CN115887755A - 一种3d打印牛骨来源磷酸钙仿生骨再生支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3D打印牛骨来源磷酸钙仿生骨再生支架的制备方法，包括以下步骤：(1)将牛骨块破碎、煅烧、球磨，得到牛骨来源磷酸钙粉末；(2)将所得牛骨来源磷酸钙粉末与GO、海藻酸钠、水混合，得到浆料；(3)将所得浆料利用3D打印挤出成型，得到再生支架.本发明制备的支架中牛骨来源磷酸钙和GO分散性好，对提高支架的力学性能以及促进细胞的增殖和附着发挥出很好的协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其是大段骨组织缺损再生修复的组织工程技术领域；具体来说是骨组织工程仿生骨再生支架材料的制备方法。
背景技术
骨缺损是由先天性疾病、创伤、感染、肿瘤等原因引起的骨科常见病，目前大段骨缺损仍然是骨科面临的最大挑战之一。临床常用的治疗方法包括自体骨移植、异体骨移植、人工骨移植等，但都存在一定的局限性，如来源有限、强度低、术后易感染、存在免疫排斥反应、生物活性不足等。因此，仿生骨支架材料的制备仍然是组织工程中的关键挑战。
钙磷陶瓷材料具有良好的生物相容性和骨传导性能，用于组织工程支架材料后取得了较好的成骨效果。特别是动物来源磷灰石，作为一种非化学计量的纳米羟基磷灰石晶体，对骨的机械性和骨再生能起到重要作用，其生物再吸收速率与人骨无机矿物质接近，而合成羟基磷灰石很难完全模仿天然骨磷灰石的成分和结构。在成分方面，动物来源磷酸钙包含多种活性离子，如Mg2+、K+、Na+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Sr2+、F-及CO3 2-等，其中一些离子已被证明在骨再生中扮演重要角色，其生物再吸收速率与人骨无机矿物质接近。有关动物来源磷酸钙的研究以牛骨为最多，煅烧后天然牛骨的有机成分被去除，无免疫源性及细胞毒性。
大段骨缺损治疗的复合骨再生支架要具有优异的骨组织和血管再生能力，在此基础上还需要具有一定的力学强度，但目前仍未实现两者的最优组合。因此，如何进一步改善牛骨来源磷酸钙支架材料，使其更适合于作为组织工程支架材料是需要迫切解决的难题。
发明内容
本发明提供了一种仿生骨再生支架的制备方法。可实现牛骨来源磷酸钙的3D打印，并且打印出的再生支架具有强度高、促骨再生效果好的效果。
一种可3D打印的牛骨来源磷酸钙仿生骨再生支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将牛骨破碎、煅烧、球磨，得到牛骨来源磷酸钙粉末；
(2)将所得牛骨来源磷酸钙粉末与GO、海藻酸钠、水混合，得到浆料；
(3)将所得浆料利用3D打印挤出成型，得到再生支架。
作为一个较佳的实施例，步骤(2)中牛骨来源磷酸钙粉末、GO、海藻酸钠的重量比为(12～16)：(0.07～0.3)：(1～1.5)。
作为一个较佳的实施例，GO在固相中的质量比为0.5％～1.5％，更加优选1％。
作为一个较佳的实施例，步骤(2)所得浆料的固液质量比为(2～3)：10。
作为一个较佳的实施例，所述牛骨来源于新鲜牛胎骨，更加优选新鲜牛胎骨的松质骨部分。
作为一个较佳的实施例，所述牛骨在破碎前进行有机物脱除处理。
进一步地，可采用去离子水煮沸进行脱蛋白和脱脂处理，处理时间为8～10h。
进一步地，可采用NaOH溶液进行脱糖处理，所述NaOH溶液的浓度优选3～6mol/L，更加优选5mol/L，所述NaOH溶液处理的温度为95～100℃，时间为0.5～2h。
作为一个较佳的实施例，步骤(2)采用的牛骨来源磷酸钙粉末的粒径为10～50μm。
作为一个较佳的实施例，所述煅烧步骤如下：
(a)60～100℃烘干20～36h，优选90～100℃，更加优选95℃烘干，
(b)升温至600～900℃，优选850℃，保持2～4h；
(c)继续升温至1200～1300℃，保持4～6h；
(d)自然冷却至室温。
作为一个较佳的实施例，步骤(2)混合方法包括：
