KR20150130778A

KR20150130778A - 줄기세포 및 췌장소도 세포를 이용한 당뇨병 치료용 헤테로 스페로이드 제조 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150130778A
Application number: KR1020140057801A
Authority: KR
Inventors: 변영로; 김병수; 김지웅; 정지헌
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2015-11-24
Also published as: KR101637937B1

Abstract

본 발명의 헤테로스페로이드(hetero-spheroid) 제조방법은 세포 크기 조절을 통하여 췌장소도 단일세포의 생존율을 향상 및 영양분 공급을 원활히 하고, 이식 전 및 후에 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor(VEGF)) 및 CD31을 많이 발현시켜 신생혈관생성을 촉진하고, 항괴사 유전자인 Bcl-2 유전자 발현을 증가시키고 세포괴사 관련 단백질의 양을 감소시켜 세포 괴사 억제를 확인함으로써 당뇨병 치료를 위한 취도세포이식 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 및 췌장소도 세포를 이용한 당뇨병 치료용 헤테로 스페로이드 제조 방법 및 이의 용도{Method of hetero-spheroid for treatment Diabetes Mellitus disease using stem cell and islet cell, and use of the same}

본 발명은 췌장소도 단일세포 및 줄기세포를 혼합한 후 배양하는 단계를 포함하는 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드(hetero-spheroid)를 제조하는 방법 및 이를 이용한 당뇨병 치료에 관한 것이다.

현재 당뇨병으로 고통받고 있는 환자는 전 세계의 4.6%이며, 지속적으로 증가하여 2025년에는 6.0%를 초과할 것으로 예상되고 있다. 최근, 췌장이식 및 췌도세포이식을 통한 당뇨병 치료가 시행되고 있다. 그러나 현재 췌도세포 이식을 위한 세포의 분리 및 배양기술은 2~4명의 공여자로부터 얻은 췌도세포로 한 명의 당뇨병환자에게 이식할 수 있는 정도이며, 이식 후 인슐린 비의존성의 유지는 10% (5년)을 넘지 못하고 있는 실정이다. 그러므로 췌도세포 분리 및 배양 조건을 최적화하고, 이식된 췌도의 손상을 최소화하여 이식 조직의 생존률을 향상시키고자 하는 연구들뿐만 아니라, 다양한 췌도세포의 증식방법, 인간 이외의 동물조직을 이용한 이종이식 등의 방법 등에 대해서도 연구를 진행하고 있다. 또한, 췌도세포는 췌장조직으로부터 분리될 때, 췌도세포의 기능이 손상되고 세포사멸이 초래된다는 문제점이 있고, 일반적인 세포주와 달리 췌도세포는 배양기간에 따라 세포의 손실이 급증하는 것으로 알려져 있다.

한편, 현재 췌도세포의 기능 및 활성의 향상에 관련된 여러 가지 성장인자들이 알려져 있고, 이들의 췌도세포에 대한 영향에 대한 현상 및 그 기전에 대하여 다각적인 검증이 이루어지고 있는 추세이다. 대표적으로 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF(Brissova M, et al., Diabetes. 55(11):2974-2985, 2006)), 인터루킨-6 (Interleukin-6: IL-6(Shimizu H, et al., J. Endocrinol. 6(1):121-126, 2000)), TGF-베타(Hanley S, et al., Mol Endocrinol. 21(6):1467-1477(2007)), 간성장인자(Hepatocyte growth factor: HGF (Izumida Y, et al., (2005) Biochem Biophys Res Commun. 8;333(1):273-282)) 등을 들 수 있고, 연구 결과 이러한 성장 인자들이 중간엽 줄기세포로부터 인접세포들에 대한 자극 효과(trophic effect)에 의해서 방출되는 성장 인자들 중에 포함이 된다. 하지만 이러한 성장인자들의 조합에 의한 췌도세포의 생물학적 기능 및 활성의 향상에 대해서는 현재까지도 연구 성과가 미비한 상황이다.

