CN110628760A - 一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法。该制备方法简单，无需再进行生长磁核，包硅再表面修饰等步骤；制备的纳米磁珠比表面积大，磁响应快，表面电荷丰富，表面亲水性强，悬浮性好。通过这种方法制备出来的磁珠用于核酸提取扩增过程中可以实现一步完成，无需清洗和洗脱两个步骤，减少了操作的繁琐程序并能有效提高反应的效率。本发明工艺流程简单，操作简便，适于批量化生产，可广泛推广应用。

Description

一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法
技术领域
本发明属于磁性纳米材料，具体涉及一种一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法。
背景技术
基因精准快检技术在临床，POCT(即时检测)、现场检测等领域有着广泛的应用前景，限制该技术应用的关键问题是核酸的特异性快速提取。目前的核酸提取过程操作复杂、特异性低，无法满足基因精准快检技术的需求。在各种提取技术中，磁珠提取技术应用范围最为广泛，应用前景也最为广阔。现代分子生物学和医学对高通量，高灵敏度，自动化操作的需求与日俱增，磁珠法核酸提取技术由此得到了大力发展。
而传统的磁珠的制备方法较为复杂，常规步骤大致分为以下三个步骤：首先合成四氧化三铁磁性颗粒，然后在四氧化三铁颗粒外面生长一定厚度的二氧化硅，最后在二氧化硅表面进行修饰，使之表面带上满足下一步核酸提取所需各种基团。此过程步骤繁多，操作麻烦，且反应需要较长的时间。用这种方法合成的磁珠在用于DNA提取时需要结合、孵育、至少两次以上清洗、富集等多个步骤才能进入下一步的检测，磁珠往往也因其影响后期反应的进行而不能跟随样本DNA进入扩增阶段，需要在此之前加入高盐溶液洗脱使目标DNA与磁珠脱落，并进一步清洗去除杂质，过程繁琐，程序复杂，并不能真正减少 DNA提取过程的工作量或有效提高DNA提取效率。因此，如何实现一步法高效提取目标DNA用的磁性纳米颗粒的快速制备，在所有分子诊断领域，如遗传病、慢性病、传染病、司法鉴定、转基因食品检测等等，具有里程碑似的重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法，其工艺流程简单，操作简便，适于批量化生产，可广泛推广应用；通过这种方法制备出来的磁珠用于核酸提取扩增过程中可以实现一步法完成，无需清洗和洗脱两个步骤，减少了操作的繁琐程序并能有效提高反应的效率。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法，包括以下步骤：
1)将氯化铁溶于乙二醇中，超声振荡5～15min，使之完全溶解为黄色澄清溶液；
2)将步骤1)得到的溶液，水浴70℃条件下加入醋酸钠和PBMD (PFd-G4-Acetylene-NH)，剧烈搅拌25～40min；
3)将步骤2)中的反应液转移到高温反应釜，120～150℃条件下放置过夜；
4)磁力收集生成产物，用去离子水和乙醇反复清洗，保存在乙醇溶液中。
具体的，氯化铁的质量与乙二醇的体积比为：1～1.5g：(20～25)mL。
具体的，氯化铁、醋酸钠和PBMD的质量比为1～1.5：2～3：1。
本发明还提供一种上述任一种方法制得的免洗免脱纳米磁珠在核酸提取中的应用，包括以下步骤：
1)取样品溶于水中，混匀，加入磁珠，室温震荡孵育0～30min；
2)对上述步骤1)中的混合溶液涡旋，磁富集，弃上清，得到磁珠-核酸复合物；
3)将磁珠-核酸复合物直接加入PCR反应体系中，进行扩增。
具体的，所述磁珠为超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒，大小在50～500nm之间，经过超声、重悬等处理。
具体的，所述核酸为RNA或DNA。
