TW201420106A - 動物用之脂肪組織－衍生幹細胞 - Google Patents

Abstract

本發明提供製造及使用用於治療非人類哺乳動物之各種醫學病狀之脂肪-衍生幹細胞之組合物及方法。特定而言，本發明提供可用於在非人類哺乳動物中修復骨折及治療「乾眼」病狀、急性腎衰竭及慢性腎衰竭之方法及組合物。

Description

動物用之脂肪組織-衍生幹細胞 相關申請案之交叉參考

此係2011年2月14日申請之美國申請案12/997,067之部分延續案，該美國申請案係2009年6月8日申請之國際申請案第PCT/US2009/046587號之國家階段，該國際申請案根據35 U.S.C.§ 119(e)主張2008年6月11日申請之美國臨時申請案第61/060,701號及2009年4月9日申請之美國臨時申請案第61/168,148號之權益，其每一者之內容皆以引用的方式全文併入本文中。

本發明提供製造及使用用於治療非人類哺乳動物之各種醫學病狀之脂肪-衍生幹細胞之組合物及方法，該等醫學病狀包括骨折、「乾眼病狀」、慢性腎衰竭及急性腎衰竭。

脂肪組織含有已分離出多潛能細胞之基質血管成分(SVF)。該等細胞有多種名稱：經加工脂肪抽吸物(PLA)細胞、脂肪組織-衍生間葉幹細胞、多潛能脂肪-衍生幹(MADS)細胞、脂肪組織-衍生幹細胞、脂肪組織-衍生基質細胞(ADSC、ATSC)、脂肪組織衍生成人幹(ADAS)細胞、脂肪組織-衍生成人基質(ADAS)細胞及脂肪組織-衍生細胞(ADC)。

ADSC具有與骨髓幹細胞(BMSC)之彼等類似之表現型及基因表現 圖譜。除了具有自我更新及長期生長之能力，ADSC能夠分化成不同細胞類型，包括脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、肌細胞、心肌細胞、神經元及上皮細胞。因此，ADSC不僅愈來愈公認為真正的成人幹細胞，且對於未來臨床應用而言亦視為優於其他類型之成人幹細胞。然而骨髓因供區發病率僅可獲得有效數量，但脂肪組織通常可大量獲得，尤其在此愈來愈肥胖的社會。另外，成株研究已確定，BMSC在骨髓中之數量大約為25,000分之一至100,000分之一，而ADSC在經加工脂肪抽吸物中之平均頻率大約為有核細胞之2%。因此，ADSC自1 g脂肪之產量大約為5000個細胞，而BMSC之產量為每毫升骨髓100個至1000個細胞。

先前已嘗試使用ADSC用於治療目的。例如，參見WO 2005/035742。然而，該等嘗試主要集中於動物環境中ADSC之自體使用。對於動物診所，自體治療計劃對於獸醫及寵物主人二者而言皆過於耗時。業內需要以有效且不引起所移植細胞之排斥反應之方式治療非人類哺乳動物(例如寵物及農場動物)之組合物及方法。本文所述本發明提供該等優勢且亦提供其他益處。

本文中所揭示之所有專利、專利申請案、參考文獻及其他出版物皆以引用的方式全文併入本文中。

本發明提供製造及使用脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)之組合物及方法。在一態樣中，本發明提供治療非人類哺乳動物之各種醫學病狀之方法。在一態樣中，本發明提供治療非人類哺乳動物之尿失禁之方法，該等方法包含向非人類哺乳動物投與有效量之脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)。非人類哺乳動物亦可具有繼發症狀，其中該繼發症狀為膀胱感染或尿燙浸或膀胱感染及尿燙浸二者。

在本發明之另一態樣中，本發明提供治療非人類哺乳動物之炎 性疾病之方法，該等方法包含向非人類哺乳動物投與有效量之脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)。在一實施例中，該炎性疾病為關節炎。在另一實施例中，該關節炎為骨關節炎。

在本發明之另一態樣中，本發明提供減輕有需要之非人類哺乳動物之疼痛之方法，該等方法包含向非人類哺乳動物投與有效量之脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)。

在本發明之另一態樣中，本發明提供治療有需要之非人類哺乳動物之糖尿病之方法，該等方法包含向非人類哺乳動物投與有效量之脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)。

在本發明之另一態樣中，本發明提供治療有需要之非人類哺乳動物之醫學病狀之方法，該等方法包含向非人類哺乳動物投與有效量之脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)，其中該醫學病狀為一或多種選自由以下組成之群之病狀：尿失禁、骨關節炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、創傷癒合、結瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴張型心肌病、髖關節發育不全、股骨頭無血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動脈粥樣硬化相關梗塞、關節炎、肌肉萎縮症、骨折、「乾眼」病狀、慢性腎衰竭及急性腎衰竭。

本發明提供治療或緩解在上述任一者中之方法中所論述之病狀，其中ADSC對於非人類哺乳動物而言為異種的。在一態樣中，該治療為異種移植，且利用ADSC治療之排斥反應或發炎極低。在任一上述方法中及本文中，非人類哺乳動物可係以下非限制性實例中之任一者：狗、貓、馬、兔、豬、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹及美洲駝。

在另一態樣中，本發明提供一組用於治療醫學病狀之非人類ADSC，其中該等ADSC對於ADSC之接受者而言為異種的，且其中該醫學病狀為一或多種選自由以下組成之群之病狀：尿失禁、骨關節 炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、創傷癒合、結瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴張型心肌病、髖關節發育不全、股骨頭無血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動脈粥樣硬化相關梗塞、關節炎、肌肉萎縮症、骨折、「乾眼」病狀、慢性腎衰竭及急性腎衰竭。

在另一態樣中，本發明提供一組用於治療醫學病狀之非人類ADSC，其中該等ADSC對於ADSC之接受者而言為同種的，且其中該醫學病狀為一或多種選自由以下組成之群之病狀：尿失禁、骨關節炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、創傷癒合、結瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴張型心肌病、髖關節發育不全、股骨頭無血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動脈粥樣硬化相關梗塞、關節炎、肌肉萎縮症、骨折、「乾眼」病狀、慢性腎衰竭及急性腎衰竭。視情況，以上任一組之ADSC可包含羧甲基纖維素(CMC)。

在另一態樣中，本發明提供組合物包含用於移植之經純化非人類ADSC群及CMC。在一態樣中，該移植為異種移植，其中該異種移植部造成組合物之任何顯著排斥反應。

圖1繪示關於胰島素產生細胞之生成之實驗之結果。利用GFP(對照)、Pdx1或Pdx1-PV-16(PV-16)轉導人類ADSC。相位差顯微鏡顯示，Pdx1-及PV-16轉導細胞在細胞質及培養基中具有胰島素樣顆粒。免疫螢光顯微鏡顯示，Pdx1-及PV-16轉導細胞之胰島素染色呈陽性。使用DAPI核染色來定位細胞。

圖2繪示驗證Pdx1及胰島素表現之實驗之結果。利用GFP(對照)、Pdx1或Pdx1-PV-16(PV-16)轉導人類及大鼠ADSC。藉由西方墨點(western blotting，以β-肌動蛋白充當對照，圖A)及RT-PCR(圖B)檢查Pdx1在該等細胞中之表現。藉由ELISA進一步檢查人類ADSC之靜態胰島素產生(在具有23 mM葡萄糖之DMEM中，圖C)。

圖3繪示檢查胰腺基因表現之實驗之結果。人類及大鼠ADSC未經GFP或Pdx1轉導(C)或經其轉導。藉由RT-PCR檢查該等細胞及大鼠尿道平滑肌細胞(RUSMC)中Pdx1、胰島素、升糖素及NeuroD之表現(以b-肌動蛋白充當對照，圖A)。人類及大鼠細胞之結果之統計分析分別呈現於圖B(n=3)及圖C(n=5)中。星號指示Pdx1轉導細胞與未經轉導細胞之間之顯著差異(P<0.05)。

圖4繪示關於因應葡萄糖濃度之胰島素產生之實驗之結果。在含有所示濃度之葡萄糖之緩衝液中培育Pdx1轉導細胞。1小時後，藉由ELISA評價緩衝液中胰島素之量。星號指示與0 mM葡萄糖下之胰島素產生相比之顯著差異(P<0.05)。

圖5顯示血糖含量(圖A)及體重(圖B)之變化之實驗之結果。將30只大鼠隨機等分成3個群組。第一群組(對照)接受腹膜內注射之20 mM檸檬酸緩衝液。第二及第三群組二者接受腹膜內注射60 mg STZ(存於20 mM檸檬酸緩衝液中)/kg體重。1週後，第二群組(鹽水)接受鹽水治療，而第三群組(IPADSC)接受IPADSC治療。每週監測所有大鼠之體重及禁食血糖含量。星號指示IPADSC治療與鹽水治療大鼠之間之顯著差異(P<0.05)。

圖6繪示大鼠之毛皮外觀及白內障程度之變化。

圖7顯示關於葡萄糖耐量之實驗之結果。在治療後第7週結束時，禁食7小時之大鼠接受腹膜內注射之1 mg葡萄糖/克體重。然後經2小時以30分鐘間隔監測自尾部靜脈獲得之樣品中之血液葡萄糖含量。星號指示IPADSC治療與鹽水治療大鼠之間之顯著差異(P<0.05)。

圖8顯示移植細胞之識別。在治療後第7週結束時，將大鼠處死並採集其腎用於組織學檢查。使用HE染色檢查囊下空間中移植細胞之存在。使用免疫螢光(IF)染色識別表現胰島素之細胞。20×照片中加方框之區域係注射部位並在各別100×照片中放大。100×照片中加方 框之區域在各別400×照片中進一步放大。注意IPADSC治療腎之囊下空間中之組織樣結構。在鹽水治療腎中未見到該結構。IF照片係獲取自3個IPADSC治療腎。注意胰島素陽性細胞之存在。

圖9繪示劑量效應。以0 μM、10 μM、20 μM及50 μM將EdU添加至ADSC中。藉由對細胞核之DAPI染色識別細胞位置(若使用彩色照片，則其將為藍色)。藉由Alexa 594檢測EdU(若使用彩色照片，則其將為紅色)。結果顯示，大約50%之細胞經EdU標記(A，×200)，不管EdU濃度如何(B，P>0.05)。

圖10顯示時程研究之結果。利用10 μM EdU標記ADSC，且然後在1天、4天、7天、14天及21天時拆分。結果顯示，陽性標記細胞中之EdU信號隨時間而降低(A，×100；B，P<0.01)。第21天之較大放大率(1000×)之細胞係顯示於圖C中。

圖11顯示在組織陣列中藉由使用EdU活體內標記DNA之結果。向新生大鼠腹膜內注射50 μg存於PBS中之EdU/g體重。7 h後採集主要組織用於製備組織陣列(表3)，然後對其進行HE染色(A)或EdU染色(B)。在圖C中以20×放大率顯示EdU染色組織陣列。在圖D中以200×放大率顯示EdU標記皮膚試樣(圖C之6A)。藉由對細胞核之DAPI染色識別細胞位置(若使用彩色照片，則其將為藍色)。藉由Alexa 594檢測EdU(若使用彩色照片，則其將為紅色)。

圖12顯示追蹤所移植ADSC之結果。利用10 μM EdU將大鼠ADSC標記12小時，且然後自體注射至膀胱頸(A)。4週後，藉由針對EdU(若使用彩色照片，則其將為紅色)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA，若使用彩色照片，則其將為綠色)及細胞核(若使用彩色照片，則其將為藍色)檢查組織切片。可在膀胱頸中觀察到EdU標記細胞(B，×20)。大部分EdU標記細胞定位於結締組織。少數EdU標記細胞似乎已分化成平滑肌細胞(C，×200)。

圖13顯示關於ADSC治療動物中之較高排尿壓力之實驗之結果。

圖14顯示EdU及SMA之共定位之結果。若觀察彩色影像，則紅色信號為EdU，綠色信號為ASMA，且藍色信號為DAPI。上圖中每一圖像中之加方框區域係顯示於下圖中之相應圖像中(×400)。

圖15繪示尿道中之彈性纖維。左圖：對照。右圖：ADSC移植(×400)。

圖16顯示關於ADSC治療動物中之較高排尿壓力之實驗之結果。

圖17顯示關於EdU及SMA之共定位之實驗。若觀察彩色影像，則紅色信號為EdU，綠色信號為ASMA，且藍色信號為DAPI。(a~c)定位於黏膜下層中之EdU陽性細胞。(d~h)定位於肌肉中之EdU陽性細胞(×200)。(A)黏膜下層中之EdU陽性細胞(×400)。(B)肌肉中之EdU陽性細胞(×400)。

圖18顯示關於ADSC在陰莖中之內皮分化之實驗之結果。利用BrdU標記ADSC並注射至大鼠之海綿體中。4週後，藉由免疫螢光顯微鏡檢查組織。抗BrdU及RECA-1抗體分別識別所注射之ADSC(若使用彩色照片，則其將為綠色)及內皮細胞(若使用彩色照片，則其將為紅色)。疊加影像(BrdU/RECA)顯示，一些ADSC(若使用彩色照片，則其將為黃色)之RECA-1染色亦呈陽性。另一使用相位差影像之疊加影像(合併)顯示ADSC定位至竇狀內皮細胞。大約5%之BrdU+細胞為RECA+，如藉由計數剖面中10個隨機選擇之區域來測定。

圖19顯示DMEM及EGM2中之細胞形態及生長速率之比較。以相同密度(300,000個細胞/培養皿)將兩個大鼠ADSC系RADSC-1及RADSC-2接種至100 mm培養皿中並在DMEM或EGM2中生長3天。RADSC-1之細胞形態係顯示圖A中。兩個細胞系之生長速率係顯示於圖B中。

圖20顯示識別在EGM2中生長之細胞中之內皮標記之表現之實驗 的結果。使RADSC-1及RADSC-2在DMEM(未經誘導)或EGM2(經誘導)中生長。然後針對內皮標記CD31、vWF及eNOS對其染色。若觀察彩色影像，則綠色指示CD31、vWF或eNOS之表現；藍色指示細胞核。原始放大率為200×。亦分析細胞之基質膠管形成(管)及LDL攝取。紅色指示LDL之存在，其呈與紅色螢光染料DiI之偶聯形式。兩個細胞系之結果類似；僅顯示RADSC-1之彼等。人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)充當陽性對照。將實驗重複3次。

圖21顯示一些結果，其圖解說明內皮分化之可逆性及可再誘導性。使RADSC-1及RADSC-2在DMEM中生長6天至10天(DMEM第一輪)；分析一半細胞之內皮標記。將另一半細胞轉換至EGM2，生長6天(第一輪EGM2)，且分析一半細胞之內皮標記。將另一半細胞轉換至DMEM，生長10天(第二輪DMEM)，且分析一半細胞之內皮標記。最後，將另一半細胞轉換至EGM2，生長6天(第二輪EGM2)，且分析內皮標記。兩個細胞系之結果類似；僅顯示RADSC-1之彼等。若觀察彩色影像，則綠色指示CD31、vWF或eNOS之表現；且藍色指示細胞核。原始放大率為200×。紅色指示LDL之存在，其呈與紅色螢光染料DiI之偶聯形式。將實驗重複3次。

