CN104028745A - 一种利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，包括金颗粒的制备，丝蛋白溶液的制备，丝蛋白对金纳米颗粒自组装的调控。本发明所使用的调控蛋白家蚕丝素蛋白，为一种高分子蛋白，具有良好的生物相容性，与其他蛋白类调控物质相比，其来源广泛、制备简单、获取量大，能够投入工业化进行大批量生产，与其他方法相比，本发明中获得最后的金颗粒自组装完成后的产物更为方便简单，其他方法往往需要高温或者高压条件下才能提取，而本方法仅仅通过低速的离心就可以获得提取产物，本发明不仅局限于调控金纳米颗粒的自组装，对于其他的金属颗粒如银、铬等也能诱导其本身发生自组装，更好的应用于不同的领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，属于天然高分子领域。
技术背景
金纳米颗粒是指尺寸在1-100nm范围内的金粒子，通常为分散在水中的水溶胶，故又称胶体金。金纳米颗粒除了具有纳米粒子所共有的小尺寸效应、表面效应和量子尺寸效应等特性以外，其独特的光学性能以及金元素本身的惰性而带来的良好的生物相容性，使其能在各个领域得到广泛的应用。例如在生物应用领域，金纳米颗粒能够强烈的吸收和发散可见光，因此通过不同的显微技术，金纳米颗粒能够成为一种良好的显影剂，从而对一些生物分子如蛋白质、DNA等进行标记和跟踪。最近，研究人员发现，金颗粒吸收光以后，除了能够发散电子以外，其颗粒表面由于等离子共振，能够产生一定热量。利用这一性质，将金纳米颗粒注射到癌变部位，通过光照发热，能够将金颗粒周围的癌变细胞杀死，从而一定程度的达到治疗癌症的目的。
金纳米颗粒制备方法简单、粒径均匀、化学性质稳定，主要的制备方法可以分为物理法和化学法。物理法是通过各种分散技术将金直接转变为纳米粒子，包括真空沉积法、激光消融法等。化学法主要是通过还原金化合物溶液从而使其成为纳米粒子，目前主要包括水相氧化还原法、晶种法、微乳法、模板法等。经过上述方法合成的金纳米颗粒多为单分散性的粒子，而要作为不同领域尤其是生物应用领域的有用工具，往往需要进一步的修饰和组装。通常，利用有机分子对金纳米颗粒进行表面修饰，或者利用生物模板诱导和调控金纳米颗粒的自组装往往能达到预期的目的。目前，有研究曾利用聚乙烯亚胺(PEI)为模板来诱导金纳米颗粒自组装成纳米簇用于免疫探针方面的应用。此外，国外有研究报道，用蛋白质如抗体及一些生长因子作为模板，从而调控金纳米颗粒自组装成棒状的长条结构。但是，有机分子往往具有一定的毒性，而且对反应条件要求较高如强酸、高温等，因此在使用上并不方便。而目前研究所用蛋白质类生物分子则存在着制备提取工艺复杂，提取量少等缺点，因此并不能在工业上推广应用。所以，寻找一种制作工艺简单，提取量大的生物分子成为有效调控金纳米颗粒自组装的关键。
家蚕丝蛋白是一种纯天然的纤维蛋白，通过脱胶、溶解以及透析等简单步骤后，就能够获得不同浓度的丝素蛋白溶液。丝素蛋白主要是由18种不同的氨基酸所组成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸约占80％，另外还有酪氨酸和色氨酸等。刚提取的丝蛋白溶液多为α-螺旋结构，而随着时间、温度、外部作用力等条件的影响，丝蛋白则会向β-折叠转变，并且能够自组装成不同的结构。通常情况下经过还原生成的金纳米颗粒往往带正电荷，而家蚕丝蛋白的等电点在pH3左右，因此可以通过调节反应溶液的pH值，而使其带负电荷，最后通过电荷间的相互作用力，丝蛋白就可以调控金纳米颗粒的自组装。丝蛋白通常是由家蚕茧壳中提取制备，来源广泛、价格便宜，因此用丝蛋白来调控金颗粒的自组装存在大批量、工业化生产的可能性。
发明内容
本发明提供了一种利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，这种方法不仅简单、快速、高效，而且反应条件温和，用于调控自组装的丝蛋白来源广泛、制作简单，并且具有很好的生物相容性，从而克服了以往一些调控金颗粒自组装的生物分子所具有的制备复杂、获取量少等缺点。经过调控的金纳米颗粒能够在丝蛋白表面自组装成长条状结构，从而拓展了其在不同领域尤其是生物应用领域方面的有效应用，为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了如下具体步骤：
