CN1946430B

CN1946430B - 包含人载脂蛋白(a)三环lk68或lk8基因作为有效成分用于治疗癌症的治疗剂,以及使用其治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN1946430B
Application number: CN2005800021740A
Authority: CN
Inventors: 李圭铉; 柳贤京; 李好晶; 安珍衡; 金鏱性; 赵义哲; 尹烨; 朴斗鸿; 尹成泰
Original assignee: Mogam Biotechnology Research Institute
Current assignee: Mogam Biotechnology Research Institute
Priority date: 2004-01-09
Filing date: 2005-01-10
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2025-01-10
Also published as: US20070031379A1; JP4660486B2; EP1713511B1; WO2005065720A1; JP2007517865A; CN1946430A; EP1713511A1; KR20050074306A; KR100681762B1; EP1713511A4

Abstract

本发明涉及用于基因治疗的抗癌剂或抗转移药剂，更精确地，涉及用于基因治疗的抗癌剂或抗转移药剂，其包含具有人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因载体或细胞作为有效成分，以及使用所述抗癌剂或抗转移药剂用于癌症的治疗方法。用于本发明的基因治疗的药剂具有对于肿瘤的生长和转移的抑制作用，因此其可以作为转移抑制剂或原发肿瘤的治疗剂而有效地用于预防和治疗各种实体肿瘤。

Description

包含人载脂蛋白(A)三环LK68或LK8基因作为有效成分用于治疗癌症的治疗剂,以及使用其治疗癌症的方法

本发明涉及用于基因治疗的抗癌剂，更准确地，涉及用于基因治疗的包括基因载体或细胞的抗癌剂或抗转移药剂，以及通过使用其治疗癌症的方法，所述基因载体或细胞包含人载脂蛋白三环(kringle)基因。

背景技术

肿瘤由失控的紊乱异常的细胞增殖发展而成。如果该肿瘤显示出破坏性的生长、入侵和转移，则其被认为是恶性肿瘤。入侵性是一种浸润或破坏周围组织的特性，并且特别地，形成组织边界的基底层被这种特性破坏，导致局部扩散及有时肿瘤通过循环系统流入。转移指肿瘤细胞从原发病灶通过淋巴管或血管向其它区域的扩散。广义上讲，转移性也指肿瘤细胞通过浆液体腔或其它空间直接扩散。

外科手术、放射性治疗和化学治疗单独或联合地广泛用于癌症的治疗。外科手术是除去患病组织的一种方法。这样，特定区域内的肿瘤，如乳房、结肠和皮肤，可由外科手术有效去除。然而，脊椎内的肿瘤或分散性肿瘤如白血病则不能通过外科手术进行适当的治疗。

化学治疗阻断了细胞复制或代谢，并已被应用于乳腺癌、肺癌和睾丸癌的治疗。然而，接受化学治疗的癌症患者严重遭受了全身化疗的副作用的痛苦。其中普遍但严重的例子是晕动病和呕吐。化学治疗的副作用甚至会影响患者的生活，因为这些副作用可能使患者的适应性迅速降低。另外，剂量限制毒性(DLT)也是化学治疗的一个主要副作用，它引起了对药品服用的仔细的关注。粘膜炎就是针对抗癌剂的DLT的一个例子，所述抗癌剂诸如作为抗代谢细胞毒剂的5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤、以及抗癌抗生素如多柔比星。如果患者受化疗副作用影响严重，他或她应该住院并被施以止痛药以减轻痛苦。所以，化学治疗和放射性治疗的副作用是癌症患者治疗中最大的问题。

基因治疗是通过利用DNA重组技术治疗或预防由人细胞中的遗传性变异所导致的疾病，例如各种遗传疾病、癌症、心血管疾病、感染性疾病和自体免疫性疾病的方法，即，将治疗基因插入患者中以纠正遗传缺陷或促进或增加细胞的功能。更准确地，基因治疗是通过将治疗基因传递到靶器官从而诱导受损细胞中治疗性或正常蛋白质的表达来治疗疾病。基因治疗具有多种优势诸如优良的特异性和提高的恢复率和速度，而这些是难以受其他药物的调节的，基因治疗可以进行长期施用。基因治疗不是用于治疗疾病的症状而是用于治愈或消除疾病的起因。对于成功的治疗，重要的是将治疗基因递送到靶细胞从而提高其表达率，这是基因治疗中关键的技术。

基因载体是用于将治疗基因插入靶细胞的必需介体。理想的基因载体必须是对人无害的，大量生产的，必须将基因有效携带到靶细胞中，并且必须持续地表达基因。基因载体的制备是基因治疗的核心技术。当前，广泛用于基因治疗中的最有代表性的基因载体是病毒载体诸如腺病毒，腺病毒相关病毒，反转录病毒和非病毒性载体诸如脂质体，聚乙胺(polyethyleneamine)等。

存在许多递送基因的方式，例如使用脂质体缀合，使用受体或病毒的方法以及化学或物理方法。每种方法都具有优点和缺点。在考虑递送功效和表达效率的情况下，本发明人选择使用病毒载体的方法。在许多病毒载体中，腺病毒、腺病毒相关病毒和逆转录病毒是最广泛应用的。

将腺病毒用于其中E1基因缺陷的重组病毒系统并将治疗基因插入该位置。通过该系统已经尝试了约20％的用于基因治疗的载体(Journal of Gene Medicine网址， www.wiley.co.uk/genemd/clinical/)。腺病毒载体随意感染各种细胞，但是不入侵宿主细胞的染色体，因此，不能预期持续的表达，但是短期内的高表达是可能的。