圖22顯示關於藉由「減法」識別內皮誘導因子之實驗之結果。使RADSC-1細胞在完全或部分補充之EGM2中生長且然後分析LDL攝取。每一部分補充之EGM2係藉由所省略因子來指示；例如，「-FGF」表示無FGF2之EGM2。將實驗重複3次。

圖23顯示關於藉由「加法」識別內皮誘導因子之實驗之結果。使RADSC-1細胞在補充有所示因子之EGM2、EBM2或EBM2中生長，且然後分析LDL攝取。將實驗重複3次。

圖24顯示關於藉由FGF2誘導內皮標記表現之實驗之結果。使RADSC-1細胞在補充有FGF2及維生素C之DMEM、EGM2或EBM2中 生長。然後針對內皮標記CD31、vWF及eNOS對其染色。若觀察彩色影像，則綠色指示CD31、vWF或eNOS之表現；且藍色指示細胞核。原始放大率為200×。亦分析細胞之基質膠管形成(管)。將實驗重複3次。

圖25顯示關於FGFR抑制劑對內皮分化之影響之實驗之結果。使RADSC-1細胞在補充有FGF2及維生素C之EGM2或EBM2中在FGFR抑制劑PD173074之存在或不存在下生長。然後分析細胞之LDL攝取。若觀察彩色影像，則紅色指示LDL之存在，其呈與紅色螢光染料DiI之偶聯形式。出於排除VEGF信號傳導之參與之目的，亦使RADSC-1細胞在補充VEGF/維生素C之EBM2中生長，此乃因已知PD173074對VEGF受體具有弱抑制作用。將實驗重複3次。

圖26顯示利用豬ADSC治療犬骨折之結果。圖A提供犬之斷裂橈骨及尺骨在移除5個螺釘中之2個後1週的X射線(第0天)，該等螺釘已用於將動力加壓骨板附接至斷裂橈骨。X射線已揭露，在該板下之骨折部位處橈骨發生嚴重去鈣作用且變薄(骨量減少)。在當天(「第0天」)，以0.5 mL之體積向該板之內側及外側經皮下投與5×10⁶個豬ADSC，且向動物經靜脈內投與另外1×10⁶個豬ADSC。投與豬ADSC後17天(圖B)及26天(圖C)進行之後續X射線揭露，橈骨之去鈣作用逆轉且骨折部位癒合。

本發明提供治療非人類哺乳動物之各種病狀及緩解非人類哺乳動物之與各種病狀相關之不適及/或疼痛的組合物及方法。

除非另外定義，否則本文所用所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解含義相同之含義。

若此部分中所述之定義與以引用的方式併入本文中之專利、公開專利申請案及其他公開案中所述定義相反或者不一致，則相比於以 引用的方式併入本文中之定義，以此部分中所述定義為準。

I.一般技術

除非另外指示，否則本發明之實踐將利用幹細胞生物學、細胞培養、分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，其為熟習此項技術者所熟知。該等技術於科學文獻中充分解釋，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版(Sambrook等人，2001)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(P.Herdewijn編輯，2004)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)編輯，1987)；Methods in Enzymology(Academic Press有限公司)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編輯，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編輯，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編輯，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編輯，1991)Short Protocols in Molecular Biology(Wiley及Sons,1999)；Embryonic Stem Cells：A Practical Approach(Notaranni等人編輯，Oxford University Press 2006)；Essentials of Stem Cell Biology(R.Lanza編輯，Elsevier Academic Press 2006)；Stem Cell Assays(Methods in Molecular Biology)(Mohan C.Vemuri編輯，Humana Press；第一版(2007日8月10日)；Mesenchymal Stem Cells：Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)(Darwin J.Prockop、Donald G.Phinney、Bruce A.Bunnell編輯，第一版(2008年3月7日))；Handbook of Stem Cells(Robert Lanza等人編輯，Academic Press(2004年9月14日)；Stem Cell Culture Vol 86：Methods in Cell Biology(Jennie P.Mather編輯，Academic Press，第一版(May 15,2008))；Practical Hematopoietic Stem Cell Transplantation(Andrew J.Cant等人編輯，Wiley-Blackwell，第一版(2007年1月22日))；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Kevin D.Bunting編輯，Humana Press，第二版(2008年1月31日))；Bone Marrow and Stem Cell Transplantation(Methods in Molecular Medicine)(Meral Beksac編輯，Humana Press；第一版(2007年5月3日))；Stem Cell Therapy and Tissue Engineering for Cardiovascular Repair：From Basic Research to Clinical Applications(Nabil Dib等人編輯，Springer，第一版(2005年11月16日))；Blood And Marrow Stem Cell Transplantation：Principles,Practice,And Nursing Insights(Kim Schmit-Pokorny(作者)及Susan Ezzone(編者),Jones & Bartlett Publishers；第三版(2006年5月22日))；Hematopoietic Stem Cell Protocols(Christopher A.Klug及Craig T.Jordan編輯，Humana Press；第一版(2001年12月15日))；及Clinical Bone Marrow and Blood Stem Cell Transplantation(Kerry Atkinson等人編輯，Cambridge University Press；第三版(2003年12月8日))。

II.定義

「脂肪-衍生幹細胞」、「脂肪組織-衍生幹細胞」及ADSC在本文中可互換使用且係指源於脂肪組織且能夠自我更新之多潛能基質細胞或幹細胞。「脂肪」意指任一脂肪組織。脂肪組織可為褐色或白色脂肪組織，來源於自皮下、網膜/內臟、乳房、性腺或其他脂肪組織部位。較佳地，脂肪為皮下白色脂肪組織。該等細胞可包含原代細胞培養物或永生細胞系。脂肪組織可來自任一具有脂肪組織之非人類哺乳動物。脂肪組織可來源於欲治療之非人類哺乳動物(即自體組織)或該個體之純系，或來源於非人類哺乳動物之不同物種(即異種)，或來源於非人類哺乳動物之相同物種但非欲治療之非人類哺乳動物(即同種)。該等細胞表現細胞表面蛋白之獨特組合，其可包括(但不限於)幹 細胞標記CD 34及CD 90、四穿膜蛋白CD9、CALLA(CD10)、胺肽酶N(CD13)、整合素1(CD29)、透明質酸鹽受體(CD44)、整合素.α.4及5(CD49d、CD49e)、ICAM-1(CD54)、衰變加速因子(CD55)、互補保護素(CD59)、內皮因子(CD105)、VCAM-1(CD106)、Muc-1,8(CD146)及ALCAM(CD166)(Gronthos等人，J.Cell Physiol.(2001)10月；189(1)：54 63)。

在一態樣中，來源於豬科之ADSC通常對於CD90、CD44、CD29而言為陽性且通常對於CD31、CD45及CD11而言為陰性。例如，參見Valina等人，European Heart Journal 28：2667-77(2007)，其揭示所培養之豬ADSC對於CD90(97.3+0.62%)、CD44(98.27+0.38%)及CD29(98.2+0.87%)而言為陽性且對於CD31(0.03+0.05%)、CD45(0.45+0.41%)及CD11(0.17+0.17%)而言為陰性。

本文所用術語多潛能(multipotent或pluripotent)ADSC之「製劑」或「經純化製劑」係指含一或多種細胞之製劑，其經操作以提供實質上不含其他組份之細胞製劑。在一些態樣中，以重量或數量計細胞製劑中至少約60%不含產生細胞時所存在之其他組份。在各種態樣中，以重量或數量計，細胞為至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%純。經純化細胞製劑可藉由(例如)自天然來源純化(例如，提取)、螢光激活細胞分選或熟習此項技術者所已知之其他技術來獲得。可藉由任一適當方法(例如螢光激活細胞分選(FACS))或藉由目測檢查分析純度。

用於闡述幹細胞之純度之「純度」並非指組合物中僅存在幹細胞，而指示幹細胞已經操作以使得其已自其天然組織環境移除並指示其與所得群體中所存在之其他細胞之關係。

本文所用術語「多潛能」(「multipotent」或「pluripotent」)係指 ADSC分化成三個胚層之細胞之潛能：內胚層(例如，內部胃黏膜、胃腸道、肺)、中胚層(例如，肌肉、骨、血液、泌尿生殖)或外胚層(例如，表皮組織及神經系統)。多潛能幹細胞可產生任一胎兒或成人細胞類型。其單獨不能發展成胎兒或成人動物，此乃因其沒有促成胚外組織(例如，活體內胎盤或活體外滋胚層)之潛力。

「非人類哺乳動物」包括(但不限於)農場動物、運動動物、寵物、非人類靈長類動物、小鼠及大鼠。農場動物可包括(但不限於)豬、牛、馬、山羊及綿羊。寵物包括(但不限於)狗、貓、兔及雪貂。此定義範圍內之其他動物包括(但不限於)猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹及美洲駝。非人類哺乳動物在本文中亦可稱為「個體」。

「治療」(「treatment」或「treating」)意指獲得有益或期望結果之方法，該等結果包括臨床結果(其包括動物診所或醫院)。出於本發明之目的，有益或期望結果包括(但不限於)緩解與病狀相關之症狀、減弱與病狀相關之症狀之程度、預防與病狀相關之症狀惡化或延遲疾病或病狀發展。在一些態樣中，相比於與目前可用療法相關之副作用，利用一或多種本文所揭示細胞治療不伴隨任何副作用或伴隨有較少副作用。

「接受治療」包括初始治療及/或連續治療。本文所用「治療」係獲得有益或期望結果之方法，該等結果較佳包括來自動物診所或醫院中之治療之臨床結果。出於本發明之目的，有益或期望臨床結果包括(但不限於)穩定或改良罹患各種醫學病狀之非人類哺乳動物之健康相關生活品質。

本文所用「延遲」疾病或病狀發展意指推遲、阻礙、減緩、阻止、穩定及/或延緩疾病或病狀發展。此延遲之時間長度有所不同，取決於疾病史及/或所治療之個體。如熟習此項技術者所顯而易見， 充足或顯著延遲實際上可涵蓋預防，此乃因個體未患有該疾病或病狀。例如，當與不使用該方法相比時，該方法可降低給定時段內之疾病發展機率及/或降低給定時段內之疾病程度。在一些態樣中，該等比較係基於使用統計上可觀數量之個體之臨床研究。疾病發展可使用標準臨床技術來檢測。發展亦可係指起初可不能檢測之疾病進展且包括發生、復發及發作。

「減輕」疼痛(例如，與炎性疾病、例如一類關節炎相關之疼痛)或疼痛之一或多種症狀意指減小利用本發明ADSC組合物治療之非人類哺乳動物之疼痛之一或多種不期望臨床表現的程度。

「有效量」(當在治療或預防上下文中或在減輕疼痛或緩解特定病狀之症狀之上下文中使用時)係足以實現有益或期望結果(包括臨床結果)之量。有效量可以一或多次投與來投與。出於本發明之目的，ADSC之有效量係細胞可減輕非人類哺乳動物中所治療病狀之一或多種症狀之一定量。例如，已投與ADSC之非人類哺乳動物之跛行之減輕係非人類動物之關節炎之一症狀且觀察到此特定症狀之此減輕可意味著已向該非人類哺乳動物給予有效量之ADSC。在一態樣中，進一步培養ADSC以誘導其沿特定途徑分化。在另一態樣中，以不發生任何分化之方式培養ADSC。

本文所用「需要其」包括患有病狀或疾病或「具有該病狀或疾病之風險」之非人類哺乳動物。本文所用「具有風險」之非人類哺乳動物係具有發展病狀之風險之非人類哺乳動物。「具有風險」之非人類哺乳動物可能患有或可能未患有可檢測疾病或病狀，且在本文所述治療方法之前可能患有或可能未患有所示可檢測疾病。「具有風險」表示非人類哺乳動物具有一或多種所謂風險因子，該等風險因子係與疾病或病狀之發展相關聯之可量測參數且為業內所已知。具有一或多種該等風險因子之非人類哺乳動物發展疾病或病狀之機率高於不具有 該等風險因子之個體。該等風險因子包括(但不限於)年齡、性別、飲食、先前疾病史、前體疾病之存在、遺傳(即遺傳(hereditary))因素、繁殖方案及因素及環境暴露。

「醫藥上可接受之載劑」意指基於熟習此項技術者之知識，當與活性成份組合時允許該成份保持生物活性且並不引起不可接受之免疫反應(例如，嚴重過敏或過敏性休克)之任一材料。實例包括(但不限於)任一標準醫藥載劑，例如羧甲基纖維素(CMC)、磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)及各種類型之潤濕劑。用於氣溶膠或非經腸投與之實例性稀釋劑為磷酸鹽緩衝鹽水或生理鹽水(0.9%)。用於細胞輸注之實例性載劑為CMC。藉由熟知的習用方法調配包含該等載劑之組合物(例如，參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro編輯，Mack Publishing公司，Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版。Mack Publishing,2000，其各自以引用的方式全文併入本文中，特別地關於調配物)。

對「組合物」(「the composition」或「compositions」)之一般提及包括且適用於本發明組合物。本發明亦提供醫藥組合物包含本文所述組份。

除非另外指示，否則本文所用單數形式「一」(「a」、「an」)及「該」包括複數個指示物。例如，「一」ADSC包括一或多個脂肪組織-衍生幹細胞。

本文中提及之「約」值或參數包括(且闡述)與該值或參數本身有關之各態樣。例如，提及「約X」之闡述包括「X」之闡述。

應理解，本文中所述本發明之各個態樣包括「包含」各個態樣、「由其組成」及「基本上由其組成」。

III.脂肪-衍生幹細胞(ADSC)及其分離

脂肪組織提供多潛能基質細胞之來源。脂肪組織在許多個體(例如，非人類哺乳動物)中可容易獲得且較豐富。許多文獻中有記載，脂肪細胞係可補充細胞群。甚至在藉由抽脂手術或其他程序進行外科移除後，看到個體中之脂肪細胞在一定時間後重現亦係常見的。此表明脂肪組織含有能夠自我更新之基質幹細胞。

