CN117138044A - Tmprss13在作为心肌缺血再灌注损伤治疗靶点的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了Tmprss13在作为心肌缺血再灌注损伤治疗靶点的用途，属于生物医药技术领域。本发明提供了一种补充Tmprss13的试剂在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，在体内补充Tmprss13蛋白，从而改善心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡和坏死，改善病理性心室重构，减轻心肌缺血再灌注后心脏纤维化，改善心肌缺血再灌注后的心功能，从多个方面抵抗心肌损伤，为心肌缺血再灌注损伤的预防和/或治疗提供新的药物研发途径和药物作用靶点，具有非常重要的药用价值。

Description

Tmprss13在作为心肌缺血再灌注损伤治疗靶点的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Tmprss13在作为心肌缺血再灌注损伤治疗靶点的用途。
背景技术
心肌梗死较常见的诱发原因是缺血性心肌病(ICM)，当供应心肌的血流减少或冠脉循环的某个部分血管阻塞时，就会发生缺血性心肌病。针对心肌梗死，有效的干预手段是立即进行心肌再灌注治疗，例如通过溶栓药物或经皮冠状动脉介入(PCI)术恢复血流。但是心肌再灌注易增加心脏中活性氧水平，导致缺血再灌注损伤(IRI)，并进一步诱发心肌细胞死亡。目前再灌注治疗可成功降低急性心肌缺血的致死率和致残率，但引起的心肌缺血再灌注损伤尚缺乏有效治疗手段。目前认为细胞内氧自由基的大量产生、钙离子超负荷、白细胞的炎症作用及高能磷酸化合物缺乏等是IRI主要发生机制。
跨膜丝氨酸蛋白酶13(Transmembrane serineprotease 13，Tmprss13)基因，其编码的蛋白定位于细胞膜，属于II型跨膜丝氨酸蛋白酶(Tyep IItransmembraneserineprotease，TTSP)家族，其N端在细胞质内，C端具有组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸催化亚基组成的胞外丝氨酸蛋白酶结构域。Tmprss13通过其蛋白酶活性调控机体发育和稳态、癌症的发生发展以及病毒入侵等。
目前，Tmprss13在心肌缺血再灌注损伤中的作用及其机制尚未有任何相关的研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供Tmprss13在作为心肌缺血再灌注损伤治疗靶点的用途，体内补充Tmprss13可治疗心肌缺血再灌注损伤，增加Tmprss13的医药用途。
本发明提供了一种补充Tmprss13的试剂在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，所述Tmprss13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述试剂包括Tmprss13蛋白或Tmprss13的激动剂。
优选的，所述试剂包括转基因诱导Tmprss13过表达的试剂，或Tmprss13mRNA介导过表达的试剂。
优选的，所述试剂包括腺相关病毒诱导的Tmprss13转基因的相关试剂。
优选的，所述心肌缺血再灌注损伤包括病理性心室重构和/或心力衰竭。
本发明还提供了一种预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物，以补充Tmprss13的试剂为活性成分，还包括药学上可接受的辅料；所述Tmprss13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的，所述补充Tmprss13的试剂包括Tmprss13蛋白、Tmprss13的激动剂或转基因诱导Tmprss13过表达的试剂。
优选的，所述药学上可接受的辅料选自缓冲剂、包囊剂、填充剂、粘合剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的至少一种。
优选的，所述治疗包括以下至少一种：
(1)改善心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡和坏死；
(2)改善病理性心室重构；
(3)减轻心肌缺血再灌注后心脏纤维化；
(4)改善心肌缺血再灌注后的心功能。
优选的，所述药物的剂型包括注射剂。