腺病毒相关病毒包含由ITR，rep，cap和ITR顺序组成的基因组。为了使腺病毒相关病毒生长，需要辅助病毒诸如腺病毒和疱疹病毒的协助。当将腺病毒用作辅助病毒时，腺病毒的E1，E2a，E4和VA基因是必需的，从而制备重组腺病毒相关病毒，其中将治疗基因插入rep和cap基因缺陷的地方(Samulski，R.J.等，J.Virol.，63：3822-3828，1989)。腺病毒相关病毒显示持续的高表达，因为其使靶基因能够插入宿主细胞的染色体19的腺病毒S1的特定区域。而且，病毒本身不能生长，因此，没有关于使用该病毒所伴随的副作用的报道并且没有怀疑因为野生型病毒污染而影响稳定性的报道，意味着其比其它系统更安全。

作为最常用的载体系统，逆转录病毒在用于基因治疗的临床测试中的全部载体中占约40％(Journal of Gene Medicine网址，www.wiley.co.uk/genmed/clinical)。重组逆转录病毒通过将治疗基因和抗生素抗性基因如新霉素，潮霉素或furomycin插入两端的LTR(长末端重复序列)之间进行制备，所述LTR类似于腺病毒相关病毒的ITR(末端反向重复序列)(Miller，A.D.等，Biotechniques，7：980-990，1989)。至于逆转录病毒系统，可以将靶基因非特异性地插入宿主细胞的染色体中并且高水平地持续表达。然而，并不预期该病毒的大量生产，并且其对非增殖(non-proliferateve)性细胞的感染率非常低。与直接将基因插入活体内相比，在该系统中更优选间接基因递送。即，重组病毒不直接插入活体内，相反，体外培养的细胞首先被包含靶基因的重组病毒所感染，并且接着选择用靶基因转导的细胞施用于活体内。然而，前述系统仍旧具有很多问题诸如由RCR(具有复制能力的逆转录病毒)所带来的副作用，不充足的病毒生产的产量或不令人满意的感染效率，所述RCR所带来的副作用由宿主细胞中类似碱基序列的同源重组所发展。

作为控制肿瘤细胞的基因治疗策略，已经使用了使用肿瘤抑制基因的方法，使用具有复制能力的溶瘤病毒的方法，使用自杀基因的方法和使用免疫调节基因的方法等。使用肿瘤抑制基因的方法是通过将肿瘤抑制基因诸如p53特异性地递送到患者中来治疗癌症，其中所述基因是缺陷的或变形的。此外，使用具有复制能力的溶瘤病毒的方法是通过将能够在肿瘤细胞中特异性生长的病毒基因载体转移到人体中，通过将肿瘤抑制基因的受损活性应用到肿瘤组织中来治疗癌症。这两种方法是直接杀伤肿瘤细胞的策略。备选地，将使用自杀基因的方法包括在该类别中。自杀基因治疗的代表性实例是通过递送可以诱导肿瘤细胞死亡的HSV-tk基因和化学抗癌剂，诸如9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤来治疗疾病。与此相反，引入免疫调节基因的方法是一种间接治疗策略，其将一个或多个基因诸如白细胞介素12，白细胞介素4，白细胞介素7，γ干扰素和肿瘤坏死因子等携带到活体内从而激发T细胞来识别肿瘤细胞或通过阻断肿瘤发育蛋白质来诱导程序性细胞死亡。在另一个方面，将通过表达血管发生抑制因子诸如血管生长抑素或内皮生长抑素等来阻断营养供应从而杀伤肿瘤细胞的方法也包括在间接治疗策略的类别中。

三环(kringle)是一种由80个氨基酸和三个分子内二硫键组成的蛋白质结构域。三环结构在许多蛋白，诸如制管张素(0’Reilly，M.S等，Cell，79：315-328，1994)，凝血酶原(Walz，D.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，74：1069-1073，1977)、尿激酶(Pennica，D.等，Nature，301：579-582，1983)、间质细胞生长因子(Lukker，N.A.等，Protein Eng.，7：895-903，1994)和载脂蛋白(a)(McLean，J.W.等，Nature，330：132-137，1987)中都有发现。三环由个体折叠单位组成。三环的功能尚未充分阐明，但是考虑到具有三环结构的蛋白质的各种功能，据信所述多种三环不具有相同的功能。

载脂蛋白(a)，一种仅由肝产生的糖蛋白，具有三环结构。载脂蛋白(a)通过共价结合于apo B-100，一种低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白质成分来形成脂蛋白(a)(Fless，G.M.，J.Biol.Chem.，261：8712-8717，1986)。载脂蛋白(a)负责体内递送胆甾醇。血清本身中的脂蛋白(a)水平的增加是动脉粥样硬化(artherosclerosis)和心脏病的主要原因(Armstrong，V.W.等，Artherosclerosis，62：249-257，1986；Assmann，G.，Am.J.Cardiol.，77：1179-1184，1996)。载脂蛋白(a)是脂蛋白作用的介体。载脂蛋白(a)包括两种类型的三环区域，其非常类似于纤维蛋白溶酶原的三环IV和V，和失活的蛋白酶样区域。按照氨基酸序列的同源性，载脂蛋白(a)三环IV-样区域被分成10个亚型(亚型；IV1-IV10)，并且它们中的每个仅有一个拷贝，除了IV2三环，其在载脂蛋白(a)基因的各种人等位基因中具有3-42的拷贝数。最后的三环V与纤维蛋白溶酶原三环-5具有83.5％的氨基酸序列同源性。

