CN109010920A - 一种含有干细胞、祖细胞和细胞外基质的美容制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含有干细胞、祖细胞和细胞外基质的美容制剂，属于组织工程领域。本发明的干细胞是经过筛选的脂肪干细胞，它在汇合度为80％时，上清液中每毫克总蛋白含有≥300pg的血管内皮生长因子；本发明的祖细胞是经过筛选的内皮祖细胞，它的CD31抗原的表达率>90％，CD73抗原的表达率>90％，CD90抗原的表达率<5％，CD45抗原的表达率<5％。本发明可以用于解决美容皮下填充材料不能血管化的问题。

Description

一种含有干细胞、祖细胞和细胞外基质的美容制剂
技术领域
本发明涉及组织工程领域，尤其涉及含脂肪间充质干细胞和内皮祖细胞以细胞外基质为支架材料的美容制剂及其制备方法和应用。
背景知识
随着物质生活水平的提高，越来越多的人开始注重形象提升，开始接受医学美容。其中，皮肤除皱，特别是面部除皱，广受人们青睐。
皮肤老化后，胶原、透明质酸、纤连蛋白等细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)合成减少，胶原、弹力纤维变性老化，皮肤萎缩变薄、出现皱纹。而除皱的方法有皮下填充玻尿酸(即透明质酸)或者自体脂肪以及肉毒素麻痹肌肉神经等手段。相比较而言，皮下填充生物相容性材料的方法可操作性和安全性都更高，具有优势。但是现阶段皮下填充生物材料遇到的主要问题移植材料内部容易出现钙化现象。分析其原因多为移植材料在移植到皮下后未能很好的血管化。
在组织工程研究中，填充复合有干细胞(称为“种子细胞”)的材料植入体内，可以帮助组织修复。那么在皮下移植复合有干细胞的填充材料，将有望解决移植材料不能血管化的问题。
脂肪间充质干细胞(Adipose derived Stem Cells，ADSCs)是来源于脂肪组织的干细胞，它具有自我更新、多向分化的能力，在再生医学领域已经被广泛认可。但若单独移植脂肪间充质干细胞到皮下，其分化成血管的能力很弱。
内皮克隆形成细胞(Endothelial Colony Forming Cells,ECFCs)又称为为内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)，是血管内皮细胞(Endothelial Cells，ECs)的前体。内皮祖细胞不仅存在于胚胎发育阶段参与血管新生，也存在于脐带血、骨髓、外周血等组织中，在生理和病理条件下能够修复损伤的血管，在维持血管内皮细胞代谢平衡和血管结构的完整性上发挥重要作用。但是，单独移植内皮祖细胞到皮下其自发形成的血管组织结构脆弱，管腔较细，血管化程度不高，同样不能满足除皱要求。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种脂肪间充质干细胞和内皮祖细胞复合可降解材料的美容制剂的制备方法和应用。
本发明提供了一种组合物，其特征在于：它包括脂肪间充质干细胞、内皮祖细胞和细胞外基质；
进一步地，所述脂肪间充质干细胞与内皮祖细胞的混合比例为(1-3):(3-1)。
进一步地，所述脂肪间充质干细胞与内皮祖细胞的混合比例为1:1。
前述的组合物，其特征在于：所述脂肪间充质干细胞是具有如下特征的脂肪间充质干细胞：
a、汇合度为80％时，培养上清液中，每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量≥300pg；
b、CD10抗原表达率≥95％，CD200抗原表达率＜2％。
前述的组合物，其特征在于：所述内皮祖细胞是具有如下特征的内皮祖细胞：
a.CD31抗原的表达率为94.2％～99.5％，CD73抗原的表达率为90.6％～99.4％，CD90抗原的表达率为0.0～1.7％，CD45抗原的表达率为0.0～1.9％，CD133抗原的表达率为0.0％～14.1％，CD34抗原的表达率为8.4％～78.5％，VEGFR2抗原的表达率为12.6％～95.8％；
b.它可以内吞乙酰化低密度脂蛋白。