先前已闡述用於人類脂肪組織-衍生幹細胞之普通分離、擴增及分化之方法(Zuk等人，Tissue Engineering(2001)7：211-228；Burris等人，Mol Endocrinol 1999,13：410 7；Erickson等人，Biochemical & Biophysical Research Communications 2002,290：763 9；Gronthos等人，J Cell Physiol.2001 October；189(1)：54 63；Halvorsen等人，Metabolism 2001,50：407 413；Halvorsen等人，Tissue Eng.2001 December；7(6)：729 41；Harp等人，Biochem Biophys Res Commun 2001,281：907 912；Saladin等人，1999,Cell Growth & Diff 10：43 48；Sen等人，Journal of Cellular Biochemistry 2001,81：312 319；Zhou等人，Biotechnol Techniq 1999,13：513 517)。脂肪組織-衍生幹細胞係自切碎之人類脂肪組織藉由膠原酶消化及差速離心根據已知技術來獲得(Halvorsen等人，Metabolism 2001,50：407 413；Hauner等人，J Clin Invest 1989,84：1663 1670；Rodbell等人，J Biol Chem 1966,241：130 139)。該等技術同樣適用於非人類哺乳動物脂肪組織-衍生幹細胞之分離、擴增及分化。例如，參見Fotuhi P.等人，Europace,9(12)：1218-21(2007)；Madonna R.等人，Stem Cell,26(1)：202-11(2008)；Huang T.等人，J Spinal Cord Med,30增刊，1：S35-40(2007)；Hemmrich K.等人，J Surg Res.,144(1)：82-8(2008)；Qu CQ等人，In Vitro Cell Dev Biol Anim.,43(2)：95-100(2007)；Wang K.H.等人，Biotechnol.Appl.Biochem.(2008)；Williams K.J.,Cells Tissues Organs,(2008)；及Valina C等人，Eur Heart J.,28(21)：2667-77(2007)。

ADSC可分離自各種非人類哺乳動物，包括(但不限於)豬科、牛科、犬科、馬科及貓科。在一態樣中，可分離ADSC並用於治療及/或預防目的之個體為豬科。豬科通常經飼養用於提供用於異種移植之部分(例如，人類心臟之瓣膜)之目的。因此，豬ADSC可用於異種移植至其他非人類動物中。在另一態樣中，本發明提供自私人擁有之寵物獲得之ADSC，其獲得可由食品與藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)來調控。來自該等寵物之ADSC可用於異種移植、司種移植或同基因移植。

在一態樣中，本發明提供對於基於ADSC之治療之接受者而言為異種之ADSC。可使用之ADSC類型之非限制性實例為牛、馬、綿羊及豬。在另一態樣中，本發明提供對於基於ADSC之治療之接受者而言為司種之ADSC。在另一態樣中，本發明提供對於基於ADSC之治療之接受者而言為同基因之ADSC。在另一態樣中，本發明提供對於基於ADSC之治療之接受者而言為自體之ADSC。

來自非人類哺乳動物之ADSC可以熟習此項技術者已知之任一方式分離。在本發明之一態樣中，ADSC可根據以下非限制性方法來分離。首先，將經分離脂肪組織(即脂肪組織或抽脂脂肪)用含有1%青黴素及鏈黴素之PBS沖洗，切碎成小塊，然後以膠原酶溶液：脂肪5：1 v/v之比率與含有0.075%膠原酶IA型之溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)混合。在37℃及劇烈搖動下培育1小時後，然後在室溫下以220× g將產物離心10分鐘。形成三個層：上部脂質層、中間膠原酶層及底部細胞沈澱。收集中間層並藉助200 μm過濾器過濾，接著進行離心。在第二輪中使用流出物(flow-thru)中之循環膠原酶IA型來再次消化新鮮脂肪組織，使用高於第一輪之比率(7：1，以體積計)。底部細胞沈澱含有幹細胞。

可在進一步純化、分化、向個體投與或任一其他用途之前保存 或儲存ADSC或包含ADSC之脂肪組織。儘管已報導脂肪組織可在室溫下儲存24小時並在4℃下儲存1天至3天，但脂肪組織中之活細胞在儲存中急劇下降。因此，在一態樣中，本發明提供用於保存ADSC或使用脂肪組織保存溶液(ATPS)之脂肪組織之活力的方法，其中該ATPS含有酶超氧化物歧化酶(SOD)作為其基本成份。在一態樣中，自哺乳動物紅血球分離超氧化物歧化酶。熟習此項技術者可容易自市售來源獲得SOD，例如Sigma-Aldrich(其亦出售自牛RBC或肝分離之SOD)。

在一非限制性態樣中，ATPS係由200 mg/ml KH₂PO₄、200 mg/L KCl、2.16 g/L Na₂HPO4^.7H₂O、8 g/L NaCl、30,000個單位/L SOD及5 g/L牛血清白蛋白(BSA)組成。為保存非人類哺乳動物脂肪-衍生幹細胞，可將1×10⁶個脂肪衍生幹細胞與1 ml ATPS混合並儲存在4℃下。熟習此項技術者將認識到ATPS所包含之試劑濃度可改變至適當程度，而不實質上影響ATPS之期望性質。

眾所周知，來源於脂肪組織消化之基質血管成分係由許多類型之細胞組成，例如幹細胞、內皮細胞、平滑肌細胞及其他終末分化細胞。「淘選」(即，用於使來自不同細胞類型混合物之具體細胞群富集之免疫選擇方法)已闡述於各種細胞培養教科書及熟習此項技術者所已知之參考文獻中。此方法係基於與細胞培養皿結合之抗體之選擇能力。將細胞類型混合物於抗體塗覆板上培養並允許結合較短時期。然後可輕輕地自培養皿溶析非附著細胞(彼等不結合抗體者)，從而使得可採集所結合之細胞。此方法有助於研發其他新技術(例如密度-梯度分離)及利用具體細胞類型之獨特表面結合性質之方法。例如，磁珠粒技術之研發允許重複洗滌珠粒結合細胞，從而極大改良潛在分離純度。各公司所用之順磁珠粒之大小及組成顯著不同且定期出現進一步改進/改良。

因此，在本發明之一態樣中，使用可一起用於檢測CD34、CD90及SSEA1細胞標記之存在之抗體組合選擇脂肪-衍生幹細胞。除該等標記以外可使用其他抗體，例如彼等於Sayre等人之公開的美國專利申請案第2006/0147430號中所揭示之標記。在識別陽性細胞之後，該等細胞可經培養，進一步研究，或在一或多種本文所揭示之治療方法中投與給個體。

IV.組合物

本發明亦提供用於實踐本發明之治療方法之治療組合物。在一些實施例中，所用ADSC對於接受者而言為異種的。本發明亦提供一組可用作各種非人類哺乳動物之治療(治療或預防)用之「萬能供體」、從而降低移植排斥反應之可能性之ADSC。

在本發明之一態樣中，治療組合物以混合物形式包括醫藥上可接受之賦形劑(載劑)或介質及本發明之ADSC且其強度對於藉由各種方式向經歷細胞或組織損失或缺陷之個體投與有效，該ADSC包括單獨或與一或多種生物活性劑組合之衍生自其之細胞或組織。

在另一態樣中，本發明提供在包含或基於本發明ADSC以及醫藥上可接受之載劑或介質之方法中使用的治療組合物，該ADSC包括衍生自其之譜系未定細胞群、譜系定型細胞群或組織。應理解，本發明亦涵蓋治療組合物，該治療組合物包含對本發明ADSC及/或衍生自其之細胞或組織起作用或調節其之生物活性劑以及醫藥上可接受之載劑或介質。

細胞或基於組織之治療組合物之製備在業內眾所周知。該等組合物可調配於醫藥上可接受之介質中。該等細胞可呈溶液形式或包埋於基質中。具有生物活性劑(例如，生長因子)作為活性成份之治療組合物之製備在業內眾所周知。活性治療成份通常與醫藥上可接受且與該等活性成份相容之賦形劑或介質混合。另外，若需要，組合物可含 有少量輔助物質，例如增強活性成分效力之潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑。

可將生物活性劑調配成呈經中和之醫藥上可接受之鹽形式的治療組合物。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽(以多肽或抗體分子之游離胺基形成之鹽)，且該等鹽係與無機酸(例如氫氯酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及諸如此類)形成。由游離羧基形成之鹽亦可衍生自無機鹼(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、或氫氧化鐵)及有機鹼(例如異丙胺、三甲胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)及諸如此類)。

ADSC之投與

以與劑量調配物相容之方式並以治療有效量投與本發明之治療組合物。欲投與之量取決於(例如)欲治療之個體及虛弱。然而，本發明治療組合物之適宜劑量之範圍可為約0.05×10⁶個至100.0×10⁶個脂肪-衍生幹細胞/10 mm治療部位、較佳約0.10×10⁶個至50.0×10⁶個脂肪-衍生幹細胞/10 mm治療部位、且更佳約0.5×10⁶個至5.0×10⁶個脂肪-衍生幹細胞/10 mm治療部位。初始投與及後繼投與之適宜方案亦係可變的，但可包括初始投與，接著係以一或多個間隔根據需要或指示(例如週、月或年)藉由後續注射或其他投與進行之重複劑量。

熟習此項技術者可容易確定用於特定目的之適當細胞濃度。實例性劑量係在每治療部位每天約0.05×10⁶個至100.0×10⁶個細胞之範圍內。在非限制性實例中，將大約5×10⁶個ADSC注射至非人類關節(例如，僵硬關節)中來治療骨關節炎。治療組合物之精確投與時間表取決於獸醫之判斷及期望結果，且從而在某種程度上對於每一個體皆為特有的。

本發明之ADSC或分化細胞可藉由注射至個體之標靶部位中、較佳經由遞送器件(例如管，例如導管)來投與。在一態樣中，該管另外 含有針，例如注射器，藉助其可於期望位置將細胞引入至個體中。向個體投與細胞之具體非限制性實例亦可包括藉由皮下注射、肌內注射、關節內或靜脈內注射投與。若經靜脈內投與，則可製備細胞之可注射液體懸浮液並藉由連續滴注或以濃注形式投與。在另一態樣中，若欲治療之醫學病狀為擴張型心肌病，則熟習此項技術者(例如，獸醫)可使用基於導管之注射或以使ADSC陷獲於微血管床中、以便其可分佈至周圍組織之方式將ADSC遞送至冠狀動脈甲。

細胞亦可以不同形式嵌入遞送器件(例如注射器)中。例如，可將細胞懸浮於此一遞送器件中所含有之溶液中。本文所用術語「溶液」包括醫藥上可接受之載劑或稀釋劑，本發明細胞於其中保持活力。該等載劑及稀釋劑之用途為業內所熟知。該溶液較佳為無菌的且其流動性達可容易注射之程度。較佳地，藉助使用(例如)對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、乙汞硫柳酸鈉及諸如此類，該溶液在製造及儲存及保存之條件下較穩定以抵抗微生物(例如細菌及真菌)之污染作用。本發明之溶液可藉由將本文所述之ADSC或分化細胞納入醫藥上可接受之載劑或稀釋劑及視需要上文所列舉之其他成份中、接著過濾滅菌來製備。

細胞可全身性(例如經靜脈內)或局部地(例如，在心電圖指導下直接投與至心肌缺損中，或藉由在外科手術期間在可視化情況下直接施用)投與。對於該等注射，細胞可存在於可注射液體懸浮液製劑中或存在於可以液體形式注射並在受損組織部位處變為半固體之生物相容性介質中。可使用習用心內注射器或可控制內視鏡遞送器件，只要針腔或孔具有足以使剪切力不會損害所遞送細胞之直徑(例如30號或更大)即可。

細胞可以準許其移植至預期組織部位並重構或再生功能缺陷區域之任一方式投與。可納入或包埋ADSC之支撐基質包括具有生物相 容性、接受者相容性且降解成對接受者無害之產物之基質。該等基質向活體內之ADSC及分化細胞提供支撐及保護。

天然及/或合成生物可降解基質係該等基質之實例。天然生物可降解基質包括血漿凝塊(例如來源於哺乳動物)、膠原、纖維連接蛋白及層黏連蛋白基質。細胞移植基質之適宜合成材料必須具有生物相容性以避免遷移及免疫學併發症；且應能夠支撐廣泛細胞生長及分化細胞功能。其亦必須可再吸收，從而允許完全天然組織替代。基質應可組態成各種形狀且應具有足夠強度以防止移植後塌陷。各種研究指示由聚羥乙酸構成之生物可降解聚酯聚合物滿足所有該等準则，如Vacanti等人，J.Ped.Surg.,23：3-9(1988)；Cima等人，Biotechnol.Bioeng.38：145(1991)；Vacanti等人，Plast.Reconstr.Surg.,88：753-9(1991)所闡述。其他合成生物可降解支撐基質包括合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯及聚乳酸。合成聚合物之其他實例及將細胞納入或包埋至該等基質中之方法亦為業內所已知。例如，參見美國專利第4,298,002號及第5,308,701號。

細胞與聚合物之附接可藉由利用諸如以下等化合物塗覆聚合物來增強：基膜組份、瓊脂、瓊脂糖、明膠、阿拉伯膠(gum arabic)、膠原I型、II型、III型、IV型及V型、纖維連接蛋白、層黏連蛋白、糖胺聚多糖、其混合物及熟習細胞培養領域者所已知之其他材料。用於基質中之所有聚合物皆必須滿足向細胞後續生長及增殖提供充足支撐所必需之機械及生物化學參數。

生物可降解聚合物基質之一優勢在於：可將血管生成及其他生物活性化合物直接納入至支撐基質中，以便其隨著支撐基質在活體內降解而緩慢釋放。由於細胞-聚合物結構經血管化且該結構降解，故ADSC可根據其固有特性來分化。可將包括以下之因子納入至基質中或連同基質一起提供：營養素、生長因子、分化或去分化(即，使分 化細胞喪失分化特性並獲得諸如增殖及更一般功能等特性)之誘導物、分泌產物、免疫調節劑、發炎抑制劑、消退因子、增強或允許淋巴網絡或神經纖維長入之生物活性劑、透明質酸、及熟習此項技術者已知且可自諸如Collaborative Research,Sigma Chemical公司等供應商購得並具有關於有效量構成之說明之藥物、諸如血管內皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)及肝素結合表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)等血管生長因子。類似地，含有諸如附接肽RGD(Arg-Gly-Asp)等肽之聚合物可經合成，以用於形成基質(例如，參見美國專利第4,988,621號、第4,792,525號、第5,965,997號、第4,879,237號及第4,789,734號)。

在另一實例中，可將細胞移植於凝膠基質(例如，Gelfoam from Upjohn公司)中，該凝膠基質聚合以形成ADSC或分化細胞可生長之基質。已研發各種囊封技術(例如Lacy等人，Science 254：1782-84(1991)；Sullivan等人，Science 252：718-712(1991)；WO 91/10470；WO 91/10425；美國專利第5,837,234號；美國專利第5,011,472號；美國專利第4,892,538號)。

