JPH05508658A - 核酸の抽出に有用な非腐食性組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の抽出に有用な非腐食性組成物および方法発明の背景 この出願は１９９０年７月１３日に８願の米国出願事０７１５５２．７４５号の 一部継続出願である。

発明の分野 本発明は、核酸の抽出およびハイブリッド形成のための組成物およびアッセイ方 法に関する。本発明は特に、毒性化合物、例えばフェノールおよび／またはクロ ロホルムを使用せずに、主としてベンジルアルコールまたはベンジルアルコール 誘導体の使用を通して、複雑な生物学的試料または検体中の細胞から核酸を抽出 する方法に関する。本明細書中に記載される新規組成物および方法は、核酸の抽 出と精製に非常に有効である。

関連技術の簡単な説明 原核もしくは真核細胞からまたは複雑な生物学的試料から核酸を単離するために 用いる技術において、フェノールやクロロホルムといった有機溶媒が伝統的に使 われている。核酸の単離は、典型的には、プロテアーゼを使って行われる酵素消 化で始まり、イオン性洗剤を使った細胞溶解、次いでフェノールまたはフェノー ル／クロロホルム混合物による抽出と続く。有機相と水相を分離し、水相中に分 配された核酸をアルコールでの沈澱によって回収する。しかしながら、フェノー ルまたはフェノール／クロロホルム混合物はヒトの皮膚に対して腐食性であり、 危険廃棄物と見なされるため、注意深く取扱い適切に捨てなければならない。更 に、この抽８法は時間がかかり面倒である。Ｍａｒｍｕｒ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　３：２０８−２１８　（１９６１）は、酵素処理、洗剤の添加、お よびフェノールまたはフェノール／クロロホルムといった有機溶媒の使用による 、原核生物からの完全な高トと２−メルカプトエタノール中でのホモジナイズ後 のエタノール沈澱または塩化セシウムを通した沈降による、リボヌクレアーゼが 豊富な組織からの完全なＲＮＡの単離を記載している。

更に、主としてカオトロピック塩がヌクレアーゼとプロテアーゼを阻害するとい う事実のため、カオトロピック剤、例えばグアニジニウムチオシアネー）　（Ｇ ｎＳＣＮ）が細胞から溶液中に核酸を溶解しそして遊離させるために広範に使わ れている。しかしながら、そのように高いモル濃度の塩を使用するとすれば、そ れらのカオトロピック剤とイオン性洗剤とが不相溶でありモして水相中への核酸 の容易な分配が不可能であるため、それらのカオトロピック塩溶液から核酸を単 離するのは困難であると判明した。

核酸単離作業の間ヌクレアーゼを効果的に阻害できることが最高であり、特に出 発材料が複雑なもの、例えば排泄物または血液である時は特にそうである。１９ ５９年にＢｒｏｗｎｈｉｌｌ　らはベントナイトがヌイルスを精製する作業中リ ボヌクレアーゼを阻害するためのベントナイトの使用方法を開発した（Ｆｒａｅ ｎｋｅｌ−Ｃｏｎｒａｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１４：５４−５８　（１９６１ ））。その後の研究者らは、ＲＮＡの単離の間にリボヌクレアーゼ活性を低下さ せる際のフェノールおよびクロロホルムとＢｉｏＣｈｅｍ、５１：１５５８−１ ５６５　（１９７３）　：　Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、８ ７：５０６−５２０　（１９７８）　＋　Ｇｒａｄｙら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、１０１：１１８−１２２　（１９８０）　）。

ＤＮアーゼＩとα−アミラーゼはベントナイトでの処理によりＲＮアーゼ不含有 にすることができることも報告されているＣＧａｒｒｅｔｔら、Ａｎａｌ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　５２：３４２−３４８　（１９７３））。

上記の伝統的な核酸抽出法は全て、フェノールおよび／またはクロロホルムとい った毒性化合物の使用を必要とする。研究者らは長期に渡り安全で且つ効率的な 抽出法を捜しめている。

発明の要約 本発明は、核酸の抽出のための安全で且つ効率的な方法に関する。

特に、核酸と他の生物学的化合物との混合物を含有する試料から核酸を単離する 方法が記載される。該方法では、少なくとも１種の有機化合物、例えばベンジル アルコールまたはベンジルアルコール誘導体を含む抽出溶液と試料とを混合し、 水相と非水相を形成させる。

核酸は水相から単離される。好ましくは、生じた混合溶液は、下記に定義される ように、ベントナイトまたはマカロイド（Ｍａｃａｌｏｉｄ）も含有する。典型 的には、試料は抽出前にまず溶解剤と混合されるだろう。好ましい溶解剤はカオ トロピック塩、例えばグアニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣＩ）およびグアニジニウ ムイソチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）である。

上記の抽出溶液は、有利にはラクタム、例えばシクロへキシルピロリドン、ドデ シルピロリドン、ヒドロキシエチルピロリドン、オクチルピロリドン、１−フェ ニル−２−ピロリドン、および１．　３−ジメチル−３，４，５，６−チトラヒ ドロー２−（Ｈ）−ピロリドンとも組み合わせることができる。

一旦核酸が水相中に分離されれば、それをアルコールで、好ましくはエタノール もしくはイソプロパツールで沈澱させるか、またはブタノールで濃縮することが できる。水相をハイブリッド形成アッセイに直接用いることもでき、またはその 後の探査のため固体支持体上に固定化することもできる。

本発明で使われる有機化合物は非常に低度の毒性のものであり、ヒト組織に対し て非腐食性である。それらはフェノールまたはフェノール／クロロホルムの溶媒 性質の大部分を保持し、そして独特には核酸の単離および／または生物学的高分 子複合体の分画の用途に適する。その上、それらは一般に使われる有機溶媒より も実質的に低価格である。本発明の方法の使用を通して、塩化セシウムによる抽 出、遠心分離およびアルコール沈澱を回避し、かくして毒性である塩化セシウム への暴露を排除することもできる。本発明の抽出方法は、核酸の抽出において従 来側われている方法よりも一層迅速で、単純で、安全で且つ敏感である。よって 、それらは当該分野において有意な進歩を示し、所望の核酸の抽出をスケールア ップする一層安全な手段を提供する。

カオトロピック剤は抽出工程において溶解剤として一般に使われている。カオト ロピック剤とイオン性洗剤との不相溶性のため、カオトロピック塩溶液から核酸 を単離するのは困難であることがわかっている。更に、そのように高いモル濃度 の塩を使用するとすれば、水相中に核酸を分配させることは従来困難であった。

力オトσピック塩を必要とする抽出技術において本発明の抽出溶液と組み合わせ てベントナイトを使用することにより、特に複雑な生物学的試料からの完全なＲ ＮＡ、ＤＮＡまたは全核酸の迅速で且つ単純な回収が可能になる。

図１は、有機相として次のものを使って抽出した全核酸（染色体ＤＮＡおよびＲ ＮＡ）の電気泳動図を示す二２−メチルベンジルアルコール（レーン１）、４− メトキシベンジルアルコール（レーン２）：３−エトキシベンジルアルコール（ レーン３）：４−フェノキシベンジルアルコール（レーン４）：ベンジルアルコ ール（レーン５）：およびフェノール（レーン６）。

