CN114931669B - 一种掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料的应用，涉及生物材料领域，所述掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料的制备包括以下步骤：骨料经脱脂、脱蛋白处理后进行煅烧，然后浸泡在胶原溶液中，真空放置；取出后浸泡在含锶离子和镁离子的透明质酸溶液中，真空放置；取出后浸泡在壳聚糖溶液中，再次真空放置；取出骨粉后重复浸泡在透明质酸和壳聚糖溶液的步骤3‑5次，得到掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料。将次生物活性涂层应用于制备骨修复产品、骨再生产品、牙齿修复产品、牙齿再生产品、骨科填充物材料、骨组织工程支架材料中，提高了产品的生物相容性和钙化程度，骨组织生长能力增强，使产品性能得到进一步改善。

Description

一种掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料的应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种含锶和镁离子生物活性涂层的骨来源天然羟基磷灰石支架材料的应用。
背景技术
骨修复材料应具有原有部位的生理功能，如支撑作用或骨引导作用，能模拟人体骨的生长与吸收、参与修复部位的新陈代谢。现有的骨修复材料普遍存在药物释放过快和成骨能力弱等缺点，因此，研制一种具有长效缓释、表面反应活性强且能加速骨缺损修复的骨修复材料，在骨修复治疗领域上具有极为重要的意义。
羟基磷灰石是人体骨骼、牙齿的主要无机成分，对成骨细胞的黏附和增殖有着积极的影响，它以植入物表面涂层、骨水泥和支架材料的形式被广泛应用于骨科和牙科等领域。羟基磷灰石具有良好的生物活性和生物相容性，骨传导性优异，植入人体后能在短时间内与人体的软硬组织形成紧密结合，是一种性能优良的骨修复材料。羟基磷灰石可以由自然资源加工获得，也可以由化学试剂直接合成。但人工合成的羟基磷灰石的结晶性高于自然骨，这使羟基磷灰石的溶解性较差，在应用过程中不利于新骨的形成。为了提高修复材料与机体的表面反应活性、刺激诱导骨组织再生，促进长效缓释功能，可利用天然骨材料并在表面修饰一层涂层。
胶原又称胶原蛋白，具有生物活性，是胞外基质中最主要的水不溶性纤维蛋白，广泛存在于动物机体的一切组织中，机体内胶原蛋白的存在使结缔组织具有了一定的结构与机械力学性能。透明质酸是细胞间基质中的一种重要天然多糖，具有保水作用，可以特异地与CD44受体结合，在调节细胞行为方面有重要作用。在胶原中复合透明质酸，利用其优越的生物功能，促进细胞分化与增殖，有利于得到新生组织，加速伤口愈合。壳聚糖是一种带正电荷的天然聚多糖，其结构与细胞外基质的主要成分糖胺聚糖类似，对人体细胞有很强的亲和性，生物学功能优异，具有较强的生物降解性和生物相容性，是被广泛应用的功能性生物材料。壳聚糖的力学性能强于胶原，在体液环境中降解速率能满足骨组成工程的需要，并且能和胶原复合，增加胶原的稳定性。
羟基磷灰石植入人体后，不易降解的主要原因在于其晶形比较完整。镁元素在骨骼中的含量仅次于钙和磷，是维持骨细胞结构和功能所必需的元素。镁可以直接影响骨骼的钙化过程。锶是人体中一种必须的微量元素，在一定程度上能代替钙参与骨代谢的生理活动。在羟基磷灰石中掺入锶后，羟基磷灰石在人体体液中的降解速率加快，生物降解性和骨诱导性增强，促进骨细胞的增殖分化，促进骨钙化，因此锶羟基磷灰石极有可能作为新一代的骨科填充物材料或骨组织工程支架材料。
目前，由骨制备的掺锶羟基磷灰石用于修复骨缺损已有报道。公开号为CN113521387A的中国发明专利公布了一种可用于骨修复的掺锶天然羟基磷灰石支架材料及其制备方法，包括以下步骤：将骨依次进行脱脂和梯度升温煅烧，制备得到的煅烧骨羟基磷灰石材料置于硝酸锶反应液中进行离子交换反应，经高温煅烧后得到掺锶天然羟基磷灰石支架材料。该掺锶羟基磷灰石支架材料能以一种持续缓慢的方式释放锶离子，加速骨缺损的修复。