PLGA或聚(乳酸-共-羥乙酸)係食品與藥物管理局(FDA)批准之共聚物，該共聚物由於其生物可降解性及生物相容性可在許多治療器件中使用。PLGA係藉助兩種不同單體、即羥乙酸及乳酸之環狀二聚體(1,4-二噁烷-2,5-二酮)之無規開環共聚合合成。用於製備此聚合物之常見觸媒包括2-乙基己酸錫(II)、烷氧化錫(II)或異丙氧化鋁。在聚合期間，(羥乙酸或乳酸之)連續單體單元在PLGA中藉由酯鍵鏈接在一起，從而產生非線性脂肪族聚酯作為產物。PLGA已成功用作生物可降解聚合物，此乃因其在體內經歷水解產生初始單體乳酸及羥乙酸。該兩個單體係體內各種代謝途徑之副產物。由於身體能夠有效分解該兩個單體，故沒有與使用PLGA用於藥物遞送或生物材料應用相關之 全身毒性。與與鹽水混合之ADSC相比，與PLGA/羧甲基纖維素(CMC)混合之ADSC保持在注射區域之趨勢更大。

V.遺傳修飾細胞

另外，ADSC可經改造以含有表現生長因子、激素及細胞介素之基因。例如，ADSC可經改造以表現有益基因，例如(但不限於)VEGF、BDNF、IGF、TGF、NGF及其他神經滋養及血管滋養生長因子。注射特殊改造之ADSC可幫助某些組織再生；例如，BDNF之於神經。ADSC亦可經改造以表現β細胞特異性基因Pdx-1，其使ADSC能夠分泌胰島素。可將該等細胞移植至個體中，以治療其糖尿病。在另一態樣中，ADSC可經改造以產生肌肉萎縮蛋白且然後植入至個體中以治療肌肉萎縮症。在又一態樣中，將表現軟骨細胞之至少一個基因型或表現型特性之ADSC遺傳修飾以表現外源性基因或抑制內源性基因之表現並植入至動物中。本發明提供在移植之前遺傳修飾該等細胞及群體之方法。應理解，即便沒有遺傳修飾之幫助，ADSC亦可能夠沿朝向器官特異性細胞(例如，軟骨細胞)之譜系進一步分化。

可將包含啟動子及所關注序列之核酸構築體引入至接受者原核或真核細胞中作為非複製型DNA(或RNA)分子，該分子可係線性分子或更佳地閉合共價環狀分子。由於該等分子在沒有複製起點情況下不能自主複製，故可藉助所引入序列之短暫表現來進行基因表現。或者，可藉助將所引入DNA序列整合至宿主染色體中來進行永久表現。

在一態樣中，利用能夠將期望基因序列整合至宿主細胞染色體中之載體。已將所引入DNA穩定地整合至其染色體中之細胞可藉由亦引入一或多個允許選擇含有期望核酸序列之宿主細胞之標記來選擇。標記(若需要)可提供營養缺陷宿主之原養型、殺生物劑抗性(例如對抗生素或諸如銅等重金屬之抗性)或諸如此類。可將可選擇性標記基因序列直接鏈接至欲表現之DNA基因序列或藉由共轉染引入至同一細胞 中。較佳地，可量化標記表現。

在較佳態樣中，可將所引入核酸分子納入至接受者宿主中能夠自主複製之質體或病毒載體中。眾多種載體中之任一者可用於此目的。選擇特定質體或病毒載體之重要因素包括：1)可識別並自不含該載體之彼等接受者細胞選擇含有該載體之接受者細胞之便宜性；2)特定宿主中期望載體之拷貝數；及3)能夠使該載體在不同物種之宿主細胞之間穿梭是否合意。

較佳真核載體包括(例如)痘瘡病毒、SV40、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒及各種熟習此項技術者所熟悉之基於質體之市售哺乳動物表現載體。

在含有構築體之載體或核酸分子已經製備用於表現後，可藉由以下各種適宜方式中之任一者將DNA構築體引入至適當宿主細胞中：即轉化、轉染、病毒感染、偶聯、原生質融合、電穿孔、粒子搶技術、磷酸鈣-沈澱、直接顯微注射及諸如此類。在引入載體後，使接受者細胞在選擇性培養基中生長，該選擇性培養基選擇用於含有載體之細胞之生長。經選殖基因分子之表現導致異源蛋白之產生。

將所引入DNA「維持」在細胞中應理解為：當所引入DNA繼續生長並增殖時，其繼續存在於基本上所有所討論細胞中。亦即，所引入DNA並不自大部分經多輪細胞分裂之細胞稀釋掉。而是，其在細胞增殖期間進行複製，且所引入DNA之至少一個拷貝保持在幾乎每一子細胞中。可以兩種方式中之任一者將所引入DNA維持在細胞中。第一，其可直接整合至細胞之基因組中。此以極低頻率發生。第二，其可以染色體外元件或游離基因體之形式存在。為了游離基因體在細胞增殖期間不被稀釋掉，可選擇性標記基因可包括於所引入DNA及在需要標記基因表現之條件下生長之細胞中。甚至在已將所引入DNA整合於基因組中之情形下，可包括可選擇性標記基因以防止DNA自染色體 切除。

遺傳修飾細胞可短暫表現所關注基因或組成性表現所關注基因。表現可在細胞內或在細胞表面上。在本發明之一態樣中，本發明之ADSC經遺傳修飾以短暫表現一或多種有利於治療特定醫學病狀或減輕疼痛之細胞介素。例如，可將已經遺傳修飾以表現抗炎性細胞介素(例如，IL-2)之ADSC移植至發生發炎之位置(例如，關節炎關節)。然後移植向個體提供雙重益處，此乃因除了表現有益抗炎性細胞介素外ADSC可變成軟骨細胞。短暫表現可延續數分鐘、數小時、數天或甚至數週之時期。在本發明之一些實施例中，有益細胞介素之短暫表現為1週、2週或3週。在本發明之其他實施例中，有益細胞介素之短暫表現為症狀減少或甚至消失所必需之時間長度。症狀之減少或消失可由治療個體之熟習此項技術者(例如獸醫)確定。

然後可藉由各種方法在欲活體內表現轉基因之條件下將遺傳改變細胞引入至個體中。作為非限制性實例，轉基因可編碼用於產生細胞外基質蛋白，較佳地其中轉基因編碼用於產生膠原。然後可將含有用於細胞外基質蛋白之轉基因之細胞引入至動物中。或者，可腹膜內注射含有轉基因之細胞或將其注射至一些其他適宜的器官儲積部位中。

VI. ADSC庫

本發明亦提供已來源於非人類哺乳動物之各種物種之ADSC儲存庫。可使用之ADSC類型之非限制性實例為牛、馬、綿羊及豬。ADSC庫允許寄存及/或儲存已自非人類哺乳動物之各種分離之ADSC。ADSC庫允許熟習此項技術者(例如，獸醫)容易地且迅速地治療動物。ADSC庫亦允許熟習此項技術者利用其確定適當之自體、同種、異種或同基因ADSC治療動物。在一態樣中，提供一組可通過FDA移植(包括異種移植)條例之豬-衍生ADSC用於動物治療(治療以及 預防二者)。在另一態樣中，提供一組來源於非FDA批准來源之豬-衍生ADSC用於動物治療(治療以及預防二者)。在另一態樣中，ADSC庫對於治療接受者而言為異種的。在另一態樣中，ADSC庫充當動物治療之接受者之萬能供體。

VIII.具有來源於非人類哺乳動物之ADSC之套組

亦提供包括來源於任一非人類哺乳動物之ADSC之組合物及適宜包裝之製造物件及套組。在一態樣中，組合物包含100%(係指純度)ADSC。「純度」並非指組合物中僅存在幹細胞，而指示幹細胞已經操作以使得已將其自其天然組織環境移除。關於其他態樣，組合物包含99.9%、99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%純度之ADSC。在其他態樣中，組合物包含85%、80%、75%或70%純度之ADSC。包含來自非人類哺乳動物之ADSC之套組可用於儲存及/或裝運。在一些態樣中，本發明包括具有以下之套組：(i)一或多種來源於一或多種非人類哺乳動物之多潛能ADSC或可移植ADSC及(ii)使用該套組治療需要該治療之非人類哺乳動物之病狀之說明。在各種態樣中，本發明描述具有以下之套組：(i)一或多種來源於一或多種非人類哺乳動物之多潛能ADSC或可移植ADSC及(ii)使用該套組用於研究或藥物篩選用途之說明。在另一態樣中，ADSC之組合物係與羧甲基纖維素(CMC)組合。

本文所述組合物之適宜包裝為業內所已知，且包括(例如)小瓶(例如，密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、廣口瓶、撓性包裝(例如，密封Mylar或塑膠袋)及諸如此類。該等製造物件可進一步經滅菌及/或密封。亦提供包含本文所述組合物之單位劑型。該等單位劑型可以單一或多個單位劑量儲存在適宜包裝中且亦可進一步經滅菌並密封。本發明套組中所供應之說明通常為上標籤或包裝插頁(例如，套組中所包括之紙張)之書面說明，但機器可讀說明(例如，磁性或光學儲存碟上 所攜帶之說明)亦可接受。與使用來源於非人類哺乳動物之ADSC相關之說明通常包括關於用於預期治療或工業使用之劑量、投藥方案及投與途徑的資訊。該套組可進一步包含對選擇個別適宜或治療之描述。

該等容器可係單位劑量、散包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。例如，亦可提供含有足以向個體提供有效治療並持續諸如以下等經延長時期之劑量之ADSC的套組：約1週、2週、3週、4週、6週、8週、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月或更長中之任一者。套組亦可包括多個單位劑量之細胞及使用說明，並以足夠量包裝用於在動物診所(例如動物醫院)、動物醫院中之藥房及動物診所及/或動物醫院之供應倉庫中儲存及使用。

另外，該等套組可含有包含對於治療接受者為異種、同種或同基因之ADSC之組合物。

VIII. ADSC之治療及投與之方法

可投與ADSC以治療多種包括(但不限於)以下之哺乳動物病狀：尿失禁、骨關節炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、創傷癒合、結瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴張型心肌病、髖關節發育不全、股骨頭無血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動脈粥樣硬化相關梗塞、關節炎及肌肉萎縮症。ADSC之另一用途係阻抑免疫反應以預防移植物抗宿主(GVH)疾病。ADSC可用於組織再生或其可分泌之各種因子及/或酶或分化後其對周圍環境之影響。

可將脂肪-衍生幹細胞或分化細胞移植至接受者中，其中該等細胞將增殖並分化以形成新細胞及組織，從而提供通常由該組織提供之生理過程。本文所用術語「移植」係指單獨轉移細胞或轉移包埋於支撐基質中之細胞。該等細胞可為自體、同基因、同種或異種細胞。本文所用術語「組織」係指聯合實施特定功能之類似專門化之細胞之聚集。預期組織涵蓋所有類型之包括硬組織及軟組織二者之生物組織。 軟組織係指連接、支撐或包圍身體之其他結構及器官之組織。軟組織包括肌肉、肌腱(將肌肉連接至骨之纖維帶)、纖維組織、脂肪、血管、神經及滑膜組織(關節周圍之組織)。硬組織包括結締組織(例如，諸如骨組織或骨等硬形式)以及其他肌肉或骨骼組織。

在本發明之另一態樣中，將ADSC與醫藥上可接受之載劑或賦形劑一起投與。本文所述醫藥上可接受之賦形劑(例如，媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑)為熟習此項技術者所熟知且公眾可容易獲得。較佳地，醫藥上可接受之載劑或賦形劑為對治療組合物具有化學惰性者及在使用條件下無有害副作用或毒性者。

賦形劑或載劑之選擇在某種程度上將由特定治療組合物以及投與組合物所用之特定方法來決定。因此，存在眾多種本發明醫藥組合物之適宜調配物。本文所述調配物僅為實例性且決不具有限制性。

通常，生理上可接受之載劑係pH緩衝水溶液。生理上可接受之載劑之實例包括(但不限於)鹽水、溶劑、分散介質、細胞培養基、水性緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸、低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN(TM)、聚乙二醇(PEG)及PLURONICS(TM)。

A.尿失禁之ADSC治療

ADSC可用於治療各種非人類哺乳動物之尿失禁。尿失禁(UI)係使人虛弱且迄今不可治癒之病狀。在一態樣中，UI係定義為無意漏尿並影響大約20%切除睪丸(卵巢子宮切除術)之雌性狗，但在少於1%之 完整雌性狗中看到且極少在雄性犬中報導，不管性腺狀態如何。

罹患UI之狗具有一些常見的繼發問題，例如膀胱感染及尿燙浸。膀胱感染係由在患有UI之狗中沿尿道向上遷移並穿過較鬆弛尿道口進入膀胱之細菌引起。皮膚之尿燙浸係與漏尿(其具有高度腐蝕性)持久接觸之後果。在雌性狗中，UI可在切除睪丸後1週後之任一時間發生且與通常導致動物安樂死之嚴重管理問題相關。據信，切除睪丸之雌性狗之UI由於神經、血管或激素變化而非外科手術期間所遭受之下尿路機械損害而發生。

目前，犬UI主要利用苯丙醇胺(PPA)來治療。PPA係α-腎上腺素致效劑並刺激去腎上腺素(即增加尿道括約肌肌肉緊張度之激素物質)之分泌。1999年，聯邦食品與藥物管理局禁止PPA用於人類用途，此乃因其增加出血性中風(腦中出血或出血進入腦周圍之組織中)之風險。

已在人類醫學中成功證明瞭UI之幹細胞療法。現在，將幹細胞自個體之骨骼肌肉分離並注射至尿道括約肌中，從而導致肌肉細胞再生及尿道收縮性增強。然而，由於缺乏該等幹細胞且肌肉生檢大小受限，故此程序需要持久培養經分離幹細胞。另外，該等細胞肯定僅變成肌肉細胞且從而不能復原尿道之其他胞類型(例如神經及血管)。相比之下，ADSC可大量獲得並可分化成眾多種細胞類型(包括神經元、血管內皮及平滑肌細胞)，從而提供優於其他療法類型之優勢。

因此，ADSC可用於治療UI。在一態樣中，所使用之ADSC描述為萬能供體。用作萬能供體之ADSC可儲存在動物診所或動物醫院以便於及迅速治療。治療UI之個體具有注射至尿道之括約肌區域中之有效量之ADSC。有效量係在每個動物1百萬個至10百萬個細胞之範圍內或5百萬個/10 kg，此取決於動物大小。可藉由使用允許可視化及注射二者之尿檢查儀來完成精確注射。熟習此項技術者(例如，獸醫)可與 個體之體重成比例地調整懸浮液之體積及細胞數。

治療程序後，個體之所有者應每天留心監測個體以觀察以下特性：監測注射部位之反應體徵，例如發紅、疼痛及發熱，監測動物之過敏性反應及泌尿堵塞之體徵，動物中任一其他不尋常體徵，例如持續噁心、疲勞、嗜睡症、食欲下降及排尿困難。若觀察到任一該等特性，則個體之所有者應立即通知獸醫，以便獸醫可採取適當措施來使個體進入較好健康狀態。獸醫可在治療後定期實施評估，例如，在治療後10天至15天、25天至30天及55天至60天。