前述的组合物，其特征在于：所述细胞外基质为纤连蛋白、胶原、透明质酸和基质胶中的一种或多种；优选所述细胞外基质为Matrixgel。
前述的组合物，其特征在于：所述组合物中还含有缓冲液；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或者生理盐水。
前述的组合物，其特征在于：所述组合物中还含有缓冲液每毫升组合物中脂肪间充质干细胞的数量为1×105至5×107，优选地2×105至2×107，优选地为5×105至1×107，优选地为1×106至5×106。
前述的组合物，其特征在于：每毫升组合物中内皮祖细胞的数量为1×105至5×107，优选地2×105至2×107，优选地为5×105至1×107，优选地为1×106至5×106。
本发明还提供了前述组合物在制备皮肤美容制剂的用途。
前述用途，其特征在于：所述皮肤美容制剂为皮下填充物。
本发明以脂肪间充质干细胞和内皮祖细胞作为种子细胞，复合到细胞外基质后，移植到裸鼠皮下，可以形成肉眼可见的血管组织，避免了细胞外基质的钙化。
本发明提供的复合物克服了传统皮肤美容制剂的容易钙化的问题，在皮肤美容方面具有较好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是人类脂肪间充质干细胞形态图。A1，接种后2天后可见贴壁；A2，贴壁4-5天后可见较多长梭样hADSCs；A3，汇合度80％左右的hADSCs。hADSCs，人类脂肪间充质干细胞。
图2是FITC和PE通道双染脂肪间充质干细胞表面标志物流式检测图。A，IgG1κ-FITC/IgG 1κ-PE Isotype control；B，HLA-DR-FITC/CD73-PE；C，CD90-FITC/CD14-PE/CD34-PE；D，CD45-FITC/CD105-PE；E，CD44-FITC/CD166-PE；F，CD29-FITC/CD79α-PE；G，CD146-FITC/CD31-PE。
图3是hADSCs三向分化能力图。B1，hADSCs成骨分化；B2，hADSCs成脂分化；B3，hADSCs成软骨分化。hADSCs，同图1。
图4是脂肪间充质干细胞CD10-FITC和CD200-PE双通道流式筛选图。
图5是细胞培养上清总蛋白含量图。AM-MSC：羊膜间充质干细胞，N＝6；CP-MSC：绒毛膜间充质干细胞，N＝5；DP-SMC：蜕膜间充质干细胞，N＝5；UC-MSC：脐带间充质干细胞，N＝13；ASC：脂肪间充质干细胞，N＝22。图6A是脂肪间充质干细胞克隆形成图。
图6B是脂肪间充质干细胞传代扩增曲线。n＝3
图7是hEPCs细胞形态图。A1，接种3天后可见贴壁细胞；A2，贴壁6-7天后可见较大铺路石样hEPCs克隆；A3，汇合度80％左右的hEPCs。hEPCs，人类内皮祖细胞。
图8是hEPCs流式检测结果。A.CD31；B.CD73；C.CD90；D.CD45；E.CD133；F1-F4.CD34；G1-G4.VEGFR2。VEGFR2，血管内皮细胞生长因子受体2；hEPCs，同图7。
图9是hEPCs传代到P10代的扩增曲线。n＝3；hEPCs，同图7。
图10是hEPCs内吞乙酰化低密度脂蛋白能力图。B1，DAPI染色的hEPCs细胞核；B2，内吞到hEPCs细胞里的Dil标记的ac-LDL；B3，B1和B2的重叠图。DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚；Dil，1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐；ac-LDL，乙酰化低密度脂蛋白；hEPCs，同图7。
图11是hEPCs细胞在Matrigel成血管实验图。D1，hEPCs铺在Matrigel上2小时后开始形成管状结构；D2，hEPCs铺在Matrigel上16小时后成网状结构。hEPCs，同图7。
图12是材料对照组包埋材料的直观图。
图13是hEPCs+材料组包埋材料的直观图。hEPCs，同图7。