有益效果：本发明提供了一种补充Tmprss13的试剂在制备治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用。本发明实施例中通过动物模型实验，证实了过表达Tmprss13能够改善心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡和坏死、改善病理性心室重构，减轻心肌缺血再灌注后心脏纤维化，改善心肌缺血再灌注后的心功能，从多个方面抵抗心肌损伤。本发明首次明确过表达Tmprss13能够改善心肌缺血再灌注损伤，为心肌缺血再灌注损伤的预防和/或治疗提供新的药物研发途径和药物作用靶点，具有非常重要的药用价值。
附图说明
图1为过表达载体AAVMCS1.3-d的图谱；
图2为AAVMCS1.3-d-Tmprss13的测序结果图，上侧图为正向引物测序部分结果(包含Tmprss13核苷酸序列起始部分)，下侧图为反向引物测序部分结果(包含Tmprss13核苷酸序列终止部分)；
图3为RT-qPCR动物水平检测Tmprss13表达，验证AAV9-Tmprss13效率结果图；
图4为过表达Tmprss13干预心肌缺血再灌注损伤小鼠心肌细胞凋亡的TUNEL与α-actinin染色结果图；图中A为小鼠TUNEL与α-actinin染色代表图，比例尺：50μm；B为TUNEL与α-actinin染色后各组心脏组织凋亡率的统计结果，***表示p<0.001，从左到右分别为AAV9-Control+Sham、AAV9-Tmprss13+Sham、AAV9-Control+IRI和AAV9-Tmprss13+IRI处理组；
图5为过表达Tmprss13干预心肌缺血再灌注损伤小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)活性检测结果图；
图6为过表达Tmprss13干预心肌缺血再灌注损伤小鼠心功能的超声心动图；图中A为小鼠心脏超声心动图代表图；B为小鼠心脏超声的射血分数(EF)心功能指标统计结果，C为小鼠心脏超声的缩短分数(FS)心功能指标统计结果，B和C从左到右分别为AAV9-Control+Sham、AAV9-Tmprss13+Sham、AAV9-Control+IRI和AAV9-Tmprss13+IRI处理组；
图7为过表达Tmprss13干预心肌缺血再灌注损伤小鼠心脏纤维化的马松染色结果图，图中A为小鼠心脏纤维化马松染色代表图，蓝色为心肌组织纤维化的区域，比例尺：50μm；B为马松染色后各组纤维化占比的统计结果，***表示p<0.001，从左到右分别为AAV9-Control+Sham、AAV9-Tmprss13+Sham、AAV9-Control+IRI和AAV9-Tmprss13+IRI处理组。
具体实施方式
本发明提供了一种补充Tmprss13的试剂在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，所述Tmprss13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：ATGGACAGAGGCAGCCACCGGAATTCTTCTCCAGCAAGGACACCTCCCCAGGCTTCCCCAGCAAGGACATCTCCAGCAAGGGCACCTCCTCAGGCCTCTCCAGCAAGGACACCTCCTCAGGCCTCTCCAACAAGGACACCTCCTCAGGCCTCTCCAGCAAGGGCACCTCCTCCTCAGGCTTCCCCAGCCCGGGCATCTCCAGCCCGGGCATCTCTAGCCAGGGCACCACCTTCCAGGTCATCATCGGGCAGATCATCATCTGCCAGGTCAGCCTCCACGACATCCTCCCCAACGAGAGTGTACCTTGTTAGAGCAACACCAGTGGGGGCTGTCCCCATCCGGGCATCTCCTGCCAGGTCAGCACCAGCCACCAGGGCCACCAGGGAGAGCCCAGGTCTCAGTTTCCCCAAGTTCTCCTGGCAGGAGACCCAGAGGCAGCTGCCACTCATCGGGTGTGTCATCCTTCTCATCAGCCTGGTGATCTCACTCATCCTTCTCTTCTACTTCTGGAGAGGCCACACAGGGATCAAGTACAAAGAGCCACTGGAGAGTTGCCCTATCCACGCAGTTCGCTGTGATGGAGTGGTGGACTGCAAAATGAAGAGCGATGAGCTGGGCTGTGTCAGGTTCGACTGGGACAAGTCCCTCCTGAAAGTCTACTCTGGGTCTTCTGGCGAGTGGCTTCCTGTCTGCAGCAGCAGCTGGAACGACACTGACTCCAAGAGGACCTGCCAGCAGCTGGGATTTGACAGCGCTTACCGAACAACTGAGGTAGCCCACAGGGACATCACCAGCAGCTTCTTACTCTCCGAATACAACACCACCATCCAGGAAAGCCTCTATAGGTCGCAATGTCCTTCCCGGCGGTATGTCTCCCTCCAGTGTTCCCACTGTGGTTTGAGAGCTATGACCGGGCGGATCGTGGGAGGGGCTCTGACCTCGGAGAGCAAGTGGCCCTGGCAAGTTAGCCTGCACTTCGGCACCACCCACATCTGTGGGGGCACACTCATCGATGCCCAGTGGGTGCTCACCGCTGCCCACTGTTTCTTTGTGACCCGGGAGAAGCTGCTGGAGGGGTGGAAGGTGTATGCAGGCACCAGCAACTTGCACCAGCTGCCCGAGGCTGCCTCTATCTCCCAGATCATCATCAACGGCAACTACACAGATGAACAGGATGACTATGACATTGCCCTCATCAGGCTGTCCAAGCCCCTGACCCTGTCAGCTCACATCCACCCTGCCTGCCTCCCCATGCATGGTCAGACCTTCGGCCTCAATGAGACCTGTTGGATCACGGGCTTTGGCAAAACCAAGGAGACAGATGAGAAGACATCTCCCTTCCTCCGAGAGGTTCAGGTCAACCTCATTGACTTCAAGAAGTGCAATGACTACTTGGTCTATGACAGCTACCTTACCCCAAGGATGATGTGTGCCGGGGATCTACGAGGAGGGAGGGACTCCTGCCAGGGAGACAGTGGAGGACCTCTCGTCTGTGAGCAGAACAATCGCTGGTACCTGGCAGGTGTCACCAGCTGGGGCACAGGCTGTGGCCAGAAAAACAAGCCTGGTGTGTACACCAAAGTGACAGAAGTACTTCCCTGGATTTACAGAAAGATGGAGAGTGAGGTACGATTCCGGAAATCTTAA。
本发明所述试剂优选包括Tmprss13蛋白或诱导Tmprss13过表达的试剂，更优选包括Tmprss13的激动剂，或通过转基因诱导Tmprss13过表达的试剂以及通过Tmprss13 mRNA介导的过表达试剂，更优选包括腺相关病毒诱导的Tmprss13转基因的相关试剂。
本发明优选通过Tmprss13腺相关病毒介导的方法在体内过表达所述Tmprss13。本发明对所述Tmprss13腺相关病毒的来源没有特殊要求，采用常规构建质粒的方式，将上述Tmprss13基因的核苷酸序列克隆到腺相关病毒过表达载体，得到重组腺相关病毒即可。本发明在得到所述重组腺相关病毒后，优选还包括对所述重组腺相关病毒进行包装。本发明对所述包装的方法也没有特殊限定，每只小鼠注射病毒用量为1×1011vg即可。
在本发明中，所述心肌缺血再灌注损伤优选包括病理性心室重构和/或心力衰竭，并且所述药物的治疗作用优选包括以下至少一种：
(1)改善心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡和坏死；
(2)改善病理性心室重构；
(3)减轻心肌缺血再灌注后心脏纤维化；
(4)改善心肌缺血再灌注后的心功能。
本发明还提供了一种预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物，以补充Tmprss13的试剂为活性成分，还包括药学上可接受的辅料；所述Tmprss13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明所述补充Tmprss13的试剂包括Tmprss13蛋白、Tmprss13的激动剂或转基因诱导Tmprss13过表达的试剂，具体与上述相同，在此不再赘述。本发明所述药学上可接受的辅料优选选自缓冲剂、包囊剂、填充剂、粘合剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的至少一种。本发明所述药物的剂型包括注射剂。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的Tmprss13在作为心肌缺血再灌注损伤治疗靶点的用途进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.AAV9-Tmprss13腺相关病毒载体构建及病毒包装
利用限制性内切酶BamH1和Sal1对载体AAV MCS1.3-d和Tmprss13片段酶切后进行连接，随后进行大肠杆菌转化，转化后使用条件性LB培养基筛选目标菌株，利用质粒提取试剂盒进行质粒抽提，并对重组质粒AAV MCS1.3-d-Tmprss13进行测序，验证正确后获得包含Tmprss13全长编码序列的腺相关病毒过表达载体AAV MCS1.3-d-Tmprss13。
载体AAV MCS1.3-d的图谱如图1所示，AAV MCS1.3-d-Tmprss13质粒部分测序结果如图2所示。根据图2测序结果可以看出，测序结果与Tmprss13目的序列一致，表明该重组腺相关病毒Tmprss13过表达载体AAV MCS1.3-d-Tmprss13构建成功。