図２は、ベンジルアルコールとベントナイトを使って抽出した糞便試料からの全 核酸の電気泳動図を示す。レーン１は、抽出溶液がベンジルアルコールと１％（ Ｗ／Ｖ）ベントナイトとから成る時の、細菌バクテロイデス・ギンギバリス（Ｂ ａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）でスパイクした糞便試料から単 離された全核酸の電気泳動図を示す。比較として、レーン２は、抽出溶液がフェ ノールから成る時の泳動図を示す。再抽出とも全核酸の回収は同等であり、そし て完全な形で１６Ｓおよび２３Ｓ　ｒＲＮＡが単離される。

詳細な説明 本発明は、核酸と他の生物学的化合物との生物学的混合物を含有する試料から核 酸を単離するための新規組成物および方法に関する。

本発明の方法は、毒性または腐食性化学物質を使用せずに核酸を抽出することに より、核酸を含有する生物学的試料を容易に処理できるようにする。本発明の方 法は更に、ハイブリッド形成アッセイ用の核酸試料を調製することを可能にする 。

この抽出方法は、下記に指定するような少なくとも１種の有機化合物を含有する 抽出溶液と試料を混合して水相と非水相を形成せしめ、そして非水相から水相を 分離することを含んで成る。抽出溶液によって試料が二相になる。次いで水相中 に核酸が単離される。

本発明の抽出方法は、核酸〔リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核 酸（ＤＮＡ））と核酸以外の他の生物学的化合物との生物学的混合物を含有する 試料に適用することができる。そのような試料としては、核酸を含有する生物学 的材料、例えば任意の真核および／または原核細胞（プロトプラストを含む）の 複雑な生物学的混合物、または核酸を含有し得る他の生物学的材料、の任意の水 性混合物を挙げることができる。従って該方法は組織培養動物細胞、動物組織（ 例えば、溶解緩衝液中でホモジナイズされた心臓、肝臓または脳）、糞便、血液 細胞、網状赤血球、リンパ球、植物細胞または浸透圧ショックに敏感な他の細胞 、並びに細菌、酵母、ウィルス、マイコプラズマ、原生動物、リケッチア、真菌 の細胞および他の小微生物の細胞等に適用できる。

アッセイしようとする核酸試料または核酸の抽出の源として働（核酸試料は、該 試料中に内在する他の生物学的成分からの該試料中の核酸の分離を考慮した抽出 溶液と混合される。この抽出溶液はベンジルアルコール、ベンジルアルコールの 誘導体または類似の性質を有する他の溶媒を含んで成る。該溶媒は、抽出溶液を 水性試料と混合した時に核酸を水相中に分配せしめることによって他の生物学的 成分から核酸を効果的に単離させなければならない。抽出溶液は、典型的には、 次の性質を有する有機化合物を含有する有機組成物を含んで成るだろう： （ａ）　約９．０〜約１５．５の誘電率；（ｂ）　約１，３５〜約１．７０ク一 ロンメートルの双極子モーメント：および （Ｃ）　有機化合物１部に対して約ｏ、ｏｏｉ〜約０．３部の分配係数。好まし くは、そのような有機化合物は約０．７〜約１．９■／ｒｎｌ！、好ましくは約 １．０１〜約１．９ｍｇ／ｄ、最も好ましくは約１．０９〜約１．９ｍｇ／ｍｌ の比重も育し、そしてヒト皮膚に対して非腐食性であろう。抽出溶液に適当な有 機化合物の例は、４−へキシルレゾルシノールおよびレゾルシノール並びに下記 に列挙されるものである。

「誘電率」　（Ｄ）は、クーロンの法則の関係において大きさのない数である： 式中、Ｆは引力または折力であり、ｑｌおよびｑ２は距離ｄにより隔てられた２ つの電荷の大きさである。真空ではＤが１．０の値を存する。他のＤ値の例は、 １気圧で０℃の空気が１．０００５９．２５°Ｃのアルコールが２４．３、そし て２０℃の水が８０゜３７である。

「双極子モーメント」なる用語は、中性分子中の電荷の分布または＋もしくは一 電荷の量×電荷中心間の距離の大きさを指摘する分子定数（ρまたはμ）を言う 。１クーロンメートル＝２．９９７９３　ＸＩＯ”。

デバイ。例えば、それらが対称に分布すれば双極子モーメントはＯである。

「分配定数」なる用語は、同量の有機溶媒と水との相分離時の有機相中の水の濃 度を意味する。

あるいは、抽出溶液は好ましくは少なくとも１種の式１の有機化合物を含んで成 り、ここで式１は、式ｃｓｕｓｃｎｔｏｏまたは下式：Ｒ１は−（Ｃ）（ｚ）、 ＯＨ（ｎは１〜６である）　；　−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２０Ｈ；ｐはＯ〜３である ）から成る群から選択された基であり：Ｒ２は−Ｈ：　−Ｆ　；　−Ｃ１：　− ８ｒ　：　（：　−ＯＨ：　−５（ＣＨ２）、ＣＨ３（ｒは０〜３である）　； 　−０（ＣＨ２）、ＣＨ，（ｑはＯ〜６である）ニーＣ０ＯＲ’　（Ｒ’は−（ ＣＨ，）、ＣＩ（２であり、Ｓはθ〜３である）　；　−Ｃ，Ｒ５ニーＣＨｔＣ ｓＨｓ　：　−０ＣｓＨｓ　：　−０ＣＨｉＣｓＨｓ　；　−ＣＨＪ）ｔ　ニー ＣＦｓおよび＝（ＣＨ，）　。

ＣＨ３（ｔはＯ〜６である）から成る群から選択された基であり：Ｒ３は−Ｈ： 　−Ｆ　；　−Ｃ１：　−Ｂｒ　：　−Ｉ　：　−ＯＨ：　−ＣＨ３ニー（ＣＨ ｔ）、ＣＨｚ　（ｘはＯ〜３である）　；　−０（ＣＨｚ）　ｖＣＨ−（ｖはＯ 〜３である）から成る群から選択された基であり：そしてＲ４は−Ｈ：　−Ｆ　 ；　−ＣＩ　＋　−Ｂｒ　：　−［：　−（ＣＨｚ）−ＣＨ−（ｙはＯ〜３であ る）　：　−０（ＣＨｔ）、ＣＨｉ　（ｗは０〜３である）から成る群から選択 された基であり；そして更に、 Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はＲ１に関して任意の位置に存在してもよく、ただし、 （ａ＋Ｒ’が−ＣＨ（０）１）ＣＨ２０Ｈ１−ＣＨ，ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２０Ｈま たは−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＲ’である時、Ｒ１，Ｒ３およびＲ４は−Ｈでなけれ ばならず。

（ｂ）Ｒ’が−ＣＨ，ＯＨでありそしてＲ１が−ＣｓＨｓ　：　−０ＣＨ２Ｃ， Ｈはたは−ＣＨ＝ＣｇＨｓである時、Ｒ３は−ＧＨｚ、　−ＯＨ，−Ｃ１，−Ｂ ｒ、　−Ｆ。

−［、−Ｈ，−ＯＣＨ，または−０ＣＲ２ＣＨ２でなければならず、Ｒ４は−Ｈ でなければならず；そして （ＣＡＲ’が−（ＣＨ，）、ＯＨでありｎが２〜６である時、Ｒ３およびＲ４は 両方とも−Ｈでなければならないことを前提とする〕 を有する化合物の群から選択される。