최근에 골수 및 제대혈 유래의 중간엽 줄기세포를 이용하여 췌도세포와 공동배양 또는 중간엽 줄기세포를 배양한 배양액을 이용하여 췌도세포를 배양한 연구가 있으나(대한민국 공개특허 10-2009-0110738), 이에 대한 기전 연구는 아직 미흡한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점들을 극복하기 위하여, 줄기세포와 췌장소도 세포를 이용하여 클러스트(cluster)를 제조하는 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 줄기세포와 췌장소도 세포가 결합된 헤테로스페로이드가 혈관생성을 촉진하고 세포괴사를 억제하며 이식체의 췌장소도 단일세포의 생존률을 향상시켜 당뇨병 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 줄기세포 및 췌장소도 세포를 이용한 당뇨병 치료용 헤테로 스페로이드 제조 방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 췌장소도 세포 및 줄기세포를 혼합한 후 배양하는 단계를 포함하는 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드(hetero-spheroid) 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드를 제공한다.

나아가, 본 발명은 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드를 인간을 제외한 개체에 이식하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다.

도 1은 췌장소도세포 자체로 이식한 경우, 췌장소도세포와 줄기세포를 섞어서 이식한 경우, 및 췌장소도 단일세포와 줄기세포를 헤테로스페로이드 방법으로 이식한 경우에 각각의 차이를 설명하는 도이다.
도 2는 헤테로스페로이드의 제조방법에 대해 설명한 도이다.
도 3은 췌도세포 클러스터(ICC) 및 헤테로스페로이드(IC:MSC=10:1, 2:1 및 1:1)를 각각의 비율로 제조한 후, 생존성을 나타낸 도이다.
도 4는 췌도세포 클러스터(ICC) 및 헤테로스페로이드(10:1, 2:1 및 1:1)의 크기 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드(10:1, 2:1 및 1:1)의 구성형태를 나타낸 도이다(췌장소도 단일세포(IC): 녹색, 줄기세포(MSC): 붉은색).
도 6는 헤테로스페로이드(10:1, 2:1, 1:1)를 제조한 후 트립신 처리에 의해 분리하여 이의 구성 성분을 이미지로 나타낸 도이다(핵: 푸른색, 줄기세포: 붉은색).
도 7은 헤테로스페로이드(10:1, 2:1 및 1:1) 제조한 후 트립신 처리에 의해 분리하여 이의 구성 성분을 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 췌도세포클러스터 및 헤테로스페로이드(10:1, 2:1 및 1:1)를 7일간 배양 후 생존성을 이미지로 나타낸 도이다.
도 9는 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드(10:1)를 정상산소(Normoxia) 조건 및 저산소(Hypoxia) 조건에서 배양 후, 생존성의 차이를 이미지로 나타낸 도이다.
도 10은 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드를 정상산소 조건 및 저산소 조건에서 배양 후, 항세포괴사 인자 및 세포괴사 인자 관련 유전자의 발현 비율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드(10:1)을 배양한 배지에서의 혈관신생관련 단백질 발현 양(A 및 B) 및 시간에 따른 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor(VEGF)) 분비양(C)을 나타낸 도이다.
도 12는 간문맥을 통해서 췌도세포클러스터(A) 또는 헤테로스페로이드(10:1)(B)를 각각 이식한 후 간에 분포하는 형태를 나타낸 이미지이다.
도 13은 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드(10:1)를 마우스 모델에 각각 이식한 후, 조직검사에서 혈관생성의 정도를 CD31의 발현 측정을 이용하여 나타낸 도이다.
도 14는 췌도세포클러스터 및 헤테로스페로이드(10:1)를 마우스 모델에 각각 이식한 후, 이식된 조직을 취하여 시간에 따른 Bcl-2 유전자 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 15는 췌도세포클러스터 및 헤테로스페로이드(10:1)를 마우스 모델에 각각 이식한 후, 이식된 조직을 취하여 시간에 따른 세포괴사 관련 caspase-3 및 -7의 단백질 및 유전자 발현양을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 췌장소도 세포 및 줄기세포를 혼합한 후 배양하는 단계를 포함하는 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드(hetero-spheroid) 제조 방법을 제공한다.

