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Gegenstand der Erfindung ist ein universelles und stark vereinfachtes Verfahren zur Isolierung von Plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten, das sowohl eine sehr hohe Qualität der zu isolierenden Nukleinsäuren garantiert als auch die Isolierung quantitativer Ausbeuten ermöglicht und darüber hinaus deutlich weniger manuellen und zeitlichen Aufwand in Anspruch nimmt.
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Unter klassischen Bedingungen erfolgt die Isolierung von DNA aus Zellen und Geweben dadurch, dass die Nukleinsäuren enthaltenden Ausgangsmaterialien unter stark denaturierenden und reduzierenden Bedingungen, teilweise auch unter Verwendung von proteinabbauenden Enzymen, aufgeschlossen, die austretenden Nukleinsäurefraktionen über Phenol-/Chloroform-Extraktionsschritte gereinigt und die Nukleinsäuren mittels Dialyse oder Ethanolpräzipitation aus der wässrigen Phase gewonnen werden (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., 1989, CSH, ”Molecular Cloning”).
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Diese ”klassischen Verfahren” zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen und besonders aus Geweben sind sehr zeitaufwendig (teilweise länger als 48 h), erfordern einen erheblichen apparativen Aufwand und sind darüber hinaus auch nicht unter Feldbedingungen realisierbar. Außerdem sind solche Methoden aufgrund der verwendeten Chemikalien wie Phenol und Chloroform in einem nicht geringen Maße gesundheitsgefährdend.
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Verschiedene alternative Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen biologischen Ausgangsmaterialien ermöglichen, die aufwendige und gesundheitsschädigende Phenol-/Chloroform-Extraktion von Nukleinsäuren zu umgehen sowie eine Reduzierung der zeitlichen Aufwendungen zu erreichen.
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Alle diese Verfahren basieren auf einer von Vogelstein und Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615–619) entwickelten und erstmals beschriebenen Methode zur präparativen und analytischen Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen. Die Methode kombiniert die Auflösung der die zu isolierende DNA-Bande enthaltende Agarose in einer gesättigten Lösung eines chaotropen Salzes (NaJ) mit einer Bindung der DNA an Glaspartikel. Die an die Glaspartikel fixierte DNA wird anschließend mit einer Waschlösung (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v Ethanol) gewaschen und danach von den Trägerpartikeln abgelöst.
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Diese Methode erfuhr bis heute eine Reihe von Modifikationen und wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt für unterschiedliche Verfahren der Extraktion und Reinigung von Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Herkünften, insbesondere auch für die Isolierung von Plasmid DNA, angewendet (Marko, M. A., Chipperfield, R. und Birnboim, H. G., 1982, Anal. Biochem., 121, 382–387).
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Für die Isolierung von Plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten gelten allerdings einige Besonderheiten.
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Plasmide sind doppelsträngige DNA Moleküle, welche in 3 Konformationen vorliegen können. Die Supercoil Form (geschlossene zirkuläre Form) ist die natürliche Konformation des Plasmids. Da die DNA-Doppelhelix um sich selber gewunden ist und sich in einem geschlossenen Plasmid nicht entwinden kann, entsteht eine Torsionsspannung, wodurch sich das Plasmid im Raum um sich selbst krümmt. Bei der offenkettigen Form (offene zirkuläre Form) ist einer der beiden DNA-Stränge an einer Stelle gebrochen, wodurch sich der offene Strang frei um den fixierten drehen kann, dadurch entspannt sich die Torsionspannung, das Plasmid liegt offen vor. Bei der linearen DNA sind beide Stränge gebrochen, die Kreisstruktur ist aufgehoben. Wesentlich für die Isolierung von Plasmid DNA für molekularbiologische Anwendungen ist dabei, dass möglichst nur die Supercoil Form isoliert werden soll.
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Eine weitere Anforderung besteht darin, dass die zu isolierende Plasmid DNA frei von Kontaminationen mit chromosomaler DNA und RNA sowie von weiteren zellulären Bestandteilen sein muss, da diese zellulären Bestandteile ebenfalls in den aufzuarbeitenden Bakterienzellen präsent sind.