式Ｉは分岐鎖と直鎖の両方のアルキルの全異性体形を包含する。

特記しない限り、どの数字の範囲も指摘した範囲の上限と下限を包含し、０はそ の要素が無いことを意味する。例えば、−（ＣＨ，）。ＣＨ。

（ｎはＯ〜２である）とは、３つの成分−ＣＨ，、−ＣＨ２ＣＨ２および−ＣＨ 。

ＣＨ３ＣＯ，を言う。ＨＣ＝Ｈｓはベンゼン環である。

次の式Ｉの化合物が特に好ましい： Ｒ１が−（ＣＨ２）−０８（ｎは１〜４である）であり、そしてＲ”ＩＲ３およ びＲ４が全て−Ｈであるもの；Ｒ１が−（ＣＨ２）、ＯＨ（ｎは１〜４である） であり、Ｒ２が−（ＣＨｚ）１ＧＨｚ　（ｔはＯ〜４である）であり、そしてＲ ３とＲ４が両方とも−Ｈであるもの二または Ｒ１が−（ＣＨ２）、ＯＨ（ｎは１〜４である）であり、Ｒ２が−０（Ｃ）１２ ）、ＣＨ２（ＱはＯ〜４である）であり、そしてＲ３とＲ４が両方とも−Ｈであ るもの。

上記化合物は全て市販されている。代表的化合物はアルドリッチケミカル社（Ａ ｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｉｌ＊ａ ｕｋｅｅ。

１１ｆｉｓｃｏｎｓｉｎ）またはフル力ケミカル社（Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）から購入することができる。

上記に指摘した有機化合物またはその混合物は、約０．７〜１．９■／ｍＬ好ま しくは約１．０１■／ｍ１以上、最も好ましくは約１．０９■／ｍ１以上の比重 を有するものである。それらはまた３７°Ｃ以下の融点も有するだろう。

抽出溶液の最も好ましい有機化合物はベンジルアルコール、２−メチルベンジル アルコール、４−メトキシベンジルアルコール、３−エトキシベンジルアルコー ルおよび４−フェノキシベンジルアルコールである。

上記有機化合物の幾つかは液体形でないが、抽出溶液に使われるベンジルアルコ ールのような適当な溶媒中に溶解させる二とができる。

従来、相分離を使って核酸を抽出するためには、有機溶媒、例えばフェノールま たはフェノール−クロロホルム混合物が使われている。本発明の抽出溶液を用い てそれらの方法を有効に利用することができる。しかしながら、本発明の方法の 利点は、そのような毒性化合物や長くて面倒な抽出方法が不要なことである。

抽出溶液を生物学的混合物と混合すると、混合した溶液が二相になり、非核酸材 料が有機相に存在しそして核酸材料は水相に存在する。有機相を適当な緩衝液、 典型的には該試料を希釈または懸濁するのに使われる緩衝液で飽和することが有 用である。典型的には合わせた溶液を混合し、低速遠心に１回または複数回かけ る。遠心は相分離には必要でないが、一層迅速な分離に備える。

水相中の核酸は、当業者に既知の方法で、アルコール、例えばエタノールまたは イソプロパツールで沈澱させる。例えば、ハイブリッド形成法に使用するために は、核酸を水相中に残してもよい。新たな抽出溶液を添加することによって水相 を再抽出してもよい。

抽出溶液は、混合した溶液が典型的には約ｌＯ〜約８０％、好ましくは約４０〜 約６０％、最も好ましくは約５０％（容量：容量に基づく）の上記有機組成物を 含有するように試料と混合されるだろう。次いで好ましくは、抽出溶液は標準緩 衝液および細胞の溶解を促進する洗剤も含有するだろう。クエン酸ナトリウム、 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ　、好ましくはＴｒｉｓ−Ｈ ＣＩ、とイー）だ緩衝液を約０．０１〜０．１Ｍの濃度で使用することができる 。緩衝液は典型的には約０．０５〜５％のイオン性または非イオン性洗剤、例え ばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）またはサルコシル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、１〜２０ｍＭ ０巳ＤＴＡ、および約０〜２５０ｍ！ｉｔの塩、例えばＮａＣｌも含有するだろ う。

同様に好ましく抽出溶液中に内在するものは、約０．１〜約１０％、好ましくは 約１〜約５％（重量・容量に基づく）の濃度のヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは 有機粘土等、より好ましくはベントナイト、Ｍａｃａｌｏｉｄの、ａｅｎｔｏｎ ｅ＠（２面に長鎖有機化合物が結合しているベントナイトまたはへクトライト存 機粘土血小板）等、並びにそれらの混合物、誘導体または類似体である。ベント ナイトは、ここでは任意の粘土もしくはシリケート、例えば珪藻土、または主と してモンモリロナイト（Ａ１２０．・４５ｉｆ２・Ｈ２Ｏ）から成る任意の物質 、典型的には珪酸アルミニウム等を包含する。使用時、ベントナイトをまず水で 飽和し、抽出溶液に添加する。Ｍａｃａｌｏｉｄ■（粘土）とＢｅｎｔｏｎｅ＠ はＮ、Ｌ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｈｉｇｈｔｓｔｏｗｎ、　Ｎ、Ｊ、から入 手できる。Ｂｅｎｔｏｎｅ＠は本発明の範囲内の利用に特に適当である。という のは、ベントナイトやＭａｃａｌｏｉｄ　”に比べて長期間に渡り特定物質を比 較的均一な懸濁Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）　（これは参 考として本明細書中に組み込まれる）に記載されたようにして、ヌクレアーゼ阻 害剤、例えばベントナイトまたはλＩａｃａｌｏｉｄ　＠を最初に精製すること が必要かもしれない。効率的な抽出のために、均一な小粒子を使用することが好 ましい。そのようなヌクレアーゼ阻害剤は、ＤＮＡの抽出を所望する時に特に望 ましい。リボヌクレアーゼが実質的に抽出を妨害しないか、またはＲＮＡのみを 抽出しようとする試料では、そのようなヌクレアーゼ阻害剤を使わずに核酸を抽 出することができる。

抽出溶液は、場合により、アミノトリアリールメタン染料、例えばＲ，Ｄ、　Ｌ ｉ１ｌｉｅ、　Ｈ，Ｊ、　Ｃｏｎｎ’ｓ　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ　５ｔａｉｎｓ 、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　ＭＤ　（ １９７７）において記載されたもの、を含むことがある。適当な染料の性質とし ては、有機溶媒中への溶解性、水中への分配が最少または全くないこと、および 核酸への結合が最少または全くないことが挙げられる。好ましい染料はメチルバ イオレットであり、メチルバイオレット６Ｂが特に好ましい。抽出溶液中への染 料の配合は、着色した有機相と無色の水相をもたらし、それによって抽出工程の 間の二相の一層鮮明な境界線を提供する。染料濃度は水相と有機相との間の視覚 対比を提供するのに十分であり、典型的には約ｏ、　ｏｏｏｓ〜０，０１％（Ｗ ／Ｖ）の範囲内である。染料は有機相中に存在するので、好ましい有機化合物は 染料の選択によって異なり得る。