本发明人已经在2003年申请了关于包含LK8蛋白质作为有效成分的抗癌剂的专利(韩国专利申请号.：2003-10797)。实体肿瘤或转移性肿瘤具有长期的静止阶段，意味着其可以在治疗后的长时间后再次发展。然而，包含蛋白质作为有效成分的抗癌剂在体内具有相当短的半衰期。因此，为了保持抗癌效果，所需量的蛋白质必须持续进行施用从而在肿瘤细胞中维持抗癌蛋白质的水平。

上述方法具有许多问题。首先，其需要大量蛋白质，对于此不得不配备设备和技术。第二，尽管大量生产是可能的，其使患者和生产者都花费很多。第三，长期施用药物对于患者是根本不容易实现的。因此，这些问题在开发包含抗癌蛋白质作为有效成分的抗癌剂前是必须要克服的。

因此，本发明人判断使用编码蛋白质的基因的基因治疗是一种克服使用蛋白质作为抗癌剂所带来的问题的有效备选，因为其能够在全身或局部肿瘤中保持有效抗癌蛋白的含量。并且，本发明人公开了通过使用人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIVI0-KV(LK68)和KV(LK8)基因的动物测试可以有效抑制肿瘤和转移瘤的生长。最后，本发明人通过证实LK68和LK8基因能够被用作抗癌剂来完成本发明。

公开内容

技术问题

本发明的一个目标是提供抗癌剂或抗转移药剂用于基因治疗，所述抗癌剂或抗转移药剂包含基因载体或细胞作为有效成分，所述基因载体或细胞包含人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因。

本发明的另一个目标是提供用于预防或治疗实体肿瘤的方法，其包括向个体肠胃外施用包含LK68或LK8基因的基因载体或细胞的步骤。

技术路线

为了实现上述目标，本发明提供抗癌剂或抗转移药剂用于基因治疗，所述抗癌剂或抗转移药剂包含基因载体或细胞作为有效成分，所述基因载体或细胞具有人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因。

本发明还提供用于预防或治疗实体肿瘤的方法，其包括向个体肠胃外施用包含LK68或LK8基因的基因载体或细胞的步骤。

附图描述

图1是显示结肠癌细胞系的制备方法的示意图和一组照片，在所述细胞系中，通过使用重组病毒引入LK68或LK8基因。(a)用于克隆编码LK68和LK8蛋白质的基因的载体’pLXSN-LK68’和’pLXSN-LK8’的示意图，(b)蛋白质印迹分析的照片，其显示LK68和LK8蛋白质在用重组病毒转染的结肠癌细胞系中的表达，(c)RT-PCR的照片，其显示LK68和LK8蛋白质在用重组病毒转染的结肠癌细胞系中的表达。

图2是一组曲线图，其显示通过锥虫蓝染色进行测量的重组结肠癌细胞系的体外生长(a)(在该图中，Y轴表示细胞数量，而X轴表示观察时间)，和使用膜联蛋白-V和PI(碘化丙锭，Clontech)染色(处理10μg/ml的紫杉醇用于阳性对照)通过FACS(荧光激活细胞分选仪；BectonDickinson，San Jose，CA，USA)来观察重组结肠癌细胞系的程序性细胞死亡(b)。进行测量和观察来研究LK68或LK8基因的引入对靶细胞的程序性细胞死亡和生长的影响。

CT-模拟品：未被病毒感染的结肠癌细胞系，

CT-载体：被不携带LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

CT-LK68：被包含LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

10μg/ml紫杉醇：用紫杉醇处理的CT-模拟品(阳性对照)

图3是一组照片和曲线图，其显示在将每个结肠癌细胞系皮下注射到Balb/c裸鼠(Charles River，Wilmington，MA，USA)中后测量的实体肿瘤的生长(a)(统计学显著性通过斯氏t检验来检查(*：p＜0.0005)，Y轴表示通过式[长度×(宽度)²×0.52]计算的肿瘤的体积，X轴表示在肿瘤移植后的天数)，在结肠癌细胞系培养的最后一天从小鼠中分离的实体肿瘤(b)，和实体肿瘤的重量(c)。

CT-模拟品：未被病毒感染的结肠癌细胞系，

CT-载体：被不携带LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

CT-LK68：被包含LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

图4是一组照片和曲线图，其显示对结肠癌细胞向肝的转移的比较(a)和在肝表面上形成的转移瘤结节的数量的比较(b)。将结肠癌细胞移植到脾中并诱导向肝中的转移。在实验组和对照组之间比较从脾向肝的转移，从而研究是否LK68或LK8基因在被引入结肠癌细胞中后能够抑制转移。并且，通过计算在肝的表面上形成的癌细胞的数量来研究对向肝中的转移的抑制。