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Die Isolierung von Plasmid DNA umfasst zur Zeit die Schritte der Anzucht und Lyse von Bakterien und die nachfolgende Reinigung der freigesetzten Plasmid DNA. Die Reinigung der Plasmid DNA kann dabei auf verschiedenen Wegen erfolgen und folgt dabei dem schon aufgeführten Stand der Technik. Bewährt hat sich auf Grund der relativen Einfachheit und der hervorragenden Qualität der Plasmid DNA eine Modifikation der klassischen sog. alkalischen Lyse Methode (Birnboim und Doly; 1979). Nach Resuspendierung der nach Anzucht gewonnenen Bakterienzellen in einem Puffer (z. B. 10 mM Tris; EDTA; RNase A), folgt die Lyse der Bakterienzellen unter alkalischen Konditionen in Gegenwart von NaOH und SDS. Die Entfernung der zellularen Komponenten, wie die chromosomale DNA oder die bakteriellen Proteine, wird nachfolgend dadurch erreicht, dass man dem Lyseansatz eine sog. Neutralisationslösung (z. B. eines sauren Puffers auf der Basis von Natrium- oder Kaliumacetat; pH 4.0–5.5) zugibt. Diese Komponenten bewirken das sichtbare Ausfällen der bakteriellen Proteine wie auch der chromosomalen DNA. Mittels nachfolgender Zentrifugation wird dann ein klarer Überstand gewonnen. Dieser Überstand enthält die zu isolierende Plasmid DNA. Die finale Aufreinigung der Plasmid DNA kann jetzt z. B. mittels klassischer Alkoholpräzipitation erfolgen.
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Sehr viel einfacher und schneller arbeiten Verfahren, die darauf basieren, dass man neben dem obligaten Natriumacetat oder Kaliumacetat auch noch eine chaotrope Salzkomponente für die Neutralisationsreaktion nach durchgeführter Bakterien-Lyse einsetzt und den klaren Überstand nachfolgend mit einem Trägermaterial auf der Basis von Glas oder Silica in Kontakt bringt. Durch das Vorhandensein einer chaotropen Komponente erfolgt dann die Bindung der Plasmid DNA an das eingesetzte Trägermaterial. Die gebundene Plasmid DNA wird in an sich bekannter Weise mit einem Alkohol-Salzgemisch gewaschen und final durch Zugabe von Wasser oder eines Niedrigsalzpuffers wieder vom Trägermaterial abgelöst. Die Plasmid DNA kann jetzt für eine Vielzahl von molekularbiologischen Methoden eingesetzt werden. Diese Methode ist die zur Zeit am häufigsten eingesetzte Variante der Isolierung von Plasmid DNA im sog. „Mini-Format” (Plasmid Mini Präp). Weitere Methoden zur Isolierung von Plasmid DNA basieren auf der Verwendung von chromatographischen Materialien zur Bindung der Plasmid DNA (z. B. Anionenaustauscher).
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Aber auch bei diesen Verfahren erfolgt die Gewinnung der Plasmid DNA (
WO99/61603 A1 ) in der Regel aus klar zentrifugierten oder filtrierten Überständen nach Präzipitation der chromosomalen DNA und der Proteine nach dem schon beschriebenen Verfahren der alkalischen Lyse.
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung bestand darin, das Verfahren der Isolierung von Plasmid DNA deutlich zu vereinfachen, insbesondere durch die Reduktion von Verfahrensschritten. Insbesondere der Schritt der Präzipitation der chromosomalen DNA und der Proteine sollte nicht mehr Bestandteil der Plasmid DNA Isolierung sein.
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Ein solches Verfahren ist Gegenstand der Offenlegungsschrift
WO99/61603 A1 . Das Verfahren beschreibt die Isolierung von Plasmid DNA, auch unter Umgehung der bisher notwendigen Präzipitation der chromosomalen DNA und der Proteine und deren nachfolgende Entfernung mittels eines Zentrifugations- oder Filtrationsschrittes. Die Separation von Plasmid DNA, ohne vorhergehende Präzipitation chromosomaler DNA und bakterieller Proteine, wird dadurch erreicht, dass man – nach Resuspendierung der Bakterienzellen und nachfolgender Zelllyse mittels NaOH/SDS – die Mixtur durch Zugabe eines Puffers auf einen pH Wert von > 8 einstellt. Dies bedeutet den Verzicht auf die bisher übliche Neutralisationsreaktion durch die Verwendung eines sauren Puffers auf der Basis von Natriumacetat oder Kaliumacetat. Allerdings wird auch schon in der Offenlegungsschrift
DE 102 22 133 A1 darauf hingewiesen, dass man ohne eine Neutralisationsreaktion und bei einem basischen pH-Wert Plasmid DNA isolieren kann.