タンパク質構造を破壊しそして核酸を遊離せしめるために、抽出の前または最中 に、生物学的試料は典型的には溶解剤の使用を通して溶解される。好ましくは、 試料は抽出溶液の添加前に溶解にかけられるだろう。核酸抽出法に典型的に使わ れる溶解剤はいずれも適当であり、例えばＳＤＳ、リゾチーム、カオトロピック 剤と様々に組み合せたプロテイナーゼＫ、または細胞膜の完全状態を弱化もしく は破壊するであろう他の剤が適当である。

核酸を解離せしめそしてヌクレアーゼを阻害するために、タンパク質の二次およ び三次構造を破壊するカオトロピック剤〔例えば、グアニジニウム塩、例えばグ アニジニウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）　、グアニジニウムイソチオシアネート（Ｇ ｕＳＣＮ）　、尿素または他のイソチオシアネート〕を抽出溶液と組み合わせて または抽出溶液の添加前に溶解剤として使用することができる。核酸の抽出およ びハイブリッド形成におけるカオトロピック剤の使用は欧州特許公報第０１２７ ３２７号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。カ オトロピック剤は、標的細胞から核酸を遊離せしめ且つ遊離された核酸をヌクレ アーゼから保護するのに十分な濃度で存在する。

典型的には、カオトロピック剤は約ＩＭ〜約５Ｍの濃度で存在し、より好ましく は約２Ｍ〜約３Ｍで存在する。溶解および抽出を促進するためにラクタムを抽出 溶液と組み合わせて用いることもできる。

ラクタムの例および抽圧操作におけるそれらの利用法は、１９８９年７月２４日 に出願の一般譲渡されたＵ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０７／３８４．２３５において十分 に記載されている。これは参考として本明細書中に組み込まれる。

好ましいラクタムはシクロへキシルピロリドン、１−フェニル−２−ピロリドン および１．３−ジメチル−３，４，５，６−チトラヒドロー２−（Ｈ）−ピロリ ドンである。

全核酸（ＤＮＡとＲＮＡ）の抽出のためには、抽出は典型的には約３７°Ｃ〜約 ６５°Ｃにて約１〜ｌＯ分間行われる。この抽出操作は、好ましくは試料を抽出 溶液と混合した後、水相中に存在する核酸の量が１■／ｒｄを越えないような核 酸の濃度を有する水性試料を与えるだろう。有用な経験法は、生物学的材料の合 計が与えられた試料中５０■／ｄを越えないようにすることである。試料容量対 抽出溶液容量の比は典型的には０．５：１〜３：１、より典型的には０．７５： １〜２：１、最も典型的には約１＝１である。

本発明の抽出溶液はリポソームＲＮＡ　（ｒＲＮＡ）の選択的抽出も可能にする 。核酸を含む試料を溶解させた後、試料を抽出液と混合する前または後に、試料 を加熱する。抽出溶液の添加の前または後で試料を約６５℃で約１０分間加熱す ることにより、ｒＲＮＡの収量は５〜５０倍増加する。加熱を使わなければ、主 としてＤＮＡが抽出される。

従って、最初に試料を溶解させることによりｒＲＮＡとＤＮＡの連続抽出を行う ことができる。例えば、本明細書に記載の如く抽出溶液を使って室温で抽出を行 い、最初の水相からＤＮＡを単離し、最初の有機相中にｒＲＮＡを残す。次いで 標準緩衝液（例えば１％ＳＤＳ、　５０１！ＩＭ　ＴｒｉＳ、　２５ｍＭ　ＥＤ ＴＡおよび０．０５ｍＭ　ＮａＣ１）　’Ｅ添加した径、最初の有機相からｒＲ ＮＡを抽出する。この溶液を典型的には約６５°Ｃに加熱し、第二の有機相と第 二の水相を作る。

最も好ましく且っキット形態において提供してもよい抽出溶液は、ベントナイト またはＢｅｎｔｏｎｅ■、溶解剤、および抽出溶液に関連して上記に記載したも のから選択された有機化合物を含んで成る抽出組成物である。新規抽圧組成物は 、上述の要素（これは様々に記載した抽出溶液中に含まれてもよい）の任意の組 み合わせを含有することができる。

ハイブリッド形成を改善する抽出 複雑な生物学的試料、例えば糞便または血液においてハイブリッド形成アッセイ を行う前に、本発明の抽出方法および組成物を使うことも存利である。この抽出 操作は、ある場合にはバックブラウン−ド干渉を招く汚染物を除去することが必 要となり得る。抽出の後で核酸を濃縮する操作は、ハイブリッド形成アッセイに おける感度とシグナル対ノイズ比を改善することができる。

本発明に係るハイブリッド形成アッセイは、本明細書に与えられる指針を前提に して、当業者に既知であるかまたはイムノアッセイ方法論に類似している任意の 方法により実施することができる。好ましいアッセイ方法はサンドイッチアッセ イとその変形、競合または置換アッセイである。ハイブリッド形成技術は“Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　Ａｐｐｒｏａｃｈ、”　Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、Ｄ、およびＨｉｇｇｉｎｓ、　Ｓ 、Ｊ、纒、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８５　：　Ｇａ１ｌおよびＰａｒｄｕｅ　 （１９６９）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　６３：３７８ −３８３　：並びにＪＯｈｎ、　Ｂｕｒｎｓｔ−ｅｉｌおよびＪｏｎｅｓ　（１ ９６９）　Ｎａｔｕｒｅ　２２３：５８２−５８７に概括的に記載されている。

ハイブリッド形成技術に改良が行われると、それらを容易に適用することができ る。

サンドイッチ゛Ｙツ七イは、核酸配列を検出または単離するための商業的に有用 なハイブリッド形成アッセイである。そのようなアッセイは固体支持体上に共有 結合的に固定化された「捕捉」核酸ど溶液中の標識された「シグナル」核酸を使 用する。臨床試料が標的核酸を提供するだろう。「捕捉」核酸と「シグナル」核 酸プローブが標的核酸とハイブリッド形成して「サンドイッチ」ハイブリッド形 成複合体を形成する。有効であるためには、シグナル核酸は捕捉核酸とハイブリ ッド形成することができない。

ハイブリッド形成アッセイでは、標的核酸は、その存在が興味あるものでありそ してその存在または不在を検圧しようとするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）　、リ ボ核酸（ＲＮＡ）またはリポソームリボ核酸（ｒＲＮＡ）のヌクレオチド配列で ある。標的核酸は核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡおよび／またはｒＲＮＡ）と非核酸との 複雑な生物学的混合物において提供され得る。

ハイブリッド形成媒質は、ハイブリッド形成に必要な成分を全て含むように商業 的にまたは研究室で予備調製しておくことができる。

例えば、サンドイッチアッセイでは、媒質は、ラクタム、所望の緩衝液および洗 剤、固体支持体（例えばミクロビーズ）上に結合させた捕捉核酸、並びにシグナ ル核酸を含んで成ることができる。この媒質は、アッセイを実施する時点で標的 核酸を含む溶液と混合することのみを必要とする。一度ハイブリッド形成が起こ れば、固体支持体に結合したハイブリッド形成複合体を洗浄し、そしてハイブリ ッド形成の程度を測定することができる。

適当な配列が決定されれば、好ましくは商業的に利用可能な方法および装置を使 ってＤＮＡプローブを化学合成する。固相ホスポルアミダイト法を使って、１５ 〜５０塩基から成り１６．０００ダルトン未満の分子量を育する短いプローブを 製造することができる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ−的の特異性を決定するだろう。例 えば、幾つかのウィルス単離物からのＤＮＡ配列を比較することにより、型特異 性かまたは属特異性のいずれかであるウィルス検出用配列を選択することができ る。ＤＮＡ領域および配列の比較は市販のコンピュータープログラムを使って行 うことができる。