具体的，当核酸与磁珠接触后，磁珠-核酸复合物扩增前，不对磁珠进行任何的洗涤或洗脱的处理步骤。
具体的，所述样品为血液样品，包括血清或血浆或两者的混合物。
具体的，所述步骤1)中取浓度为5mg/mL的磁珠5～40uL加到 100～200uL血液样品中。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明方法制备的纳米磁珠无需进行磁核生长、包硅和修饰等步骤，一步完成，即可实现纳米磁珠对核酸的有效提取，新颖独特，整个过程无需有毒试剂绿色环保，条件温和(一般磁珠制备方法需200℃的高温)，制备产率高。
(2)本发明方法制备的纳米磁珠比表面积大，磁响应快，表面电荷丰富，悬浮性好，磁珠表面功能化，可以特异性地与核酸分子结合，从而实现复杂样本核酸在磁珠表面的富集，通过外加磁场，分离得到高纯度核酸样本。
(3)本发明方法解决了现有磁珠合成手段复杂，同时由于磁珠合成及核酸提取条件温和，核酸结合特异性强，避免了非特异性的干扰，因此磁珠生物相容性高，适用于PCR直接扩增，克服了传统磁分离核酸提取步骤中磁珠在下一步扩增反应前必须洗脱的问题，极大的提高了工作的效率，操作更简单，更适于全自动高通量作业。
附图说明
图1为采用本发明方法对检测丙肝病毒的RT-PCR图；
图2为采用本发明方法对检测乙肝病毒的RT-PCR图；
图3为采用本发明方法检测乙肝病毒时洗与免洗的RT-PCR图对比。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1一步法核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的制备
1)将1g氯化铁溶于20mL乙二醇中，超声15min；
2)待氯化铁完全溶解后，水浴70℃条件下加入2克醋酸钠和1g PBMD(PFd-G4-Acetylene-NH)，剧烈搅拌30min；
3)反应液转移到高温反应釜，150℃条件下放置一晚上；
4)磁力收集生成的磁珠产物，并用水和乙醇清洗，保存在5mL 乙醇溶液中。
制得的磁珠大小为50nm。产率为85％，Zeta电位为-30mV±1.2 mV，在乙醇溶液中所制磁珠在5h内不聚沉。
实施例2一步法核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的制备
1)将1g氯化铁溶于25mL乙二醇中，超声15min；
2)待氯化铁完全溶解后，水浴70℃条件下加入2克醋酸钠和1g PBMD(PFd-G4-Acetylene-NH)，剧烈搅拌30min；
3)反应液转移到高温反应釜，120℃条件下放置一晚上；
4)磁力收集生成的磁珠产物，并用水和乙醇清洗，保存在5mL 乙醇溶液中。
制得的磁珠大小为200nm。产率为90％，Zeta电位为-32mV± 1.5mV，在乙醇溶液中所制磁珠在5h内不聚沉。
实施例3一步法核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的制备
1)将1.5g氯化铁溶于20mL乙二醇中，超声15min；
2)待氯化铁完全溶解后，水浴70℃条件下加入2克醋酸钠和1g PBMD(PFd-G4-Acetylene-NH)，剧烈搅拌30min；
3)反应液转移到高温反应釜，150℃条件下放置一晚上；
4)磁力收集生成的磁珠产物，并用水和乙醇清洗，保存在5mL 乙醇溶液中。
制得的磁珠大小为500nm。产率为92％，Zeta电位为-36mV± 1.8mV，在乙醇溶液中所制磁珠在5h内不聚沉。
利用上述实施例得到的纳米磁珠进行核酸提取，借此验证本发明的有益效果，具体方法见实施例4、实施例5和实施例6。
实施例4病毒RNA的提取
本发明在应用于RNA提取时，所用的所有试剂都要用千分之一 DEPC处理的超纯水配制，所有耗材都要求无RNA酶污染。
1)室温放置各组分，待其升温至室温平衡，待用。