B.骨關節炎(OA)之ADSC治療

ADSC可用於治療各種非人類哺乳動物之骨關節炎(OA)。OA係狗之慢性疼痛之最常見原因，其中在美國(United States)在任何時候20%以上或10百萬隻至12百萬隻狗患有慢性疼痛。OA之特徵在於關節軟骨退化，伴隨基質損失、纖維顫動及形成裂縫，且可導致軟骨表面之完全損失。軟骨細胞(即關節軟骨之唯一細胞)經由分泌大分子組份(膠原、糖胺聚多糖及透明質酸)及調節細胞外基質周轉率來維持細胞外基質之自動調節合成及降解。在OA中，相對於同化及修補物質存在破壞性及促炎性媒介物之過量產生，從而導致關節軟骨之進行性破壞。

現在，幹細胞療法已在臨床環境中應用於人類、馬及狗。在馬中，已藉助使用脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)治療肌腱損傷、韌帶損傷、骨關節炎(OA)及骨軟骨缺陷來達成高成功率(約70%)。在狗中，OA之ADSC治療似乎同樣有效。為幹細胞療法之潛在標靶之其他犬疾病包括肌腱及韌帶損傷、髖關節發育不全、股骨頭無血管壞死、擴張型心肌病、脊髓損傷、退行性脊髓病、尿失禁(UI)及肌肉萎縮症。

目前，OA主要利用NASID來治療。然而，許多科學研究及臨床經驗表明，NSAID並不徹底緩解疼痛。與藥物療法相比，諸如ADSC 療法等細胞療法不依賴其作用之單一標靶受體或途徑。細胞療法藉由分泌細胞介素及生長因子及藉由將內源性細胞募集至受傷部位來起滋養作用，且其可促進細胞分化成常駐譜系。已知間葉幹細胞(其包括ADSC)與其局部環境之細胞連通，阻抑免疫反應並抑制凋亡。最新研究亦顯示，骨髓幹細胞(其具有與ADSC類似之再生能力)可將新粒線體遞送至受損細胞，從而拯救需氧代謝。因此，ADSC療法可減輕OA個體之疼痛並增強癒合，從而改良生活品質。

因此，ADSC可用於治療OA。在一態樣中，所使用之ADSC描述為萬能供體。用作萬能供體之ADSC可儲存在動物診所或動物醫院以便於迅速治療。在一態樣中，本發明提供對罹患OA之非人類哺乳動物(例如狗)之治療。儘管OA實際上可折磨任一關節，但其最常與後膝關節及髖關節相關。治療可藉由將ADSC懸浮液注射至該等關節中來實現。熟習此項技術者(例如，獸醫)可按個體大小熟練地成比例調整細胞懸浮液之體積及細胞數。作為非限制性實例，20 kg狗每關節可接受存於0.5 ml PBS中之5百萬個ADSC。在治療之後，建議所有者每天牽繩遛狗(leash-walk)30分鐘。允許非人類哺乳動物繼續服用在ADSC治療前所服用之任何經口醫藥。ADSC治療前之任何關節內治療應中斷。

治療後，動物評估將納入病歷、身體檢查及跛足檢查，該跛足檢查包括關節靈活性及操作時之疼痛記錄。臨床結果量度將基於動物矯形外科評估，該評估使用基於標準化問卷之數值等級量表。可在介於狗藉由關節內注射接受測試或對照製劑前2天與14天之間記錄所有者及動物評估二者之基線結果。可在狗之關節內注射後30天、60天、90天至動物診所進行跟蹤訪視。在每一訪視時，可要求所有者完成作為自辛辛那提(Cincinnati)矯形外科失能指數改編之標準問卷之一部分之數字等級量表(1(最好)至5(最差))，其包括對以下參數之評估：行 走、跑、跳、突然轉向、自躺下起來、自站立躺下、爬階梯、下階梯、蹲下排尿或排便、早晨僵硬、晚上僵硬、在光滑地板上行走之難度及自主玩耍之意願。

C.癒合傷口之ADSC治療

亦可出於加速創傷癒合及減緩瘢痕形成之目的向非人類哺乳動物投與ADSC。此具有改良美容術(即，僅出於美容目的改良瘢痕癒合)及作為改良體內外科瘢痕(例如，外科吻合部位處之過度結瘢可導致外科併發症，例如吻合部位攣縮。在外科手術時或以延遲方式局部注射ADSC可改良外科組織部位癒合並降低由於過度結瘢導致之外科手術後併發症之發生率)之輔佐物二者之應用。

因此，在本發明之一態樣中，於期望位置(例如沿外科傷口之縫合部位)皮下注射ADSC。在某些態樣中，可引入支撐材料(例如具有CMC之基質膠或微球體)之使用以進一步將ADSC定位至治療部位。將ADSC引入至傷口部位導致ADSC以模擬身體對傷口之天然反應之方式分化。例如，ADSC似乎自發分化成包含天然創傷癒合裝置之其他細胞類型(例如纖維母細胞及炎性細胞)或新形成血管。

D. ADSC之預防用途

本發明之ADSC亦用作預防以藉由分別向臀或股骨頭投與有效量之ADSC延遲髖關節發育不全及股骨頭無血管壞死之發展。有效量係在每個動物1百萬個至10百萬個細胞之範圍內或5百萬個/10 kg，取決於動物大小，此可由熟習此項技術者(例如，獸醫)容易地確定。

E. ADSC在骨折修復中之使用

本發明ADSC用於促進修復骨斷裂，包含在斷裂部位投與有效量之ADSC。在某些實施例中，ADSC之有效量可在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約5×10⁷個ADSC、約1×10⁶個ADSC至約1×10⁷個ADSC之範圍內。在其他實施例中，連同有效量之 骨形態發生蛋白(BMP)一起投與ADSC。在特定實施例中，BMP為人類BMP 2、人類BMP 4、人類BMP 7或人類BMP之混合物，該等混合物包含種BMP 2、人類BMP 4、人類BMP 7中之一或多者。在特定實施例中，BMP或BMP混合物中之一或多者係以重組方式產生。BMP之適宜含量係提供於市售去礦質骨基質產品(例如，AlloMatrix® Custom；Wright Medical Technology有限公司，Arlington，TN)中或可由熟習此項技術者獨立確定。在該等實施例之特定態樣中，同樣經靜脈內投與有效量之ADSC。在某些實施例中，經靜脈內投與之ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約5×10⁷個ADSC、約1×10⁶個ADSC至約1×10⁷個ADSC之範圍內。在該等實施例之其他態樣中，視動物大小來調整ADSC及BMP之所投與劑量。在某些實施例中，由此，所投與ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重、約5×10⁵個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重、約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內。在其他特定實施例中，所治療之動物為非人類動物且ADSC為非人類動物。在具體實施例中，ADSC為豬ADSC。

F. ADSC在「乾眼」病狀治療中之用途

非人類哺乳動物可因淚腺及/或瞼腺之功能障礙導致淚液之產量降低且不足或所產生淚液之組成經改變且有效性降低而產生之「乾眼」病狀(例如，乾性角膜結膜炎)。乾眼症之原因尤其包括自體免疫疾病(例如，修格蘭氏症候群(Sjörgen's syndrome)及/或類風濕性關節炎)、年齡及創傷。

本發明之ADSC用於促進患有乾眼症之非人類哺乳動物之淚液產生復原，包含將有效量之ADSC投與至受折磨非人類哺乳動物之眼睛之淚腺周圍區域中。在某些實施例中，ADSC之有效量可在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約5×10⁷個ADSC、約 1×10⁶個ADSC至約1×10⁷個ADSC之範圍內。在具體實施例中，將存於0.2 mL鹽水中之1×10⁶個ADSC注射至淚腺周圍區域中。在另一具體實施例中，將存於0.2 mL鹽水中之1×10⁶個ADSC注射至欲治療非人類哺乳動物之瞼腺之區域中。視需要根據治療動物之獸醫之決定重複注射。在具體實施例中，視需要根據治療動物之獸醫之決定每週重複注射，持續(例如)數週。在該等實施例之特定態樣中，同樣經靜脈內投與有效量之ADSC。在某些實施例中，經靜脈內投與之ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約5×10⁷個ADSC、約1×10⁶個ADSC至約1×10⁷個ADSC之範圍內。在該等實施例之其他態樣中，視動物大小來調整ADSC及BMP之所投與劑量。在某些實施例中，由此，所投與ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重、約5×10⁵個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重、約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內。在其他特定實施例中，所治療之動物為非人類哺乳動物且ADSC來自非人類哺乳動物。在具體實施例中，ADSC為豬ADSC。在一具體實施例中，所治療之非人類哺乳動物為貓，而在另一具體實施例中，所治療之非人類哺乳動物為狗。

G. ADSC在慢性腎衰竭治療中之使用

慢性腎病之特徵在於在經延長時期(例如，數月或數年)內腎功能之進行性損失，其通常藉由尿中血清肌酸酐含量之增加及/或蛋白質含量之增加來識別。慢性腎衰竭之發展通常與受折磨非人類哺乳動物中糖尿病、高血壓及腎小球性腎炎之存在相關。

本發明之ADSC係用於治療(例如)以改善患有慢性腎衰竭之非人類哺乳動物中慢性腎衰竭之症狀，其中該治療包含向受折磨非人類哺乳動物靜脈內投與有效量之ADSC。在某些實施例中，ADSC之有效量可在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約 5×10⁷個ADSC、約1×10⁶個ADSC至約1×10⁷個ADSC之範圍內。在具體實施例中，每公斤體重之受折磨哺乳動物經靜脈內遞送1×10⁶個ADSC。視需要根據治療動物之獸醫之決定重複投與。在具體實施例中，視需要根據治療動物之獸醫之決定每週重複投與，持續(例如)數週。在某些實施例中，經靜脈內投與之ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約5×10⁷個ADSC、約1×10⁶個ADSC至約1×10⁷個ADSC之範圍內。在該等實施例之其他態樣中，視動物大小來調整ADSC及BMP之所投與劑量。在某些實施例中，由此，所投與ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重、約5×10⁵個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重、約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內。在其他特定實施例中，所治療之動物為非人類哺乳動物且ADSC來自非人類哺乳動物。在具體實施例中，ADSC為豬ADSC。在另一具體實施例中，所治療之非人類哺乳動物為貓，而在又一具體實施例中，所治療之非人類哺乳動物為狗。

H. ADSC在急性腎衰竭治療中之使用

急性腎衰竭之特徵在於腎功能之相對快速損失。急性腎衰竭有許多原因，包括由任一原因導致之血容量、暴露於對腎有害之物質及尿路阻塞。急性腎衰竭可藉由(例如)尿素氮及肌酸酐之升高之血液含量以及藉由受折磨非人類哺乳動物不能產生足夠量之尿之腎無能來識別。

本發明之ADSC係用於治療(例如)以改善患有急性腎衰竭之非人類哺乳動物中急性腎衰竭之症狀，其中該治療包含將有效量之ADSC注射至患有急性腎衰竭之非人類哺乳動物之每一腎之腎皮質中。在某些實施例中，ADSC之有效量可在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約5×10⁷個ADSC、約1×10⁶個ADSC至約 1×10⁷個ADSC之範圍內。在具體實施例中，每公斤體重之受折磨哺乳動物遞送1×10⁶個ADSC。在一具體實施例中，將存於鹽水中之1×10⁶個ADSC注射至受折磨非人類哺乳動物之每一腎之腎皮質中。視需要根據治療動物之獸醫之決定重複投與。在具體實施例中，視需要根據治療動物之獸醫之決定每週重複投與，持續(例如)數週。在某些實施例中，所投與ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC至約1×10⁸個ADSC、約5×10⁵個ADSC至約5×10⁷個ADSC、約1×10⁶個ADSC至約1×10⁷個ADSC之範圍內。在該等實施例之其他態樣中，視動物大小來調整ADSC及BMP之所投與劑量。在某些實施例中，由此，所投與ADSC之有效量係在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重、約5×10⁵個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重、約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內。在其他特定實施例中，所治療之動物為非人類哺乳動物且ADSC來自非人類哺乳動物。在具體實施例中，ADSC為豬ADSC。在另一具體實施例中，所治療之非人類哺乳動物為貓，而在又一具體實施例中，所治療之非人類哺乳動物為狗。在再一具體實施例中，在水凝膠(例如(但不限於)基於聚葡萄胺糖之水凝膠)之前、在其之後或與其同時投與ADSC。在此實施例之一態樣中，將ADSC分佈於水凝膠(例如(但不限於)基於聚葡萄胺糖之水凝膠)中。

實例

該等實例意欲對本發明僅為實例性且從而不應視為以任何方式限制本發明，其以闡述並詳述上文所論述本發明之各個態樣。

實例1 利用脂肪組織-衍生幹細胞對犬尿失禁之實驗治療 材料及方法 動物選擇

選擇具有明顯UI症狀之雌性狗用於此研究。該等症狀包括滴 尿、損失自主控制及/或尿燙浸皮膚炎。為確保個體之UI症狀係由尿道缺陷導致，其必須展示對PPA治療之反應性。每一所有者亦藉由簽署同意書來同意進入此實驗研究，該同意書指示(1)狗將經受在後腿中測試性注射ADSC以確保沒有免疫反應，(2)將狗之PPA治療取消若干天(最多1週)以使得再次出現UI症狀，(3)狗在經受ADSC治療之前必須展示UI症狀再次出現至少3天，及(4)若所有者不願在取消PPA之後及/或在ADSC治療之後照顧狗，則狗可能需要住院，直至症狀改良為止。

治療前檢查

在治療之前，所有狗進行身體檢查、常規臨床化學及血液學評估及尿分析，以確保個體整體上健康且無原發性尿路感染。另外，將檢查後腿中之測試性注射部位以確保未發炎。

治療程序

在此研究中，UI之治療程序係將1-10百萬個豬ADSC注射至尿道之括約肌區域中。利用允許可視化及注射二者之尿檢查儀來完成精確注射。懸浮液之體積及細胞數隨個體體重成比例地變化。例如，每次注射20 kg狗將接受存於0.2 ml PBS中之2百萬個ADSC。通常，每10 kg體重使用5百萬個細胞。

治療後評估

所有者將每天藉由觀察以下特性來實施評估：監測注射部位之反應體徵，例如發紅、疼痛及發熱；監測動物之過敏性反應及泌尿堵塞之體徵；動物中任一其他不尋常體徵，例如持續噁心、疲勞、嗜睡症、食欲下降及排尿困難。

獸醫在治療後10天至15天、25天至30天及55天至60天實施評估。

實例2 使用ADSC治療骨關節炎 治療程序

儘管OA實際上可折磨任一關節，但其最常與後膝關節及髖關節相關。將ADSC注射至該等關節中與注射皮質類固醇類似，只是使用細胞懸浮液而非類固醇。細胞懸浮液之體積及細胞數隨個體之大小成比例地變化。作為實例，20 kg狗每關節將接受存於0.5 ml PBS中之5百萬個ADSC。在治療之後，建議所有者每天牽繩遛狗30分鐘。允許狗繼續服用在ADSC治療前所服用之任何經口醫藥。ADSC治療前之任何關節內治療應中斷。

