CN104873987A - 一种靶向肝癌基因治疗药物scrAAV-Kal的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子药物学和分子医学领域，涉及一种自身互补型重组腺相关病毒载体和内源性血管生成抑制因子基因药物的制备及应用，具体涉及自身互补型重组腺相关病毒scrAAV8载体和内源性的血管生成抑制因子KAL的基因药物，实验研究结果表明，该药物可以靶向有效地抑制肝癌的增殖、转移，可作为临床应用的安全有效、靶向性更强的治疗肝癌的基因药物。

Description

一种靶向肝癌基因治疗药物scrAAV-Kal的制备及应用

技术领域：

本发明属于分子药物学和分子医学领域，涉及一种自身互补型重组腺相关病毒载体和内源性血管生成抑制因子基因药物的制备及应用。

技术背景：

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)简称肝癌，是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤疾病，被冠以“癌中王”。根据2014年2月3日世界卫生组织(WHO)表数据统计，2012年中国新增患者约占全球新增肝癌病例的一半，相应的死亡率约占世界范围内的51％。被批准上市用于晚期肝癌临床治疗的分子靶向药物索拉非尼，作为化学药物显示出巨大的潜力，使晚期肝癌的治疗困境得到明显改善。但是肝癌的发生是多因素多基因多途径交叉对话复杂通路调控的，具体机制目前仍不明确，针对某个单一靶点或信号通路治疗往往难以遏制肿瘤进展。无论是合成的西药、还是我国的传统中药，普遍存在短期有效、多次用药、见效缓慢、靶向性差和靶点单一的缺点。因此，寻求通过多靶点、多途径的抗肿瘤药物是当前研究的热点。基因治疗的出现给肝癌的治疗带来了希望，也给这类疾病的临床治疗提供了新思路。

rAAV载体系由细小病毒家族的腺相关病毒改造而来，载体因其基因结构简单、理化性质稳定、宿主范围广、在体内外长期高效表达、免疫原性及遗传毒性低以及可规模化生产等优点，已成为目前基因治疗领域中非常有前景的基因病毒载体。截止2015年1月，进入临床申报的基因治疗有2206项，rAAV应用于临床试验的研究有127项，占所有载体的5.9％(http://www.abedia.com/wiley/)。2012年，欧盟最终批准了首个可以上市的基因治疗药物Glybera，用于治疗一种极其罕见的遗传性疾病——脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)，成为基因治疗领域的重大推动力。此外，与研 究较深入的单链AAV2相比，AAV8具有免疫原性低、肝脏靶向性强的优势，自身互补型AAV(self-complementary AAV，scAAV)是一种自身互补型腺相关病毒载体，其基因组本身以双链形式存在，与常规的单链AAV(ssAAV)载体相比，具有高效快速表达的特点，可以显著降低在治疗过程中其载体本身所诱发的免疫反应。因而scrAAV8被认为是肝脏相关疾病基因治疗最具前景的载体。

Kallistatin(KAL)，一种内源性的血管生成抑制因子，不仅能抑制血管生成、血管舒张，还具有显著的抗氧化、抗炎症及抗肿瘤的多重功效。研究表明，ssrAAV2-KAL可显著抑制肝癌的增殖，但由美国宾州大学主持进行的治疗血友病的ssrAAV2基因药物I/II期临床研究却发生了严重的细胞免疫反应。本研究选取易于定量检测的分泌型萤光素酶(Gaussia luciferase，Gluc)作为报告基因，以scrAAV2载体作比较，探讨scrAAV2/8-KAL在体内外对肝癌的治疗作用，以寻求一种更安全有效、靶向性更强的治疗肝癌的基因药物应用于临床。该项研究成果，迄今尚未见有相关报道。

发明内容：

本发明提供了一种靶向治疗肝癌的基因药物(scrAAV8-KAL)。

本发明提供了scrAAV8-KAL的制备方法。 

本发明提供了基因治疗药物scrAAV8-KAL在制备抗肝癌药物的应用。

本发明提供了以所述基因治疗药物scrAAV8-KAL为有效成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物。