상기 헤테로스페로이드는 줄기세포와 췌장소도 단일세포가 결합된 세포 덩어리를 의미하는 것으로, 상기 췌장소도 세포 및 줄기세포는 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합하는 것이 바람직하고, 10:1인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 헤테로스페로이드는 정상산소증 경우의 항괴사 유전자인 Bcl-2 유전자의 발현 비율은 췌장소도 클러스트 또는 췌도세포와 줄기세포가 2:1 또는 1:1 비율의 헤테로스페로이드보다 10:1 비율의 헤테로스페로이드에서 가장 높은 발현 비율을 나타내고, 또한 저산소증 경우에서도 10:1 비율의 헤테로스페로이드가 현저한 Bcl-2 유전자의 발현을 나타냄으로써, 췌도세포와 줄기세포가 10:1 비율로 혼합된 헤테로스페로이드를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하고, 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(cord blood mesenchymal stem cells) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

또한, 상기 중간엽 줄기세포는 사람, 마우스를 포함하는 포유동물로부터 유래한 것이 바람직하다.

상기 췌장소도 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드의 크기는 1-100 ㎛인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 췌장소도 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드는 췌장소도 세포의 생존률을 증가시키고, 혈관신생(angiogenesis)을 촉진시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 췌장소도 및 줄기세포는 세포사멸 억제 유전자의 발현을 증가시키고, 세포사멸 촉진 유전자의 발현을 억제시키는 것이 바람직하고, 상기 세포사멸 억제 유전자는 Bcl-2이고, 세포사멸 촉진 유전자는 Bax인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 췌장조직으로부터 분리된 췌도세포와 줄기세포를 현적법을 이용하여 혼합시키고 배양하여 헤테로스페로이드를 제조하고(도 2 참조), 헤테로스페로이드(HS)의 생존율을 평가한 결과, 거의 모든 헤테로스페로이드가 생존성에 영향을 받지않음을 확인하였다(도 3 참조). 헤테로스페로이드의 크기 측정한 결과, 약 80 ㎛의 지름을 나타냈고(도 4 참조), 각각의 헤테로스페로이드의 구성형태를 염색법을 이용하여 측정한 결과, 헤테로스페로이드는 췌장소도와 줄기세포의 비율을 잘 유지함을 확인하였다(도 4, 5 및 6 참조). 헤테로스페로이드는 장기간 배양에서 세포괴사가 관찰되지 않았고(도 8 참조), 저산소증에서 헤테로스페로이드가 췌장소도보다 높은 생존률을 나타냈으며(도 9 참조), 정상 산소증 및 저산소증 경우 모두에서 Bcl-2 유전자는 헤테로스페로이드가 췌도세포 클러스터 보다 높게 나타났으나, Bax 유전자는 헤테로스페로이드가 췌도세포 클러스터보다 낮게 나타났다(도 10 참조).

또한, 헤테로스페로이드는 신생혈관 인자들인 TIMP-1, Ang-1, TSP-1, IGFBP-3, PDGF-AA, ET-1, CXCL8, 및 VEGF를 발현하였고(도 11A 참조), 특히 헤테로스페로이드로부터 분비되는 VEGF의 발현 양은 췌도세포 클러스로부터 분비되는 발현 양보다 현저히 증가함을 확인하였다(도 11B 참조).

또한, 간문맥이식에 있어서, 헤테로스페로이드는 줄기세포와 췌도세포가 동시에 같은 위치로 이동할 수 있는 우수한 방법임을 확인하였다(도 12 참조). 이식한 후의 조직에서 신생혈관생성 효과를 검증한 결과, 헤테로스페로이드를 이식한 경우가 췌도세포 클러스터를 이식한 경우보다 CD31을 많이 발현함으로써 혈관생성을 현저히 촉진함을 확인하였다(도 13A, 13B 및 13C 참조). 또한, 이식된 조직의 괴사정도를 비교한 결과, 헤테로스페로이드를 이식한 경우가 췌도세포 클러스터를 이식한 경우보다 Bcl-2 유전자를 많이 발현하였으며, Casaps-3 및 Casaps-7와 같은 세포괴사 관련 단백질 및 유전자의 발현 정도를 조사한 결과, 헤테로스페로이드 보다 췌도세포 클러스터에서 많이 발현됨을 확인함로써(도 14 및 15 참조), 상기 췌장소도와 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드는 당뇨병 치료를 위한 세포이식 방법으로 유용하게 사용될 수 있다(도 1 참조).