公开号为CN103342555A的中国发明专利公布了一种掺锶镁纳米羟基磷灰石的制备方法，包括以下步骤：按预定摩尔比将硝酸锶溶液、硝酸镁溶液和磷酸氢氨溶液同时加入到硝酸钙溶液中，调节Ph经沉淀过滤洗涤后，低温80-90℃反应清洗得到掺锶镁纳米羟基磷灰石。该掺锶镁纳米羟基磷灰石仿生了自然骨，可应用于硬组织修复的产品中，缩短骨修复的周期。
本发明的目的是为了克服既往生物活性羟基磷灰石支架材料所存在的不足，提供一种新型含锶镁离子的生物活性羟基磷灰石材料在制备骨修复、骨再生、牙齿修复、牙齿再生产品中的应用，大大提高了产品的生物相容性、生物活性以及促进骨组织再生的能力，该生物活性涂层羟基磷灰石材料具有广泛的骨/牙齿再生修复，应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供了一种掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料的应用，将得到的生物涂层羟基磷灰石材料应用于制备骨修复产品、骨再生产品、牙齿修复产品、牙齿再生产品、骨科填充物材料、骨组织工程支架材料中。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料在制备骨修复产品、骨再生产品、牙齿修复产品、牙齿再生产品、骨科填充物材料、骨组织工程支架材料的应用，其中，所述掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料按照以下步骤制备：
(1)骨料经脱脂、脱蛋白处理后进行煅烧，得到骨粉1；
(2)将骨粉1加入胶原溶液中，真空放置，取出得到骨粉2；
(3)将骨粉2加入含锶离子和镁离子的透明质酸溶液中，真空放置，取出得骨粉3；
(4)将骨粉3加入壳聚糖溶液中，真空放置，取出得骨粉4；
(5)将骨粉4重复步骤(3)-(4)的操作，重复3-5次，干燥，得掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料。
优选地，步骤(1)中，所述脱脂具体为：将骨料放入氯仿/甲醇混合液中，并于30-50℃水浴震荡，每0.5-2h更换氯仿/甲醇混合液，共5-10次，之后清洗2-8次，每20-40min更换一次水。
进一步优选地，所述骨料为动物骨片、骨粒、骨粉中的至少一种。
进一步优选地，所述骨料和氯仿/甲醇混合液的重量比为1:2-5，更进一步优选为1:3。
进一步优选地，所述氯仿/甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1-3:1，更进一步优选为2:1。
进一步优选地，每1h更换氯仿/甲醇混合液,共更换8次。
进一步优选地，所述清洗是指：用纯化水浸泡并置于水浴震荡中清洗。
进一步优选地，所述清洗次数为4次。
进一步优选地，每30min更换一次水。
优选地，步骤(1)中，所述脱蛋白具体为：将脱脂后的骨料放入过氧化氢溶液中3-6h，之后开水煮0.5-2h，取出放入4-10℃的氯化氢溶液中4-6h，清洗后干燥。
进一步优选地，所述骨料与过氧化氢的重量比为1:2-5，更进一步优选为1:3。
进一步优选地，所述过氧化氢溶液的浓度为20-50％，更进一步优选为30％。
进一步优选地，过氧化氢溶液浸泡4h，开水煮1h。
进一步优选地，所述氯化氢溶液的温度维持在4℃。
进一步优选地，所述氯化氢溶液的浓度为2-6M，更进一步优选为4M。
进一步优选地，所述清洗清洗为：用蒸馏水反复浸洗。
进一步优选地，所述干燥为真空干燥
优选地，步骤(1)中，所述煅烧温度为600-850℃，进一步优选为700℃；煅烧时间为4-7h，进一步优选为6h。
优选地，步骤(2)中，所述胶原溶液的浓度为0.5-3mg/ml，进一步优选为2mg/ml。
优选地，步骤(3)中，所述透明质酸溶液的浓度为0.5-3mg/ml，进一步优选为2mg/ml。
优选地，步骤(3)中，所述锶离子的浓度为0.05-0.4mol/L，进一步优选为0.1mol/L。
优选地，步骤(3)中，所述镁离子的浓度为0.05-0.4mol/L，进一步优选为0.2mol/L。
优选地，步骤(3)中，所述锶离子的来源包括硝酸锶，氯化锶，进一步优选为氯化锶。
