DNA提取效率的问题，本发明的目的是提供一种多分散DNA提取磁珠的制备方法，该方法操作简单，稳定，成本低，适于大批量的工业生产，制备得到的磁珠具有悬浮性好，官能基团稳定，生物吸附性能较高等特点，本发明还对该类磁珠进行了自动化DNA提取的验证，从而更好的证明其实用效果。
为了实现所述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种多分散DNA提取磁珠的制备方法，其制备步骤为：
S1：多分散裸珠的制备：将FeCl3·6H2O与FeSO4·7H2O按比例混合于去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min；加入反应制剂，继续搅拌30min；将上述溶液转入2L反应釜中，在100℃-200℃条件下反应10-24小时；冷却至室温后，将反应物移出反应釜，用乙醇清洗后，用去离子水清洗，直至上清液PH值为7，真空干燥，得到固体粉末，即多分散裸珠；
S2：多分散磁珠的制备：称取S1所述多分散裸珠10g，并将其加入含有表面活性剂的溶液中，300rpm机械搅拌30min后，用去离子水清洗；磁分离，将上清倒掉，加入1mol/L的盐酸溶液50ml，300rpm机械搅拌30min，同时超声处理30min，结束后用去离子水清洗；磁分离，将上清倒掉，加入100ml的无水乙醇，超声处理30min；加入质量分数10%的柠檬酸钠水溶液50ml，400rpm机械搅拌30min，同时辅助超声处理30min；加入20ml氨水，超声处理20min；加入体积比为1：1.5的硅酸乙酯和无水乙醇混合液20ml，超声处理15min；然后再次加入体积比为1：1.5的硅酸乙酯和无水乙醇混合液20ml，超声处理15min；300rpm机械搅拌12小时后，制得多分散磁珠。
本发明所述S1中的FeCl3·6H2O与FeSO4·7H2O的比例为1-2.5mol：1mol。
本发明所述S1中的反应制剂为PEG2000、乙酸钠、柠檬酸钠中的一种或几种。
本发明所述S2中的含有表面活性剂的溶液为质量分数5%的柠檬酸钠溶液或十六烷基三甲基溴化铵溶液。
一种多分散DNA提取磁珠的应用，所述多分散DNA提取磁珠在DNA自动化提取领域的应用。
本发明所述多分散DNA提取磁珠在DNA自动化提取领域的应用过程为：S1：人工操作：选取多分散DNA提取磁珠样本，将样本转移到DNA提取设备AUTOMAG® 32的32孔板中；
S2：机器操作：将2%CTAB自动转移至AUTOMAG® 32的32孔板中，同时加热，实现自动化裂解；
S3：人工操作：裂解后将AUTOMAG® 32的32孔板取出进行离心；
S4：机器操作：将520ul磁珠结合液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，吸弃上清；将400ul洗涤液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，吸弃上清；将150ul洗脱液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，将上清转移至PCR八连管中；
S5：然后将磁珠结合液、洗涤液及洗脱液自动转移至AUTOMAG® 32的32孔板，同时伴随升温与降温，实现DNA的自动化提取，最终DNA提取设备将提取好的DNA溶液转移至PCR八连管中，进行下游的检测与实验。
本发明所述磁珠结合液为250ul无水乙醇、250ul异丙醇及20ul磁珠；所述洗涤液为400ul 80%无水乙醇；所述洗脱液为150ul 去离子水。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明首先生产的是不含官能基团多分散裸珠，这使得接下来包覆官能基团的过程更为简便、灵活，可根据实际需求，进行不同种类，不同浓度的官能基团包覆，且反应制剂采用了PEG2000、乙酸钠、柠檬酸钠中的一种或几种，使其制得裸珠在第一环节便具有较高的悬浮性，粒径也更加均一。
对不含官能基团的多分散裸珠进行了表面改性，尤其以盐酸溶液辅助改性过程，使裸珠表面与盐酸发生初步反应，再配以柠檬酸钠溶液，使得表面改性更加彻底。
对制备好的多分散磁珠进行了熟化处理，在氨水的作用下，连续搅拌12小时，使多分散磁珠的悬浮性及官能基团更加稳固，从而使其理化性质更加稳定。
具体实施方式
通过下面的实施例可以详细的解释本发明，公开本发明的目的旨在保护本发明范围内的一切技术改进。
实施例1
（1）取0.15mol的FeCl3·6H2O与0.1mol的FeSO4·7H2O混合于500ml去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min。
（2）加入40g PEG2000和25g柠檬酸钠，继续搅拌30min。
（3）将上述溶液转入2L反应釜中，在120℃条件下反应10小时。