본 발명은 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드를 인간을 제외한 개체에 이식하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법을 제공한다.

상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 개체는 인간을 제외한 영장류(챔팬지, 고릴라, 짧은 꼬리 원숭이, 원숭이 등), 설치류(생쥐, 쥐, 게리빌스쥐, 헴스터, 토끼, 기나아피그 등), 개, 고양이, 일반 가축(소, 말, 돼지, 염소)을 포함하는 기타 포유류 종인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드 제조방법은 췌장소도 단일세포의 생존율을 향상시키고 이식시 신생혈관생성을 촉진시키고 항괴사 단백질을 증가시켜 세포괴사를 억제함으로써 당뇨병 치료를 위한 세포이식 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다.

단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 헤테로스페로이드(hetero spheroid)의 형성 확인

<1-1> 췌도세포의 분리

췌도세포를 분리하기 하루 전부터 금식시킨 체중 250 내지 300 g의 SD 랫트를 케타민(ketamine)과 자일라진(xylazine)의 혼합용액으로 피하주사하여 마취시켰다. 복강을 개복한 후 췌장을 부풀리기 위해 콜라게네이즈(collagenase; 1.5 mg 콜라게네이즈/HBSS 1 mL, 12.5 mL/SD 래트)를 담즙관(bile duct)을 통해 주입하였고, 주입이 끝남과 동시에 즉시 부풀려진 췌장을 적출하였다. 적출한 췌장을 가위로 잘게 부수고, 37℃ 수조 내에서 흔들어주면서 분해시킨 후 더 이상의 분해를 막기 위하여 냉각된 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)를 첨가하였다. 분해된 췌장 조직을 채로 거른 후 여러 번 세척하여 이를 약 1400 rpm에서 4분간 원심분리를 수행하여 상층액을 제거하고, 27, 23, 20 및 11%의 피콜(ficoll) 농도 구배를 준 후 약 2400 rpm에서 24분간 원심분리를 실시 하였다. 20%와 23% 층 사이 및 11%와 20% 층 사이에 존재하는 췌도를 모아 세척한 후 RPMI-1640 배양액이 첨가된 배양 접시로 옮겨 37℃에서 5% CO₂를 공급하면서 배양하였다. 배양액은 이틀에 한 번씩 새것으로 교체해 주었고 이로부터 췌도세포를 분리하였다.

<1-2> 헤테로스페로이드(hetero spheroid)의 형성방법

당뇨병 치료를 위한 췌장소도 이식에 있어서, 부작용을 최소한으로 줄이기 위하여, 상기 실시예 <1-1>로부터 분리된 췌장소도 단일세포와 인간골수 유래 중간엽 줄기세포(Bone marrow-derived human MSCs(hMSCs), Lonza, Walkersville, MD)를 각각 1:0, 10:1, 2:1 또는 1:1의 비율로 섞어서 헤테로스페로이드를 제조하였다. 구체적으로, 총 부피 30 ㎕에 총 세포의 합이 500개를 기준으로 하여 페트리디쉬(petri dish) 뚜껑에 마이크로 파이펫을 이용하여 방울방울 놓은 후(현적법), 뚜껑을 돌려서 닫는다. 상기 페트리디쉬에 약 15 ㎖의 PBS를 첨가하여 세포가 들어있는 방울이 마르지 않도록 한다. 상기 페트리디쉬를 세포 배양기에서 37℃에서 3일 동안 배양하고 수거하여 헤테로스페로이드를 제조하였다.

상기 헤테로스페로이드 제조과정을 도 2에 나타냈다.

< 실험예 1> 췌도세포 클러스터( ICC ) 또는 헤테로스페로이드(HS)의 생존율 평가

상기 실시예 <1-2>에서 제조한 헤테로스페로이드의 생존율을 평가하기 위해서, 상기 실시예 <1-1>의 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드를 배양 플레이트에 각각 첨가하였다.