本发明提供了所述组合物在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明主要包括以下步骤：

(1)载体质粒是血清型AAV2的rep基因，AAV8的cap基因。治疗基因选择内源性的血管生成抑制因子Kallistatin(KAL)，基因表达框选择CB作为启动子，土拨鼠肝炎转录后基因表达调控元件是WPRE。

(2)三质粒磷酸钙转染法制备scrAAV2/2-Gluc、scrAAV2/8-Gluc作为参比，底物腔肠素(coelenterazine)检测Gluc体外转导效率，同时生产基因药物ssrAAV2/8-KAL、scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL、scrAAV2/9-KAL；

(3)采用MTT法检测基因药物scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL对细胞增殖的影响，PI、Dye eFluor670(Ki-67)流式细胞仪检测基因药物对细胞周期、增殖的影响；

(4)划痕法、Western Blot和小管形成实验检测结果显示，scrAAV2/8组可以明显抑制SMMC-7721迁移、上皮间质转化，抑制HUVEC小管形成能力；

(5)不同免疫背景小鼠(Balb/c、C57BL/6)体内以不同血清型scrAAV-KAL给药，不同时间点小鼠尾静脉采血，Elisa检测血清、组织中KAL表达量，36周后血清和肝脏中KAL依然高表达；

(6)本发明所述肝癌治疗用基因药物scrAAV2/8-KAL高低剂量，rAAV适用于腹腔注射、静脉注射、瘤内注射、肌肉注射、皮下注射、口服等途径给药。scrAAV2/8尾静脉注射组的血清以及肝脏内KAL表达量最高，而且呈剂量依赖性。

(7)Balb/c小鼠体内尾静脉注射ssrAAV2/8-KAL、scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL，2周、6周、12周检测组织中KAL的mRNA、蛋白水平表达量，为进一步的人体药代动力学研究提供数据。

(8)体内药效学实验，建立HepG2肝癌皮下移植瘤模型，采用瘤内注射形式进行给药，每隔三天观察记录肿瘤大小。7周后通过肿瘤体积，重量以及组织中KAL蛋白分布情况，评价scrAAV2/8-KAL的抗肿瘤效果。肿瘤组织免疫组化染色结果表明，基因药物对HepG2的增殖侵袭具有抑制作用，scrAAV2/8-KAL作用大于scrAAV2/2-KAL。

附图说明：

图1：ssrAAV和scrAAV载体介导的病毒基因组的元件组成

其中：CAG--ssrAAV；CB--scrAAV.

图2：不同血清型scrAAV-Gluc在HUVEC、不同肝(癌)细胞内转导效率

其中：2DG--scrAAV2/2-Gluc组；8DG--scrAAV2/8-Gluc.

图3：scrAAV-KAL选择性杀伤不同细胞

图4：scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL抑制细胞增殖

其中：DYE染色组：绿色--正常组；红色--scrAAV2/2-KAL组；蓝色--scrAAV2/8-KAL；黄色--scrAAV2/9-KAL.

Ki-67组：蓝色--正常组；红色--scrAAV2/2-KAL组；绿色--scrAAV2/8-KAL；黄色--scrAAV2/9-KAL.

图5：scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL对细胞周期阻滞作用

图6：scrAAV-KAL抑制SMMC-7721肝癌细胞的迁移

图7：scrAAV-KAL抑制SMMC-7721肝癌细胞上皮间质转化

图8：rAAV-KAL抑制HUVEC细胞的小管形成

其中：a--正常组；b--ssrAAV2/8-KAL组；c--scrAAV2/2-KAL组；d--scrAAV2/8-KAL组；e--scrAAV2/9-KAL.

图9：不同血清型、给药途径、给药剂量在不同免疫背景小鼠体内scrAAV-KAL的体外长效表达

其中：a--Balb/c小鼠尾静脉注射PBS对照组(NC)、scrAAV2/8-Gluc对照组(8DG)、scrAAV2/2-KAL组(2DK)、scrAAV2/8-KAL组(8DK)；b--Balb/c小鼠尾静脉注射高(8DK-H)低剂量组；c--Balb/c小鼠尾静脉注射(8DK)、肌肉注射组(8DK-IM)、腹腔注射组(8DK-IP)血清中KAL蛋白表达；d--C57BL/6小鼠尾静脉注射PBS对照组、scrAAV2/8-Gluc对照组、scrAAV2/2-KAL组、scrAAV2/8-KAL组血清中KAL表达.