治療後評估

動物評估將納入病歷、身體檢查及跛足檢查，該跛足檢查包括關節靈活性及操作時之疼痛記錄。臨床結果量度將基於動物矯形外科評估，該評估使用基於標準化問卷之數值等級量表。所有者及動物評估二者之基線結果將於狗藉由關節內注射接受測試或對照製劑前2天與14天之間記錄。在狗之關節內注射後30天、60天、90天將需要對動物診所進行跟蹤訪視。在每一訪視時，將要求所有者完成作為改編自辛辛那提矯形外科失能指數之標準問卷之一部分之數字等級量表(1(最好)至5(最差))，其包括以下參數之評價：行走、跑、跳、突然轉向、自躺下起來、自站立躺下、爬階梯、下階梯、蹲下排尿或排便、早晨僵硬、晚上僵硬、在光滑地板上行走之難度及自主玩耍之意願。

實例3 利用ADSC治療患有糖尿病之非人類哺乳動物

Pdx1係β細胞(胰島素產生細胞)發展中之關鍵調節基因且PV-16係Pdx1之經改造形式(例如，參見Tang等人，Laboratory Investigation 86：829-841(2006)；Cao等人，Diabetes 53：3168-3178(2004)；Tang等人，Laboratory Investigation 86：83-93(2006))。此實例闡述顯示在利用攜帶Pdx基因或PV-16之慢病毒轉染之後，ADSC可轉化成胰島素產生細胞之結果。然後可將該等細胞注射至門靜脈(如在島細胞細胞移 植中)以幫助糖尿病個體。此治療需要大約10億個細胞。

非人類ADSC係利用Lenti-Pdx1、Lenti-PV-16或Lenti-GFP(GFP，綠色螢光蛋白)進行轉染，其中後者充當陰性對照。轉染後，在分化培養基中培養細胞。21天後，GFP轉染之細胞之形態保持不變，而Pdx1-或PV-16轉染之細胞之形態學發生顯著變化。另外，Pdx1-或PV-16轉染之細胞似乎分泌粒狀材料。由轉染細胞進行之Pdx1 mRNA表現係藉由RT-PCR來證實並量測。使用西方墨點(Western blot)證實Pdx1蛋白質之表現。

亦藉由利用抗胰島素抗體對細胞染色來分析由經轉染細胞進行之胰島素產生。

實例4 使用循環膠原酶分離ADSC之方法

將自非人類哺乳動物分離之脂肪組織(即脂肪組織或抽脂脂肪)用含有1%青黴素及鏈黴素之PBS沖洗，切碎成小塊，然後以5：1 v/v之膠原酶溶液：脂肪比率與含有0.075%膠原酶IA型之溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)混合。於37℃下在劇烈搖動之情況下培育1小時後，然後在室溫下以220× g將產物離心10分鐘。形成三個層：上部脂質層、中間膠原酶層及底部細胞沈澱。收集中間層並藉助200 μm過濾器過濾，接著進行離心。使用流出物中之循環膠原酶IA型消化新鮮脂肪組織(亦降低購買大量膠原酶之成本)，使用高於第一輪之比率(7：1，以體積計)。

實例5 利用超氧化物歧化酶保存ADSC

此實例闡述含有自哺乳動物紅血球分離之超氧化物歧化酶以保存細胞活力之新脂肪組織保存溶液(ATPS)。ATPS係由200 mg/L KH₂PO₄、200 mg/L KCl、2.16 g/L Na₂HPO₄ ^.7H₂O、8 g/L NaCl、30,000單位/L超氧化物歧化酶(SOD)及5 g/L牛血清白蛋白(BSA)組成。

在4℃下使用ATPS保存脂肪組織24 hr及48 hr。根據上文所述程 序使用所保存之脂肪組織分離脂肪衍生幹細胞。比較自ATPS保存之組織獲得之脂肪-衍生幹細胞及自兩個個體剛採集之脂肪組織的產率。與剛採集之脂肪組織相比，ADSC之產率在24小時下為85%且在48小時下為65%。此遠高於在不存在ATPS之情況下所獲得之產率，如Matsumoto等人，Plast.Reconstr.Surg.(2007)120(6)：1510-7所報導。

亦已針對脂肪幹細胞之保存測試ATPS。將1×10⁶個非人類脂肪衍生幹細胞與1 ml ATPS混合並儲存在4℃下。48小時後，實施細胞活力測試(台酚藍(trypan blue)方法)。結果指示少於5%之細胞在利用ATPS保存48小時後受損。

實例6 分離較佳ADSC群之方法

具體細胞類型之有效且準確分離係許多研究項目之決定性態樣。使用抗體用於細胞分離並非新技術。「淘選」(即，用於使來自不同細胞類型混合物之具體細胞群富集之免疫選擇方法)已存在很長時間。此方法係基於與細胞培養皿結合之抗體之選擇能力。將細胞類型混合物於抗體塗覆板上培養並允許結合較短時期。然後可輕輕地自培養皿溶析非附著細胞(彼等不結合抗體者)，從而使得可採集所結合之細胞。此方法有助於研發其他新技術(例如密度-梯度分離)及利用具體細胞類型之獨特表面結合性質之方法。磁珠技術之研發允許重複洗滌珠結合細胞，從而極大改良潛在分離純度。各公司所用之順磁珠粒之大小及組成顯著不同且定期出現進一步改進/改良。

來源於脂肪組織消化之基質血管成分係由許多類型之細胞組成，例如幹細胞、內皮細胞、平滑肌細胞及其他終末分化細胞。磁細胞系統提供優良之磁珠粒標記細胞分選。

根據製造商之方案藉由流式細胞術針對細胞表面抗原表現來分析剛分離之ADSC。利用存於50 μl洗滌緩衝液(含有1% FBS及0.1% Na₃N之PBS)中之一級抗體(表1)於冰上將細胞培育30分鐘，接著再利用FITC偶聯之二級抗體(山羊抗IgG)進行培育。然後將細胞利用洗滌緩衝液沖洗兩次，利用存於PBS中之1%多聚甲醛固定，並藉由螢光激活細胞分選機(FACS Vantage SE；Becton Dickinson)來分析。利用FlowJo軟體(Tree Star有限公司，Ashland，OR)分析結果。所分析之細胞抗原為CD13、CD31、CD34、CD90、CD105、CD133、SSEA-1及端粒酶。表現含量呈現於表2中。

抗體混合劑

根據流式細胞術之結果，選擇三種標記作為陽性細胞標記來分 離脂肪衍生幹細胞。抗體混合劑包括比率為2：3：5之小鼠抗CD34、小鼠抗CD90及小鼠抗SSEA1。

藉由MACS對CD34(+)/CD90(+)/SSEA1(+)進行之陽性選擇

將非人類脂肪衍生幹細胞與CD34(+)/CD90(+)/SSEA1(+)一起培育。利用泛小鼠抗體磁珠粒選擇陽性細胞。

增殖差異：CD34(+)/CD90(+)/SSEA1(+)對CD34(-)/CD90(-)/SSEA1(-)細胞

培養使用CD34(+)/CD90(+)/SSEA1(+)混合劑選擇之陽性細胞及陰性空乏細胞並用於藉由MTT測試進行細胞增殖分析。結果顯示，陽性細胞生長快於陰性選擇細胞。

細胞介素分泌差異：CD34(+)/CD90(+)/SSEA1(+)對CD34(-)/CD90(-)/SSEA1(-)細胞

使用陽性及陰性選擇細胞之細胞培養基藉由細胞介素陣列檢驗細胞介素之產生。結果指示陽性選擇細胞分泌更多細胞介素，例如MCP1、b-NGF、TIMP-1 TNF-a、IL-1b、CINC-1等。

活體內恢復勃起功能之差異：CD34(+)/CD90(+)/SSEA1(+)對CD34(-)/CD90(-)/SSEA1(-)細胞

培養陽性及陰性選擇ADSC並在海綿體神經之擠壓傷後將其注射至大鼠海綿體。四週後，藉由神經刺激評價勃起功能。結果顯示，陽性選擇細胞顯著改良勃起功能，而陰性細胞無改良。

實例7 在血小板裂解物中培養ADSC

在大多數ADSC標準培養基中，動物血清為基本組份。然而，已報導將動物蛋白整合至幹細胞中且此係人類細胞療法中之主要問題。此處描述在血小板裂解物培養基中培養ADSC之新穎方法。

根據以下程序自全血獲得血小板裂解物。將全血汲取至4個含有檸檬酸鈉二水合物之50 ml無菌塑膠管中，並以350× g離心10分鐘。 利用同等體積之含有0.38 mg/ml檸檬酸鈉二水合物之磷酸鹽緩衝液鹽水(PBS)洗滌富含血小板之血漿部分。然後將血小板以510× g離心10分鐘且將沈澱懸浮於DMEM中，達到1×10⁹個細胞/ml至2×10⁹個細胞/ml之最終濃度。藉由單一循環之冷凍(80℃)及解凍(37℃)獲得血小板裂解(及趨化性因子及生長因子之後繼釋放)。高速離心存於DMEM中之血小板裂解物(12,000× g，10分鐘)以移除細胞膜，且提取上清液並儲存於-80℃下。

為測試維持及促進細胞生長及增殖之能力，在不含血清之培養基及含有10% FBS、2%血小板裂解物及4%血小板裂解物之培養基中培養ADSC。藉由MTT測試評估血小板裂解物對ADSC之增殖影響。結果指示4%血小板裂解物在支撐細胞生長及增殖方面具有與10% FBS相同之影響。

實例8 使用60微米PLGA微球體及羧甲基纖維素作為ADSC之載劑

藉由首先將1 μg 60-μm PLGA微球體與1 ml 0.5%羧甲基纖維素(CMC)混合、溶解於PBS中來製備可注射聚(乳酸-共-羥乙酸)(「PLGA」)溶液)。將大約5×10⁶個ADSC與1 ml此PLGA/CMC混合物混合。於冰上培育30分鐘後，將ADSC/PLGA混合物注射至尿道中。作為對照，將與鹽水混合之ADSC注射至不同群組之動物。四週後，殺死動物並檢查組織。結果顯示相比於鹽水群組，ADSC/PLGA群組中更多ADSC保持於注射區域中。

實例9 利用ADSC治療傷口及其他病狀

評價ADSC可自發分化成血管之程度。例如，將ADSC經皮注射至健康大鼠之皮下空間中。組織學研究顯示ADSC分化成眾多種局部細胞類型，包括血管、脂肪、肌肉、結締組織/纖維母細胞及毛囊周(圍繞皮膚毛囊)細胞。

亦沿外科傷口之縫合部位將ADSC經皮下注射。在縫合線之一側 接受懸浮於緩衝液中之ADSC之皮下注射，而另一側接受僅接受緩衝液注射。結果顯示傷口之接受ADSC之側發展顯著較高密度之血管。此外，於傷口之接受ADSC之側的瘢痕形成程度與對照側相比似乎較弱。重複該等實驗，其中改變該設計，以便在同一動物中創建相同傷口，且實驗傷口接受ADSC，而對照傷口(或者相同)不接受ADSC。該等結果具有高度再現性。

其他研究顯示所注射ADSC在傷口環境內優先分化成血管。使用稱為基質膠之試劑將ADSC引入至傷口環境中。基質膠係充當緻密凝膠之生物相容性但另外惰性材料，該緻密凝膠允許氧及微量營養素擴散，但足夠緻密以防止局部組織細胞細胞長入。重要的係，其在人為冷溫下以液態形式存在，且在體溫下以半固態形式存在。

在實驗群組中，將ADSC懸浮於設定體積之基質膠中，且然後將基質膠經皮注射至大鼠背隆起之皮下空間中。在同一大鼠中，在其背隆起之對側，注射相同體積之無ADSC之基質膠作為對照。使基質膠於傷口部位內保持10天，且然後將基質膠自傷口空間切下，切片，並評估組織學。結果顯示，懸浮於基質膠中之經標記ADSC分化成血管/內皮細胞。此外，與傷口腔並置之基質膠之邊緣與中心相比展示較高血管密度。ADSC仍經核標記標記，此證實，可視化新生血管與ADSC而非與局部血管長入相對應。基質膠之對照注射展示無血管形成。

上文所述結果顯示標靶部位內之宿主組織環境影響由ADSC分化導致之細胞類型。所注射ADSC藉由優先分化成血管而對傷口環境起反應，此與天然創傷癒合反應一致，即局部組織缺氧影響ADSC優先分化成血管。此外，ADSC似乎自發分化成包含天然創傷癒合裝置之其他細胞類型，例如纖維母細胞及炎性細胞。具體傷口應用包括(但不限於)預防在外科吻合、輻射誘導之傷口、外科吻合口(例如，結腸 造口術、尿道造口術)及美容外科傷口處結瘢/狹窄。ADSC治療亦可用於預防壓瘡(褥瘡潰瘍)之發展或促進現有壓瘡之癒合。

實例10 其他材料及方法 ADSC分離及培養

如Ning H等人，Differentiation 74：510-518(2006)中所述實施大鼠ADSC之分離。

慢病毒轉導

已闡述含有小鼠Pdx1、Pdx1-PV-16(PV-16，Pdx1之遺傳修飾形式)或綠色螢光蛋白(GFP，作為對照)之慢病毒構築體。例如，參見Tang DQ等人，Lab.Invest.86：829-841(2006)及Tang DQ等人，Lab.Invest.86：83-93(2006)。以20之感染複數(MOI)將該等構築體轉導至ADSC中過夜。恢復兩天後，將經轉導細胞轉換至分化培養基(具有23 mM葡萄糖之DMEM)中，生長至匯合，並以1：3拆分成每個10 cm培養皿大約5×10⁵個細胞。之後，每7天至10天以1：3將其拆分。

胰島素分泌之量測

為量測靜態胰島素分泌，將經GFP、Pdx1或PV-16轉導之人類ADSC系於具有FBS之分化培養基(20 mM葡萄糖)中培養3週。然後收集細胞培養基並利用針對人類胰島素之市售ELISA套組(目錄編號EZHIASF-14K，Linco Research，St.Charles，MO)進行分析。為量測因應葡萄糖激發之胰島素分泌，利用PBS將生長於6孔板(6×10⁴個細胞/孔)中之細胞洗滌3次，且然後於KRB緩衝液(120 mM NaCl，2.5 mM CaCl₂，1.1 mM MgCl₂，25 mM NaHCO₃及0.1% BSA)中培育1 h。然後將葡萄糖添加至0 mM、5.6 mM、16.7 mM、23 mM及33 mM之最終濃度。再培育1小時後，收集KRB緩衝液並利用針對大鼠胰島素之市售ELISA套組(目錄編號EZRMI-13K，Linco Research，St.Charles，MO)進行分析。該等實驗係以一式三份進行。