구체적으로, 배양액은 FBS가 10% 포함된 RPMI-1640 배지를 사용하였고, 세포배양기 내에서 2일 동안 배양하였다. 상기에서 배양한 각각의 췌장소도를 HBSS 완충용액으로 세척하고 라이브/데드 세포 키트(live/dead cell kit)로 15분 동안 반응시킨 후, 형광 현미경을 이용하여 세포의 생존성을 확인하였다. 이때, 죽은 세포는 붉은색으로 염색되고 살아있는 세포는 녹색으로 염색된다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 췌도세포 클러스터(ICC) 또는 헤테로스페로이드(HS)는 거의 녹색으로 염색되어 생존성에 영향을 받지 않음을 확인하였다(도 3).

< 실험예 2> 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드 의 크기 및 구성형태 평가 확인

<2-1> 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 크기 측정

상기 <실시예 1>에서 제조한 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 크기를 측정하기 위하여, 멀티사이저(Multisizer 3, Beckman Coulter Inc.)를 이용하여 제조 비율에 따른 췌도세포 클러스터 및 스페로이드의 크기를 측정하였다.

구체적으로, 플라스틱 튜브에 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드를 500 개 이상 등장액(isotonic solution)과 함께 넣고 기계를 작동시키고 400 ㎛ 아퍼튜어(aperture) 튜브를 이용하여 측정하였다. 확산에 의해서 산소와 영양분의 공급이 원활하게 공급되기 위해서는 거리가 100 ㎛이하여야 한다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 크기는 약 80 ㎛를 나타냈고, 이는 산소와 영양분을 공급하기에 수월함을 나타냈다. 즉, 기존의 췌도세포의 경우는 크기가 150 ㎛ 이상이 많이 존재하지만, 헤테로스페로이는 사이즈가 80 ㎛이기 때문에 산송의 공급이 확산으로도 충분이 공급될 수 있음을 나타냈다(도 4).

<2-2> 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 구성 형태 측정

상기 <실시예 1>에서 제조한 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 구성형태를 염색방법을 이용하여 쉽게 확인하기 위하여, PKH26 레드형광 세포 링커 키트(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit; Sigma)을 이용하여 염색하였다.

구체적으로, 중간엽 줄기세포 2 x 10⁷ 세포를 준비하고 폴리프로필렌 튜브(polypropylene tube)에 넣고 세척하고 원심분리를 통해서 배지를 제거하였다. 조심스럽게 염색 물질인 PKH26 에타놀릭 염색용액(ethanolic dye solution)을 4 ㎕ 넣고 배양한 후 세척하여 염색을 완료하였다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell(MSC))는 붉은색으로 염색되고, 췌장소도 단일세포(IC)는 녹색으로 염색된 후, 상기 두 세포를 이용하여 상기 <실시예 1>에서 사용한 동일한 방법으로 헤테로스페로이드를 제조하였다. 제조된 헤테로스페로이드를 형광현미경을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 염색된 각각의 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드의 이미지를 나타냈다(도 5).

상기 도 5의 염색된 각각의 헤테로스페로이드의 구성형태를 측정하기 위하여, 상기 염색된 헤테로스페로이드를 트립신(0.25% Trypsin EDTA, 3 ㎖) 처리해서 단일 세포로 만든 후, 상기 단일 세포를 DAPI(PBS에 있는 DAPI 1 ㎍/㎖)를 이용하여 15 분간 반응시켜 세포의 핵을 염색을 하고(푸른색), 형광현미경을 이용하여 관찰한 후, 형광현미경 사진을 도 6에 나타냈다.

또한, 도 6의 결과를 정량적으로 나타내기 위하여, 상기 전체 단일 세포 중 붉은색을 가지는 줄기세포의 비율을 측정하여 헤테로스페로이드 생성 후에 구성 비율을 정량적으로 분석하였으며, 그 결과를 도 6에 나타냈다.

< 실험예 3> 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 장기 생존율 평가 확인

제조된 헤테로스페로이드의 장기 생존율을 평가하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제조한 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드를 세포배양기에서 7일간 배양 후, 라이브/데드 세포 키트를 이용하여 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 시행하여 췌도세포의 장기 생존율을 관찰하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 현미경으로 관찰된 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드는 거의 모든 세포에서 녹색을 나타냈다(도 8). 이는 제조된 각각의 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드는 7일간 배양에서도 세포괴사가 관찰되지 않음으로써 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 8).