图14是hADSCs+材料组包埋材料的直观图。hADSCs，同图1。
图15是hEPCs+hADSCs+材料组包埋材料的直观图。hEPCs，同图7；hADSCs，同图1。
图16是材料对照组的H&E切片图。H&E，苏木精&伊红染色。
图17是hADSCs+材料组的H&E切片图。hADSCs，同图1；H&E，同图16。
图18是hEPCs+材料组的H&E切片图。hEPCs，同图7；H&E，同图16。
图19是hEPCs+hADSCs+材料组的H&E切片图。hEPCs，同图7；hADSCs，同图1；H&E，同图16。
图20是H&E切片的显微视野血管管腔数目统计图。ADSC，脂肪间充质干细胞；EPC，内皮祖细胞；A+E，脂肪间充质干细胞和内皮祖细胞。
具体实施方式
以下将以实施例的方式进一步说明。
缩略词：
hADSCs:人类脂肪间充质干细胞；
SVF:血管基质组分；
hEPCs:人类内皮祖细胞。
实施例1人类脂肪间充质干细胞(hADSCs)分离培养及鉴定
一、脂肪间充质干细胞的获取
(一)分离方法
1.细胞获取
取抽脂手术获得的脂肪组织用注射级生理盐水清洗3-5次，优选地，使用注射级生理盐水清洗5次；将清洗后的脂肪组织与消化液按体积比1:1混合，置于37℃恒温摇床中转速150rpm消化2h。所述消化液为0.2％的胶原酶液。
2.获取血管基质组分(SVF)
将步骤1中消化后的脂肪组织碎片以900g离心5-10min，取下层沉淀得到SVF，其中含有脂肪间充质干细胞。
3.SVF重悬培养
将步骤2中离心后的血管基质组分SVF加入培养基中重悬，以每5mL抽脂产物消化得到的SVF接种1瓶T75培养瓶的密度接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，48h后第一次换液，之后每2d换液一次。所述培养基为DMEM/F12培养基，其中含有体积分数为2-5％的人富血小板血浆。
富血小板血浆的获取方法为：取人体新鲜血液加入柠檬酸钠0.1mol/L，将该血液置于低温离心机中以3000-10000g离心5-20min，收集上层液即为富血小板血浆。
(二)鉴定方法
1.分离获得的脂肪间充质干细胞能贴壁生长，细胞形态呈现长梭形，效果见图1。
2.细胞表面标志物的流式鉴定。
细胞培养汇合度达到80％左右时，用含有0.1％的胰酶溶液消化，离心。用流式细胞仪鉴定筛选表达CD73/CD90/CD105，阳性率≥95％，不表达CD14/CD34/CD45/CD79α/HLA-DR，阳性率＜2％的细胞(图2)。
3.脂肪间充质干细胞三向分化能力鉴定
所获得脂肪间充质干细胞还应具有成骨、成脂和成软骨的分化能力；对细胞进行油红O、茜素红和番红O染色，具有图3的染色效果(图3)。
二、筛选
(一)筛选方法
1.脂肪间充质干细胞CD10和CD200的鉴定
流式检验CD10和CD200，所得脂肪间充质干细胞表达抗原CD10，阳性率≥95％，不表达抗原CD200，阳性率＜2％(见图4)。
2.脂肪间充质干细胞VEGF分泌能力筛选
传代培养细胞汇合度达到80％左右时，取其上清液，通过ELISA检测VEGF含量，每毫克总蛋白中VEGF含量≥500pg的(图5)，对应细胞则为所需细胞。
(二)筛选后进一步鉴定
1.脂肪间充质干细胞克隆形成能力
hADSCs按100和50个细胞每100mm皿进行接种，培养14天以后，分别得到了48.0±7.7和28.0±5.2个克隆(图6A)，证明了筛选获得的hADSCs具有强大的克隆形成能力。
2.长期增殖能力
对三个不同的生物样本进行了连续传代，传至P10代没有观察到细胞增殖活性的降低(图6B)。每3-4天传代一次，每代扩增6.4±2.3倍。
实施例2人类内皮祖细胞(hEPCs)的分离培养及鉴定
一、分离与培养
内皮祖细胞可以有两种来源：脐带静脉或脂肪组织
(一)从脐带静脉中分离
采集了17根健康新生儿脐带样本，样本剪成2～3cm小段，用胶原酶消化接种到II型胶原铺板后的EGM2培养基里。在5％CO2孵箱中37℃培养至80％汇合度后传代至P3代。
(二)从脂肪组织中分离