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Die in der Offenlegungsschrift
WO99/61603 A1 dargestellte Erfindung bedient sich eines neuartigen Puffers, welcher mindestens eine chaotrope Substanz enthält und der pH Wert des Puffers durch eine weitere essentielle Komponente in Form einer amphoteren Substanz, z. B. einer Omega Aminosäure, auf 8–12 einstellt wird. Nach Zugabe dieses Puffers zum klassischen SDS/NaOH basierten Lyseansatz und der dadurch realisierten Einstellung eines pH-Wertes von > 8 wird der Ansatz dann mit einem Silica-Material in Kontakt gebracht, an das nun spezifisch die Plasmid DNA, nicht aber andere zelluläre Bestandteile des Lysates, adsorbieren. Die trägergebundene Plasmid DNA wird nachfolgend in an sich bekannter Weise gewaschen und final durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers oder durch Zugabe von Wasser eluiert. Die Isolierung von Plasmid DNA ohne den bisher immer benötigten Schritt der Präzipitation chromosomaler DNA und Proteine soll insbesondere dadurch möglich geworden sein, dass Plasmid DNA (zirkulär geschlossene Plasmid DNA), nicht aber chromosomale DNA, in Gegenwart hoher Konzentrationen chaotroper Salze und einem alkalischen pH-Wert selektiv an eine Silica Matrix binden. Die angegebenen Konzentrationen chaotroper Salze, insbesondere hier das chaotrope Salz Natriumthiocyanat, betragen 6–9 M.
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In der zitierten Offenlegungsschrift ist damit ein neuer Wissenstand formuliert, der es ermöglicht, Plasmid DNA einfacher zu isolieren, indem der bisher obligaten Schritte der Abtrennung anderer zellulären Komponenten nicht mehr benötigt und die Plasmid DNA Isolierung direkt aus dem Zelllysat ermöglicht wird, wenn nach Zelllyse durch Zugabe des neuartigen Puffers der pH Wert der Lösung auf > 8 eingestellt wird. Dabei liegt das Wissen zugrunde, dass bei einem alkalischen pH Wert > 8 in Gegenwart hoher Konzentrationen chaotroper Salze lediglich die zirkuläre Plasmid DNA, nicht aber andere Nukleinsäure Spezies an das mineralische Trägermaterial binden. Aus diesem Grund benötigt das Verfahren einen präzise eingestellten pH Wert von > 8, welcher durch die Verwendung des beschriebenen Puffers mit einer amphoteren Komponente erreicht werden soll. Diese alkalischen Bindungskonditionen ermöglichen die Isolierung von Plasmid DNA aus einem Gemisch an unterschiedlichen Nukleinsäuren ohne eine Präzipitation der zellulären Komponenten direkt nach erfolgter Lyse.
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Aus der Offenlegungsschrift
WO 03/040 364 A1 ist ein Verfahren zur Isolierung von Plasmid DNA bekannt, bei dem nach alkalischer Lyse die resultierende Reaktionsmischung mit beispielsweise Natriumacetat neutralisiert und in Gegenwart von Ethanol oder Isopropanol mit einer Silica-Matrix in Kontakt gebracht wird und die an die Matrixgebundene Nukleinsaure isoliert und mit einem Waschpuffer gewaschen wird. Der pH-Wert für die Anbindung der Plasmid DNA liegt bei 5,5. Keinesfalls erfolgt die Anbindung der Plasmid-DNA bei einem pH-Wert unter 5.
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Ausgehend vom Stand der Technik lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Isolierung von Plasmid DNA weiter zu vereinfachen.
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Die Aufgabe wurde – gemäß den Merkmalen der Patentansprüche – gelöst.
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Überraschenderweise zeigt sich, dass die Isolierung von Plasmid DNA – ebenfalls unter Umgehung der Präzipitation der chromosomalen DNA und bakterieller Proteine – noch viel einfacher möglich ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt, dass nach Resuspendierung von Bakterienzellen und nachfolgender Zelllyse mit an sich bekannten Puffern eine selektive Adsorption von Plasmid DNA an ein eingesetztes mineralisches Trägermaterial (z. B. ein Glasfasermaterial) auch bei sauren pH-Werten zwischen 4 und 5 effizient erfolgt, wenn man zusätzlich noch eine alkoholische Komponente in den Bindungspuffer integriert. Dies ist umso unerwarteter, als dass – wie schon aufgeführt – eine solche selektive Adsorption nur bei pH-Werten > 8 erfolgen sollte. Darüber hinaus ist dem Fachmann aus einer Vielzahl an Patentschriften zusätzlich bekannt, dass viele Verfahren gerade der Isolierung chromosomaler DNA sich Bindungspuffern bedienen, welche immer eine Kombination von Salz und Alkohol darstellen. Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt aber gerade, dass unter den gefundenen Bedingungen eines sauren bis neutralen pH-Wertes eben nicht die chromosomale DNA, wohl aber hoch effizient die Plasmid DNA an ein mineralisches Trägermaterial bindet, obwohl sowohl Plasmid DNA als auch chromosomale DNA und bakterielle Proteine gleichzeitig vorliegen.