CT-载体：被不携带LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

CT-LK68：被包含LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

CT-LK8：被包含LK8基因的质粒感染的结肠癌细胞系

图5是一组照片和曲线图，其显示其中被转移了结肠癌细胞的肝的组织化学形态(a)，显示为百分比的被证实针对PCNA染色为阳性的细胞的数量(b)，和显示为百分比的被证实针对TUNEL为阳性的细胞的数量(c)。为了鉴定是否肿瘤结节的数量和大小被明显减少，以及是否是程序性细胞死亡，而不是细胞增殖在被转移了LK68-转化结肠癌细胞的肝的区域中大大增加，以组织学或免疫组化染色(这次，进行了H&E(苏木精-曙红)染色观察一般转移，进行PCNA(增殖细胞核抗原)染色和TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP切口末端标记)观察了癌细胞的增殖和程序性细胞死亡)检查了肝中癌症发展区域的主要部分。从总细胞数量，对那些被证实针对PCNA染色和TUNEL都是阳性的细胞进行计数，并将相对比例在曲线图中表示为％(通过斯氏t检验来检查统计学显著性)。

CT-载体：被不携带LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

CT-LK68：被包含LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系

图6是显示携带结肠癌的肝转移的小鼠的存活率的曲线图。比较了对照(CT-载体)和携带LK68基因的结肠癌细胞系(CT-LK68)两者的存活率(通过Kaplan-Meier存活曲线的对数等级检验来检查统计学显著性)。

CT-载体：被不携带LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

CT-LK68：被包含LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系

图7是显示携带结肠癌的腹膜转移的小鼠的存活率的曲线图。比较了对照(CT-载体)和携带LK68基因的结肠癌细胞系(CT-LK68)两者的存活率(通过Kaplan-Meier存活曲线的对数等级检验来检查统计学显著性)。

CT-载体：被不携带LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系，

CT-LK68：被包含LK68基因的质粒感染的结肠癌细胞系

图8是一组示意图和照片，其显示包含LK68或LK8的载体的质粒图谱，琼脂糖凝胶电泳的结果，和编码FLAG的核苷酸序列。以包括编码FLAG的核苷酸序列的引物组来进行PCR，从而将FLAG的结合位点引入LK68或LK8蛋白质的羧基末端。

图9是一组示意图和照片，其显示将扩增的LK68和LK8DNA克隆到腺病毒相关病毒的质粒载体中，并且琼脂糖凝胶电泳的结果证实上面的克隆的结果。

图10是质粒图谱，其显示每个基因在通过图9的克隆所构建的质粒载体中的定位。

图11是一组照片，其显示蛋白质印迹的结果。将用于产生腺病毒相关病毒基因载体的质粒载体体外转染到HEK 293细胞中从而诱导LK68和LK8蛋白质的表达，并且该结果被蛋白质印迹分析(a)所证实。将用于产生腺病毒相关病毒基因载体的质粒载体和辅助质粒共转染到HEK 293细胞中从而制备重组腺病毒相关病毒(rAAV)，接着将其用于体外感染HEK293细胞从而表达LK68和LK8蛋白质，并且该结果通过蛋白质印迹分析(b)进行证实。

图12是一组照片和曲线图，其显示在小鼠的血液中的基因的表达。将包含LK8基因(a)，载脂蛋白的38三环，LK68基因(b)或制管张素(angiostatin)(K13)基因(c)的重组腺病毒相关病毒注射到Balb/c裸鼠中的下肢的肌肉中，接着检查那些基因的表达。将包含LK68或LK8基因的质粒通过基于流体动力学的转染技术递送到C57BL/6野生型小鼠中，接着还研究了上述基因在血液中的表达(d)。

图13是一组照片(a)和曲线图(b)，其显示被转移到肺中的B16F10肿瘤细胞的转移在表达LK68或LK8蛋白质的小鼠中因为重组腺病毒相关病毒转移而受到抑制。

图14是一组曲线图，其显示实体肝肿瘤的生长曲线(a)和生长抑制的程度(b)。通过使用Huh-7肝细胞癌细胞构建了实体肝肿瘤模型。并且互相比较了在通过肌内注射用LK68或LK8基因载体处理的组中的实体肝肿瘤和未用其处理的组中的实体肝肿瘤的生长和生长抑制(这次，通过斯氏t检验来检查统计学显著性)。

图15是显示实体肝肿瘤的生长曲线的曲线图。通过使用Hep3B肝细胞癌细胞来构建实体肝肿瘤模型。相互比较了在通过肌内注射用LK68和LK8基因载体处理的组，和在未用其处理的组中的实体肝肿瘤的生长曲线(在这次，通过斯氏t检验来检查统计学显著性)。

图16是一组照片(a)和曲线图(b)，其显示基因治疗对EL4淋巴瘤细胞生长的抑制作用。将EL4淋巴瘤细胞施用到因为重组腺病毒相关病毒(rAAV)的转移而表达LK68和LK8蛋白质的小鼠的脾中。研究了对从脾向肝的转移的抑制，和转移瘤的生长(通过斯氏t检验来检查统计学显著性，并且为了帮助理解图，分别将rAAV-GFP，-LacZ，-K13，-LK68和-LK8以GFP，LacZ，K13和LK8表示)。

图17是曲线图，其显示通过肌内注射用包含LK68和LK8基因的重组病毒处理的小鼠组和未用其处理的组在huh-7肝细胞癌细胞的实体肝肿瘤模型中的存活曲线(在这次，通过Kaplan-Meier存活曲线的对数等级检验来检查统计学显著性)。

最佳方式

术语

基因载体意为用于将LK8或LK68基因插入治疗靶点的基因的转运载体。其包括适合于在靶标个体中表达的启动子，增强子，LK8或LK68基因和转录终止区域，并且选自由包含线性DNA片段的载体，环状质粒载体和病毒表达载体，重组腺病毒，重组逆转录病毒，重组腺病毒相关病毒，重组单纯疱疹病毒和重组慢病毒组成的组。启动子是器官或组织特异性启动子之一，并且可以包括在靶器官或组织中用于增殖的复制起点。