< 실험예 4> 정상산소증 ( Normoxia ) 및 저산소증( Hypoxia ) 조건에서 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 생존율 및 괴사 관련 인자들의 유전자 발현 비율 평가

정상 산소증(normoxic condition) (20% 산소) 및 저산소증(hypoxic condition)(1% 산소)에서 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 생존율을 측정하기 위하여, 상기 <실험예 1>의 동일한 방법으로 생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상 산소증에서의 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드 모두 살아있는 형태를 나타냈으나(녹색) 저산소증에서는 죽은 세포 형태(붉은색)의 이미지를 나타냈다(도 9).

또한, 정상산소증 및 저산소증 각각의 상태에서 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 세포괴사를 비교하기 위하여, 양적 RT-PCR(Quantitative RT-PCR(qRT-PCR))을 이용하여 항괴사 유전자(Bcl-2)의 발현 및 괴사 인자(Bax)의 발현 등을 조사하였다.

구체적으로, 세포를 균질화하고 트리졸 시약(TRIzol reagent, Invitrogent)로 용출시켰다. 총 RNA를 클로로포름(chloroform, Sigma)으로 추출하고 80% (v/v) 이소프로판올(isopropanol, Sigma)로 침전시켰다. 상층액을 제거한 후, 75% (v/v) 에탄올로 세척하고, 건조시키고 0.1% (v/v) DEPC 처리된 물(diethyl pyrocarbonate-treated water)에 녹였다. 총 RNA 농도를 측정한 후, 역전사(reverse transcription)를 1 ㎍의 RNA 및 수퍼스크립트 II 역전사 효소(Superscripts II reverse transcriptase, Invitrogen)를 사용하여 수행하였고, 합성된 카널(canal)을 RT-PCR로 증폭하였다. qRT-PCR은 스텝원플러스 실시간 PCR 시스템(StepOnePlus real-time PCR system)(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 사용하여 수행하였고, TaqMan^®Master Mix(Applied Biosystems)를 반응에 사용하였다. 스페로이드 또는 이식 부위의 유전자 발현 프로파일을 테크맨 유전자 발현 분석(TaqMan Gene Expression Assays, Applied Biosystems)으로 정량하였다. 프라이머는 래트 GAPDH(rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase): Rn01775763_g1, 래트 Bax: Rn02532082_g1 및 Bcl-2: Rn99999125_m1을 사용하였다. 표적 유전자의 발현 정도는 비교 Ct 방법을 사용하여 결정하였다

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 정상 산소증 및 저산소증 경우 모두에 있어서, 항괴사 유전자인 Bcl-2 유전자의 발현 비율은 헤테로스페로이드(HCs)가 췌도세포 클러스터보다 높게 나타났으나, 괴사 유전자인 Bax 유전자의 발현 비율은 헤테로스페로이드가 췌도세포 클러스터보다 낮게 나타났다(도 10). 특히, 정상산소증 경우의 항괴사 유전자인 Bcl-2 유전자의 발현 비율에 있어서, 췌도세포 클러스트 또는 2:1 및 1:1 비율의 헤테로스페로이드보다 10:1 비율의 헤테로스페로이드에서 가장 높은 발현 비율을 나타냈다(도 10).

상기 결과를 통해 헤테로스페로이드를 구성하고 있는 줄기세포가 헤테로스페로이드를 구성하는 췌장소도 단일세포의 생존율에 영향을 미치는 것을 확인하였다.

< 실험예 5> 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드의 신생혈관 촉진인자의 분비 평가

췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드가 췌도이식에서 중요한 신생혈관 촉진 인자를 발현하는지 측정하기 위하여, 프로테오믹스 혈관신생항체 어레이(Proteome Profile Human Angiogenesis Antibody Array, R&D Systems)를 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 55개의 헤테로스페로이드 및 50개의 췌도세포 클러스터를 24-웰 플레이트에 깔고 7일간 배양하면서 2일에 한 번씩 배지를 취하여 신생혈관생성인자들의 양을 프로테오믹스 혈관신생항체 어레이를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 11A에 나타낸 바와 같이 헤테로스페로이드로부터 분비되는 다양한 신생혈관 인자들, 예를 들면, TIMP-1, Ang-1, TSP-1, IGFBP-3, PDGF-AA, ET-1, CXCL8, 및 VEGF가 발현됨을 확인할 수 있었다(도 11A).