（4）冷却至室温后，将反应物移出反应釜，用500ml乙醇清洗3遍后，用去离子水清洗5遍以上，直至上清液PH值为7，真空干燥，得到不含官能基团的多分散裸珠。
（5）称取步骤（4）中的固体粉末10g，并将其加入100ml质量分数为5%的柠檬酸钠溶液中，300rpm机械搅拌30min后，用去离子水清洗3遍。
（6）磁分离，将上清倒掉，加入1mol/L的盐酸溶液50ml，300rpm机械搅拌30min，同时超声处理30min，结束后用去离子水清洗3遍。
（7）磁分离，将上清倒掉，加入100ml的无水乙醇，超声处理30min。
（8）加入质量分数10%的柠檬酸钠水溶液50ml，400rpm机械搅拌30min，同时辅助超声处理30min。
（9）加入20ml氨水，超声处理20min。
（10）加入硅酸乙酯和无水乙醇的混合液（体积比1：1.5）20ml，超声处理15min。
（11）重复步骤（10），300rpm机械搅拌12小时后，制得多分散磁珠。
（12）将制好的多分散磁珠用500ml无水乙醇清洗3遍后，去离子水清洗10遍以上，直至上清液PH值为7，调整固含量为15%。
实施例2
（1）取0.2mol的FeCl3·6H2O与0.1mol的FeSO4·7H2O混合于700ml去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min。
（2）加入60g PEG2000，40g柠檬酸钠，继续搅拌30min。
（3）将上述溶液转入2L反应釜中，在150℃条件下反应18小时。
（4）冷却至室温后，将反应物移出反应釜，用700ml乙醇清洗3遍后，用去离子水清洗5遍以上，直至上清液PH值为7，真空干燥，得到不含官能基团的多分散裸珠。
（5）称取步骤（4）中的固体粉末50g，并将其加入300ml质量分数为5%的柠檬酸钠溶液中，300rpm机械搅拌30min后，用去离子水清洗3遍。
（6）磁分离，将上清倒掉，加入1mol/L的盐酸溶液150ml，300rpm机械搅拌30min，同时超声处理30min，结束后用去离子水清洗3遍。
（7）磁分离，将上清倒掉，加入300ml的无水乙醇，超声处理30min。
（8）加入质量分数10%的柠檬酸钠水溶液100ml，400rpm机械搅拌30min，同时辅助超声处理30min。
（9）加入40ml氨水，超声处理20min。
（10）加入硅酸乙酯和无水乙醇的混合液（体积比1：1.5）30ml，超声处理15min。
（11）重复步骤（10），300rpm机械搅拌12小时后，制得多分散磁珠。
（12）将制好的多分散磁珠用700ml无水乙醇清洗3遍后，去离子水清洗10遍以上，直至上清液PH值为7，调整固含量为15%。
实施例3
（1）取0.25mol的FeCl3·6H2O与0.1mol的FeSO4·7H2O混合于1000ml去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min。
（2）加入100g PEG2000，60g柠檬酸钠，继续搅拌30min。
（3）将上述溶液转入2L反应釜中，在200℃条件下反应24小时。
（4）冷却至室温后，将反应物移出反应釜，用1000ml乙醇清洗3遍后，用去离子水清洗5遍以上，直至上清液PH值为7，真空干燥，得到不含官能基团的多分散裸珠。
（5）称取步骤（4）中的固体粉末100g，并将其加入500ml质量分数为5%的柠檬酸钠溶液中，300rpm机械搅拌30min后，用去离子水清洗3遍。
（6）磁分离，将上清倒掉，加入1mol/L的盐酸溶液250ml，300rpm机械搅拌30min，同时超声处理30min，结束后用去离子水清洗3遍。
（7）磁分离，将上清倒掉，加入500ml的无水乙醇，超声处理30min。
（8）加入质量分数10%的柠檬酸钠水溶液200ml，400rpm机械搅拌30min，同时辅助超声处理30min。
（9）加入60ml氨水，超声处理20min。
（10）加入硅酸乙酯和无水乙醇的混合液（体积比1：1.5）50ml，超声处理15min。
（11）重复步骤（10），300rpm机械搅拌12小时后，制得多分散磁珠。
（12）将制好的多分散磁珠用1000ml无水乙醇清洗3遍后，去离子水清洗10遍以上，直至上清液PH值为7，调整固含量为15%
以植物为例，利用上述方法得到的多分散磁珠，配合DNA提取设备，进行植物DNA自动化提取的步骤如下：
（1）人工操作：将研磨好的植物叶片50-100mg转移到DNA提取设备专用的32孔板中
（2）机器操作：将准备好的试剂自动转移至32孔板中，同时机器加热，实现自动化裂解
（3）人工操作：裂解后将32孔板取出进行离心
（4）机器操作：将准备好的磁珠结合液、洗涤液、洗脱液按流程自动转移至32孔板，同时伴随升温与降温，实现DNA的自动化提取，最终DNA提取设备将提取好的DNA溶液转移至干净的PCR 八连管中，进行下游的检测。
本发明未详述部分为现有技术。