图10：scrAAV-KAL在不同免疫背景小鼠血清、肝脏的转导效率

图11：不同基因药物在Balb/c小鼠体内代谢分析

其中：a--2周以及6周小鼠肝脏组织KAL mRNA表达，泳道1、5 8SK，泳道2、6 2DK，泳道34、78 8DK组；b--小鼠主要内脏组织KAL mRNA表达，泳道1-11分别是心、肝、脾、肺、肾、胰腺、胃、大肠、肌肉、睾丸、脑组织；c--Elisa检测2周、6周、12周小鼠肝脏组织KAL蛋白表达；d--Qpcr检测2周、6周、12周小鼠肝脏KAL mRNA表达.

图12：不同血清型rAAV-KAL对皮下移植肿瘤作用以及KAL蛋白在各个器官的表达分布情况

其中：a--肿瘤生长曲线；b--肿瘤大小图片；c--肿瘤组织重量；d--KAL组织分布.

图13：主要内脏组织HE染色

图14：肿瘤组织Ki-67的免疫组化染色

图15：肿瘤组织中E-cadherin的免疫组化染色

实施方案：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

《实施例1》rAAV基因药物的生产制备

(1)rAAV基因药物是由腺相关病毒载体质粒和治疗基因组成，其载体质粒优选自血清型AAV自身互补型的重组腺相关病毒，治疗基因选自内源性的血管生成抑制因子KAL基因，构建成scrAAV-KAL基因药物。基因表达框依次是：CB启动子，KALcDNA，polyA，土拨鼠肝炎转录后基因表达调控元件WPRE，表达框的一端为ITR。表达质粒pdsAAV-CB-Gluc是通过将原报告基因EGFP替换成含易于定量检测的萤光素酶Gluc基因得到，购自promega公司。

(2)通过将rAAV基因组一端的ITR上可以被Rep等具有核酸内切酶的元件剪切的末端断裂位点(TRS)去除，使得单链基因组在复制成互补的双链基因 组的时候无法通过剪切的方式恢复到单链的形式，只能继续以互补的双链基因组方式存在，从而被包装进病毒外壳形成自身互补型的重组腺相关病毒(图1)。

参考《分子基因药物学》，以辅助质粒Ad，rAAV衣壳辅助质粒，目的表达框pAAV-Gluc、pAAV-KAL和ITR组成的表达质粒共转染HEK293细胞，中试转瓶规模包装rAAV，传统的CsCl密度梯度离心法分离纯化制备scrAAV2/2-CB-Gluc、scrAAV2/8-CB-Gluc作为参比，同时，制备自身互补型scrAAV2/2、scrAAV2/8、scrAAV2/9-CB-KAL和单链ssrAAV8-CAG-KAL四种基因药物。

《实施例2》体外转导效率筛选

(1)scrAAV-Gluc筛选：以人血管内皮细胞HUVEC、人源肝(癌)细胞为研究对象，胰酶消化汇合度为60％-70％的细胞，调整浓度至每孔100μL 8×10³个细胞于96孔板，培养过夜至细胞贴壁。以5个不同感染滴度MOI＝1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶VG./cell的scrAAV2/2-Gluc和scrAAV2/8-Gluc分别感染血管内皮细胞(HUVEC)、正常肝细胞(LO2/Changliver)、永生化人肝星状细胞(LX-2)、肝癌细胞系(HepG2/Hep3B/Huh-7/Bel-7404/SMMC-7721)9种细胞，3个复孔，不同感染时间(48、72、96h)收集培养上清。开启荧光检测仪，设置2秒延迟和10秒读数。取干净离心管，预先加入50μL荧光素酶底物肠腔素，置于化学发光检测仪中。取20μL转染后细胞上清，快速加入到离心管中并迅速小心混匀，使用化学发光检测仪，记录读数即每秒相对发光强度(relative light units per second，RLU/s)。间接测定Gluc荧光素酶蛋白含量结果(图2)表明，所有细胞内Gluc的表达量随着时间延长、转染滴度的升高而升高，说明Gluc的表达具有剂量依赖性，在MOI＝1×10⁶V.G./cell转染96h时，基因药物在肝正常细胞Chang liver、肝癌细胞SMMC-7721中表达量最高，在HUVEC细胞、LO2肝正常细胞、Hep3B肝癌细胞中转到效率相对较低。不同血清型的Gluc在不同细胞内选择性表达，相同感染滴度、感染时间scrAAV8-Gluc在肝星状细胞LX-2、肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh-7、SMMC-7721细胞中表达效率相对scrAAV2/2-Gluc高。scrAAV2-Gluc在血管内皮细胞(HUVEC)、正常肝细胞(LO2、 Changliver)、肝癌细胞Bel-7404中表达效率要比scrAAV2/8-Gluc高，在MOI＝5×10⁵V.G./cell转染72h、96h时二者具有显著性差异(P<0.05)。