分离方法与专利申请号CN201510698296.3相同。脂肪组织清洗后，用胶原酶消化后离心获得血管基质部分，接种含10％FBS的培养基在37℃、5％CO2孵箱中贴附48小时，更换为EGM2培养基至铺路石样细胞长出，更换为10％FBS培养基/EGM2培养基混合培养至80％汇合度后传代培养。
培养至汇合度80％及以前的hEPCs细胞形态见图7。
二、细胞鉴定
(一)流式鉴定
取消化后的第3代hEPCs，流式检测表面标志物CD31/CD73/CD90/CD45/CD133，其中，CD31(98.2±1.4％，n＝17；94.2～99.5％)、CD73(97.5±2.3％，n＝13；90.6～99.4％)为阳性表达(图8，A和B)，不表达CD90(0.4±0.5％，n＝15；0.0～1.7％)和CD45(0.6±0.6％，n＝10；0.0～1.9％)(图8，C和D)，低表达CD133(7.3±4.9％，n＝10；0.0～14.1％)(图8E)、部分表达CD34(26.9±34.9％，n＝17；8.4～78.5％)和VEGFR2(69.8±23.1％，n＝17；12.6～95.8％)。
取消化后P0、P1、P5和P10代hEPCs，流式检测表面标志物CD34和VEGFR2。结果显示不同代次的hEPCs细胞表面CD34和VEGFR2的表达量不断变动(图8，F1-F4和G1-G4)。
(二)长期传代稳定性
与hADSCs类似，传代到P10代，统计每一代细胞数，发现其传代稳定(图9)。
(三)乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)内吞实验
取第3代hEPCs在含1,1'-双十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚菁高氯酸盐(1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，Dil)标记的乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride,DAPI)的培养液中37℃孵育4h，然后用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)室温固定，漂洗后，标本在荧光显微镜下观察。如图10所示，细胞能够内吞乙酰化低密度脂蛋白。
(四)体外成血管实验
取第3代hEPCs，调整细胞浓度为5×105/mL，与Matrigel人工基质混匀，种入24孔板，每隔2h在倒置显微镜下观察毛细血管网状结构生成情况。如图11所示，细胞能够在matrigel上生产网状的血管结构。
实施例3本发明美容制剂的制备
取100μL Matrigel和100μL含有2万个实施例1制备的人类脂肪间充质干细胞(hADSCs)与6万个实施例2制备的人类内皮祖细胞(hEPCs)的PBS(磷酸盐缓冲液)混合，即可。
实施例4本发明美容制剂的制备
取100μL Matrigel和100μL含有100万个实施例1制备的人类脂肪间充质干细胞(hADSCs)与100万个实施例2制备的人类内皮祖细胞(hEPCs)的PBS(磷酸盐缓冲液)混合，即可。
实施例5本发明美容制剂的制备
取100μL Matrigel和100μL含有900万个实施例1制备的人类脂肪间充质干细胞(hADSCs)与300万个实施例2制备的人类内皮祖细胞(hEPCs)的生理盐水混合，即可。
以下以实验例的方式对本发明技术方案做进一步描述。
实验例1裸鼠皮下填充实验
1.方法
对分离获得的P3代hEPCs和hADSCs进行了裸鼠皮下填充实验。实验分为四个组：材料对照组皮下注射100μL Matrigel+100μL PBS，hEPCs+材料组皮下注射100μL Matrigel+100μL含有100万hEPCs的PBS；hADSCs+材料组皮下注射100μL Matrigel+100μL含有100万hADSCs的PBS，hEPCs+hADSCs+材料组皮下注射100μL Matrigel+100μL同时含有100万hEPCs和100万hADSCs的PBS。裸鼠的左侧统一为材料对照组，裸鼠右侧分别为hEPCs+材料组、hADSCs+材料组、hEPCs+hADSCs+材料组，注射7天后处死小鼠，取包埋材料观察并切片做H&E染色。