利用汇合度80％-90％的293T细胞进行目的质粒AAV MCS1.3-d-Tmprss13和包装质粒转染，转染10-12h后换成新的完全培养基，换液48h后收集病毒，进行病毒纯化与浓缩，将浓缩好的Tmprss13过表达腺相关病毒AAV9-Tmprss13进行滴度检测并冻存-80度。
2.AAV9-Control腺相关病毒载体构建及病毒包装
同步骤1，使用AAV MCS1.3-d质粒，包装对照腺相关病毒AAV9-Control。
实施例2
1.小鼠分组和模型建立
实验小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，将其随机平均分为心肌缺血再灌注损伤(IRI)组(实验组)和假手术(Sham)组(对照组)；
实验组：将用1×PBS配制的4％水合氯醛按体重10μl/g剂量腹腔注射小鼠，使其麻醉，将小鼠固定在手术台上，将小鼠颈部和左胸部的毛发用脱毛膏脱除，在体视镜下用剪刀分离覆盖于气管上的颈部皮肤、肌肉及组织，气管暴露后，在声门下两个气管软骨环之间切一个小孔，将气管插管插入并固定好。检查小鼠胸廓起伏频率，确保两肺通气良好。在体视镜下，将小鼠胸骨左缘第四第五肋间部位使用剪刀做一横行切口，用显微镊钝性分离胸壁肌肉、肋间肌肉，使心脏暴露，结扎心脏左前降支动脉。缝合胸腔。30分钟后再打开胸腔，剪断结扎线并取出，恢复血流供应。最后缝合肋间肌、胸壁肌肉及皮肤，用碘酒对术后伤口进行消毒。
对照组：操作步骤除不进行结扎部分外，与实验组一致。
手术后注意观察小鼠是否有呼吸不畅现象，如有应及时清理呼吸道。苏醒后从恒温垫取下小鼠并放回鼠笼。
2.病毒的尾静脉注射
将实验组小鼠平均分为两组，分别记为AAV9-Control+IRI组和AAV9-Tmpr ss13+IRI组，对于急性IRI模型(IRI术后24小时取样，图4与图5)，进行步骤1前3周将各组小鼠置于尾静脉注射器上，使用酒精对小鼠尾部进行消毒，使用一次性胰岛素针通过尾静脉注射的方式按每只小鼠1×1011vg的剂量注射实施例1得到的AAV9-Tmprss13和AAV9-Control；注射完用脱脂棉止血后将小鼠放入鼠笼，病毒注射3周后按照上述步骤1对实验组小鼠进行后续处理，IRI手术24小时后对小鼠麻醉处死并进行组织取样检测细胞凋亡和坏死指标。
按照同样的方式将对照组小鼠平均分为两组，分别记为AAV9-Control+Sham组和AAV9-Tmprss13+Sham组，处理方式同实验组小鼠。
对于IRI术后病理性心室重构模型(IRI术后3周检测取样，图6与图7)，进行步骤1前1周将各组小鼠置于尾静脉注射器上，使用酒精对小鼠尾部进行消毒，使用一次性胰岛素针通过尾静脉注射的方式按每只小鼠1×1011vg的剂量注射实施例1得到的AAV9-Tmprss13和AAV9-Control；注射完用脱脂棉止血后将小鼠放入鼠笼。病毒注射1周后按照上述步骤1对实验组小鼠进行后续处理，IRI手术3周后首先对小鼠进行超声心动图活体心功能检测，心脏超声结束后将小鼠麻醉处死并进行组织取样检测心肌纤维化水平。
按照同样的方式将对照组小鼠平均分为两组，分别记为AAV9-Control+Sham组和AAV9-Tmprss13+Sham组，处理方式同实验组小鼠。
测试例1
实施例2处理结束后，小鼠麻醉处死并采集小鼠心脏样本，利用Trizol提取小鼠心脏组织RNA，使用iScript TM cDNA Synthesis Kit对抽提的RNA进行反转录成cDNA。然后使用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)对cDNA进行定量，使用18s rRNA作为内参基因，用2-ΔΔCt法计算Tmprss13相对表达量。
所用引物序列如下：
Tmprss13基因-qPCR引物
Tmprss13-qPCR-Forward Primer(SEQ ID No.2)：CGAGAGTGTACCTTGTTAGAGCA；
Tmprss13-qPCR-Reverse Primer(SEQ ID No.3)：GGATGACACACCCGATGAGTG；
18s rRNA-qPCR引物
18s-qPCR-Forward Primer(SEQ ID No.4)：TCAAGAACGAAAGTCGGAGG；
18s-qPCR-Reverse Primer(SEQ ID No.5)：GGACATCTAAGGGCATCAC；
检测结果如图3所示，AAV9-Tmprss13+Sham组小鼠心脏组织中Tmprss13的mRNA相对表达量比AAV9-Control+Sham组显著升高，AAV9-Tmprss13+IRI组小鼠心脏组织中Tmprss13的mRNA相对表达量比AAV9-Control+IRI组显著升高，表明AAV9-Tmprss13有效增加Tmprss13的mRNA表达，***表示p<0.001。
测试例2