ハイブリッド形成の程度の測定は、当業界で公知の方法のいずれかを使って行う ことができる。検出可能なハイブリッド形成が全くない場合は、ハイブリット形 成の程度はＯである。典型的には、標識されたシグナル核酸を使ってハイブリッ ド形成を検出する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在を検出するのに 典型的に使われる幾つかの方法のいずれか１つにより、相補的核酸またはシグナ ル核酸を標識することができる。最も一般的な検出方法は、２　Ｈ。

＋２１ｉ、　３″ｓ、”ｃまたは２２ｐ標識プローブ等を用いるオートラジオグ ラフィーの使用である。放射性同位体の選択は、選択した同位体の合成の容易さ 、多様な安定性および半減期による研究優先権に依存する。他の標識としては、 標識抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光物質、酵素、および標識リガン ドに対する特異的結合ペアメンバーとして働（ことができる抗体が挙げられる。

標識の選択は、必要な感度、プローブとの接合の容易さ、安定性要件、および利 用可能な装置に依存する。

核酸の抽出およびハイブリッド形成のためのキットも期待される。

該キットは、様々な所望の組合せで上記溶液と組成物を含んで成る。

典型的には、生物学的試料中に存在する化合物は、標的増幅方法、例えばＰＣＲ およびＬＣＲに対して阻害作用を及ぼす。この観察される阻害は、血液試料から 抽出された核酸の増幅の場合に特に問題となる。本発明の方法は、一般に生物学 的試料、特に血液からの標的増幅の阻害剤を全部ではないにしろ大部分除去する 。よって、本発明の方法は、標的増幅方法と組み合わせて有利に利用することが できる。本発明は、低コピー数の標的核酸を含有する生物学的試料から得られた 核酸の標的増幅に特に適当である。

下記め実施例は例示のつもりで与えられ、けっして本発明を限定するものと解釈 してはならない。

実施例 実施例１ ベンジルアルコールおよびベンジルアルコール誘導体を使った全核酸の抽出 この抽出プロトコールは、フェノールまたはフェノール／クロロホルムを使用し ないでグアニジニウムイソチオシアネートで溶解された試料からの核酸の単離を 可能にする。有機相はベンジルアルコールまたはベンジルアルコールの誘導体か ら成る。

約５Ｘ１０’個のバクテロイデス・ギンギバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｇｉ ｎｇｉｖａｌ　ｉｓ）細胞を、２％サルコシル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）　、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，６）および ２５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む３ＭＧｕＳＣＮ　（Ｋｏｄａｋ、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅ ｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）溶解溶液７５０μ！中で溶解せしめた。次いて溶解物 を６本の１．５ｍｌ超遠心管に１００μ！ずつアリコートに分けた。各試験管に 、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｔ（Ｃ１，５ｍ＾１εＤＴＡ　ＣｐＨ７，２）で飽和 された有機相５００μｌ〔ここで、試験管１の有機相は２−メチルベンジルアル コール（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅ＋＋＋１ｅａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｍｉｌｗａ ｕｋｅｅ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）であり：試験管２の存機相は４−メトキシベ ンジルアルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ）であり； 試験管３の有機相は３−エトキシベンジルアルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ）であり ： 試験管４の有機相は４−フェノキシベンジルアルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ）であ り： 試験管５の有機相はベンジルアルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ）であり：試験管６の 有機相はフェノール（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ（ＢＲＬ）、　Ｇａｊｅｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）であっ た〕および抽出緩衝液２５０ａ　ｌ　（０，０５Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，２）。

５ｄ　ＥＤＴＡおよび０．０５％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　：　 ５ＤＳ）　）をそれぞれ添加した。生じた溶液を１５秒間激しく混合し、６５° Ｃで１０分間加熱した。次いで試験管を再び１５秒間激しく混合した。次いで超 遠心機中で１０．０００　ｒｐｍでの遠心により相を分離した。上の水和を取り 呂しく通常４００ｕｌ！の容量）、水相に二倍の容量の１００％エタノールを添 加した。１９°Ｃで５分間核酸の沈澱を生じさせた。次いで１０．０００　ｒｐ ｍでのｉｏ分間の遠心により溶液から核酸をペレット化した。液相をデカンテー ションし、捨てた。核酸ベレットを１００μ！の蒸留水に溶かし、次いでアガロ ースゲル電気泳動にかけた。結果を図１に与える。該結果は、どの抽出も収量お よび純度においてフェノールを使った抽出と同等であったことを指摘する。

実施例２ ベンジルアルコールとベントナイトを使った糞便試料からの全核酸の抽出 この抽出プロトコールは、フェノールまたはフェノール／クロロホルムを使用せ ずにグアニジニウムイソチオシアネートで溶解された特に複雑な試料からの核酸 の単離を可能にする。

輸送媒体（Ｔｒｅｎｄ　Ｆｅｋａｌ”　Ｅｎｔｅｒｉｅ　Ｐｌｕｓ　Ｔｒａｎｓ ｐｏｒｔ　Ｓｙｓｔｅｍ。

Ｔｒｅｎｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　（ｎｃ、、　Ｓｔ、　Ｐａｕｌ、　Ｍｉｎ ｎｅｓｏｔａ）中の糞便試料を１００μｍずつのアリコートに分けた。各アリコ ートを３００μ！のＧｕＳＣＮ溶解溶液（実施例１と同じ）で溶解せしめ、モし て５Ｘ１０”個ツバクチロイデス・ギンギバリス（ｈΩ見１瓜競旺匡ハ虹旦）　 Ｊｔｌｌ胞でスパイクした。スパイク後、試料を２セツトに等分した。１セツト はフェノールを使って抽出し、もう１セツトは、１％Ｗ／Ｖ水飽和ベントナイト （Ｓｉｇｍａ）を含有するベンジルアルコールから成るベンジルアルコール／ベ ントナイト溶液５００μ１１および抽出緩衝液（０，０５Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，２，５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５％ドデシ ル硫酸ナトリウム）２５０μｌを添加することによって抽出した。

生じた溶液を１５秒間激しく混合し、６５℃で１０分間加熱した。次いで試験管 を再び１５秒間激しく混合した。次いで超遠心機中でｉｏ、ｏｏ。

ｒｐｍでの２分間の遠心により泪を分離した。上の水相を取り出しく通常４００ μｌの容量）、水相に２倍の容量の１００％エタノールを添加した。１９°Ｃで ５分間核酸の沈澱を生じさせた。次いで１０．０００　ｒｐｍでの１０分間の遠 心により溶液から核酸をペレット化した。液相をデカンテーションし、捨てた。

核酸ベレットを１００μ！の蒸留水に溶かし、次いでアガロースゲル電気泳動に かけた。

フェノール抽出には、上記と同様に試料を溶解せしめ、そしてベンジルアルコー ル法について記載したものと全く同様に抽出した。

上記と同様な遠心により相を分離し、追加の量のフェノールを使って６５°Ｃに て水相を再抽出した。単離された核酸を上記と同様にして７０％エタノールで沈 澱させた。液相をデカンテーションし、捨てた。