AAV代表腺病毒相关病毒。其包括表达外源基因的重组腺病毒相关病毒，但是在本发明中，其意为野生型病毒，除非有特殊指定。重组腺病毒相关病毒(rAAV)指这样的腺病毒相关病毒，所述病毒当基因被插入其中时能够表达外源基因，并且是一种用于基因治疗的基因载体。重组腺病毒相关病毒也被称为重组AAV载体。同时rAAV-LK8指表达LK8的重组腺病毒相关病毒，其由被pAAV-LK8，一种LK8蛋白质的表达载体转染的细胞产生。类似地，rAAV-LK68指表达LK68蛋白质的重组腺病毒相关病毒。

重组腺病毒相关病毒表达载体(其后，称为“rAAV表达载体”)，狭义地说，指包含外源基因的表达载体，其被设计用于在被转染了重组腺病毒相关病毒的细胞中表达外源基因。在广义上讲，rAAV表达载体包括AAV rep-cap基因表达载体，辅助质粒或辅助病毒，即，其包括所有的能够通过转染细胞构建重组腺病毒相关病毒的载体。在本发明中，rAAV表达载体指后者，除非有特殊指定。

AAV rep-cap基因表达载体指用于这样的基因的表达载体，所述基因可以分别编码，来自重组腺病毒相关病毒表达载体的基因组的拷贝所需要的酶(Rep)，和可用于形成腺病毒相关病毒颗粒的壳体蛋白质(Cap)，并且可以与重组腺病毒表达载体同时被插入，使重组腺病毒相关病毒在细胞中产生。辅助病毒是帮助形成本身不能复制的感染性腺病毒相关病毒颗粒的病毒，并且可以通过腺病毒、痘苗病毒和单纯疱疹病毒等进行扩增。同时，辅助质粒是代表辅助病毒功能的质粒。提及的AAV rep-cap基因表达载体和辅助病毒可以体现为一个载体，并且pDG(DKFZ，Germany)是最有代表性的实例。由于所有的AAV rep-cap基因表达载体和辅助病毒或辅助质粒可以帮助本身不能形成感染性腺病毒相关病毒颗粒的rAAV 表达载体来形成感染性rAAV颗粒，在本发明中，将包含AAV rep-cap基因和形成感染性腺病毒相关病毒颗粒所必需的腺病毒的最少基因的质粒(例如：pDG)称为辅助质粒。并且将与辅助病毒一起的辅助质粒称为“辅助载体”。因此，辅助质粒包括上述AAV rep-cap基因表达载体和形成感染性腺病毒相关病毒颗粒所必需的最少腺病毒基因的表达载体，除非关于它有特殊的指示。

发明描述

为了实现上述目标，本发明提供用于基因治疗的抗癌剂或抗转移药剂，其包括具有人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因载体或细胞作为有效成分。

其后，详细描述本发明。

本发明提供用于基因治疗的抗癌剂或抗转移药剂，其包括具有人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因载体或细胞作为有效成分。

上述的LK68基因优选地包括由SEQ.ID.No.1所表示的核苷酸序列，但是不一定受其限制。包含LK68基因的基因载体优选地包括在人或动物中表达的线性DNA，质粒载体，包含病毒表达载体或重组逆转录病毒载体的载体，重组腺病毒载体，重组腺病毒相关病毒载体，重组单纯疱疹病毒载体或包含重组慢病毒载体的重组病毒载体，但是不一定受其限制。最优选的是从由pSecTag-LK68，pLXSN-LK68，rAAV-LK68和pAAV-LK68组成的组中选择基因载体。包含LK68基因的细胞优选地选自由造血干细胞，树突细胞，自体肿瘤细胞，和建立的肿瘤细胞组成的组，但是也不一定受其限制。

LK8基因优选地包括由SEQ.ID.No.2所表示的核苷酸序列，但是不一定受其限制。包含LK8基因的基因载体优选地包括在人或动物中表达的线性DNA，质粒载体，包含病毒表达载体或重组逆转录病毒载体的载体，重组腺病毒载体，重组腺病毒相关病毒载体，重组单纯疱疹病毒载体或包含重组慢病毒载体的重组病毒载体，但是不一定受其限制。最优选的是从由pSecTag-LK8，pLXSN-LK8，rAAV-LK8和pAAV-LK8组成的组中选择基因载体。包含LK8基因的细胞优选地选自由造血干细胞，树突细胞，自体肿瘤细胞，和建立的肿瘤细胞组成的组，但是也不一定受其限制。

在本发明的治疗剂是包含LK68或LK8基因的载体的情形中，优选0.05-500mg的剂量。并且更优选0.1-300mg的剂量。在本发明的治疗剂是包含LK68或LK8基因的重组病毒的情形中，优选10³-10¹²IU(10-10¹⁰PFU)的剂量，并且更优选10⁵-10¹⁰IU的剂量。在本发明的治疗剂是包含LK68或LK8基因的细胞的情形中，被包括的细胞的优选数量是10³-10⁸，更优选的数量是10⁴-10⁷。

优选前述重组病毒是腺病毒或腺病毒相关病毒。以包含载体基因组的病毒颗粒或感染性病毒的数量来计算治疗需要的病毒的数量。即，感染性病毒的有效数量是在1％的病毒颗粒下，其通过IU(感染单位)或PFU(噬斑形成单位)来得出。