优选地，步骤(3)中，所述镁离子的来源包括硝酸镁，氯化镁，进一步优选为氯化镁。
优选地，步骤(4)中，所述壳聚糖溶液的浓度为0.5-3mg/ml，进一步优选为2mg/ml。
优选地，步骤(2)-(4)中，所述真空放置时间为5-20分钟，进一步优选为15分钟。
优选地，步骤(5)中，所述重复次数为4次。
优选地，步骤(5)中，所述干燥方法包括但不限于常压干燥，真空干燥，冷冻干燥等，进一步优选为冷冻干燥。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的一种掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料在制备骨修复产品、骨再生产品、牙齿修复产品、牙齿再生产品、骨科填充物材料、骨组织工程支架材料的应用，由于透明质酸和壳聚糖具有良好的生物活性、相容性及可降解性，透明质酸可以促进细胞的分化与增殖，壳聚糖与胶原复合增加胶原的稳定性，锶和镁可以刺激成骨细胞分化，促进骨钙化。因此，生物活性涂层的羟基磷灰石材料制备的骨修复产品、骨再生产品、牙齿修复产品、牙齿再生产品、骨科填充物材料、骨组织工程支架材料具有良好的生物相容性。
2.通过层层自组装法制备的聚合物薄膜涂层，表面致密、平整，具有良好的机械强度和粘结强度，可以使骨修复产品、骨再生产品、牙齿修复产品、牙齿再生产品、骨科填充物材料、骨组织工程支架材料充分的发挥其生物活性和成骨能力。
3.金属离子的加入使生物活性涂层的羟基磷灰石材料制备的骨修复产品、骨再生产品、牙齿修复产品、牙齿再生产品、骨科填充物材料、骨组织工程支架材料具有良好的生物钙化活性。
附图说明
图1是本发明实施例1和对比例3制备得到的含生物活性涂层的羟基磷灰石材料的扫描电镜测试图；
图2是本发明实施例1和对比例3制备得到的含生物活性涂层的羟基磷灰石材料的细胞活死染色实验图和细胞增殖结果图；图中，第1、3、5天共三组，每个数据组中，柱形从左至右依次为：TCP组、Origina组l、Col组、Col/HA/CS组、S0.1M0.2组；实验数据使用SPSSStatistics 21.0进行统计分析，采用t检验方法用于确定独立样本之间的统计差异，p<0.05标为*，被认为具有统计学意义，p<0.01标为**和p<0.001标为***被认为是非常显著的；图中TCP代表细胞培养板样品。
图3是本发明实施例1和对比例3制备得到的含生物活性涂层的羟基磷灰石材料的ALP表达量结果图和染色图。图中，第3、7、14天共三组，每个数据组中，柱形从左至右依次为：TCP组、Origina组l、Col组、Col/HA/CS组、S0.1M0.2组；实验数据使用SPSS Statistics21.0进行统计分析，采用t检验方法用于确定独立样本之间的统计差异，p<0.05标为*，被认为具有统计学意义，p<0.01标为**和p<0.001标为***被认为是非常显著的；图中TCP代表细胞培养板样品。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。下文中所述含量均为质量含量。
下述实施例中，所述胶原为I型胶原，购自Solarbio，美国；透明质酸分子量80-100万，购自西安隆茂生物科技有限公司；壳聚糖为95％壳聚糖，购自上海毕得医药；氯化锶，纯度99％，购自武汉裕清嘉衡药业有限公司；氯化镁，纯度，99％，购自湖北云镁科技有限公司；硝酸锶，纯度99％，购自武汉裕清嘉衡药业有限公司；硝酸镁，纯度99％，购自湖北云镁科技有限公司。
实施例1
(1)新鲜骨冷冻后去除软组织和骨髓，取骨干部分密质骨和关节软骨下松质骨，蒸馏水反复冲洗，晾干后粉碎得到骨粉；将骨粉放入氯仿/甲醇混合液(氯仿：甲醇＝2:1，骨粉和混合液的重量比为1:3)，于40℃水浴震荡，每1h更换氯仿/甲醇混合液，共8次，之后用水浸泡并水浴震荡清洗4次，每30min更换一次水；干燥后的骨粉用30％过氧化氢浸泡处理4h后再开水煮1h，然后加入4M氯化氢溶液于4℃下处理5h。处理后的骨粉用蒸馏水反复浸洗，干燥；然后放入电阻炉700℃煅烧6h，得到骨粉1(Original)；