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Es zeigt sich auch, dass für eine selektive Adsorbtion von zirkulärer Plasmid DNA an ein mineralisches Trägermaterial nicht zwingend hohe Konzentrationen chaotroper Salze notwendig sind als auch die für die Anbindung der Plasmid DNA benötigte Konzentration an anderen Salzen nicht in einem hochmolaren Bereich liegen muss. Im Unterschied zu der zitierten Patentanmeldungen reichen schon Ionenstärken an Salzen von 0.5 M aus, eine effiziente Bindung von Plasmid DNA an mineralische Träger zu erzielen. Für das erfindungsgemäße Verfahren ist wesentlich, die Bindungsbedingungen für eine selektive Adsorption von Plasmid DNA mit einem Puffer einzustellen, welcher aus einem Salz und einem Alkohol besteht, wobei der pH Wert eines solchen Puffers im sauren Bereich liegt, was bedeutet, dass final für eine selektive Adsorption von Plasmid DNA ein pH-Wert zwischen 4 und 5 realisiert wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sich somit prinzipiell den an sich bekannten Lösungen, welche in klassischen Verfahren zur Isolierung von Plasmid DNA eingesetzt werden, bedienen, mit der Besonderheit, dass lediglich eine alkoholische Komponente Bestandteil des Bindungspuffers sein muss. Die Verwendung eines solchen Puffers verhindert auch effizient eine Präzipitation der zellulären Komponenten. Der große Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt sich damit ebenfalls in der nicht mehr notwendigen Präzipitation der chromosomalen DNA und der bakteriellen Proteine, dies aber basierend auf einem Puffer, welcher im Gegensatz zur oben zitierten Patentschrift
WO99/61603 A1 , nicht im basischen sondern im sauren Milieu wirkt. Das erfindungsgemäße Verfahren bedeutet durch den Wegfall der obligaten Zentrifugation oder Filtration zur Entfernung zellulärer Komponenten einen erheblichen zeitlichen Vorteil und reduziert die bisher benötigten Verfahrensschritte. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren durch den geringen Chemikalieneinsatz als auch in der Einfachheit der Pufferzusammensetzungen deutlich vorteilhafter als das Verfahren, welches in der Offenlegungsschrift
WO99/61603 A1 beschrieben wird. Interessant ist auch, dass die Kombination eines Salzes mit einem Alkohol im Bindungspuffer auch davon abhängt, welcher Alkohol eingesetzt wird, dies insbesondere in Hinblick auf die Realisierung quantitativer Extraktionsausbeuten.
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So zeigen sowohl Ethanol als auch Isopropanol gute Ergebnisse in der Plasmid DNA Isolierung. Am günstigsten dagegen ist der Einsatz von 1-Propanol für die Isolierung von Plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Als effiziente Salze haben sich z. B. Natriumacetat oder Kaliumacetat in Kombination mit einem Alkohol erwiesen. Darüber hinaus eignen sich aber auch Kombinationen von Natriumacetat oder Kaliumacetat mit einem chaotropen Salz, z. B. Guanidinhydrochlorid oder Guanidinthiocyanat in Kombination mit einem Alkohol, wobei bei allen Varianten die für eine effiziente Anbindung der Plasmid DNA an ein Glassfasermaterial final vorliegenden pH-Werte zwischen 4 und 5 liegen. Insbesondere die Kombination von 1-Propanol und Kaliumacetat führt zu sehr hohen quantitativen Ausbeuten an Plasmid DNA, wobei die finale Konzentration der beiden Komponenten dann nur noch in einem Bereich von ca. 0.5 M, bezogen auf Kaliumacetat und ca. 40% bezogen auf 1-Propanol, liegt. Damit ist die für eine effiziente Isolierung von Plasmid DNA benötigte Salzkonzentration mindestens um den Faktor 10 geringer, als dies die Schrift
WO99/61603 A1 darlegt. Dies bedeutet eine nicht unerhebliche Kostenreduktion sowie einen deutlichen Vorteil, was die nachfolgenden notwendigen Schritte der Salzentfernung betrifft. Nach der selektiven Bindung der Plasmid DNA an ein mineralisches Trägermaterial wird das Trägermaterial mit einem dem Fachmann bekannten Waschpuffer, z. B. auf der Basis eines Alkohol-Salz-Gemisches, gewaschen. Die finale Desorption der gebundenen Plasmid DNA erfolgt mittels Wassers oder mittels eines Niedrigsalzpuffers.