1型糖尿病大鼠模型之建立

已知鏈佐黴素(STZ)選擇性破壞胰腺β-細胞(Mansford KR等人，Lancet 1：670-671(1968))且亦用於建立1型糖尿病大鼠模型(El-Sakka AI等人，Int J Impot Res 11：123-132(1999)。藉由腹膜內注射60 mg STZ(存於20 mM檸檬酸鹽緩衝液)/kg體重使2個月大之雌性斯普拉-道來氏(Sprague-Dawley)大鼠患上高血糖。向對照大鼠注射20 mM檸檬酸鹽緩衝液。此後，每週利用自尾部靜脈獲得之樣品使用Accutrend帶(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)監測體重及血液葡萄糖含量。當血液葡萄糖達到300 mg/dl(在約7天內)時，使STZ治療之大鼠經受在腎小囊下注射IP-ADSC或鹽水。

於腎小囊下之細胞移植

藉由暴露於1%至3%異氟烷中使大鼠麻醉，且切開穿過左側腹之皮膚及肌肉之2 cm切口。利用1 ml含有青黴素/鏈黴素之PBS沖洗傷口，且將腎拉出體外(externalize)。在囊中切開較小橫切口，且將存於1 ml PBS中之2×10⁶ IP-ADSC或僅PBS分配於囊下方。將腎放回腹腔，且使用手術夾(surgical clip)閉合切口。利用7-0耐綸縫合線標記注射部位以供識別。

葡萄糖耐量測試

如Animal Models of Diabetes Complications Consortium(www.amdcc.org)所述實施腹膜內葡萄糖耐量測試(IPGTT)。使小鼠禁食7小時且然後腹膜內注射1 mg存於鹽水中之葡萄糖/克體重。以30分鐘間隔監測自尾部靜脈獲得之樣品中之血液葡萄糖含量並持續2小時。

免疫化學及螢光顯微鏡

以於DMEM中40%至60%匯合於6孔板之每一孔內將細胞接種至蓋玻片上。第二天，利用PBS沖洗細胞並利用冰冷甲醇固定5分鐘。 再次利用PBS沖洗細胞並利用0.05% triton X-100透化8分鐘。再次PBS沖洗後，利用5%馬血清將細胞培育1小時且然後利用抗胰島素抗體(Abcam有限公司，Cambridge，MA，1：500)培育1小時。利用PBS沖洗3次後，利用德克薩斯紅(Texas red)偶聯之二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)將細胞培育1小時。利用PBS沖洗3次後，利用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI，用於核染色，1 μg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)將細胞染色5分鐘。利用Nikon Eclipse E600螢光顯微鏡檢查經染色細胞且利用Retiga 1300 Q-成相相機記錄影像。

組織學及免疫螢光

於冷的存於0.1 M磷酸鹽緩衝液中之2%甲醛及0.002%飽和苦味酸(pH 8.0)中將組織樣品固定4小時，接著於含有30%蔗糖之緩衝液中浸漬過夜。然後將試樣包埋於OCT化合物(Sakura Finetic USA,Torrance,CA)中並儲存於-70℃下，直至使用為止。於10微米處切割經固定之冷凍組織試樣，安裝於SuperFrost-Plus載玻片(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上並空氣乾燥5分鐘。利用蘇木精及曙紅(HE染色)對該等載玻片染色用於一般組織學檢查。對於免疫螢光檢查，將載玻片置於0.3% H₂O₂/甲醇中10分鐘，於PBS中洗滌兩次並持續5分鐘，並在室溫下利用存於PBS/0.3% Triton X-100中之3%馬血清培育30分鐘。自組織切片排出此溶液後，將載玻片於4℃下培育過夜並與抗胰島素抗體(Abcam有限公司，Cambridge，MA，1：500)一起培育1小時。以類似方式製備對照組織切片，只是不添加一級抗體。沖洗之後，將切片與德克薩斯紅偶聯之二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)一起培育，接著利用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI，用於核染色，1 μg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)染色。

西方墨點分析

使細胞於含有1% IGEPAL CA-630、0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS、抑肽酶(10 μg/ml)、亮抑酶肽(10 μg/ml)及PBS之緩衝液中裂解。使含有20 μg蛋白質之細胞裂解物於SDS-PAGE中進行電泳，且然後轉移至PVDF膜(Millipore公司，Bedford，MA)。利用麗春紅S(Ponceau S)對膜染色以驗證經轉移蛋白質之完整性並監測所有蛋白質樣品之無偏差轉移。利用ECL套組(Amersham Life Sciences有限公司，Arlington Heights，IL)使用抗Pdx1抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)對膜上之蛋白質實施檢測。利用ChemiImager 4000(Alpha Innotech Corporation,San Leandro,CA)分析所得影像來測定每一蛋白質帶之積分密度值(IDV)。在利用抗b肌動蛋白抗體再次探測之前，於56℃下在62.5 mM Tris-HCl(pH 6.7)、2%SDS、10 mM 2-巰基乙醇中剝離該膜並持續30分鐘，且然後於1×TBST中洗滌4次。

RT-PCR分析

使細胞於Tri-Reagent RNA提取溶液(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)中均質化。利用DNA酶I進一步處理所提取之RNA以移除痕量之污染DNA。分別藉由分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA之量及完整性。使用SuperScript逆轉錄酶及其隨附試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)將RNA逆轉錄成「互補DNA(cDNA)之文庫」。簡言之，將2.5 μg RNA退火成12-μl體積之0.4 μg oligo-dT引物。然後添加4 μl 5×緩衝液、2 μl 0.1 M DTT、1 μl 10 mM dNTP及1 μl逆轉錄酶以使最終反應體積達20 μl。於42℃下培育1小時後，於70℃下將混合物培育10分鐘以使逆轉錄酶不活化。然後添加8 μl TE緩衝液以製作5×稀釋文庫。將此文庫之一部分進一步稀釋至各種濃度(最多100×稀釋物)。然後在10-μl聚合酶鏈反應(PCR)中使用1 μl之每一稀釋物，以識 別線性放大範圍內之最優輸入。除1-μl稀釋文庫以外，PCR混合物係由10 ng之每一引物對(表1)及與Taq聚合酶(Invitrogen)一起供應之試劑組成。於DNA Engine(MJ Research有限公司，Watertown，MA)中在所計算溫度控制下實施PCR。將循環程式設定為94℃，5秒；55℃，5秒；72℃，10秒之35個循環，接著係72℃，5分鐘之1個循環。使PCR產物於1.5%瓊脂糖凝膠在溴乙啶之存在下進行電泳，藉由UV螢光可視化，並藉由連接至電腦之數位相機來記錄。

數據分析

利用Prism 4(GraphPad Software有限公司，San Diego，CA)分析數據並表示為平均值±標準偏差。使用司徒登氏t測試(Student-t test)於兩個群組(例如，經治療者及對照)之間進行比較。使用單因子ANOVA變異數分析於3個或更多個群組之間比較。在P<0.05下之差異視為顯著。

實例11 人類及大鼠ADSC細胞系之特性

已報導人類及大鼠ADSC之分離及表徵(Lin G等人，Stem cells and development 17：1053-1063(2008)；Ning H等人，Differentiation 74：510-518(2006))。剛分離之細胞附著至塑膠培養皿允許選擇ADSC系之形態同質群。該等附著細胞呈纖維母細胞形狀並以約每3天倍增1次之速率生長。在第三代，其對於內皮標記CD31及造血標記CD34大多為陰性。其亦表現極低含量之幹細胞標記Oct4、SSEA1及端粒酶。然而，儘管沒有明顯幹細胞標記，但該等人類及大鼠ADSC二者皆能夠分化成內皮細胞及神經元樣細胞(Ning H等人，Differentiation 74：510-518(2006)；及Ning H等人，FGF2 Promotes Endothelial Differentiation of Adipose Tissue-Derived Stem Cells.J Sex Med(出版中))。

實例12 利用脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)治療1型糖尿病 ADSC中Pdx1基因之轉導及表現

使用2個人類及5個大鼠ADSC系作為用於經Pdx1轉導之候選物。另外，亦利用Pdx1-PV-16(PV-16)轉染該2個人類ADSC系，Pdx1-PV-16(PV-16)係Pdx1之遺傳修飾形式。利用GFP之轉導充當陰性對照以及用於測定轉導效率，發現轉導效率高於95%(顯示綠色螢光之細胞之百分比)。轉導後1週，Pdx1-及PV-16轉導細胞(而非GFP轉導細胞)呈現表明分泌胰島素顆粒之形態(圖1)，此隨後由免疫螢光染色(圖1)證實。RT-PCR及西方墨點分析亦證實Pdx1於Pdx1-及PV-16轉導細胞(而非GFP轉導細胞中)中表現(圖2)。最後，ELISA分析顯示Pdx1轉導細胞中胰島素之靜態產生(圖2)；從而產生胰島素之ADSC(IPADSC)。

IPADSC中Pdx1相關基因之表現

Pdx1控制若干關鍵基因在胰腺發育期間之表現，包括胰島素、升糖素及NeuroD基因。RT-PCR分析顯示人類ADSC組成性表現升糖素及NeuroD(圖3)。其亦表現較低含量之胰島素，其在IPADSC中上調。對照大鼠ADSC以低於IPADSC之含量表現胰島素、升糖素及NeuroD。該3個基因在對照及IPADSC中之表現之特異性係藉由在大鼠尿道平滑肌細胞中沒有該表現來證實(圖3)。

因應葡萄糖激發之升高之胰島素產生

如上文所論述，Pdx1轉導導致生成IPADSC，IPADSC向培養基中釋放大約30 ng/dl胰島素(圖2)。定量分析顯示該等細胞因應增加濃度之葡萄糖而產生增加含量之胰島素(圖4)。

利用IPADSC治療糖尿病大鼠

1型DM大鼠係藉由腹膜內注射STZ來產生。STZ注射後1週，該等大鼠之血液葡萄糖含量在300 mg/dl至400 mg/dl之範圍內，而僅注射有檸檬酸鹽緩衝液之對照小鼠具有正常血液葡萄糖含量。隨後利用 IPADSC治療STZ治療大鼠中之10只，而利用鹽水治療其他10只STZ治療大鼠。治療係藉由在腎小囊下移植大約2百萬隻大鼠IPADSC或注射鹽水來進行。然後每週監測該等大鼠之禁食血液葡萄糖含量及體重並持續7週。如圖5A中所示，貫穿整個過程，IPADSC治療大鼠具有低於鹽水治療大鼠之血液葡萄糖含量(P<0.05)。IPADSC治療大鼠之體重亦好於鹽水治療大鼠之彼等，但差異在統計上不顯著(P>0.05)(圖5B)。在第7週結束時，檢查所有大鼠之毛皮外觀及白內障程度，測試其葡萄糖耐量，且然後處死用於組織學評價。結果顯示相比於鹽水治療大鼠，IPADSC治療大鼠具有外貌更健康(較不邋遢)之毛皮及較低程度之白內障(圖6)。IPADSC治療大鼠亦具有較高位準之葡萄糖耐量(圖7)。最後，對所移植腎之組織學檢查顯示所移植細胞之存在，該等所移植細胞經染色對於胰島素而言為陽性(圖8)。

實例13 利用EdU標記及追蹤幹細胞

溴去氧尿苷(5-溴-2-去氧尿苷，BrdU)係可納入複製型細胞之剛合成DNA中之合成核苷。隨後含有BrdU之細胞可藉由免疫化學使用BrdU特異性抗體來檢測。BrdU標記方法已主要用於分析培養細胞中之細胞週期並用於使中樞神經系統中之增殖細胞可視化。其亦用於識別幹細胞，據信該等幹細胞分裂緩慢或不對稱分離染色體，由此使得BrdU滯留於緩慢分離之幹細胞或子代(非分化性)幹細胞(而非經分化子細胞)中。另外，已使用BrdU標記來追蹤活體外經標記並隨後活體內經移植之幹細胞或非幹細胞。在幹細胞之情形下，該追蹤使得確定所移植幹細胞是否已分化成特定細胞類型。

目前，標記分裂細胞之選擇方法為將胸苷類似物5-溴-2-去氧尿苷(BrdU)納入至S期細胞之DNA中。固定經標記細胞之後，利用BrdU特異性抗體檢測BrdU。然而，BrdU免疫化學可成問題，此乃因需要強DNA變性條件(例如強酸及加熱)來揭露遮蔽於DNA內之表位。此將 顯著可變性引入實驗內及實驗間。在克服該等問題之努力中，最近引入可選胸苷類似物5-乙炔基-2-去氧尿苷(EdU)。EdU之末端炔烴基團允許使用與炔烴基團共價結合之螢光疊氮化物檢測。此檢測方法較快且具有特異性，且不需要DNA變性。目的係研究使用EdU活體外標記ADSC並活體內追蹤經標記細胞之可行性。

動物

研究中之所有動物實驗係由舊金山加州大學機構動物照護與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of University of California,San Francisco)批准。將總共12個懷孕之三個月大未經產斯普拉-道來氏大鼠(Charles River Laboratories,Wilmington,MA)隨機分成兩個群組。遞送前1天，在測試群組中注射(i.p.)200 μg存於PBS中之EdU並在對照群組中僅注射(i.p.)PBS。使用新生大鼠來追蹤活體內標記之EdU。遞送後1週，自成人大鼠採集脂肪組織用於分離ADSC，隨後使用ADSC來活體內追蹤EdU標記細胞。

EdU標記

使ADSC於補充有10%小牛血清、青黴素及鏈黴素之DMEM中之玻璃蓋玻片上生長。對於劑量效應，以0 μM、10 μM、20 μM及50 μM將EdU添加至培養基。24小時後，利用PBS洗滌細胞，接著添加常規培養基(圖9)。對於時程研究，利用10 μM EdU標記ADSC，且然後在1天、4天、7天、14天及21天時拆分(圖10)。

EdU染色

甲醇固定後，利用PBS將細胞洗滌兩次，且然後在室溫下於存於PBS中之3% BSA中、接著於存於PBS中之0.5% Triton® X-100中培育20分鐘。然後在室溫下於黑暗中利用剛製成之Click-it反應混合劑(Invitrogen)將細胞培育30分鐘。利用DAPI對細胞對比染色，將其安裝於標準安裝介質中並藉由螢光顯微鏡成像。

組織之EdU標記

向懷孕大鼠腹膜內注射200 μg存於PBS中之EdU，且新生大鼠在出生後2小時、1週及6週用於採集各種組織。於冷的存於0.1 M磷酸鹽緩衝液中之2%甲醛及0.002%飽和苦味酸(pH 8.0)中將所採集組織固定4小時，接著於含有30%蔗糖之緩衝液中浸漬過夜。然後將試樣包埋於OCT化合物(Sakura Finetic USA,Torrance,CA)中並儲存於-70℃下，直至使用為止。加工30個來自EdU注射群組及PBS注射群組二者之不同組織(表3)用於組織陣列。於10微米處切割經固定之冷凍組織試樣，安裝於SuperFrost-Plus載玻片(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上並空氣乾燥5分鐘。如上文所述對組織實施EdU染色。亦利用蘇木精及曙紅(HE染色)對組織染色用於一般組織學檢查(圖11)。

追蹤所移植ADSC

利用10 uM EdU標記總共1×10⁶個大鼠ADSC並持續12小時，並自體注射至膀胱頸。在移植後1天、2天、1週及4週採集組織。於冷的存於0.1 M磷酸鹽緩衝液中之2%甲醛及0.002%飽和苦味酸(pH 8.0)中將組織樣品固定4小時，接著於含有30%蔗糖之緩衝液中浸漬過夜。然後將試樣包埋於OCT化合物(Sakura Finetic USA,Torrance,CA)中並儲 存於-70℃下，直至使用為止。於10微米處切割經固定之冷凍組織試樣，安裝於SuperFrost-Plus載玻片(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)上並空氣乾燥5分鐘。對於免疫螢光檢查，將載玻片置於0.3% H₂O₂/甲醇中10分鐘，於PBS中洗滌兩次並持續5分鐘，並在室溫下利用存於PBS/0.3% Triton X-100中之3%馬血清培育30分鐘。自組織切片排出此溶液後，於室溫下利用抗α平滑肌肌動蛋白抗體(Abcam有限公司，Cambridge，MA，1：500)將載玻片培育1.5小時。以類似方式製備對照組織切片，只是不添加一級抗體。沖洗後，利用FITC偶聯之二級抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)培育切片。利用PBS洗滌後，然後於室溫下在無光之情況下利用剛製成之Click-it反應混合物將載玻片培育30分鐘，接著利用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI，用於核染色，1 μg/ml，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)染色。參見圖12。利用10 μM EdU標記大鼠ADSC並持續12小時，且然後自體注射至膀胱頸(A)。4週後，藉由針對EdU(若使用彩色照片，則其將為紅色)、α-平滑肌肌動蛋白(SMA，若使用彩色照片，則其將為綠色)及細胞核(若使用彩色照片，則其將為藍色)檢查組織切片。可在膀胱頸中觀察到EdU標記細胞(B，×20)。大部分EdU標記細胞定位於結締組織。少數EdU標記細胞似乎已分化成平滑肌細胞(C，×200)。

實例14 利用同基因ADSC治療尿失禁 方法

在此實驗中使用22只於妊娠第16天之2個月大初產斯普拉-道來氏大鼠。將其隨機分成對照群組(n=10)及ADSC移植群組(n=12)。分娩後，所有大鼠經歷陰道之血管氣球擴張術及卵巢切除術。1週後，大鼠接受ADSC或PBS之注射。

注射前，利用10uM EdU標記同基因大鼠ADSC並持續12小時。 在治療群組中，將1×10⁶個存於400 μl PBS中之EdU標記之ADSC注射至膀胱頸及副尿道組織中。在對照群組中，將400 μl PBS注射至相同區域中。

注射後4週，所有動物經歷藉由清醒狀態膀胱測壓對膀胱功能之評價。若膀胱充盈伴隨有頻繁的低體積膀胱收縮以及漏尿，則將膀胱測壓結果歸類為「異常」。在膀胱測壓之後，對所有動物實施安樂死。採集尿道、陰道、骨盆底組織及膀胱。對該等組織實施免疫螢光染色以定位EdU、平滑肌肌動蛋白(SMA)及核(DAPI染色)。亦實施化學染色來評價治療群組之間彈性纖維之差異。利用司徒登氏t-測試進行統計分析。

結果

基於上文所述膀胱測壓準则，對照群組中10只大鼠中之8只具有異常泌尿功能，而ADSC治療群組中12只(33.3%)大鼠中之4只具有異常泌尿功能。ADSC移植群組中之平均排尿壓力顯著高於對照群組(分別61.7±13.9 cm H₂O對34±8 cm H₂O)(P<0.05)(圖13)。在膀胱頸及尿道之黏膜下層中識別EdU標記細胞。一些該等EdU陽性細胞對於SMA而言亦為陽性的，此表明ADSC分化成平滑肌細胞(圖14)。在利用ADSC治療之大鼠之尿道中存在顯著較多之彈性纖維(圖15)。

實例15 利用異種ADSC治療尿失禁 方法

在此實驗中使用12只於妊娠第16天之2個月大初產斯普拉-道來氏大鼠。將其隨機分成對照群組(n=5)及ADSC移植群組(n=7)。分娩後，所有大鼠經歷陰道之血管氣球擴張術及卵巢切除術。1週後，大鼠接受ADSC或PBS之注射。

自1個月大雄性約克夏豬(Yorkshire pig)分離ADSC並利用10uM EdU標記12小時，然後注射。在治療群組中，將1×10⁶個存於400 ul PBS中之EdU標記之ADSC注射至膀胱頸及副尿道組織中。在對照群組中，將400 ul PBS注射至相同區域中。

注射後4週，所有動物經歷藉由清醒狀態膀胱測壓對膀胱功能之評價。若膀胱充盈伴隨有頻繁的低體積膀胱收縮以及漏尿，則將膀胱測壓結果歸類為「異常」。在膀胱測壓之後，對所有動物實施安樂死。採集尿道、陰道、骨盆底組織及膀胱。對該等組織實施免疫螢光染色以定位EdU、平滑肌肌動蛋白(SMA)及核(DAPI染色)。亦實施化學染色來評價治療群組之間彈性纖維之差異。利用司徒登氏t-測試進行統計分析。

結果

基於上文所述膀胱測壓準则，對照群組中5只大鼠中之4只具有異常泌尿功能，而ADSC治療群組中7只(14.2%)大鼠中之1只具有異常泌尿功能。ADSC移植群組中之平均排尿壓力高於對照群組(分別48.7±16.1 cm H₂O對34.4±7.8 cm H₂O)(P=0.097)(圖16)。在膀胱頸及尿道之黏膜下層中識別EdU標記細胞。一些該等EdU陽性細胞對於SMA而言亦為陽性的，此表明ADSC分化成平滑肌細胞(圖17)。

實例16 ADSC之內皮分化 活體內內皮分化

為測試ADSC是否可分化成內皮細胞，將ADSC注射至大鼠之陰莖中並在4週後檢查該組織。藉由BrdU染色識別ADSC，且其中大約5%之大鼠內皮細胞抗原(RECA-1)染色亦呈陽性。該等細胞定位至竇狀內皮細胞，如藉由螢光及相位差顯微鏡之疊加影像所揭露(圖18)。

細胞生長在EGM2培養基中之形態及生長特性

在DMEM中以常規方式培養ADSC。在EGM2中以常規方式培養內皮細胞，EGM2為市售內皮生長培養基。當利用EGM2替代ADSC培養中之DMEM時，該等細胞相比於保持於DMEM中之細胞更快到達匯 合並似乎更緊實(更大核)。增殖分析證實ADSC在EGM2中比在DMEM中生長快得多(圖19)。

內皮特性

免疫化學顯示在EGM2中生長之ADSC表現內皮特異性標記CD31、vWF及eNOS(圖20)。基質膠管形成分析亦顯示在EGM2中生長之ADSC能夠形成內皮樣管結構。另外，LDL攝取分析顯示在EGM2中生長之ADSC具有LDL攝取之能力。該3個分析之內皮特異性係由HUVEC細胞之陽性結果來支持。

內皮分化之可逆性及可再誘導性

ADSC分化是否可逆係藉由利用DMEM代替EGM2來測試。此導致所有內皮特性消失(圖21)。內皮分化是否可再誘導係藉由將EGM2再引入至細胞中來測試。此導致所有內皮特性再現，雖然含量減少。該等測試確定EGM2培養基含有能夠誘導ADSC內皮分化之特異性因子。

內皮誘導因子之識別

EGM2培養基係由製造商以基礎培養基(EBM2)及含補充因子之個別小瓶之形式供應。此包裝格式允許測試與ADSC內皮分化相關之每一補充因子之重要性。具體而言，藉由一次省略一種補充因子製備「減法」EGM2培養基。然後將ADSC維持於每一經減去EGM2培養基中1週，且然後分析其LDL攝取能力，已顯示該能力為最可靠內皮標記。結果顯示，在生長因子中，省略VEGF、EGF或IGF基本上沒有影響，而省略FGF2極大減弱ADSC之LDL攝取能力(圖22)。在非生長因子中，省略氫化可體松或肝素基本上沒有影響，而省略維生素C極大減弱ADSC之LDL攝取能力。當省略FGF2及維生素C二者時，ADSC基本上不呈現任何LDL攝取能力。為進一步證實FGF2及維生素C之重要性，藉由將FGF2及/或維生素C添加至EBM2製備「加法」培養基， 將ADSC維持於該等培養基中1週，且然後分析ADSC之LDL攝取能力。結果顯示，(1)補充有FGF2及維生素C之EBM2與EGM2幾乎一樣有效，(2)補充有FGF2之EBM2仍有效，雖然含量減少，及(3)補充有維生素C之EBM2仍略微有效，但含量極大減少(圖23)。亦值得注意的係，在不含維生素C之EGM2(圖22)中或在補充FGF2之EBM2(圖23)中生長之細胞呈現圓形形態，此可指示氧化壓力。

藉由FGF2誘導其他內皮特性

上文實驗識別FGF2為誘導ADSC之LDL攝取能力所需之唯一生長因子。然後測試FGF2是否能夠誘導其他內皮特性之表現。結果顯示此的確如此；亦即，在補充FGF2/維生素C之EBM2中生長之細胞獲取所有所測試內皮標記，如在補充完全之EGM2中生長之細胞一樣(圖24)。

FGFR1抑制劑阻斷ADSC內皮分化

為進一步證實FGF2在ADSC內皮分化中之關鍵作用，在PD173074(即FGF受體(FGFR1)之選擇抑制劑)之存在或不存在下實施ADSC分化實驗。在PD173074之不存在下(僅添加溶劑)，在補充完全之EGM2或補充FGF2/維生素C之EBM2中生長之細胞獲取LDL攝取能力(圖25)。另一方面，在PD173074之存在下，在任一培養基中生長之細胞不能獲取該能力(圖25)。為確保VEGF信號傳導不干擾此測試，由於已知PD173074對VEGF受體(VEGFR2)具有較弱抑制作用，故顯示在補充VEGF/維生素C之EBM2中生長之ADSC未獲取LDL攝取能力。

實例17-骨折修復

在此實例中，投與豬ADSC以逆轉犬中之去鈣作用及斷裂長骨變薄並促進骨折修復。

非人類患者

此實例中之患者係其左前腿之橈骨及尺骨二者已遭受嚴重骨折之7個月大900 g犬(小型貴賓犬)。

治療前檢查

已以外科手術方式藉由使用5個螺釘將加壓接骨板附接至橈骨來修復斷裂。然而，X射線分析(「第0天」)已證明橈骨未充分癒合且存在在斷裂區域內及在該板下之去鈣作用及骨嚴重變薄(骨量減少)之證據。因此，在其他治療之準備中，移除兩個螺釘且使用包含人類骨形態發生蛋白(「BMP」)之市售去礦質骨基質產品(Allo基質® Custom；Wright Medical Technology有限公司，Arlington，TN)進行初始修復。允許切口癒合1週。

治療程序

已移除2個螺釘後1週(圖26，圖A)，以0.5 mL之體積向該板之內側及外側經皮下投與5×10⁶個豬ADSC，且向動物經靜脈內投與另外1×10⁶個豬ADSC。

治療後評估

第17天(圖26，圖B)及第26天(圖26，圖C)進行之X射線分析展示，去鈣作用逆轉，品質有所改良且斷裂部位處之骨變厚，從而填滿了因移除螺釘而產生之空隙並使斷裂癒合。

此實例展示異種ADSC有助於非人類動物中之骨修復之令人驚奇且意外的能力。

上文所引用之所有參考文獻以引用的方式併入本專利中。

根據本文所提供之詳細闡述，本發明之其他可應用領域將變得顯而易見。應理解，本詳細說明及具體實例儘管指出本發明之較佳實施例，但其僅意欲用於說明目的且並不意欲限制本發明之範圍。

Claims (28)

1. 一種脂肪組織-衍生幹細胞(ADSC)之用途，其用於製造用以治療非人類哺乳動物之骨折之藥劑。
2. 如請求項1之用途，其中該非人類哺乳動物係選自由狗、貓、馬、兔、豬、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹及美洲駝組成之群。
3. 如請求項1之用途，其中該ADSC對於該非人類哺乳動物而言為異種的。
4. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於提供在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
5. 如請求項4之用途，其中該藥劑係用於提供在約5×10⁶個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
6. 如請求項5之用途，其中該藥劑係用於提供在約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
7. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於與骨形態發生蛋白一起投與。
8. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於在該骨折部位投與。
9. 如請求項8之用途，其中該藥劑係用於靜脈內投與ADSC的投噢。
10. 如請求項9之用途，其中該靜脈內投與之ADSC係在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重之範圍內。
11. 如請求項10之用途，其中該靜脈內投與之ADSC係在約5×10⁶個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內。
12. 如請求項11之用途，其中該靜脈內投與之ADSC係在約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內。
13. 如請求項1之用途，其中該ADSC為豬ADSC。
14. 一種脂肪組織-衍生幹細胞ADSC之用途，其用於製造用以治療非人類哺乳動物之選自由「乾眼」病狀、慢性腎衰竭、急性腎衰竭及其組合組成之群之病狀的藥劑。
15. 如請求項14之用途，其中該非人類哺乳動物係選自由狗、貓、馬、兔、豬、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹及美洲駝組成之群。
16. 如請求項14之用途，其中該ADSC對於該非人類哺乳動物而言為異種的。
17. 如請求項14之用途，其中該藥劑係用於提供在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
18. 如請求項17之用途，其中該藥劑係用於提供在約5×10⁶個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
19. 如請求項18之用途，其中該藥劑係用於提供在約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
20. 如請求項14之用途，其中該藥劑係用於靜脈內投與。
21. 如請求項20之用途，其中該藥劑係用於提供在約1×10⁵個ADSC/kg體重至約1×10⁸個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
22. 如請求項21之用途，其中該藥劑係用於提供在約5×10⁶個ADSC/kg體重至約5×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
23. 如請求項22之用途，其中該藥劑係用於提供在約1×10⁶個ADSC/kg體重至約1×10⁷個ADSC/kg體重之範圍內之ADSC。
24. 如請求項14之用途，其中該ADSC為豬ADSC。
25. 如請求項14之用途，其中該病狀為「乾眼」病狀。
26. 如請求項25之用途，其中該藥劑係用於投與至該非人類哺乳動物之淚腺周圍區域中。
27. 如請求項14之用途，其中該病狀為慢性腎衰竭。
28. 如請求項14之用途，其中該病狀為急性腎衰竭。