将细胞用于使用重组逆转录病毒的治疗。例如，因为重组逆转录病毒被血液补体所失活，将其通过离体传播的方法进行使用。具体地，首先制备包含LK68或LK8的重组逆转录病毒，接着将靶基因通过病毒递送到人造血干细胞(CD34+)中，并且最后，将细胞施用于个体以治疗疾病。此时，细胞可以被树突细胞，自体肿瘤细胞，建立的肿瘤细胞等取代。在许多本发明的优选实施方案中，通过使用逆转录病毒载体，将LK68或LK8基因递送到CT26细胞系，一种建立的肿瘤细胞中，接着将细胞施用于个体，随后进一步观察疾病的进展。

优选地，将这些本发明的治疗剂施用于抑制癌症转移或治疗原发肿瘤。并且，靶标癌症优选地选自由结肠癌，肝癌，肺癌，乳腺癌，脑肿瘤，前列腺癌，皮肤癌，胃癌，胰腺癌，淋巴瘤，肾癌，卵巢癌和转移瘤组成的组中。

可以将用于本发明的基因治疗的药剂肠胃外施用并且用在药物制剂的一般形式中，所述药剂包含作为有效成分的包含LK68或LK8基因的基因载体或细胞。

本发明的治疗剂可以通过混合以一般使用的填充剂，补充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，稀释剂诸如表面活性剂，或赋形剂来进行制备以用于肠胃外施用。用于肠胃外施用的制剂是无菌的水溶液，不可溶于水的赋形剂，混悬液，乳剂，冻干产品，和栓剂。除了活性化合物或多种化合物之外，不可溶于水的赋形剂和混悬液可以包含丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，可注射的酯如ethylolate等。除了活性化合物或多种化合物之外，栓剂可以包含，witepsol，聚乙二醇，吐温61，可可脂，月桂油(laurin butter)，甘油化明胶等。为了增加药物效果，可以将钙或维生素D3另外包括进来。

剂量单位可以包含，例如，1，2，3或4的个体剂量或1/2，1/3或1/4的个体剂量。个体剂量优选地包括在一次施用中所给药的活性化合物的量，并且其通常对应于全部，1/2，1/3或1/4的每日剂量。

本发明的治疗剂可以包含下列的任一个；载体，重组病毒和被转染的细胞。并且每种情形的有效剂量分别是0.05-12.5mg/kg，10⁷-10¹¹ 颗粒/kg，和10³-10⁶细胞/kg，并且更优选地0.1-10mg/kg，10⁸-10¹⁰颗粒(10⁶-10⁸IU)/kg，和10²-10⁵细胞/kg。并且施用次数是每天2-3次。剂量不一定受其限制并且按照患者的情形和疾病的严重程度来确定。

本发明已经证实LK68和LK8蛋白质在体内和离体都充当非常有效的抗癌剂(韩国专利申请号.：2003-10797)。抗癌剂中的许多必须被长期持续施用从而保持靶蛋白的需要水平，这导致了高生产费用和得到的生产的蛋白的高单位价格等问题。LK68和LK8蛋白质能够与作为细胞外基质的主要成分的许多高分子(纤维蛋白原，血纤蛋白等)结合，显示它们可能在达到靶标肿瘤之前，通过与高分子的非特异性反应而受到损失。

为了克服这些问题，基因治疗是备选方法之一。准确地说，将编码靶蛋白质的基因，而不是蛋白质本身体内插入靶细胞中，从而在那些转化细胞中直接表达蛋白质。例如，取代插入作为一种抗癌剂的LK68或LK8蛋白质，将编码该蛋白质的基因插入从而在体内表达该蛋白质，这样可以使抗癌效果最大化。基于该观点，本发明人获得了在人载脂蛋白(a)的许多三环结构中，每个仅具有KIV9-KIV10-KV(LK68)结构和KV(LK8)结构的基因，接着将那些基因离体(ex vivo)递送到肿瘤细胞中，随后引入活体中。观察肿瘤细胞的生长和转移。结果，证实了肿瘤的生长和转移被那些基因的递送成功抑制。

本发明人制备了具有编码LK68或LK8蛋白质的基因的重组逆转录病毒。接着，将该病毒离体递送到结肠癌细胞中，并且接着将其转移到活体内，随后观察肿瘤细胞的生长和转移。本发明人还制备了作为治疗性基因载体的重组腺病毒相关病毒(rAAV)，其包含LK68或LK8基因。接着，将该病毒引入活体内，随后观察所述肿瘤细胞的生长和转移从而研究该系统的抑制效果。本发明人最终证实前述基因可以被有效地用作抗癌剂。

在本发明的优选实施方案中，本发明人通过RT-PCR，从人肝cDNA文库中，制备了包含编码LK68和LK8蛋白质的基因的约1kbps DNA，其对应于载脂蛋白(a)末端的三个三环结构(KIV9，KIV10和KV)。通过自动测序仪证实了获得的DNA的相容性，并接着将该DNA称为“LK68基因”。用选择性引物仅扩增了LK68 DNA末端的KV三环区，随后通过用于分离LK68的相同的方法来进行克隆。将该产物称为“LK8基因”。