(2)scrAAV2/8/9-KAL和单链ssrAAV2/8-KAL在HUVEC细胞以及几种肝(癌)细胞中的选择性表达：MOI＝1×10⁵V.G./cell转染以上9种细胞72h时，Elisa检测上清中KAL的蛋白浓度，结果见表1。

表1 不同病毒感染细胞72h后KAL的表达量

*P<0.05表示与scrAAV8-KAL组比较

如果不考虑启动子对基因药物表达的影响，与scrAAV2/8-KAL相比，单链基因药物ssrAAV2/8-KAL在LX2、Bel-7404、SMMC-7721、Huh-7、Hep3B细胞株中均高表达，而且具有显著性差异。自身互补型scrAAV2/2、scrAAV2/8-KAL在不同细胞株中选择性表达与Gluc转导效率基本一致。scrAAV2/9-KAL在多数细胞中的转导效率相对较低，KAL含量非常小，未达到有效作用浓度。与scrAAV2/8组相比，仅在肝星状细胞LX2以及肝癌细胞Hep3B中，scrAAV2/9-KAL表达量偏高，且具有统计学差异(P<0.05)。

《实施例3》体外选择性杀伤细胞

(1)scrAAV2/2-KAL组(2DK)、scrAAV2/8-KAL组(8DK)两种病毒以4个不同感染滴度MOI＝1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、1×10⁶V.G./cell分别感染血管内 皮细胞HUVEC、正常肝细胞LO2、肝癌细胞系HepG2/SMMC-7721细胞，72h时MTT检测细胞的相对活力(图3)。

(2)采用染料(抗体)Dye eFluor670(Ki-67)流式细胞仪分别检测细胞增殖情况(图4)。结果表明，其对肝正常细胞增殖没有明显影响，DYE/Ki-67染色效果可以看出，scrAAV2/2-KAL对HUVEC、HepG2细胞增殖抑制作用不明显；而scrAAV2/8-KAL组能明显抑制SMMC-7721细胞增殖，药物处理组DYE荧光强度峰的位置会偏右，Ki-67荧光强度左移。

《实施例4》体外抑制细胞周期、迁移

(1)体外scrAAV2/8-Kallistatin转染细胞HUVEC、SMMC-7721、HepG272h后，经Modfit细胞周期软件分析，结果如图5，scrAAV2/2-KAL(2DK)干预后能提高HUVEC细胞的G2/M期的比例，同时导致S期的细胞百分数也增加，使细胞周期组织在G0/G1期，scrAAV2/8-KAL(8DK)对G2/M期影响更大；肝癌细胞SMMC-7721G2/M期以及S期的比例，两种药物预处理组相对于对照组均有明显的提高；而对肝细胞HepG2的G2/M期，没有明显的阻滞作用，但是S期的细胞百分数增加。

(2)使用Wound Maker^TM对贴壁细胞SMMC-7721进行划痕，IncuCyte ZOOM^TM细胞培养箱系统拍照，定位细胞，设置每隔3h进行一次拍照，动态观察细胞迁移的距离，结果如图6，6h时scrAAV2/8-KAL明显抑制SMMC-7721细胞划痕愈合，表明基因药物可以抑制细胞迁移。Western Blotting检测肿瘤组织中标志物结果如图7，统计结果表明，基因药物预处理使细胞上皮标志E-cadherin增强，N-cadherin及vimentin等间质标志减弱，因此，KAL抑制细胞迁移原因可能是抑制上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)，而且scrAAV8-KAL的作用更加显著。