(2)分别配置浓度均为2mg/ml的透明质酸溶液、壳聚糖溶液和胶原溶液。在透明质酸溶液中加入氯化锶和氯化镁，使溶液中锶离子和镁离子浓度分别为0.1mol/L和0.2mol/L；
(3)将骨粉1浸泡在胶原溶液中并放入真空烘箱中维持真空状态15分钟，去离子水冲洗后真空干燥得到骨粉2(Col)；
(4)将骨粉2浸泡在步骤(2)所述含锶和镁离子的透明质酸溶液中，真空维持15分钟后用去离子水冲洗得到骨粉3；
(5)将骨粉3放入壳聚糖溶液中真空维持15分钟，取出，用去离子水冲洗；
(6)重复步骤(4)-(5)共4次，干燥后得到掺锶镁离子生物活性涂层的骨粉样A(S0.1M0.2)。
实施例2
和实施例1不同的是，步骤(2)中，透明质酸溶液、壳聚糖溶液和胶原溶液的浓度为3mg/ml，镁离子和锶离子的浓度均为0.4mol/L，其余皆相同，得到掺锶镁离子生物活性涂层的骨粉样品B。
实施例3
和实施例1不同的是，步骤(2)中，透明质酸溶液、壳聚糖溶液和胶原溶液的浓度为0.5mg/ml，镁离子和锶离子的浓度均为0.05mol/L，其余皆相同，得到掺锶镁离子生物活性涂层的骨粉样品C。
对比例
和实施例1不同的是，骨粉浸泡的透明质酸溶液中不含锶离子和镁离子，其余皆相同。得到不掺锶镁离子生物活性涂层的骨粉样品D(Col/HA/CS)。
结果检测：
1、离子累计释放量测试
测试方法：每组骨颗粒分别称取50mg放入试管，每管加10mL PBS，在37℃的水浴摇床环境下持续放置。分别在1天、4天、7、14天、21天、28天时将试管中的PBS全部收集起来并做好标记，用于做释放离子含量的测试。同时将10mL新鲜的PBS补充到试管中，把试管放回水浴摇床继续进行释放实验。取出在不同时候收集的PBS溶液，并将溶液转移到电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)中对其镁、锶离子的含量进行检测，将不同天数所得的数据进行加和，绘制累计的离子释放曲线。
测试结果如表1，表2所示：
表1
从表1和表2可得知锶镁离子在前7天是主要的释放阶段，后续虽一直在持续释放但释放量比较少，释放时间可达28天以上。通过实施例与对比例的锶镁离子释放量可得知，仅涂层胶原、壳聚糖和透明质酸的羟基磷灰石未释放锶镁离子，涂层中生物活性成分及锶镁离子浓度越高则锶镁离子的累计释放量越高。涂层中锶镁离子的加入能够促进药物缓释，锶镁离子存在的体液环境中有利于成骨细胞的生成。
2、表面形貌测试
测试方法：称取骨粉试样50mg，将各组骨粉浸泡在15mL37℃的SBF里，每隔24小时换一次SBF。分别在第3天和第7天时取出骨粉，去离子水清洗后冷却干燥，得到矿化的骨粉。将其置于SEM下观察形貌并使mapping扫描其表面的元素分布情况。
测试结果如附图1所示：
从图1中可以看出，各组骨粉的微观表面在第3天已经出现了片状物质的堆积，这是典型的矿化沉积。而在第7天时骨粉表面已经有了较大颗粒状的矿化沉积，尤其样品A(S0.1M0.2)不管是沉积颗粒的大小还是数量，明显比Original多。这是因为涂层中的胶原、透明质酸和锶离子都有着加速矿化沉积的作用，因此样品Col和样品Col/HA/CS的矿化沉积效果也要比样品Original稍好一些。这就验证了在骨粉上所构建的涂层有着优异的生物矿化活性。
3、细胞活死染色测试
测试方法：使用48孔板，按每孔1×104个BMSCs的接种密度进行接种，补加浸提液至每孔500μL，放入培养箱进行培养，每隔48小时取出孔板更换一次浸提液。分别在1、5天取出一组细胞，吸出培养液，用PBS清洗3次，配制Live/Dead染液(5mLPBS+10μL Calcein-AM+10μLPI)，每孔加入200μL染液，室温下避光孵育30分钟。之后吸出染液用PBS小心反复冲洗2次，将细胞板放在激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)下观察细胞的存活状况并进行拍照，绿色荧光是活细胞，红色荧光是死细胞。
测试结果如附图2所示：