一种利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，该方法包括：(1)金颗粒的制备：将氯金酸、去离子水以及聚乙烯亚胺(PEI)相互混合反应，再加入还原剂获得金纳米颗粒；(2)丝蛋白溶液的制备：将家蚕茧壳或者下脚茧丝分别经过脱胶、晾干、溶解、透析、浓缩等步骤，最后获得所需浓度的丝素蛋白溶液；(3)丝蛋白对金纳米颗粒自组装的调控：将丝蛋白溶液加入到金颗粒溶液中，相互混合，反应一段时间后，离心洗涤提取沉淀，即可得到自组装的金纳米颗粒。
作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中的氯金酸通常为四氯金酸水合物溶液，目前市场上有四氯金酸四水、四氯金酸三水等试剂可供选择。
作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中的聚乙烯亚胺(PEI)可选用不同分子量的PEI，如PEI600、PEI1800等。
作为进一步地改进，本发明所述步骤(1)中的还原剂种类可为抗坏血酸、柠檬酸三钠和硼氢化钠中的一种或多种。
作为进一步地改进，本发明所述步骤(2)中的丝蛋白浓度可调整在100ug/ml-1000ug/ml的范围内。
作为进一步地改进，本发明所述步骤(2)中的丝蛋白溶液往往在制备后经过一段时间再用于金颗粒的调控。
作为进一步地改进，本发明所述步骤(3)中的金颗粒混合溶液在与丝蛋白溶液反应之前，将其pH值调整到pH4-6的范围之内。
作为进一步地改进，本发明所述步骤(3)中的离心选择低速离心，通常在rpm3000-rpm5000范围内。
由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有以下突出特点：
(1)本发明所使用的调控蛋白家蚕丝素蛋白，为一种高分子蛋白，具有良好的生物相容性，与其他蛋白类调控物质相比，其来源广泛、制备简单、获取量大，能够投入工业化进行大批量生产。
(2)本发明调控的金纳米颗粒能获得不同程度的自组装，与其他有机物调控金颗粒自组装相比，金颗粒自组装所获得的形状规整统一，能够更好的应用于其他的领域。
(3)与其他方法相比，本发明中获得最后的金颗粒自组装完成后的产物更为方便简单，其他方法往往需要高温或者高压条件下才能提取，而本方法仅仅通过低速的离心就可以获得提取产物。
(4)本发明所需的反应条件温和，与其他方法相比不需要强酸或强碱的反应条件，而且反应过程中不需要加热常温即可。
(5)本发明获得产物的时间较短，通常丝蛋白溶液与金化合物溶液培养2h就能获得产物，与其他方法相比不需要较长的反应周期。
(6)本发明不仅局限于调控金纳米颗粒的自组装，对于其他的金属颗粒如银、铬等也能诱导其本身发生自组装，更好的应用于不同的领域。
附图说明
图1为实施例中所获得的金纳米颗粒自组装的透射电子显微镜照片。
具体实施方式
以下结合说明书附图，通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明：
实施例1
(1)金纳米颗粒的制备：分别将750ul四氯金酸(浓度12mM)、10ul聚乙烯亚胺(分子量1800)以及4.25ml去离子水混合搅拌生成氯金酸水溶液。向氯金酸水溶液中逐滴滴加预先配置好的硼氢化钠溶液(浓度10mM)，观察混合溶液的颜色，直到颜色不再发生变化则停止滴加。(2)丝蛋白溶液的制备：将5g家蚕茧壳在500mL浓度为0.5wt％Na2CO3水溶液煮沸进行脱胶处理，每次30min，重复三次。用清水清洗脱胶蚕丝后并晾干，得到丝素纤维。将丝素纤维在50ml浓度为9mol/l的LiBr溶液中进行溶解，所获得的溶液在去离子水中进行透析，经过3天后获得丝素蛋白溶液。将所获得的丝蛋白溶液进行浓缩，调整其浓度在100–500ug/ml之间，放置在冰箱中备用。(3)丝蛋白对金纳米颗粒自组装的调控：反应之前，将金颗粒混合溶液的pH值调整至5左右，然后加入1.5ml备用的丝蛋白溶液。在室温下培养2h后，将上述反应溶液低速离心后去除上清液获得沉淀。获得的沉淀经多次洗涤后，重新分散在去离子水中，最终获得自组装的金纳米颗粒溶液。
实施例2