(a)将海藻酸钠，GO和牛骨来源磷酸钙粉末分别与去离子水混合均匀；
(b)将牛骨来源磷酸钙溶液倒入GO溶液中，混合均匀；
(c)将所得牛骨来源磷酸钙/GO混合溶液倒入海藻酸钠溶液中，混合均匀。
作为一个较佳的实施例，上述溶液混合方式为磁力搅拌和/或超声分散。
作为一个较佳的实施例，打印的环境温度20-30℃。
作为一个较佳的实施例，固化的步骤为自然干燥或低温烘干，优选在45～65℃的真空干燥箱中烘干。
本发明还提供一种牛骨来源磷酸钙仿生骨支架，采用上述的方法制备得到。
本发明将牛骨来源磷酸钙粉末与氧化石墨烯(GO)充分混合，使得支架中GO和牛骨来源磷酸钙纳米颗粒在支架具有很好的分散性，从而提高支架的机械强度。此外，GO表面含有各种氧官能团(如环氧树脂，羟基，酮，羧基和二醇等)，同时具有大的表面积，与牛骨来源磷酸钙的均匀结合，有利于细胞高效附着和增殖。
本发明制备的打印浆料还具有良好的流动性和形状保持能力，能够满足较高的打印精度、无需支撑结构、低温打印等要求，制备出的支架具有连接贯通孔隙结构，且支架内部无粉末和毒性单体残留。本发明为研发高强度可降解骨再生支架提供科学依据，为承重部位大段骨缺损的治疗提供一种新的方案。
附图说明
图1为本发明制备的不同磷酸钙来源以及不同含量的GO仿生骨再生支架的CCK-8测试结果；
图2为通过EDS测定的本发明制备的牛骨来源磷酸钙/GO/海藻酸钠复合支架表面的元素分布，其中左图为C元素(左)、中图为Ca元素(中)、右图为P元素(右)的分布；
图3为本发明通过3D打印挤出成型技术制备的复合支架，其中左边为牛骨来源磷酸钙/GO/海藻酸钠复合支架，右边为牛骨来源磷酸钙/海藻酸钠复合支架，可以看到复合了GO的支架边缘形状更加完整。
具体实施方式
以下实施例以发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。
实施例1
(1)牛骨来源磷酸钙的制备：
将新鲜胎牛骨的松质骨部分锯成规格约为5cm×5cm×5cm的长方体骨块，采用去离子水煮沸8～10h和5mol/L的NaOH溶液95～100℃水浴60min脱去有机物质。将上述处理后的牛骨块放入粉碎机粉碎，再将粉碎后的牛骨粉在95℃烘干24h，放入电阻炉中煅烧，以10℃/min的升温速度缓慢升至850℃，维持3h后，继续升温至1200～1300℃煅烧5小时，自然冷却至室温。将冷却后的牛骨粉末以无水乙醇为介质湿法球磨，转速400rpm，用氧化锆球磨罐球磨12h，球磨珠与粉末质量比为4:1。粉末悬浊液置于90℃烘箱中充分干燥，过325目筛网制备得到50μm以下的牛骨来源磷酸钙粉末。
对所得牛骨来源磷酸钙进行XPS能谱分析，其检测结果如下表1所示。可以看出，牛骨来源磷酸钙包含多种活性离子Mg2+、K+、Na+、Zn2+、Fe2+、Cu2+、Sr2+等。
表1所得牛骨来源磷酸钙的XPS能谱分析结果
| 元素 | Ca | P | Na | Mg | K | Sr | Al | Zn | Fe | Pb | Cu |
| 含量(％) | 29.3 | 16.5 | 0.7 | 0.64 | 0.08 | 0.04 | 0.03 | 0.02 | 0.01 | 0.001 | 0.0004 |
(2)牛骨来源磷酸钙/GO/海藻酸钠3D打印浆料的制备：(a)称1.2g的海藻酸钠，0g(0.076g/0.154g/0.231g)GO，和14g牛骨来源磷酸钙粉末，并分别加入到装有20ml，10ml，30ml去离子水的烧杯中；(b)磁力搅拌三种溶液30分钟和超声波分散30分钟；(c)牛骨来源磷酸钙溶液倒入GO溶液中，然后磁搅牛骨来源磷酸钙/GO混合溶液30分钟和超声波分散30分钟；(d)将牛骨来源磷酸钙/GO混合溶液倒入海藻酸钠溶液中，然后磁力搅拌牛骨来源磷酸钙/GO/海藻酸钠混合溶液，以获得用于支架制造的牛骨来源磷酸钙/GO/海藻酸钠混合浆料，转移至打印料筒，出料喷头直径选用600μm，移动速度6mm/s，采用低温3D打印挤出成型技术在环境温度20～30℃下打印5cm×5cm×3cm的长方体，得到多孔的牛骨来源磷酸钙仿生骨再生支架。