1.1.TUNEL与α-actinin染色：实施例2处理结束后，小鼠麻醉处死，心脏取样，心脏组织横切后将其浸在OCT中冻于-80℃冰箱，取出进行冰冻切片，然后进行TUNEL与α-actinin共染，待组织切片晾干后，滴加用灭菌水配制的50％甘油进行封片，避光保存，通过激光共聚焦显微镜进行观察及采集图像，并用ImageJ计算小鼠心脏组织的凋亡率。
结果如图4所示，过表达Tmprss13能够改善缺血再灌注损伤小鼠心肌细胞凋亡的发生。
1.2.乳酸脱氢酶(LDH)活性检测：实施例2处理结束后，小鼠麻醉处死并立即采集小鼠血液，4度静置过夜后取上层血清，将血清稀释后使用乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒进行检测。
结果如图5所示，AAV9-Control+Sham组和AAV9-Tmprss13+Sham组小鼠血清中乳酸脱氢酶的活性都非常低，AAV9-Control+IRI组小鼠血清中乳酸脱氢酶活性增加，表明心肌细胞坏死显著增加，而过表达Tmprss13能够显著降低缺血再灌注损伤小鼠血清乳酸脱氢酶的活性，改善小鼠心肌细胞坏死。*表示p<0.05，***表示p<0.001。
测试例3
实施例2处理结束后，将小鼠置于密闭玻璃盒中，使用1.5％～2％异氟烷麻醉小鼠，采用频率为30MHZ的Visual Sonics 2100小动物心脏超声仪检测小鼠的心功能。对小鼠心脏进行左室长轴图像和相应的M-mode图像采集，以评估小鼠的心功能。每个指标测量三次，取平均值。
结果如图6所示，过表达Tmprss13能够改善缺血再灌注损伤小鼠心功能。**表示p<0.01，***表示p<0.001。
1.3马松染色：实施例2处理结束后，小鼠麻醉处死，心脏取样，心脏组织横切后将其浸泡在4％多聚甲醛中，48小时后经过脱水、石蜡包埋，制成厚度为5μm的组织切片。然后经过脱蜡后，使用马松三色染色法试剂盒(凯基生物)进行染色。待组织切片晾干后，用中性树脂进行封片，并通过明场显微镜观察及采集图像，运用ImageJ进行胶原纤维含量的定量分析，评估心肌胶原纤维的水平。
结果如图7所示，过表达Tmprss13能够改善缺血再灌注损伤小鼠心脏纤维化。
本发明提供的过表达Tmprss13的试剂能够改善心肌缺血再灌注后心功能，改善心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡和坏死，减轻心肌缺血再灌注后心脏纤维化，为心肌缺血再灌注损伤和/或心力衰竭的诊断及治疗提供新的防治药物研发途径和药物作用靶点，具有非常重要的药用价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种补充Tmprss13的试剂在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用，其特征在于，所述Tmprss13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂包括Tmprss13蛋白或Tmprss13的激动剂。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂包括转基因诱导Tmprss13过表达的试剂，或借助Tmprss13 mRNA介导过表达的试剂。
4.根据权利要求1或3所述应用，其特征在于，所述试剂包括腺相关病毒诱导的Tmprss13转基因的相关试剂。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述心肌缺血再灌注损伤包括病理性心室重构和/或心力衰竭。
6.一种预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物，其特征在于，以补充Tmprss13的试剂为活性成分，还包括药学上可接受的辅料；所述Tmprss13的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述补充Tmprss13的试剂包括Tmprss13蛋白、Tmprss13的激动剂或转基因诱导Tmprss13过表达的试剂。
8.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自缓冲剂、包囊剂、填充剂、粘合剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂和吸附载体中的至少一种。
9.根据权利要求6所述药物，其特征在于，所述治疗包括以下至少一种：
(1)改善心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡和坏死；
(2)改善病理性心室重构；
(3)减轻心肌缺血再灌注后心脏纤维化；
(4)改善心肌缺血再灌注后的心功能。
10.根据权利要求6或9所述药物，其特征在于，所述药物的剂型包括注射剂。
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