(1)金纳米颗粒的制备：分别将750ul四氯金酸(浓度12mM)、10ul聚乙烯亚胺(分子量10000)以及4.25ml去离子水混合搅拌生成氯金酸水溶液。向氯金酸水溶液中逐滴滴加预先配置好的硼氢化钠溶液(浓度10mM)，观察混合溶液的颜色，直到颜色不再发生变化则停止滴加。(2)丝蛋白溶液的制备：将10g家蚕茧壳清洗干净，置于烧杯中，加入约300ml去离子水，密封完全后放入高压灭菌锅中，高压加热30min，进行脱胶处理。将脱胶后的清洗晾干后在100ml浓度为9mol/l的LiBr溶液中进行溶解，所获得的溶液在去离子水中进行透析，经过3天后获得丝素蛋白溶液。将所获得的丝蛋白溶液进行浓缩，调整其浓度在100–500ug/ml之间，放置在冰箱中备用。(3)丝蛋白对金纳米颗粒自组装的调控：反应之前，将金颗粒混合溶液的pH值调整至5左右，然后加入1.5ml备用的丝蛋白溶液。在室温下培养2h后，将上述反应溶液低速离心后去除上清液获得沉淀。获得的沉淀经多次洗涤后，重新分散在去离子水中，最终获得自组装的金纳米颗粒溶液。
实施例3
(1)金纳米颗粒的制备：分别将150ul四氯金酸(浓度12mM)、2ul聚乙烯亚胺(分子量1800)以及850ul去离子水混合搅拌生成氯金酸水溶液。向氯金酸水溶液中逐滴滴加预先配置好的硼氢化钠溶液(浓度10mM)，观察混合溶液的颜色，直到颜色不再发生变化则停止滴加。(2)丝蛋白溶液的制备：将5g家蚕茧壳在500mL浓度为0.5wt％Na2CO3水溶液煮沸进行脱胶处理，每次30min，重复三次。用清水清洗脱胶蚕丝后并晾干，得到丝素纤维。配制质量分数为50％的CaCl2溶液100ml，将其加热至微沸后加入丝素纤维进行溶解。溶解后的溶液在去离子水中进行透析，经过3天后获得丝素蛋白溶液。将丝蛋白溶液进行浓缩调整至浓度为700-1000ug/ml范围内，放置于冰箱中备用。(3)丝蛋白对金纳米颗粒自组装的调控：反应之前，将金颗粒混合溶液的pH值调整至5左右，然后加入300ul备用的丝蛋白溶液。在室温下培养2h后，将上述反应溶液低速离心后去除上清液获得沉淀。获得的沉淀经多次洗涤后，重新分散在去离子水中，最终获得自组装的金纳米颗粒溶液。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形，除了家蚕丝素蛋白调控以外，家蚕丝胶蛋白、野蚕丝素丝胶蛋白以及蜘蛛丝蛋白对金纳米颗粒的调控都被认为是本发明的范围之内。另外，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)金颗粒的制备：将氯金酸、去离子水以及聚乙烯亚胺(PEI)相互混合反应，再加入还原剂获得金纳米颗粒；
(2)丝蛋白溶液的制备：将家蚕茧壳或者下脚茧丝分别经过脱胶、晾干、溶解、透析、浓缩等步骤，最后获得所需浓度的丝素蛋白溶液；
(3)丝蛋白对金纳米颗粒自组装的调控：将丝蛋白溶液加入到金颗粒溶液中，相互混合，反应一段时间后，离心洗涤提取沉淀，即可得到自组装的金纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的氯金酸为四氯金酸水合物溶液。
3.根据权利要求2所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述的四氯金酸水合物溶液是四氯金酸四水或四氯金酸三水。
4.根据权利要求1或2或3所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的聚乙烯亚胺(PEI)是PEI600或PEI1800。
5.根据权利要求4所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述的还原剂可为抗坏血酸、柠檬酸三钠和硼氢化钠中的一种或多种。
6.根据权利要求1或5所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的丝蛋白浓度可调整在100ug/ml-1000ug/ml的范围内。
7.根据权利要求1所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的丝蛋白溶液往往在制备后经过一段时间再用于金颗粒的调控。
8.根据权利要求1所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的金颗粒混合溶液在与丝蛋白溶液反应之间，将其pH值调整到pH4-6的范围之内。
9.根据权利要求1或2或3或5或7或8所述的利用丝素蛋白调控金纳米颗粒自组装的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的离心选择低速离心，通常在rpm3000-rpm5000范围内。
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