또한, 혈관신생을 촉진하는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor(VEGF))의 양을 측정하기 위하여, 날짜별(1일 내지 7일)로 공지된 방법(http://www.rndsystems.com/Products/dve00/AssayProcedure)으로 ELISA를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 11B의 그래프에서 나타낸 바와 같이, 헤테로스페로이드(HS)로부터 분비되는 VEGF의 발현 양은 췌도세포 클러스(ICC)로부터 분비되는 VEGF의 발현 양보다 시간이 지나감에 따라 현저히 증가함을 나타냄으로써 헤테로스페로이드의 신생혈관 촉진에 대해 우수한 능력이 있음을 확인할 수 있었다(도 11B).

< 실험예 6> 간문맥이식시, 췌도세포 클러스터, 줄기세포의 혼합된 경우 및 헤테로스페로이드의 비교 확인

췌도세포 클러스터를 줄기세포와 단순히 섞어서 간문맥으로 이식할 경우에 줄기세포가 쉽게 없어지는 것에 비해 헤테로스페로이드의 경우에는 같은 위치에 존재함으로써 긍정적 영향을 줄 수 있을 것이라는 가정하에 하기 실험을 진행하였다.

간문맥이식시, 췌도세포 클러스터 및 줄기세포가 혼합된 경우와 헤테로스페로이드를 비교하기 위하여, 줄기세포 및 인슐린 분비 세포의 위치를 관찰하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 2>에서 사용한 동일한 방법으로 DAPI 및 PKH26 레드형광 세포 링커 키트를 이용하여 염색한 세포를 각각의 경우를 간문맥으로 이식한 후 줄기세포 및 인슐린 분비 세포의 위치를 관찰하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이 헤테로스페로이드의 경우에는 엷은 붉은색이 관찰됨으로써 인슐린 분비 양성 세포(Islet)(녹색)와 줄기세포(MSC)(붉은색)가 동시에 존재하고 있는 것을 확인하였고(도 12B), 각각의 췌도세포 클러스터와 줄기세포를 동시에 주입하였을 경우에는 녹색이 관찰됨으로써 같이 존재하지 않음을 확인하였다(도 12A). 즉, 간문맥 이식에 있어서, 헤테로스페로이드는 줄기세포와 췌도세포가 동시에 같은 위치로 이동할 수 있는 우수한 방법임을 확인하였다.

< 실험예 7> 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드가 이식된 조직의 신생혈관 생성 비교 확인

혈소판내피세포분자(platelet endothelial cell adhesion molecule(PECAM-1))는 CD31이라고 불리우며 내피세포(endothelial cell), 농축혈소판(platelets), 대식세포(macrophages), 과립백혈구(granulocytes) 및 림프구(lymphocytes) 등에서 발현되는 단백질로서, 혈관신생정도를 평가하는데 사용되어왔다.

상기 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드를 이식한 후의 신생혈관생성 효과를 검증하기 위하여, 췌도세포 클러스터 및 헤테로스페로이드를 마우스 모델에 이식한 후 14일째 및 28일째에 이식된 신장 부위의 조직을 취하여 혈관을 검증할 수 있는 CD31+ 세포 및 혈관생성을 관찰하였다.

구체적으로, 이식부위의 혈관농도를 측정하기 위하여, 절편(section)을 항-CD31(Abcam, Cambridge, UK) 및 항-인슐린(Abcam)으로 면역형광 염색하였다. PBS로 세척한 후, 각각 FITC-결합(Jackson Immuno Research Laboratories) 및 로다민(rhodamine)-결합된 2차 항체로 배양하였다. 세포의 핵은 푸른색, 인슐린은 붉은색을 나타내고 CD31은 녹색을 나타냈으며(도 13A), 총 인슐린 분비세포 수중에서 CD31 양성반응 수의 세포를 세어서 그 비율을 그래프화하였다(도 13B).