2.结果
(1)直观观察
材料对照组出现钙化现象(图12)，hEPCs+材料组同样出现钙化现象(图13)；hADSCs+材料组未出现明显钙化(图14)；hEPCs+hADSCs+材料组未出现钙化，且长出了红色的血管(图15)。
(2)切片结果
200×视野下，材料对照组，只能观察到少量炎性细胞浸润(图16)；hADSCs+材料组，可以观察到脂肪间充质干细胞在材料中存活(图17)；hEPCs+材料组，可以观察到形成毛细血管管腔结构(图18)；hEPCs+hADSCs+材料组，观察到非常明显的管腔结构，且管腔中可以观察到红细胞的存在，说明已经存在血流，血供已经恢复(图19)。
对切片中每个视野中血管管腔数统计(图20)，发现hEPCs+hADSCs+材料组的血管管腔数目显著高于其它组别，表明本发明的组合物具有较强的帮助移植物实现血管化的能力。
我们的结果发现，通过特异表面标志物CD10+/CD200-，培养上清中VEGF表达量高于500pg/mL/mg筛选获得的脂肪间充质干细胞与内皮祖细胞按一定比例混合后，以细胞外基质组分做支架材料移植到皮下可以很好的血管化，恢复移植材料的血供，支持其长期存活。在再生医学、损伤修复、医学美容等方面具有巨大的应用潜力。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于：它包括脂肪间充质干细胞、内皮祖细胞和细胞外基质；
脂肪间充质干细胞与内皮祖细胞的混合比例为(1-3):(3-1)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：脂肪间充质干细胞与内皮祖细胞的混合比例为1:1。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述脂肪间充质干细胞是具有如下特征的脂肪间充质干细胞：
a、汇合度为80％时，培养上清液中，每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量≥300pg；
b、CD10抗原表达率≥95％，CD200抗原表达率＜2％。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述内皮祖细胞是具有如下特征的内皮祖细胞：
a.CD31抗原的表达率为94.2％～99.5％，CD73抗原的表达率为90.6％～99.4％，CD90抗原的表达率为0.0～1.7％，CD45抗原的表达率为0.0～1.9％，CD133抗原的表达率为0.0％～14.1％，CD34抗原的表达率为8.4％～78.5％，VEGFR2抗原的表达率为12.6％～95.8％；
b.它可以内吞乙酰化低密度脂蛋白。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述细胞外基质为纤连蛋白、胶原、透明质酸和基质胶中的一种或多种；优选所述细胞外基质为Matrixgel。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物中还含有缓冲液；所述缓冲液为磷酸盐缓冲液或者生理盐水。
7.根据权利要求1或6所述的组合物，其特征在于：所述组合物中还含有缓冲液每毫升组合物中脂肪间充质干细胞的数量为1×105至5×107，优选地2×105至2×107，优选地为5×105至1×107，优选地为1×106至5×106。
8.根据权利要求1或6所述的组合物，其特征在于：每毫升组合物中内皮祖细胞的数量为1×105至5×107，优选地2×105至2×107，优选地为5×105至1×107，优选地为1×106至5×106。
9.权利要求1-8所述组合物在制备皮肤美容制剂的用途。
10.根据权利要求9所述用途，其特征在于：所述皮肤美容制剂为皮下填充物。
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