为了构建重组逆转录病毒，将制备的基因克隆到逆转录病毒载体pLXSN(Clontech，USA)中。将包含LK68基因的载体称为“pLXSN-LK68”，并将包含LK8基因的载体称为“pLXSN-LK8”(见图1)。将重组载体pLXSN-LK68和pLXSN-LK8引入PT67包装细胞系中从而产生重组病毒，通过所述重组病毒，将LK68或LK8基因递送到靶标小鼠结肠癌细胞系CT26。将稳定表达LK68基因的CT26细胞系称为“CT-LK68”，并且将稳定表达LK8基因的CT26细胞系称为“CT-LK8”。同时，将其中仅引入了不携带LK68或LK8的pLXSN载体的细胞系称为“CT—载体”，将所述CT—载体作为对照。

LK68或LK8基因的引入并不直接影响靶细胞的生长和程序性细胞死亡(见，图2)。通过观察体内实体肿瘤的生长和转移来研究在CT-LK68或CT-LK8细胞系中表达的LK68或LK8蛋白质的抗癌效果(见，图3到图7)。结果，证实了包含LK68和LK8的基因治疗剂极好地抑制了肿瘤的生长和转移。

基于上述结果，本发明人通过将诱导免疫球蛋白kappa(Igk)链和 FLAG抗原的细胞外分泌的信号核苷酸序列连接于上述LK68和LK8 DNA而制备DNA。将该DNA引入腺病毒相关病毒基因载体递送系统从而构建包含LK68或LK8基因的重组腺病毒相关病毒载体。将构建的载体称为“pAAV-LK68”或“pAAV-LK8”。并且，将从该载体产生的病毒颗粒称为“rAAV-LK68”或“rAAV-LK8”(见图8到图10)。证实了上述重组基因载体将LK68或LK8基因成功递送到细胞或组织中并且由此那些基因的表达也得以成功完成(见图11)。通过动物试验证实了通过重组病毒递送的表达的LK68和LK8蛋白质抑制了转移性肿瘤B16F10黑素瘤细胞向肺中的转移约30-60％(见图12和图13)，并且抑制了转移性肿瘤EL4淋巴瘤细胞向肝的转移40-90％(见图16)。因此，证实了可以将rAAV-LK68或rAAV-LK8重组腺病毒相关病毒用作用于基因治疗的抗癌剂。

本发明还提供了用于预防或治疗实体肿瘤的方法，所述方法包括向个体肠胃外施用抗癌剂或抗转移药剂的步骤，所述抗癌剂或抗转移药剂包含作为有效成分的具有人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因载体或细胞。通过动物试验证实了通过重组病毒递送的表达的LK68和LK8蛋白质抑制肝细胞癌Huh7和Hep3B细胞的肿瘤生长约80-90％(见图14和图15)，并且在Huh-7细胞的实体肝肿瘤模型中增加动物的存活率30-40％(见图17)。

在上述治疗剂的施用方法中没有限制，优选的是从由化学方法，物理方法，通过使用脂质体缀合，使用受体和病毒的方法等组成的组中选择一种方法来将基因载体引入细胞，所述基因载体包含人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因。在本发明中预防或治疗实体肿瘤优选地是通过抑制肿瘤的生长和转移来完成。在本发明的另一个优选实施方案中，所述施用优选地通过将人载脂蛋白(a)三环KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因引入细胞，并接着体内施用细胞的方法来进行，所述细胞选自由造血干细胞，树突细胞，自体肿瘤细胞，和建立的肿瘤细胞组成的组。

本发明人证实了LK68或LK8基因的引入通过抑制体内肿瘤的生长和转移显示抗癌效果(见图3到图7)，并且包含LK68或LK8基因的基因治疗剂可以有效抑制肿瘤的生长和向其它器官的转移。并且，在通过上述基因载体被递送后，在细胞中表达的LK68和LK8蛋白质抑制了转移性肿瘤B16F10黑素瘤细胞向肺的转移约30-60％(见图12和图13)。此外，证实了包含LK68或LK8基因的重组腺病毒相关病毒基因载体抑制转移性肿瘤EL4淋巴瘤细胞向肝的转移40-90％(见图16)。

发明方式

本发明的实施和目前优选的实施方案如在下面实施例中所显示的那样进行举例说明。

然而，将理解的是，在考虑本文公开内容后，本领域那些技术人员可以在不背离本发明精神和范围的前提下，作出多种改进和改善。

<实施例1>表达重组蛋白质LK68或LK8的结肠癌细胞系的构建

通过使用逆转录病毒，将编码LK68或LK8蛋白质的基因引入结肠癌细胞系。在后面，明确阐述构建方法。

<1-1>表达LK68或LK8蛋白质的重组载体的构建

为了获得从人肝中分离的包含编码LK68或LK8蛋白质的基因的DNA片段(在后面，称为“LK68或LK8基因”)，所述DNA片段由SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2表示，用由SEQ.ID.No.3表示的LK68基因的有义引物或由SEQ.ID.No.4表示的LK8基因的有义引物和由SEQ.ID.No.5表示的病毒载体的有义引物，通过如下方法来进行PCR；在94℃变性5分钟，接着在94℃30秒，在56℃退火30秒，在72℃延伸1分钟，并且该循环重复30次，随后在72℃进行另外的反应5分钟。设计每个有义引物使其包括限制性内切核酸酶Sfi I裂解位点，并设计反义引物使其具有限制性内切核酸酶Xho I裂解位点从而容易与载体进行DNA连接。将PCR产物插入载体，得到重组载体。为了诱导靶标蛋白(LK68或LK8蛋白)的表达和靶标蛋白在细胞外的平稳地分泌，进行上述PCR产物与在pSecTag载体(Invitrogen，USA)中的Sfi I和Xho I消化区域中的连接，随后插入Igk前导序列的Sfi I限制性内切核酸酶位点。结果，将每个PCR产物设定在LK68和LK8基因的上游，得到了载体“pSecTag-LK68”和“pSecTag-LK8”构建体。