그 결과, 도 13A에 나타낸 바와 같이 헤테로스페로이드를 이식한 경우는 췌도세포 클러스터를 이식한 경우와 비교하여 CD31을 나타내는 녹색 형광이 많이 관찰됨으로써 혈관생성이 현저히 촉진됨을 확인하였다(도 13A 및 13B). 특히 헤테로스페로이드를 이식한 후 28일째가 14일째에 비해 혈관생성이 현저히 촉진됨을 확인하였다(도 13A).

녹색을 띠는 CD31 양성 반응을 나타내는 세포수는 췌도세포 클러스터에 비해 헤테로스페로이드에서 많이 발현됨을 확인하였다(도 13C).

< 실험예 8> 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드가 이식된 조직의 세포 괴사 비교 확인

<8-1> 이식된 조직의 세포괴사 비교

췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드를 이식한 후에 이식된 조직의 괴사정도를 비교하기 위하여, 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드를 마우스에 이식한 후 3일째 및 7일째에 각각의 신장조직에서 RNA를 취하여 RT-PCR을 수행하였고 Bcl-2 유전자(Applide Biosystems, Rn99999125_m1)의 발현 양을 q-PCR을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이 헤테로스페로이드(HS)를 이식한 경우는 췌도세포 클러스터(IC)를 이식한 경우보다 Bcl-2 유전자 발현 양이 많았으며, 이식한 후 7일째가 3일째 보다 현저하게 증가된 Bcl-2의 발현 양을 나타냈다(도 14). 상기는 헤테로스페로이드 이식에 의한 항괴사 인자의 발현이 동물실험에서도 적용이 되고 있음을 확인하였다.

<8-2> 이식된 조직의 세포괴사 관련 단백질 발현 비교

세포괴사에 관여하는 단백질의 발현 정도를 조사하기 위하여, 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드를 이식한 후 이식체의 조직을 취하여 용해버퍼에 조직을 용해시키고 같은 양의 단백질을 정량하고 전기영동한 후, 세포괴사 관련 단백질인 케스페이즈-3 또는 7 (caspase-3 또는 caaspase-7)의 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 15A에 나타낸 바와 같이 Casaps-3 및 Casaps-7 단백질의 발현 양은 헤테로스페로이드 보다 췌도세포 클러스터에서 많이 발현되었고(도 15A), 이는 췌도세포 클러스터는 헤테로스페로이드 보다 괴사정도가 증가됨을 확인하였다.

<8-3> 이식된 조직의 세포괴사 관련 유전자 발현 비교

상기 Casaps-3 및 Casaps-7 단백질뿐만 아니라, 단백질의 발현 정도를 조사하기 위하여, 이식된 조직으로부터 단백질을 추출하여 항-caspapse-7(Santa Cruz Biotechnology) 및 항-caspase-3 항체(Lifespan Biosciences)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

그 결과, 도 15B에 나타낸 바와 같이 상기 <실험예 8>의 Casaps-3 및 Casaps-7 단백질의 발현의 차이를 나타낸 것과 동일하게, 췌도세포 클러스터 또는 헤테로스페로이드에서 Casaps-3 및 Casaps-7 단백질 발현 양은 헤테로스페로이드 보다 췌도세포 클러스터에서 많이 발현되는 것을 확인하였다(도 15B).

Claims

췌장소도 세포 및 줄기세포를 혼합한 후 배양하는 단계를 포함하는 췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드(hetero-spheroid) 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 췌장소도 세포 및 줄기세포는 1:10 내지 10:1의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(cord blood mesenchymal stem cells) 또는 골수 유래 중간엽 줄기세포(bone marrow mesenchymal stem cells)인 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 췌장소도 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드의 크기는 1-100 ㎛인 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 췌장소도 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드는 췌장소도 세포의 생존률을 증가시키는 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 췌장소도 및 줄기세포는 혈관신생(angiogenesis)을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 췌장소도 및 줄기세포는 세포사멸 억제 유전자의 발현을 증가시키고, 세포사멸 촉진 유전자의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 세포사멸 억제 유전자는 Bcl-2이고, 세포사멸 촉진 유전자는 Bax인 것을 특징으로 하는 헤테로스페로이드 제조방법.
췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드.
췌장소도 세포 및 줄기세포가 결합된 헤테로스페로이드를 인간을 제외한 개체에 이식하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료 방법.
제11항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 당뇨병 치료 방법.