核酸ベレットを１００μｌの蒸留水に溶かし、次いでアガロースゲル電気泳動に かけた。結果を図２に与える。この結果は、ベンジルアルコール抽出を使って、 高いヌクレアーゼレベルを有する源から全核酸を単離することができることを示 す。

実施例３ 複雑な生物学的試料の予備抽出による改良ハイブリッド形成法アッセイはサンド イッチアッセイ形式においてナイロン固体支持体を使用し、このアッセイにおい て襟的核酸配列を配列決定し、次いで蛍光アッセイ形式を使って検出する。

輸送媒体（Ｔｒｅｎｄ　ＦｅｋａｌＴ′４Ｅｎｔｅｒｉｃ　Ｐｌｕｓ　Ｔｒａｎ ｓｐｏｒｔ　Ｓｙｓｔｅｍ。

Ｔｒｅｎｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ、）中の糞便試料を１００μｌずつ の了りコートに分けた。各アリフートを３００μ！のＧｕＳＣＮ溶解溶液（実施 例１と同じ）で溶解せしめ、そして５Ｘ　１０’個のバクテロイデス・ギンギバ リス細胞でスパイクした。スパイク後、試料を２つの等しいアリコートに分けた 。一方のアリコートは実施例２に記載したようなベンジルアルコール／ベントナ イト法を使って抽出し、もう一方の了りコートは抽出を行わなかった。抽出試料 からの核酸ベレットを１００μｆの３Ｍ　ＧｕＳＣＮ溶解溶液〔２％サルコシル 、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，６）および２５ｍＭ　ＥＤＴＡ中〕に溶かし た。未抽出の溶解物と３Ｍ　ＧｕＳＣＮ中に単離された核酸の両者を６５°Ｃで ５分間加熱した。そして該溶解物および単離された核酸１−に対して１００ナノ グラムの最終濃度になるように、細菌の１６Ｓ　ｒＲＮＡの保存領域に相補的な ビオチニル化２４マーオリゴヌクレオチド（シグナルプローブ）を添加した。

下記のビオチニル化シグナルオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド配列： Ｂｇｌ：　５−ＸＣＡＡＴＡＣＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧＴＴＡＴＴＣ−３’Ｕ Ｐ９Ａ：　５−ＸＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’並びに抽出 試料の場合にはｌＸｌ０’個のアクチッパシラス・アクチノミセテコミタンス（ Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｅｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｃｏｍｉｔａｎｓ） 、バクテロイデス・インターメジウス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｉｎｔｅｒｍ ｅｄｉｕｓ）。

エイケネラ・コロデンス（ＥｉｋｅｎｅＨａ　ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）　、ウォリ ネラ。

レクタ（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ　ｒｅｃｔａ）およびフッバクテリウム・ヌクレア ーゼ（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）の全細胞、そして未 抽出試料の場合には糞便溶解物を含有する３Ｍ　ＧｕＳＣＮ溶解溶液中の希釈剤 を使って、該溶解物の５倍連続希釈液を作製した。該希釈剤は、上記のビオチニ ル化シグナルオリゴヌクレオチドを１００■／ｄ含んだ。次いで生じた溶液を、 ０．１μｇのＢｇｌ−特異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕捉プローブ）を共 有結合的に固定化させたＴｈｅ　Ｈｏｏｖｅｒ　Ｇｒａｕｐ（Ｓａｕｌｔ　Ｓｔ 、　ＡＩａｒｉｅ、Ｍυにより製造された２個のナイロンビーズと共に周囲温度 で３０分間インキュベートした。固体支持体を周囲温度においてＳＤＳ／ＦＷ　 （０，０９Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，６，２５ｍＭ　ＥＤ ＴＡおよびｏ、ｉ％５ＤＳ）で洗浄し、次いでＯ０５％Ｔｗｅｅｎ　２０　＠　 （Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ。

［１１ｉｎｏｉｓ）、　１ｍＭ　Ａ［ｇＣｌｚ、　０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ Ｉ　ｐＨ８，０（ＡＰＢ）で洗浄し、そしてＡＰＢ中０．４μｇ／ｍｊ７のスト レプトアビジン／アルカリホスファターゼ（ＳＡ／ＡＰ）接合体と共に周囲温度 にて５分間インキュベートした。次いで固体支持体をＡＰＢ　、ＴＡＩＮＺ（０ ，０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，５，１ｍＭＭｇＣｌ□、　０．５ｍｈｌ　ＺｎＣ １２）で５回洗浄し、次に黒色ミクロタイターウェルストリップ（Ｄｙｎａｔｅ ｋ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　ＶＡ）中でナイロン ビーズを１５０μ！の０．５ｍＭ　４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ ４−ヒドロキシメチルクマリン）と共にインキュベートすることにより、アルカ リホスファターゼの存在を測定した。インキュベーションは３７°Ｃで３０分間 であった。次いで溶液をデカンテーションし、９６ウエルのミクロタイタープレ ート中に入れた。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ■蛍光計（Ｆ、ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、　ＭｃＬｅａｎ、　ＶＡ）を使って３６０　ｎｍの励起波長と４５ ６　ｎｍの発光波長を用いて該プレートを直接読んだ。その結果を下記の表工に 示す。

表１ 蛍光シグナル 細胞数　抽出試料　未抽出試料 １　ｘｌＯ”　１８７Ｂ　２１００ ２　ＸＩＯ’　１３５０　２１００ ４×１０１　７４０　１５５０” ８　ｘｌＯ’　２２０　１１８０ １．６　ＸＩＯ’　５６　９８０ ３．２　ＸＩＯ’　、　２９　１２１０６．４　ＸＩＯ３２３”　１１６０ 対照　１８　９４０ １０は検出の最低レベルを示す。

上記結果は、３０分間のハイブリッド形成において、抽出試料を使った時には６ Ｘ１０’細胞のレベルが検出されたが、未抽出試料では４　ＸＩＯ’　１１１胞 のレベルしか検出されなかったことを指摘する。

実施例４ ベンジルアルコールとＢｅｎｔｏｎｅ’を使った生物学的試料からのＤＮＡの抽 出 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の懸濁液を遠心により収集し、そのペレットを、１０ ｍＭ　ＥＤＴＡと１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ Ｈ７，６）中に１０１〜１０１°細胞／ｒｎＩに再懸濁した。次いでこの懸濁液 を周囲温度で５〜１５分間インキュベートした。あるいは、ＥＤＴＡナトリウム を含む採集管中に血液を採集した。

生物学的試料（細菌懸濁液または血液試料）を同容量の溶解緩衝液〔５λＩ　Ｇ ｕＳＣＮ、　８３ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，６，１７ｍＭ　ＥＤＴＡ および３．３％（Ｗ／Ｖ）サルコシル〕を使って溶解せしめた。

溶解物（２００μｌ）を２ｄの超遠心管に移した。激しい振盪の後、７００μｌ の抽出溶液〔９９％純度のベンジルアルコール中１．１％（Ｗ／Ｖ）Ｂｅｎｔｏ ｎｅ８）を溶解物に添加した。この混合物に４００μｌの緩衝液（５０ｍＡＩ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｌｏｏｍＭ　ＮａＣ１， ０，５％　（ｗ／ｖ）ＳＤＳ）を添加した。生じた混合物を１０秒間渦動攪拌し 、次いで１２、０００　Ｘ　ｇで５分間遠心した。上の水相を新たな２ｒＩｄ！ の超遠心管に移し、それに０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた。同容量のイ ソプロパツールを添加し、溶液を穏やかに混合してＤＮＡを沈澱させた。１２． ０００Ｘｇで１０分間の遠心の後、上溝を捨て、ペレット化したＤＮＡに１−の ７０％エタノールを添加した。穏やかな攪拌の後、こ風乾し、次いでＤＮＡペレ ットをＲＮアーゼ不含有の水または適当な緩衝液中に所望の濃度に再懸濁した。