《实施例5》体外抑制HUVEC细胞小管形成 

以MOI＝5×10⁴VG./cell感染HUVEC 48h，消化后铺于已包被10μL matrigel的u-Slide Angiogenesis板上，6h～8h后观察。由图8可知，NC组细胞能够自行 排列，伸出细丝连接其他细胞，形成节点较多，总长度较长、面积较大的管腔结构；而scrAAV2/2-KAL处理后的HUVEC细胞散点状分布，基本不能形成管腔结构，也不能连接成环；scrAAV2/8-KAL处理后的HUVEC细胞虽然有一定的排列，也有部分细胞伸出细丝，但并不能连接形成管腔结构。因此rAAV2/8-KAL对HUVEC小管形成有抑制作用。

《实施例6》不同血清型、给药途径、给药剂量在不同免疫背景小鼠体内scrAAV2/8-KAL的体外长效表达

清洁级雄性Balb/c小白鼠39只，C57BL/6小黑鼠23只，年龄均为4-6周，体重18-22g，自由进水，喂养一周。Balb/c小鼠随机分成7组，给药前12h禁食不禁水，不同血清型、不同剂量给药，尾静脉注射(Tail vein，TV)、肌肉注射(intramuscular injection，IM)、腹腔注射(intraperitoneal，IP)等不同给药途径给药，给药体积均为0.1mL，之后正常饲养，在不同时间点儿(0.5、1、3、5、8、12、16、20、28、36周)断尾1mm，静脉采血，测定血清中KAL蛋白表达情况，36周后脱颈处死，取各脏器组织样品匀浆备用。C57BL/6小鼠随机分成4组，具体处理同Balb/c小鼠，尾静脉注射不同血清型scrAAV。

(1)血清动力学结果如图8所示，两种小鼠PBS组与Gluc组均不表达KAL(图9ad)，而体内注射基因药物后，3天内血清中均能检测到KAL的表达，scrAAV2/2表达量要低于scrAAV2/8组。尾静脉注射给药之后，随着时间的延长，KAL的表达量均逐渐增加的，到36周仍然维持在较高水平，并且高剂量组(8DK-H)显著高于低剂量组(图9b)，说明KAL的表达存在剂量依赖。

(2)在Balb/c小鼠体内，尾静脉注射scrAAV2/2组变化趋势同scrAAV2/8组，均在三周表达量达到一个短暂的高表达，在五周表达量达到最高，scrAAV2/8组是scrAAV2/2组的100-120倍。在C57BL/6小鼠体内(图9d)，scrAAV2/2组在三周表达量达到最高，scrAAV2/8组在五周表达量达到最高，所有给药组在8周之后KAL基本处于稳定表达，scrAAV2/8组是scrAAV2组的120-150倍。

(3)不同给药途径给药血清动力学结果见图9c，不同给药途径，KAL蛋白的表达量不同，36周血清中KAL蛋白表达量上比较：TV>IP>IM，TV组是IP组的3-4倍，是IM组的4-5倍，IP组与IM组蛋白表达趋势是一致的。肌肉注射(8DK-IM)与腹腔给药(8DK-IP)后第7天KAL表达量达到最高，但是到7天之后其表达量就降低，具体原因有待进一步验证，5周之后所有试验组表达量持平。实验表明，scrAAV2/8-KAL基因药物能够在不同免疫背景的小鼠体内高效、长效表达，而且有剂量依赖；不同血清型、不同给药途径给药，KAL表达量会不同。

(4)分析图10可以看出，Balb/c、C57BL/6小鼠给药36周时，不论是尾静脉注射还是腹腔注射、肌肉注射，scrAAV2/8给药组血药浓度均高于scrAAV2/2-KAL组。尾静脉注射scrAAV2/8-KAL，不同免疫背景的小鼠血药浓度没有显著性差异。取脏器组织匀浆检测，比较scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL基因药物在小鼠肝脏内转到效率，ELISA结果显示，PBS对照组以及scrAAV2/8-Gluc对照组肝脏中均无KAL表达，给药组肝脏中都能检测到KAL，不同组别KAL表达量的变化趋势同血药浓度的变化趋势。但是Balb/c、C57BL/6小鼠的肝脏中，尾静脉注射scrAAV2/8-KAL组KAL浓度约为scrAAV2-KAL组的5倍、7倍，而且两种小鼠肝脏内KAL表达具有显著性差异(p<0.05)，其变化趋势不同于血药浓度。果表明，不同免疫背景小鼠scrAAV在肝脏转导效率不同，相比scrAAV2载体，scrAAV8载体具有肝脏组织靶向性，适合应用于肝相关疾病靶向治疗。