实施例2
采用实施例1同样的制备方法，不同之处在于：
采用人工合成磷酸钙替换实施例1中的牛骨来源磷酸钙，采用的人工合成磷酸钙的组成及比例为羟基磷灰石：磷酸三钙：磷酸四钙＝74.1：23.1：2.8。
对实施例1～2制得的仿生骨再生支架进行力学性能测试，结果如下表2所示。
表2实施例1～2制得的仿生骨再生支架的力学性能
从上表可以看出，本发明制得的生骨再生支架具有较高的抗压强度和较好的骨诱导性，可承受较高的荷载以及加速机体成骨时间。
对实施例1～2所得仿生骨再生支架进行CCK-8细胞增殖测试，结果如图1所示。
上述实施例仅为说明本发明所举，而非限制本发明实施方式及保护范围，凡借鉴本发明的主体设计思想和精神上做出的改进及无创新变化，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可3D打印的牛骨来源磷酸钙仿生骨再生支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将牛骨破碎、煅烧、球磨，得到牛骨来源磷酸钙粉末；
(2)将所得牛骨来源磷酸钙粉末与GO、海藻酸钠、水混合，得到浆料；
(3)将所得浆料利用3D打印挤出成型，脱水固化，得到再生支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中牛骨来源磷酸钙粉末、GO、海藻酸钠的重量比为(12～16)：(0.07～0.3)：(1～1.5)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛骨在破碎前进行有机物脱除处理。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机物脱除处理包括：采用去离子水煮沸进行脱蛋白脱脂、采用NaOH溶液进行脱糖处理。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述牛骨来源磷酸钙粉末的粒径为10～50μm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述煅烧包括如下步骤：
(a)60～100℃烘干20～36h；
(b)升温至600～900℃，保持2～4h；
(c)继续升温至1200～1300℃，保持4～6h；
(d)自然冷却至室温。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)混合方法包括：
(a)将海藻酸钠，GO和牛骨来源磷酸钙粉末分别与去离子水混合均匀；
(b)将牛骨来源磷酸钙溶液倒入GO溶液中，混合均匀；
(c)将牛骨来源磷酸钙/GO混合溶液倒入海藻酸钠溶液中，混合均匀。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，打印的环境温度20-30℃。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述固化的步骤为自然干燥或低温烘干。
10.一种牛骨来源磷酸钙仿生骨支架，其特征在于，采用权利要求1～9任一项所述的方法制备得到。
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| CN107158465A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-09-15 | 西北民族大学 | 一种骨支架复合材料的制备方法 |
| CN109223255A (zh) * | 2018-09-27 | 2019-01-18 | 叶川 | 一种生物凝胶材料、人工膝关节及其制备方法 |
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2022
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