本実施例の上記プロトコールに従って抽出されたＤＮＡは、標的増幅方法、例え ばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）における使用に適当である。様々な標的増幅 方法が当業界で公知である。下の表２は、本実施例のＤＮＡ抽出法が低コピー数 の標的核酸の増幅および検圧を可能にすることを示す。簡単に言えば、既知濃度 のＨＩＶ−１プラスミドをヒト全血に添加し、ＰＣＲ反応反日１回りθ〜２５０ のｐＨ［Ｖ−１コピーを与えた。二重複製の血液試料１００μ！を抽出し、抽出 した核酸を１００μｌの水に再懸濁し、この核酸懸濁液５０μ！を増幅反応毎に 使った。増幅された標的は、相補的ｘｔｐ標識オリゴヌクレオチドプローブのハ イブリッド形成により検出した。

表２ 低コピー数の標的ＤＮＡの増幅および検出ＰＣＲ反応あたりの　検出 下の表３は、プロトコ−ルに／フェノール抽圧法を使った全血からのＤＮＡの抽 出と本実施例の抽出法を使ったものとを比較する。

簡単に言えば、３つのＰＣＲ陽性ＨＴＬＶ−１血液試料と５つの対照血液試料（ ＰＣＲによりＨＴＬＶ−１陰性）を、ＥＤＴＡナトリウムを含む試験管中に採血 した。対照血液を使って各陽性試料を５倍間隔において連続希釈した。二重複製 の血液試料１００μｌを、プロトコ−ルに／フェノール法（例えば、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋら、”＆１ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ−ｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９８９　；　Ｒ，Ｈｉｇｕｃｈｉ、　”Ａｍ　１ｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ二Ａ　 Ｆｏｒｕｍ　ｆｏｒ　ＰＣＲＵｓｅｒｓ”。

Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐ、、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ、　１９８ ９を参照のこと）または本実施例の方法を使って抽出した。抽出された核酸を１ ００μ！の水に再懸濁し、そしてこの核酸懸濁液５０μｌをＰＣＲ反応毎に使っ た。増幅された標的は、相補的２２ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブのノ）イ ブリッド形成により検出した。表３は、プロトコ−ルに／フェノール法と記載の 方法が同等な抽出限界および検出限界を与えることを証明する。

表３ プロトコ−ルに／フェノール法と実施例４の抽出方法との比較−全血からの核酸 のＰＣＲ増幅と検出−）ＩＴＬＶ−１陽性　検出シグナル 血液試料の　プロトコ−ルに／ ＨＩＴＶ−Ｉ陰性血液　−− 負のＰＣＲ対照　−一 実施例５ ベンジルアルコールとＢｅｎｔｏｎｅのを使った生物学的試料からの全核酸の抽 出 大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の懸濁液を遠心により収集し、そのペレットを、１０ｍ Ｍ　ＥＤＴＡと１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ ７，６）中に１０’〜１０Ｉ０細胞／−に再懸濁した。次いでこの懸濁液を周囲 温度で５−１５分間インキュベートした。あるいは、ＥＤＴＡナトリウムを含む 採集管中に血液試料を採集した。

生物学的試料（細菌懸濁液または血液試料）を同容量の溶解緩衝液［５Ｍ　Ｇｕ ＳＣＮ、　８３ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，６，１７ｍＭ　ＥＤＴＡお よび３．３％（Ｗ／Ｖ）サルコシル〕を使って溶解せしめた。

溶解物（２００μＩりを２１１Ｌｌの超遠心管に移した。激しい振盪の後、７０ ０μ！の抽出溶液〔９９％純度のベンジルアルコール中１．１％（Ｗ／Ｖ）Ｂｅ ｎｔｏｎｅ■〕を溶解物に添加した。この混合物に４００μ！の緩衝液（５０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１００ｍＭ　Ｎ ａＣ１，０，５％（ｗ／ｖ）ＳＯＳ）を添加した。生じた混合物を１０秒間渦動 攪拌し、時折混合しながら６５°Ｃで１０分間加熱し、次いで１２．０００　Ｘ 　ｇで５分間遠心した。

上の水相を新しい２−の超遠心管に移し、それに５００μｌの抽出溶液（上記の ベンジルアルコールとＢｅｎｔｏｎｅ　＠　）を添加した。この混合物を１０秒 間渦動攪拌し、次いで１２、ｏｏｏｘｇで５分間遠心した。上の水相を再び新た な２−の超遠心管に移し、それに０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えた。同容 量のイソプロパツールを添加し、溶液を穏やかに混合して全核酸を沈澱させた。

１２、ｏｏｏ　ｘ　ｇで１０分間遠心した後、上溝を捨て、ペレット化した核酸 に１ｒｎｌの７０％エタノールを添加した。穏やかな攪拌の後、この調製物を１ ２．０００Ｘｇで５分間遠心した。上清を捨て、ペレットを風乾し、次いで核酸 ベレットをＲＮアーゼ不含有の水または適当な緩衝液中に所望の濃度に再懸濁し た。

要　約　書 本発明は、核酸の抽出のだめの安全で且つ効率的な方法に関する。

特に、核酸と他の生物学的化合物との生物学的混合物を含有する試料から核酸を 単離するための方法および組成物が記載され、この場合、少なくとも１種の有機 化合物、例えばベンジルアルコールまたはベンジルアルコール誘導体を含有する 抽出溶液と前記試料とを混合し、水相と非水相とを形成せしめる。核酸は水相か ら単離される。