《实施例7》不同时间点KAL在组织中表达 

Balb/c小鼠随机分成4组，给药前12h禁食不禁水，尾静脉注射例1生产的ssrAAV2/8-KAL、scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL基因药物，2周、6周、12周后，脱颈处死Balb/c小鼠，取内脏组织。采用trizol法提取组织总mRNA，以GAPDH为内参，Qpcr检测2周、6周、12周小鼠肝脏组织KAL mRNA表达(图11ad)，同时用Elisa试剂盒检测不同时间点KAL蛋白表达(图11c)。

(1)在不同时间点单链ssrAAV2/8-KAL组小鼠肝脏中KAL mRNA以及蛋白表达的表达量总是比scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL高，而且在2周就已经处于很高水平，在6、12周时与scrAAV载体表达效率相比具有显著性差异，原因可能是我们所用启动不同导致的。

(2)比较scrAAV2/2-KAL、scrAAV2/8-KAL两种血清型的载体在肝脏中表达(图11)，与scrAAV2/8-KAL相比，在2周时scrAAV2/2-KAL转导效率要低；但是到了第6周，两组在肝脏的转导效率几乎相等；到了12周，8型转导效率要比2型的高。肝脏、心脏、肾脏、肺、胰腺、性腺、十二指肠、胃、脑、脾、肌肉等组织KAL mRNA表达见图11b，表明仅在肝脏组织中有KAL mRNA表达，其他组织中均无表达。

《实施例8》人肝癌裸小鼠移植瘤模型的体内抗肿瘤试验

(1)培养的HepG2人肝癌细胞，按照6×10⁶个/只的细胞数接种于裸鼠背部皮下，15-20天后，肿瘤体积增殖到100mm³时，随机分成对照组(PBS)、rAAV给药实验组，每组6只，观察40天后，眼眶取血，脱臼处死。每周测量肿瘤直径，计算肿瘤体积(tumor volume，TV)：TV＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示长宽高。根据测量结果计算相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，RTV＝V_t/V₀。其中V₀为分笼给药时(即d₀)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率(％)＝治疗组RTV*100％/阴性对照组RTV。疗效评价标准：相对肿瘤增殖率≤60％，并经单因素方差分析，统计学处理P<0.05为有效。

(2)不同血清型scrAAV给药的人肝癌裸鼠移植肿瘤的抑制作用

接种了HepG2细胞的移植瘤小鼠，接种7-10天后，肿瘤体积增殖到100mm³时，随机分4组，每组6只，分成阴性对照组(PBS)，scrAAV2/8-Gluc对照组，scrAAV2/2-KAL，scrAAV2/8-KAL试验组，瘤内注射给药100μL，试验组给药滴度为3×10¹¹VG/mL，观察40天后，剥离肿瘤块儿拍照(见图12b)，称重(见图12c)。计算肿瘤的相对增值率，scrAAV2、scrAAV8组的相对肿瘤增殖率31％、 45％，与阴性对照组相比有显著性差异(P<0.05)，但是scrAAV2组与scrAAV8组没有显著性差异(见图12a)。

(3)KAL蛋白在肿瘤组织以及主要内脏器官的分布与表达

将获得的裸鼠组织，剪切成细小的碎片，按照每20mg组织加入200μL裂解液(含1mM PMSF)的比例加入裂解液；在冰上用电动匀浆器匀浆，直至充分裂解。4000g离心10min，取上清，Elisa试剂盒检测。经瘤内注射给药后，KAL主要分布在肝、肾、肺，其次是心、脾、肌肉(见图12d)；在组织中，阴性对照组(PBS)和Gluc对照组相比，给药组KAL含量有显著性差异。与scrAAV2/8-KAL组相比，scrAAV2/2-KAL组在肝脏、肾脏组织中转导效率要低，但是在肌肉与肺组织靶向性要更强，而且具有显著性差异(P<0.05)。