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Zusammenfassend ist das erfindungsgemäße Verfahren zur schnellen Isolierung von Plasmid durch folgende Schritte gekennzeichnet:
- 1. Resuspendierung eines Bakterienpellets in einem Standardpuffer
- 2. Lyse der Bakterienzellen mit einem Standardpuffer (z. B. SDS/NaOH) oder enzymatisch mittels Lysozym
- 3. Mischen des Lyseansatzes mit einem Bindungspuffer auf der Basis eines Salz-Alkohol-Gemisches mit saurem pH-Wert, so dass der pH-Wert nach Mischen mit dem Lysepuffer einen pH-Wert zwischen 4 und 5 aufweist
- 4. Ansatz mit einem mineralischen Trägermaterial in Kontakt bringen z. B. durch die Zentrifugation des Ansatzes über eine Zentrifugationssäule mit eingelegtem Glassfaservlies
- 5. Waschen der gebundenen Plasmid DNA mit alkoholhaltigen Waschpuffern
- 6. Elution der Plasmid DNA mittels eins Niedrigsalzpuffers
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Der gesamte Prozess der Isolierung von Plasmid DNA aus bakteriellen Lysaten benötigt nur ca. 5–6 min und ist damit deutlich schneller als die bisher eingesetzten Verfahren.
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Gegenstand der Erfindung ist auch eine Kit zur Isolierung von Plasmid DNA gemäß Anspruch 7.
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Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels erläutert werden, wobei das Ausführungsbeispiel keine Limitierung der Erfindung darstellt.
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Ausführungsbeispiel
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Isolierung von Plasmid DNA mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Nutzung von drei verschiedenen Bindungspuffern
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2 ml einer bakteriellen Übernachtkultur wurden zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Bakterienpellet wurde in 150 μl Resuspensionspuffer (50 mM tris HCl, 1 mM EDTA, RNase A) resuspendiert. Nach Resuspendierung erfolgte die Zugabe von 150 μl, Lysepuffer (0.1% SDS/0.1 N NaOH). Das Gefäß wurde viermal konvertiert und mit 500 μl von drei verschiedenen Bindungspuffern (Bindungspuffer 1–3) versetzt, der Ansatz mittels einer Pipette gemischt und nachfolgend auf eine Spin Filtersäule mit einem Glasfaservlies überführt. Nach Zentrifugation für 1 min wurde das Filtrat verworfen und die Spin Filtersäule mit einem ersten Waschpuffer (Tris HCl, NaCl, Ethanol) mittels Zentrifugation für 1 min gewaschen. Danach folgte ein weiterer Waschschritt und nachfolgend ein kurzes Trockenzentrifugieren der Spin Filtersäule für 2 min. Die finale Elution der Plasmid DNA erfolgte durch Zugabe von 50 μl Elutionspuffer (10 mM Tris HCl). und nachfolgender Zentrifugation für 1 min. Die isolierte Plasmid DNA wurde nachfolgend zur Visualisierung gelelektrophoretisch aufgetrennt (1, TAE Agarosegel; Ethidiumbromid gefärbt). 1 zeigt eine gelelektrophoretische Darstellung der isolierten Plasmid DNA. In der gelelektrophoretischen Darstellung sind die für ein Plasmid typischen Bandenmuster zu sehen, wobei die gewünschte CC-Form des Plasmides die stärkste Intensität zeigt.
Bindungspuffer 1: 0.9 M Kaliumacetat; pH 5.2, 70% v/v 1-Propanol
Bindungspuffer 2: 1.2 M Kaliumacetat; pH 5.2, 60% v/v 1-Propanol
Bindungspuffer 3: 0.2 M Natriumacetat; pH 4, 2.4 M Guanidinhydrochlorid, 50% Ethanol