好ましくは、生成する混合溶液は更にベントナイトを含有する。典型的には、抽 出前に、該試料は最初に溶解剤と混合されるだろう。

好ましい溶解剤はカオトロピック塩、例えばグアニジニウム塩酸塩およびグアニ ジニウムイソチオシアネートである。

国際調査報告 一 −一１−−＾帥−――−ｈコ’／ＩＪＳ９１１０４９３２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸と他の生物学的化合物との混合物を含有する試料から核酸を単離する方 法であって、 該試料を、少なくとも１種の式Ｉの有機化合物を含有する抽出溶液と混合し； 水相と非水相を形成せしめ；そして 非水相から水相を分離することを含んで成り、ここで、式Ｉは、式Ｃ６Ｈ５ＣＨ ２ＯＨまたは下式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、 Ｒ１は−（ＣＨ２）■ＯＨ（ｎは１〜６である）；−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ； −ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨおよび−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＲ５（Ｒ５は−（ ＣＨ２）■ＣＨ３であり、ｐは０〜３である）から成る群から選択された基であ り；Ｒ２は−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−Ｓ（ＣＨ２）ｒＣＨ ３（ｒは０〜３である）；−Ｏ（ＣＨ２）■ＣＨ３（ｑは０〜６である）；−Ｃ ＯＯＲ６（Ｒ６は−（ＣＨ２）■ＣＨ３であり、ｓは０〜３である）；−Ｃ６Ｈ ５；−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５：−ＯＣ６Ｈ５；−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５；−ＣＨ２ＯＨ；− ＣＦ３および−（ＣＨ２）■ＣＨ３（ｔは０〜６である）から成る群から選択さ れた基であり； Ｒ３は−Ｈ；−Ｆ：−Ｃｌ；−Ｂｒ：−Ｉ：−ＯＨ：−ＣＨ３；−（ＣＨ２）ｘ ＣＨ３（Ｘは０〜３である）；−Ｏ（ＣＨ２）ｖＣＨ３（Ｖは０〜３である）か ら成る群から選択された基であり；そしてＲ４は−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ； −Ｉ；−（ＣＨ２）ｙＣＨ３（ｙは０〜３である）；−Ｏ（ＣＨ２）ｗＣＨ３（ ｗは０〜３である）から成る群から選択された基であり；そして更に、 Ｒ２，Ｒ３およびＲ４はＲ１に関して任意の位置に存在してもよく、ただし、 （ａ）Ｒ１が−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ，−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨまた は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＲ５である時、Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は−Ｈでなければ ならず； （５）Ｒ１が−ＣＨ２ＯＨでありそしてＲ２が−Ｃ６Ｈ５；−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５ または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である時、Ｒ３は−ＣＨ３，ＯＨ，−Ｃｌ，−Ｂｒ，− Ｆ，−Ｉ，−Ｈ，−ＯＣＨ３または−ＯＣＨ２ＣＨ３でなければならず、Ｒ４は −Ｈでなければならず；そして （ｃ）Ｒ１が−（ＣＨ２）■ＯＨでありｎが２〜６である時、Ｒ３およびＲ４は 両方とも−Ｈでなければならないことを前提とする〕 を有する化合物の群から選択されることを特徴とする方法。 ２．前記抽出溶液が有機粘土を更に含んで成る、請求項１の方法。 ３．前記有機粘土がベントナイト、マカロイド（Ｍａｃａｌｏｉｄ■）、ベント ン（Ｂｅｎｔｏｎｅ■）またはそれらの混合物、誘導体もしくは類似体である、 請求項２の方法。 ４．前記有機粘土が約０．１％〜約１０％の濃度で存在する、請求項２の方法。 ５．前記試料が抽出前に溶解剤と混合される、請求項１の方法。 ６．前記溶解剤がカオトロピック剤である、請求項５の方法。 ７．前記溶解剤がＧｕＨＣｌ、ＧｕＳＣＮ、尿素およびそれらの混合物から成る 群から選択される、請求項５の方法。 ８．前記有機化合物またはその混合物が、０．７ｇ／ｍｌ以上の比重を有するも のである、請求項１の方法。 ９．アルコールを使って前記水相から核酸が沈澱される、請求項１の方法。 １０．前記アルコールがエタノールまたはイソプロパノールである、請求項９の 方法。 １１．式Ｉの有機化合物が、ベンジルアルコール、２−メチルベンジルアルコー ル、４−メトキシベンジルアルコール、３−エトキシベンジルアルコールおよび ４−フェノキシベンジルアルコールから成る群から選択される、請求項１の方法 。 １２．前記試料を抽出溶液と混合する段階の後、約３７〜約６５℃で約１〜約１ ０分間加熱する段階を更に含んで成る、請求項１の方法。 １３．遊離された核酸を単離するための抽出組成物であって、式Ｃ６Ｈ５ＣＨ２ ＯＨまたは下式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上式中、 Ｒ１は−（ＣＨ２）ｎＯＨ（ｎは１〜６である）；−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ； −ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨおよび−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＲ５（Ｒ５は−（ ＣＨ２）ｐＣＨ３であり、ｐは０〜３である）から成る群から選択された基であ り；Ｒ２は−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−Ｓ（ＣＨ２）ｒＣＨ ３（ｒは０〜３である）；−（ＣＨ２）ｑＣＨ３（ｑは０〜６である）；−ＣＯ ＯＲ６（Ｒ６は−（ＣＨ２）ｓＣＨ３あり、ｓは０〜３である）；−Ｃ６Ｈ５； −ＣＨ２Ｃ６Ｈ５；−ＯＣ６Ｈ５；−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ５；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＦ ３および−（ＣＨ２）ｉＣＨ３（ｔは０〜６である）から成る群から選択された 基であり； Ｒ３は−Ｈ；−Ｆ：−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＣＨ３；−（ＣＨ２）ｘ ＣＨ３（Ｘは０〜３である）；−Ｏ（ＣＨ２）ｖＣＨ３（Ｖは０〜３である）か ら成る群から選択された基であり；そしてＲ４は−Ｈ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ； −Ｉ；−（ＣＨ２）ｙＣＨ３（ｙは０〜３である）；−Ｏ（ＣＨ２）ｗＣＨ３（ Ｗは０〜３である）から成る群から選択された基であり；そして更に、 Ｒ２，Ｒ３およびＲ５はＲ１に関して任意の位置に存在してもよく、ただし、 （ａ）Ｒ１が−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ，−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨまた は−ＣＨ（ＯＨ）ＣＯＯＲ５である時、Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は−Ｈでなければ ならず； （ｂ）（Ｒ１が−ＣＨ２ＯＨでありそしてＲ２が−Ｃ６Ｈ５；−ＯＣＨ２Ｃ６Ｈ ５または−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である時、Ｒ３は−ＣＨ３，−ＯＨ，−Ｃｌ，−Ｂｒ ，−Ｆ，−１，−Ｈ，−ＯＣＨ３または−ＯＣＨ２ＣＨ３でなければならず、Ｒ ４は−Ｈでなければならず：そして （ｃ）Ｒ１が−（ＣＨ２）ｎＯＨでありｎが２〜６である時、Ｒ３およびＲ４は 両方とも−Ｈでなければならないことを前提とする〕 を有する化合物の群から選択された少なくとも１種の有機化合物および有機粘土 を含んで成る抽出組成物。 １４．前記有機粘土がベントナイト、マカロイド（Ｍａｃａｌｏｉｄ■）、ベン トン（Ｂｅｎｔｏｎｅ■）またはそれらの混合物、誘導体もしくは類似体である 、請求項１３の組成物。 １５．前記有機粘土が約０．１％〜約１０％の濃度で存在する、請求項１３の組 成物。 １６．前記式Ｉの有機化合物が、ベンジルアルコール、４−メトキシベンジルア ルコール、３−エトキシベンジルアルコールおよび４−フェノキシベンジルアル コールから成る群から選択される、請求項１３の組成物。 １７．核酸と非核酸との複雑な混合物を含有する試料から核酸を単離する方法で あって、 該試料を、次の性質： （ａ）約９．０〜約１５．５の誘電率；（ｂ）約１．３５〜約１．７０クーロン メートルの双極子モーメント；および （ｃ）有機化合物１部に対して約０．００１〜約０．３部の分配係数；を有する 有機化合物を含む抽出溶液と混合し；水相と非水相を形成せしめ；そして 非水相から水相を分離する、 ことを含んで成る方法。 １８．前記有機化合物が更に約０．７〜約１．９ｇ／ｍｌの比重を有する、請求 項１７の方法。 １９．前記有機化合物が４−ヘキシルレゾルシノールまたはレゾルシノールであ る、請求項１７の方法。