(4)裸鼠主要内脏病理切片

荷瘤裸鼠经过治疗后，分别取裸鼠主要内脏器官心、肝、脾、肺、肾等器官，依次经过石蜡包埋、切片、复水等过程后，进行苏木素伊红染色，即HE染色(图13)。HE镜检结果显示，心、脾、肺、肾等器官形态正常，组织切片中未见明显的坏死区域和炎症细胞；对照组和治疗组的肝脏组织中未发现肝癌细胞的转移，肝小叶结构正常，有完整的网状纤维支架、分布规律，肝细胞索以中央静脉为中心朝四周放射排列，在病理学上无明显的损伤，表明注射基因药物不会产生机体的毒性。

(5)裸鼠肿瘤组织免疫组织化学染色

肿瘤组织的石蜡切片脱蜡复水，抗原修复、酶灭活后，分别采用兔抗Ki-67、E-cadherin一抗孵育，再加酶标二抗孵育，DAB显色后，苏木素复染，封片，显微镜下观察。Ki-67定位于细胞核，是细胞增殖重要标志物，Ki-67免疫组化染色阳性细胞为棕黄色或者黑色(图14)，统计结果(图14e)显示，与对照组相比，scrAAV-KAL给药组Ki-67表达明显减弱，基因药物在体内抑制HepG2肿瘤细胞增殖，从而起到有效的治疗效果，而且scrAAV2/2-KAL组与scrAAV2/8-KAL组相比有显著性差异(P<0.05)。

上皮钙粘蛋白(E-cadherin)与肿瘤的侵袭迁移有关，E-cadherin愈多，肿瘤细胞的迁移能力就愈差，肿瘤的危险性就越低。肿瘤组织的E-cadherin免疫组化结果(图15)，E-cadherin阳性为黄色或者棕黄色，统计结果显示，与对照组相比，scrAAV-KAL治疗组有效地抑制HepG2肿瘤细胞迁移，但是scrAAV2/2-KAL组与scrAAV2/8-KAL组抑制效果没有显著性差异(P>0.05)。

Claims (8)

1.一种靶向肝癌的基因治疗药物，其特征是，所述药物是由载体质粒及治疗基因药物scrAAV-KAL构成，其中载体质粒是优选自血清型AAV2自身互补型的重组腺相关病毒scrAAV，治疗基因药物选自内源性的血管生成抑制因子KAL。基因表达框依次是：CB启动子，KAL cDNA，polyA，土拨鼠肝炎转录后基因表达调控元件WPRE，表达框的一端为ITR。

2.权利要求1所述基因治疗药物，其特征是，自身互补型重组腺相关病毒scrAAV载体是通过将rAAV基因组，优选rAAV2一端的ITR上可以被Rep等具有核酸内切酶的元件剪切的末端断裂位点TRS去除，使得单链基因组在复制成互补的双链基因组的时候无法通过剪切的方式恢复到单链的形式，从而被包装进病毒外壳形成自身互补型的重组腺相关病毒。

3.权利要求1所述基因治疗药物，其特征是，载体质粒优选自身互补型重组腺相关病毒scrAAV8。

4.制备权利要求1所述基因治疗药物的方法，其特征是，以辅助质粒Ad，rAAV衣壳辅助质粒，目的表达框scrAAV-KAL和ITR组成的表达质粒共转染HEK293细胞，中试转瓶规模包装rAAV，传统的CsCl密度梯度离心法进行分离纯化。

5.权利要求1所述的基因治疗药物，其特征是，所述载体不仅选自scrAAV8型载体，也可选自其他血清型载体scrAAV2、scrAAV9等；不仅选自自身互补型载体，也可选自单链ssrAAV。

6.权利要求1所述基因治疗药物scrAAV-KAL在制备抗肝癌药物的应用。

7.以权利要求1所述基因治疗药物scrAAV-KAL为有效成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物。

8.权利要求6所述组合物在制备抗肝癌药物中的应用。