2)取200uL血清样本(含有0-1ng丙肝核酸标准品)于1.5ml 的离心管中，加入400uL提取液及一定量的磁珠母液，室温振荡混匀孵育12min。
3)磁吸2min，弃上清。
4)加入50uL PCR mix(聚合酶，引物，脱氧核糖核苷三磷酸，镁离子，PCR缓冲液，Evagreen等)，重悬并转移至八连管中，PCR 扩增。
5)RT-RCR检测。
通过RT-PCR结果分析，见附图1，本发明合成的磁珠能够吸附检测低至0.01ngRNA，同时具有良好的线性检测区间(0.01～1ng)，从而验证了本方法优秀适应性。
实施例5病毒DNA提取
1)室温放置各组分，待其升温至室温平衡，待用。
2)取200uL血清样本(含有0-1ng乙肝核酸标准品)溶于300uL 水中，混匀，加入一定量超声分散的磁珠母液，室温震荡浮育0～30 min。
3)磁吸2min，弃上清。
4)加入50uL PCR mix(配方不同引物，脱氧核糖核苷三磷酸，镁离子，PCR缓冲液，Gelgreen)重悬。
(6)RT-RCR检测。
如附图2所示，随着RNA浓度增强，Ct值逐渐减小，充分证明本方法有着良好的线性响应。当RNA低至0.01ng时，仍有较高信号检出，说明本方法对RNA有着较低检测线。
实施例6
为了进一步验证本方法的独有特性-免洗，我们进行了新的一组对照试验。磁珠富集核酸后，进行洗涤步骤，然后磁珠核酸复合物进行RT-PCR扩增和实时监测。如附图3所示，洗涤前后磁珠具有近似的检测区间和灵敏度，这充分说明，洗涤对整个检测体系影响甚微，本方法具有其他方法不具备的免洗优点。

Claims (9)

1.一种一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将氯化铁溶于乙二醇中，超声振荡5～15min，使之完全溶解为黄色澄清溶液；
2)将步骤1)得到的溶液，水浴70℃条件下加入醋酸钠和PBMD(PFd-G4-Acetylene-NH)，剧烈搅拌25～40min；
3)将步骤2)中的反应液转移到高温反应釜，120～150℃条件下放置过夜；
4)磁力收集步骤3)的生成产物，用去离子水和乙醇反复清洗，保存在乙醇溶液中。
2.根据权利要求1所述的一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法，其特征在于：所述氯化铁的质量与乙二醇的体积比为：1～1.5g：(20～25)mL。
3.根据权利要求1所述的一步法合成核酸提取用免洗免脱纳米磁珠的方法，其特征在于：所述氯化铁、醋酸钠和PBMD的质量比为1～1.5：2～3：1。
4.一种如权利要求1～3所述的任一种免洗免脱纳米磁珠在核酸提取中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
1)取样品溶于水中，混匀，加入磁珠，室温震荡孵育0～30min；
2)对上述步骤1)中的混合溶液涡旋，磁富集，弃上清，得到磁珠-核酸复合物；
3)将磁珠-核酸复合物直接加入PCR反应体系中，进行扩增。
5.根据权利要求4所述的免洗免脱纳米磁珠在核酸提取中的应用，其特征在于：所述磁珠为超顺磁性四氧化三铁磁性颗粒，大小在50～500nm之间。
6.根据权利要求4所述的免洗免脱纳米磁珠在核酸提取中的应用，其特征在于：所述核酸为RNA或DNA。
7.根据权利要求4所述的免洗免脱纳米磁珠在核酸提取中的应用，其特征在于：当核酸与磁珠接触后，磁珠-核酸复合物扩增前，不对磁珠进行任何的洗涤或洗脱的处理步骤。
8.根据权利要求4所述的免洗免脱纳米磁珠在核酸提取中的应用，其特征在于：所述样品为血液样品，为血清或血浆或两者的混合物。
9.根据权利要求4所述的免洗免脱纳米磁珠在核酸提取中的应用，其特征在于：所述步骤1)中取浓度为5mg/mL的磁珠5～40uL加到100～200uL血液样品中。
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