Claims (6)
1.一种多分散DNA提取磁珠的制备方法，其特征是：其制备步骤为：
S1：多分散裸珠的制备：将FeCl3·6H2O与FeSO4·7H2O按1-2.5mol：1mol的比例混合于去离子水中，300rpm机械搅拌至完全溶解后，通入氮气，将机械搅拌转速提至500rpm，持续搅拌20min；加入反应制剂PEG2000，继续搅拌30min；将上述溶液转入2L反应釜中，在100℃-200℃条件下反应10-24小时；冷却至室温后，将反应物移出反应釜，用乙醇清洗后，用去离子水清洗，直至上清液PH值为7，真空干燥，得到固体粉末，即多分散裸珠；
S2：多分散磁珠的制备：称取S1所述多分散裸珠10g，并将其加入含有质量分数5%的柠檬酸钠溶液的溶液中，300rpm机械搅拌30min后，用去离子水清洗；磁分离，将上清倒掉，加入1mol/L的盐酸溶液50ml，300rpm机械搅拌30min，同时超声处理30min，结束后用去离子水清洗；磁分离，将上清倒掉，加入100ml的无水乙醇，超声处理30min；加入质量分数10%的柠檬酸钠水溶液50ml，400rpm机械搅拌30min，同时辅助超声处理30min；加入20ml氨水，超声处理20min；加入体积比为1：1.5的硅酸乙酯和无水乙醇混合液20ml，超声处理15min；然后再次加入体积比为1：1.5的硅酸乙酯和无水乙醇混合液20ml，超声处理15min；300rpm机械搅拌12小时后，制得多分散磁珠。
2.如权利要求1所述的多分散DNA提取磁珠的制备方法，其特征是：所述S1中的反应制剂PEG2000替换为乙酸钠和/或柠檬酸钠。
3.如权利要求1所述的多分散DNA提取磁珠的制备方法，其特征是：所述S2中质量分数5%的柠檬酸钠溶液替换为质量分数5%的十六烷基三甲基溴化铵溶液。
4.一种如权利要求1所述的制备方法制得的多分散DNA提取磁珠的应用，其特征是：所述多分散DNA提取磁珠在DNA自动化提取领域的应用。
5. 如权利要求4所述的多分散DNA提取磁珠的应用，其特征是：其应用过程为：S1：人工操作：选取多分散DNA提取磁珠样本，将样本转移到DNA提取设备AUTOMAG® 32的32孔板中；
S2：机器操作：将2%CTAB自动转移至AUTOMAG® 32的32孔板中，同时加热，实现自动化裂解；
S3：人工操作：裂解后将AUTOMAG® 32的32孔板取出进行离心；
S4：机器操作：将520ul磁珠结合液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，吸弃上清；将400ul洗涤液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，吸弃上清；将150ul洗脱液转移至32孔板中，吹吸10次，磁分离1分钟，将上清转移至PCR八连管中；
S5：然后将磁珠结合液、洗涤液及洗脱液自动转移至AUTOMAG® 32的32孔板，同时伴随升温与降温，实现DNA的自动化提取，最终DNA提取设备将提取好的DNA溶液转移至PCR 八连管中，进行下游的检测与实验。
6. 如权利要求5所述的多分散DNA提取磁珠的应用，其特征是：所述磁珠结合液为250ul无水乙醇、250ul异丙醇及20ul磁珠；所述洗涤液为400ul 80%无水乙醇；所述洗脱液为150ul 去离子水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510758801.9A CN105344310B (zh) | 2015-11-10 | 2015-11-10 | 一种多分散dna提取磁珠的制备方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510758801.9A CN105344310B (zh) | 2015-11-10 | 2015-11-10 | 一种多分散dna提取磁珠的制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105344310A CN105344310A (zh) | 2016-02-24 |
| CN105344310B true CN105344310B (zh) | 2018-12-28 |
Family
ID=55320451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510758801.9A Active CN105344310B (zh) | 2015-11-10 | 2015-11-10 | 一种多分散dna提取磁珠的制备方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105344310B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112563016B (zh) * | 2020-12-23 | 2024-06-25 | 四川安可瑞新材料技术有限公司 | 核酸提取用磁性微球的制备方法、所制备的产品及用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103820431A (zh) * | 2014-02-25 | 2014-05-28 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒 |
| CN103908945A (zh) * | 2014-03-31 | 2014-07-09 | 洛阳惠尔纳米科技有限公司 | 一种核酸提取磁珠的制备方法及应用 |
-
2015
- 2015-11-10 CN CN201510758801.9A patent/CN105344310B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103820431A (zh) * | 2014-02-25 | 2014-05-28 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 基于纳米磁珠的核酸提取纯化方法及试剂盒 |
| CN103908945A (zh) * | 2014-03-31 | 2014-07-09 | 洛阳惠尔纳米科技有限公司 | 一种核酸提取磁珠的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 柠檬酸在磁性纳米粒子上的吸附及性能表征;刘冰等;《功能材料》;20070720;第38卷(第7期);第1074-1077页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105344310A (zh) | 2016-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105918319B (zh) | 功能化氧化石墨烯抑菌材料及其制备方法 | |
| CN103361885B (zh) | 一种抗菌丝素纤维膜的制备方法 | |
| CN105399150B (zh) | 一种钴酸镍纳米材料及其制备方法和应用 | |
| CN105399152B (zh) | 一种钴酸镍纳米材料的溶剂热制备方法 | |
| CN104946383B (zh) | 一种超临界co2复合微波辅助萃取制备灵芝孢子油的方法 | |
| CN103641936B (zh) | 一种采用超滤和纳滤制备水溶性壳寡糖的方法 | |
| CN105344310B (zh) | 一种多分散dna提取磁珠的制备方法及其应用 | |
| CN111017891A (zh) | 一种UiO-66/HOCN材料的合成方法及其在茶叶残留农药检测中的应用 | |
| CN104322857A (zh) | 一种改性牡丹籽粕蛋白的制备方法 | |
| CN110898817A (zh) | 一种聚乙烯亚胺改性磁性竹粉材料的制备方法及其应用 | |
| CN105967241B (zh) | 一种制备Fe3O4纳米磁球的方法 | |
| CN107383930B (zh) | 提取植物棕色素的方法 | |
| CN106861646B (zh) | 选择性吸附银离子的吸附材料的制备方法 | |
| CN103978223A (zh) | 一种利用杜仲水提取物绿色合成纳米金的方法 | |
| CN109133144A (zh) | 一种单分散超小粒径二氧化铈纳米晶的制备方法 | |
| CN109706202A (zh) | 一种利用氧化亚铁硫杆菌酸化脱钙提取甲壳素的方法 | |
| CN107868261A (zh) | 一种羧甲基壳聚糖/氧化石墨烯复合水凝胶及其制备与应用 | |
| CN108500255B (zh) | 一种三维复合纳米银及其制备方法 | |
| CN104479926A (zh) | 一种天然植物洗涤剂及其制备方法 | |
| CN104028745A (zh) | 一种利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法 | |
| CN106810462A (zh) | 一种富勒烯多氮杂桥水溶性衍生物的制备方法 | |
| CN107021874A (zh) | 一种从微生物发酵液中分离精制1,2,4‑丁三醇的方法 | |
| CN106433975B (zh) | 一种利用分子蒸馏制备低As含量树苔净油的方法 | |
| CN105460982B (zh) | 一种大量制备分等级多孔钴酸镍纳米空心盒的方法 | |
| CN105001284B (zh) | 一种紫小麦麦麸花色苷提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |