CN104862281A - 表达bFGF和PDGF-BB的重组载体修饰的间充质干细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物治疗领域，具体涉及表达bFGF和PDGF-BB的编码基因的双基因重组载体修饰的间充质干细胞及其用途。本发明要解决的技术问题是为有效治疗缺血性疾病提供新选择。本发明的技术方案是一种表达bFGF和PDGF-BB的编码基因的双基因重组载体修饰的间充质干细胞，含有bFGF蛋白的编码基因与PDGF-BB蛋白的编码基因，能在真核细胞中同时表达bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白。本发明还提供了所述间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物中的用途。本发明bFGF和PDGF-B双基因修饰的间充质干细胞在治疗肢端缺血中具有很好应用前景，为缺血性疾病的治疗提供了一个新方法。

Description

表达bFGF和PDGF-BB的重组载体修饰的间充质干细胞及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于细胞治疗技术领域，具体涉及表达bFGF和PDGF-BB的重组载体修饰的间充质干细胞及其制备方法和用途。
背景技术
缺血性疾病以其高发病率和致死致残率，严重威胁人类健康。流行病学调查显示严重肢端缺血有很高的发病率。血管主干闭塞后，首先由侧枝血管代偿供应相应组织。当侧枝循环不足以供应灌注组织时，便会发生缺血，从而引起临床症状和体征。目前血管闭塞性病变的主要治疗手段是血管成形术、血管内支架置入术和血管旁路移植术和,以及，然而这些手段往往不持久，也易造再狭窄和堵塞[2]。严重远端肢体缺血，尤其是糖尿病患者，常没有手术治疗的条件。冠状动脉疾病可致心肌梗死，危及生命，虽然目前经皮经导管血管成型术(PTCA)或冠脉旁路移植(CABG)能一定程度上恢复缓解临床症状。然而这些诊疗手段易导致血管再狭窄，移植支架也易再堵塞。因此，新的治疗方法仍需探索。
血管生成方式包括血管生成、血管新生和动脉生成。血管生成是个极其复杂的生物学过程，由促血管生成因子和血管生成抑制因子共同起作用。目前已发现的促血管生成因子有VEGF、bFGF、PDGF-BB(PDGF-B基因表达的蛋白形成的同源二聚体结构，称为PDGF-BB)和Ang-1等。血管生成抑制因子有angiostatin、TIMPs和TSP-1等。二者之间的平衡调节新生血管的形成。治疗性血管生成是指通过增加局部血管生成因子来克服本身血管生成反应的缺陷，促进血管生成，包括给予重组的血管生成因子，表达血管生成因子的基因和细胞治疗等。目前多种促血管生长因子应用于缺血性疾病的基因治疗，如aFGF、bFGF、VEGF等。然而，单基因治疗效果不太理想，这可能与血管生成过程复杂而单基因治疗过于简单相关。多基因联合治疗的方法，与相应的单基因治疗相比，明显促进血管生成，如VEGF联合FGF，G-CSF联合HGF，VEGF联合MCP-1。
干细胞治疗已成为治疗许多疾病重要手段。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)存在于机体多种组织，具有向多种细胞分化能力的多能干细胞。体外经诱导可分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、造血基质等。由于MSCs不仅可以向多种组织细胞分化，体外容易分离培养和扩增，还具有低免疫原性的特点，MSCs已经被广泛用于多种疾病的细胞治疗，如心肌梗死、脑卒中、肢端缺血、软骨修复、脊柱融合、自身免疫性疾病等。
虽然目前间充质干细胞治疗疾病有着良好的前景，但间充质干细胞的来源严重限制着其治疗应用。目前间充质干细胞多来源于骨髓，方法有创伤、细胞数量少、动员剂G-CSF的应用增加血栓形成的风险；另外，糖尿病、高脂血症、高龄等因素均削弱骨髓间充质干细胞的功能，严重限制了骨髓来源的MSCs的临床应用。虽然有学者探索外周血和脂肪组织MSCs的治疗应用，但这些MSCs亦存在数量少的特点。近年发现，脐带是获得MSCs的良好来源。脐带容易获得，含间充质干细胞数量多，亦具有低免疫原性的特点，因而存在广泛应用前景。脐带来源间充质干细胞(Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs)已被用于多种缺血性疾病的治疗并取得一定的效果。
细胞治疗联合基因治疗是另一种增强治疗效果的策略。基因修饰的间充质干细胞、骨髓单个核细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、脂肪干细胞等均显示了良好的治疗效果。目前尚无bFGF和PDGF-B双基因修饰的人胎盘间充质干细胞治疗缺血性疾病的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为有效治疗肢端缺血性疾病提供新选择。
本发明的技术方案是一种表达bFGF和PDGF-B的重组载体修饰的间充质干细胞，该重组载体含有bFGF蛋白的编码基因与PDGF-BB蛋白的编码基因，能在真核细胞中同时表达bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白。
具体的，所述的bFGF蛋白为人bFGF蛋白，其编码基因具有如Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
具体的，所述的PDGF-BB蛋白为人PDGF-BB蛋白，其编码基因具有如Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
优选的，bFGF蛋白由SV40启动子调控表达。
具体的，表达bFGF蛋白的表达框架的构成是：从5’到3’方向依次为SV40启动子、人IL-2信号肽的编码序列、编码bFGF蛋白的基因、SV40加尾信号。
具体的，表达bFGF蛋白的表达框架具有如Seq ID No.3所示的核苷酸序列。
优选的，PDGF-BB蛋白由CMV5启动子调控表达。
具体的，表达PDGF-BB蛋白的表达框架的组成是：从5’到3’方向依次为CMV5启动子、人PDGF-B蛋白信号肽的编码序列、编码PDGF-BB蛋白的基因、β-珠蛋白加尾信号。
具体的，表达PDGF-BB蛋白的表达框的具有如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
具体的，所述重组载体具有Seq ID No.5所示的核苷酸序列。
优选的，所述重组载体为腺病毒载体。
最优的，所述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒。
优选的，所述的间充质干细胞来源于脐带。
本发明还提供了双基因修饰的间充质干细胞制备方法，包括如下步骤：构建同时表达bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白的腺病毒载体；从脐带分离间充质干细胞，选择第5-8代处于对数生长期的间充质干细胞，细胞生长至70-80％汇合时，用构建好的腺病毒载体进行感染；37℃、5％CO2条件下培养48h，即获得双基因修饰的间充质干细胞。
本发明还提供了治疗缺血性疾病的药物，其主要活性成分为所述的表达bFGF和PDGF-BB的重组载体修饰的间充质干细胞。
本发明还提供了所述表达bFGF和PDGF-BB的重组载体修饰的间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物中的用途。
具体的，所述的缺血性疾病为冠心病引发的心肌缺血、肢端缺血或脑缺血。
本发明选择从脐带中分离培养间充质干细胞，有利于投入应用时获得大量间充质干细胞，克服细胞来源少的问题。
本发明重组载体是重组了人bFGF和人PDGF-B编码基因的双基因载体。研究发现二者联合应用可以更明显地促进小动脉的生成及成熟，有利于克服单个基因引起的不足。重组载体中人bFGF和人PDGF-B编码基因可以处于同一个启动子的调控下进行体内的表达，也可以处于两个单独的启动子的调控之下。最好能构建两个单独的表达框架，以对两个基因的相对表达量进行一定的控制。两个表达框架既可以同向，也可以反向。本领域技术人员可以根据本发明中的记载，参考本领域的现有的基因操作指南和实验手册制备得到重组。
本发明重组载体的载体骨架可以是质粒载体或病毒载体，优选使用在真核动物中转基因效率更高的腺病毒载体。另外，在重组双基因的腺病毒载体构建中，为了避免重组腺病毒在真核细胞中的扩增过程中发生同源重组，可以选择两个不同的启动子和不同的加尾信号构建两个单独的表达框架。两个启动子和加尾信号序列的同源性应尽可能降低一些，以有效地避免生产过程中的同源重组，有利于重组双基因腺病毒大量生产时的质量控制。
在本发明的研究中，在行股动脉结扎后1周，给予生理盐水(NS)、脐带来源间充质干细胞(UC-MSCs)、空载腺病毒修饰的脐带来源间充质干细胞(Ad-Null-UC-MSCs)和bFGF和PDGF-B双基因修饰的脐带来源间充质干细胞(Ad-FP-UC-MSCs)治疗。结果表明bFGF和PDGF-B双基因修饰的脐带来源间充质干细胞能改善肢端缺血，其主要是通过促进侧枝动脉形成，促血管新生和小血管成熟达到的。在细胞治疗后第28天，与其他组相比，bFGF和PDGF-B双基因修饰的脐带来源间充质干细胞治疗组缺血区肌肉组织的小动脉和毛细血管密度明显增加。现有技术多数运用单一的促血管生成因子进行治疗，或单用细胞治疗，其促进血管生成的疗效并不显著，而本发明bFGF和PDGF-B双基因修饰的脐带来源间充质干细胞可以明显促进血管生成和成熟，提高治疗效果。
本发明的有益效果在于：本发明将细胞治疗和基因治疗相结合，以脐带来源间充质干细胞为细胞载体，使其长效表达bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白，从而达到增强治疗效果的目的。本发明还通过选择不同的启动子来分别启动这两种蛋白质的表达，以调控bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白的表达比例，从而获得更好的治疗效果。本发明bFGF和PDGF-B双基因修饰的脐带来源间充质干细胞首次提出使用同一载体将两种不同的促血管生成因子导入脐带来源间充质干细胞以治疗肢端缺血的细胞治疗新产品。使用本发明，从脐带中分离间充质干细胞，能大量扩增治疗用细胞的数量，并克服从骨髓获取间充质干细胞数量少、取材具有创伤性等特点，降低了生产及使用成本。本发明bFGF和PDGF-B双基因修饰的脐带来源间充质干细胞在治疗肢端缺血疾病中具有很好应用前景，为缺血性疾病的治疗提供了一个新的选择。
附图说明
图1表示第5代脐带来源间充质干细胞的形态，倒置相差显微镜，100×。
图2为流式细胞术检测脐带来源间充质干细胞表面分子标记的结果。
图3为细胞治疗后第28天血管造影示意图。其中：*：与NS(即对照组)、UC-MSCs和Ad-Null-UC-MSCs相比，P<0.05，差异有统计学意义。
图4为细胞治疗后第28天各组缺血区肌肉组织中小动脉密度示意图。其中：*：与NS、UC-MSCs和Ad-Null-UC-MSCs相比，P<0.05，差异有统计学意义。
图5为细胞治疗后第28天各组缺血区肌肉组织中毛细血管密度示意图。其中：*：与NS、UC-MSCs和Ad-Null-UC-MSCs相比，P<0.05，差异有统计学意义。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行更进一步的详细说明。
实施例一 本发明脐带间充质干细胞的分离和培养
从正常离体的脐带中分离得到间充质干细胞备用。详细分离培养过程如下：取正常脐带，无菌条件下剪取约5克脐带组织，使用无血清低糖DMEM(LG-DMEM)培养基冲洗组织，去除血污，在培养皿中剪碎为细颗粒状，再用LG-DMEM培养基清洗数次，洗净血污，直至组织变为灰白色。将剪碎的脐带组织转入含1mg/ml胶原酶的LG-DMEM培养基中，置于37℃孵箱中充分消化2小时。常温下1000转/分(rpm)离心3min，弃上清，用LG-DMEM重悬沉淀。细胞悬液转入塑料培养瓶，用含20％胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养，置于37℃5％CO2恒温孵箱。第4天时第一次半量换液，以后均采用半量换液。第6天细胞明显增多，传代培养。此后大约每3至4天换液一次，细胞约80％汇合时传代培养。传代过程以0.25％胰酶-0.03％EDTA消化贴壁细胞从人脐带组织中分离出大量间充质干细胞，其形态呈典型的梭形，部分呈旋涡状排列。脐带来源间充质干细胞形态结果见图1。
实施例二 本发明脐带间充质干细胞的鉴定
为验证本发明中脐带间充质干细胞具有一般间充质干细胞的表型，取第3-5代细胞，使用流式细胞术鉴定细胞表面分子标志。结果见图2，本发明中脐带间充质干细胞高表达CD29、CD90、CD105，不表达CD31，由此可知分离得到间充质干细胞。
实施例三 bFGF和PDGF-B双基因重组腺病毒载体修饰人脐带间充质干细胞
本发明中使用的各种腺病毒载体、Ad-null、Ad-FP(Ad-F10-P)的构建过程是参照专利200810302770.6“重组人bFGF和人PDGF-B双基因腺病毒载体及其用途”中实施例1构建。
本发明使用bFGF和PDGF-B双基因修饰人脐带间充质干细胞。详细过程如下：选择第5-8代处于对数生长期的人脐带间充质干细胞，细胞生长至70-80％汇合时，弃培养上清，并换用无血清的LG-DMEM培养，饥饿半小时。同时，将脂质体Lipofectamine 2000与空载腺病毒(Ad-Null)或bFGF和PDGF-B双基因重组腺病毒载体(Ad-FP，即参照专利中的Ad-F10-P)混合，半小时后，加入脐带间充质干细胞的培养基中，此发明中重组腺病毒感染复数MOI为1500。37℃5％CO2恒温孵箱中继续培养48小时，收获细胞用于细胞治疗。
实施例四 bFGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞治疗兔肢端缺血模型实验
本实施例是使用本发明FGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞用于治疗大哺乳动物兔的肢端缺血模型。
模型建立如下：新西兰兔按右肢股动脉结扎方式建立肢端缺血模型，步骤如下：按3ml/kg的剂量将10％水合氯醛从耳圆静脉缓慢注射，并不断观察新西兰兔的角膜反射、肌肉松弛情况和呼吸，直至麻醉。选择下腹部、双侧腹股沟区、双侧大腿区域备皮，并常规消毒、铺洞巾。手术开始前于左侧股部肌肉注射氨苄50μg/kg青霉素预防感染。沿股动脉体表投影切开皮肤，皮肤切口上腹股沟水平，下至膝关节上部，逐层钝性分离，游离出股动脉。使用3-0号手术缝线结扎股动脉分支，上腹下动脉、旋股外侧动脉、腹壁浅动脉、股深动脉，并双重结扎股动脉主干后切除股动脉，上至腹股沟水平，下至腘动脉和隐动脉分叉水平。逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤。送常规饲养，术后3天继续使用抗生素抗感染。
术后1周，将肢端缺血动物随机分为四组(每组5只)，接受不同治疗：①生理盐水对照组(NS)：于右侧大腿缺血区分10点肌肉注射生理盐水，每点100μl，深度1cm左右，间距0.5cm；②UC-MSCs治疗组：缺血区肌肉内按对照组同样的方式注射UC-MSCs，细胞数量为5×106/只；③Ad-Null-UC-MSCs治疗组：缺血区肌肉内按对照组同样的方式注射空载重组腺病毒修饰的UC-MSCs，细胞数量为5×106/只；④Ad-FP-UC-MSCs治疗组：缺血区肌肉内按对照组同样的方式注射bFGF和PDGF-B双基因重组腺病毒载体修饰的UC-MSCs，细胞数量为5×106/只。治疗后每日观察实验动物进食、活动、肢端溃疡、坏死等情况。
细胞治疗后28天，行检查血管造影检查，之后取缺血区肌肉组织，-80℃冻存及4％多聚甲醛固定，进行组织病理检查。
1.血管造影检查
细胞治疗后28天，于四川大学华西医院放射科介入手术室行动脉血管造影。动脉造影过程如下：使用10％水合氯醛麻醉，方法同前。分离实验动物左侧股动脉，经股动脉插入2.7号灌注导管入腹主动脉。行数字减影血管造影术(Philip-FD-201000mA)，高压注射器以1ml/s注射4ml造影剂欧乃派克(300mgI/ml)。X光下连续摄片，采集图像6帧/s。图像行数字化剪影观察右侧肢体血管新生情况，计算造影分数。
DSA结果显示，对照组在28天时的造影分数为62.975％±4.962％，UC-MSCs治疗组的造影分数为65.4％±4.101％，Ad-Null-UC-MSCs治疗组的造影分数为64.3％±3.48％，而Ad-FP-UC-MSCs治疗组的造影分数为80.975±5.199％。
图3显示治疗后28天各组血管造影分数的差异。造影分数数值在对照组、UC-MSCs治疗组和Ad-Null-UC-MSCs治疗组之间，P>0.05，差异无统计学意义。
而Ad-FP-UC-MSCs治疗组的造影分数与对照组、UC-MSCs治疗组和Ad-Null-UC-MSCs治疗组相比，P<0.05，差异有统计学意义，提示FGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞能促进缺血区侧枝动脉形成，改善肢端缺血。
2.小动脉密度计算
采用α-smooth muscle actin(α-SMA)免疫组化染色检测缺血区肌肉内的小动脉密度。根据α-SMA免疫组化的计数结果(每高倍视野HP下小动脉数量)，对照组在28天时的小动脉密度为2.28±0.642/HP，UC-MSCs治疗组的小动脉密度为2.514±0.488/HP，Ad-Null-UC-MSCs治疗组的小动脉密度为2.56±0.654/HP，而Ad-FP-UC-MSCs治疗组的小动脉密度为3.833±0.625/HP。
图4显示治疗后28天各组小动脉密度的差异。小动脉密度在对照组、UC-MSCs治疗组和Ad-Null-UC-MSCs治疗组之间，P>0.05，差异无统计学意义。
而Ad-FP-UC-MSCs治疗组的造影分数与对照组、UC-MSCs治疗组和Ad-Null-UC-MSCs治疗组相比，P<0.05，差异有统计学意义，提示FGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞有促进缺血区小血管成熟的能力。
3.毛细血管密度计算
采用CD31免疫组化染色检测缺血区肌肉内的毛细血管密度。根据CD31免疫组化的计数结果(每mm2毛细血管数量)，对照组在28天时的毛细血管密度为462.963±61.728/mm2，UC-MSCs治疗组的毛细血管密度为525.977±77.855/mm2，Ad-Null-UC-MSCs治疗组的毛细血管密度为546.737±131.272/mm2，而Ad-FP-UC-MSCs治疗组的毛细血管密度为780.958±79.751/mm2。
图5显示治疗后28天各组毛细血管密度的差异。毛细血管密度在对照组、UC-MSCs治疗组和Ad-Null-UC-MSCs治疗组之间，P>0.05，差异无统计学意义。
而Ad-FP-UC-MSCs治疗组的造影分数与对照组、UC-MSCs治疗组和Ad-Null-UC-MSCs治疗组相比，P<0.05，差异有统计学意义，提示FGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞能明显促进缺血区血管生成。
本发明bFGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞在体内肢端缺血模型中，能有效地改善肢端缺血。间充质干细胞是治疗缺血性疾病很有前途的手段，本发明从健康人脐带中分离培养间充质干细胞，可以克服骨髓和脂肪间充质干细胞来源少、有创伤等特点。与其他大部分研究选择啮齿类动物做模型不同，我们选择哺乳动物新西兰兔作为研究对象，更能模拟人类肢端缺血性疾病。通过数字剪影动脉造影术，我们发现bFGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞能明显地促进缺血区侧枝动脉生成。然而，我们并没有发现人脐带间充质干细胞可以明显地促进缺血区侧枝动脉生成。我们通过免疫组化染色方法继续分析了缺血区肌肉小动脉和毛细血管的数量，对照组、UC-MSCs治疗组、Ad-Null-UC-MSCs治疗组在小动脉和毛细血管的数量未见明显差异，而Ad-FP-UC-MSCs治疗组中小动脉和毛细血管的数量均明显高于其他组，说明bFGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞能明显促进血管生成和成熟，进而提高血管功能，改善肢端缺血。已有研究表明，腺病毒单独肌肉注射，可以诱发炎症，并且诱导机体产生抗腺病毒抗体进而清除腺病毒载体。在本发明中，我们使用脐带间充质干细胞为载体，将腺病毒转染其中，同时利用脐带间充质干细胞和腺病毒载体的功能，又可以避免直接注射腺病毒的副作用。
由上述实例可知，本发明bFGF和PDGF-B双基因修饰的人脐带间充质干细胞能有效地治疗肢端缺血，双基因治疗和细胞治疗的应用可以提高治疗效果，方法安全、可靠、有效，具有很好的应用前景。

Claims (15)

1.表达bFGF和PDGF-B的重组载体修饰的间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞中含有的重组载体含bFGF蛋白的编码基因与PDGF-BB蛋白的编码基因，能同时表达bFGF蛋白与PDGF-BB蛋白。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞，其特征在于：所述的bFGF蛋白为人bFGF蛋白，其编码基因具有如Seq ID No.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞，其特征在于：所述的PDGF-BB蛋白为人PDGF-BB蛋白，其编码基因具有如Seq ID No.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的间充质干细胞，其特征在于：表达bFGF蛋白的表达框架的构成是：从5’到3’方向依次为SV40启动子、人IL-2信号肽的编码序列、编码bFGF蛋白的基因、SV40加尾信号。
5.根据权利要求5所述的间充质干细胞，其特征在于：表达bFGF蛋白的表达框架具有如Seq ID No.3所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1～5任一项所述的间充质干细胞，其特征在于：表达PDGF-BB蛋白的表达框架的组成是：从5’到3’方向依次为CMV5启动子、人PDGF-BB蛋白信号肽的编码序列、编码PDGF-BB蛋白的基因、β-珠蛋白加尾信号。
7.根据权利要求6所述的间充质干细胞，其特征在于：表达PDGF-BB蛋白的表达框的具有如Seq ID No.4所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求1～7任一项所述的间充质干细胞，其特征在于：所述重组载体具有Seq IDNo.5所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求1～8任一项所述的间充质干细胞，其特征在于：所述重组载体为腺病毒载体。
10.根据权利要求9所述的间充质干细胞，其特征在于：所述的腺病毒为复制缺陷型腺病毒。
11.根据权利要求1～10所述的间充质干细胞，其特征在于：所述的间充质干细胞来源于脐带。
12.权利要求1～11任一项所述间充质干细胞制备方法，其特征在于：包括如下步骤：构建同时表达bFGF蛋白与PDGF-B蛋白的腺病毒载体；从脐带分离间充质干细胞；选择第5-8代处于对数生长期的间充质干细胞，细胞生长至70-80％汇合时，用构建好的腺病毒载体进行感染；然后培养获得双基因修饰的人脐带间充质干细胞。
13.权利要求1～11任一项所述间充质干细胞在制备治疗缺血性疾病药物中的用途。
14.治疗缺血性疾病的药物，其特征在于：其主要活性成分为权利要求1～11任一项所述的胎盘间充质干细胞。
15.根据权利要求13所述的用途或权利要求14所述的药物，其特征在于：所述的缺血性疾病为冠心病引发的心肌缺血、肢端缺血或脑缺血。
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