从图2中可以看出细胞都能在骨粉上正常增殖。其中样品A(S0.1M0.2)≈TCP＞样品Col/HA/CS＞样品Col≈样品Original，这说明了我们在骨粉上构建的涂层明显增强了其细胞相容性，可促进细胞增殖。而样品Col与样品Original相近可能是因为单纯的生物活性涂层没有起到明显促细胞增殖的效果；通过细胞活死(Live/Dead)染色实验，在CLSM(激光扫描共聚焦显微镜)下观察第5天的细胞生长情况并拍照记录。从Live/Dead图中我们能看到细胞在骨粉表面贴附良好，基本没有红色荧光，同时也符合吸光度值所反映的情况，细胞在样品A(S0.1M0.2)上生长情况最好。
4、ALP表达测试
测试方法：使用BCA总蛋白检测中3、7、14天的细胞培养板继续实验。在酶标板每孔中加入30μL样品，再加入200μL配好的工作液，在摇床上振荡30秒后放在37℃水浴中孵育半小时，待酶标板冷却到室温后置于酶标仪中检测560nm的吸光度。得到定量结果后再根据BCA总蛋白检测得到的每孔总蛋白量，与ALP定量结果进行归一化处理。
测试结果如附图3所示：
从图3中可以看出含锶镁离子生无涂层的骨粉样品A(S0.1M0.2)其ALP(碱性磷酸酶)表达量最多，染色程度也最深，在第7天达到峰值。这说明了涂层负载的锶镁离子起到了促成骨分化的作用。而不含锶镁离子的样品Col/HA/CS，因为这些生物大分子自身具有一定的促成骨分化能力，所以ALP表达仅次于样品A(S0.1M0.2)。像样品Col则由于生物活性组分涂覆量过少，没有起到明显的作用，只是因为本身骨粉释放的钙离子也有促成骨分化的作用，和样品Original的ALP表达量相似，且高于TCP组。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料在制备骨修复产品、牙齿修复产品中的应用，其特征在于，所述掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料的制备方法包括以下步骤：
(1)骨料经脱脂、脱蛋白处理后进行煅烧，得到骨粉1；所述煅烧温度为600-850℃，煅烧时间为4-7h；
(2)将骨粉1加入胶原溶液中，真空放置，取出得到骨粉2；
(3)将骨粉2加入含锶离子和镁离子的透明质酸溶液中，真空放置，取出得骨粉3；所述锶离子和镁离子的浓度为0.05-0.4mol/L；
(4)将骨粉3加入壳聚糖溶液中，真空放置，取出得骨粉4；
(5)将骨粉4重复步骤(3)-(4)的操作，重复3-5次，干燥，得到掺锶镁生物活性涂层的羟基磷灰石材料。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中脱脂具体为：将骨料按重量比1:2-5放入氯仿/甲醇混合液中，并于30-50℃水浴震荡，每0.5-2h更换氯仿/甲醇混合液，共5-10次，之后清洗2-8次，每20-40min更换一次水。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氯仿/甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1-3:1。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中脱蛋白具体为：将脱脂后的骨料放入过氧化氢溶液中3-6h，之后开水煮0.5-2h，取出放入4-10℃的氯化氢溶液中4-6h，清洗后干燥。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述过氧化氢溶液的浓度为20-50％，所述氯化氢的浓度为2-6M。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)-步骤(4)中胶原溶液，透明质酸溶液，壳聚糖溶液的浓度为0.5-3mg/ml。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述胶原溶液，透明质酸溶液，壳聚糖溶液的浓度为2mg/ml。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述锶离子的浓度为0.1mol/L，镁离子的浓度为0.2mol/L。
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