接着，为了将LK68或LK8基因引入逆转录病毒载体，以由SEQ.ID.No.6表示的病毒载体的有义引物和由SEQ.ID.No.5表示的LK68或LK8的反义引物通过下列程序来进行PCR；在94℃变性5分钟，在94℃达30秒，在56℃退火30秒，在72℃延伸1分钟。在重复30次循环后，在72℃进行另外的反应5分钟。通过PCR，分别从pSecTag-LK68和pSecTag-LK8载体选择性地扩增Igk-LK68和Igk-LK8 DNA。在那时，所用的引物具有EcoR I和Xho I裂解位点从而与载体容易地进行DNA连接。用限制性内切核酸酶EcoR I和Xho I消化通过PCR扩增的Igk-LK68和Igk-LK8 DNA片段。将该DNA片段插入逆转录病毒载体pLXSN(Clontech，USA)，所述载体预先用如上所述的相同限制性内切核酸酶消化，得到pLXSN-LK68和pLXSN-LK8的构建。通过核苷酸序列分析和通过使用限制性内切核酸酶制成的遗传学图来证实靶基因插入载体中(图1a)。

<1-2>具有LK68或LK8基因的结肠癌细胞系的构建

为了制备包含LK68或LK8基因的重组逆转录病毒，用在上述实施例1-1中构建的pLXSN-LK68或pLXSN-LK8载体通过商购脂质体(Lipofectamin^TM，Life Technologies Inc.，Rockville，MD，USA)来转染包装细胞系PT67(Clontech，USA)。将制备自被转染的PT67细胞系的重组病毒贮存在-80℃，并且如果对于结肠癌细胞系CT26(KoreanCell Line Bank)的转染是必须的，将其进行融解。用病毒转染的CT26细胞系由于包括在pLXSN中的报道基因而具有针对抗生素G418(浓度：1mg/ml)的抗性。这种针对G418的抗性成为确定细胞系稳定表达LK68或LK8蛋白质的提示。将具有被插入的LK68基因的细胞系称为“CT-LK68”，而将具有被插入的LK8基因的细胞系称为“CT-LK8”。作为对照组，将仅包含不具有编码蛋白质(LK68或LK8)的基因的pLXSN的细胞系称为“CT-载体”，并将未被病毒转染的细胞系称为“CT-模拟品”。

进行蛋白质印迹分析和RT-PCR来证实LK68和LK8蛋白质是否在CT-LK68和CT-LK8细胞系中进行表达(图1b和1c)。结果，LK68和LK8 蛋白质成功地在那些细胞系中进行表达。

<实施例2>CT-LK68和CT-LK8细胞系的体外生长和预期的程序性细胞死亡的观察

为了研究LK68和LK8基因的引入在CT26细胞中的效果，观察CT-LK68和CT-LK8细胞系和的体外生长和预期的程序性细胞死亡。

具体地，为了观察细胞生长，将CT-LK68，CT-LK8，CT-载体和CT-模拟品细胞系以2.5×10⁴细胞/孔的浓度分散到24孔组织培养板的每个孔中。接着，将细胞于37℃，在5％的CO₂培养箱中，培养于补充以10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagles medium)中。通过锥虫蓝排阻(exclusion)计数方法(Freshney，R.I.，1994，Culture of Animal Cells.A manual of Basic Technique，第三版，Wiley-Liss.New York，USA)来测量时间依赖型细胞生长达5天。结果，在插入LK68或LK8基因的两种细胞系和对照细胞系中都观察到相同的细胞生长(图2a；X轴表示观察时间，而Y轴表示增殖的细胞的数量)。

为了证实预期的程序性细胞死亡，将约1×10⁵细胞用anexin-V和PI进行染色，随后通过FACS进行观察。用10μg/ml的紫杉醇处理CT26细胞系达24小时，接着将其用作阳性对照。当在阳性对照中观察到83％的程序性细胞死亡的时候，在CT-模拟细胞系中观察到0.89％的程序性细胞死亡，所述阳性对照是用10μg/ml的紫杉醇处理的CT26细胞系。在CT-载体细胞系和CT-LK68细胞系中分别观察到1.21％和0.96％的程序性细胞死亡(图2b)。上述结果显示LK68基因的表达没有影响CT26细胞系的生长和预期的程序性细胞死亡。

<实施例3>通过插入LK68基因来抑制实体肿瘤生长

在同种异体移植的肿瘤模型中，研究在结肠癌细胞中表达的LK68蛋白质会是否抑制实体肿瘤的生长。

具体地，将培养在补充以10％FBS的DMEM培养基中的5×10⁵CT-LK68细胞皮下注射在Balb/c小鼠(Charles River，Yokohama，Japan)的背脊中央。每个组由8-10只小鼠组成。肿瘤移植后，观察肿瘤的生长一个月。用CT-载体或CT-模拟细胞取代CT-LK68细胞来移植到对照组小鼠中。每3天或4天测量肿瘤大小，并且通过式(长×宽²×0.52)来计算肿瘤的体积。

结果，与对照相比，在其中插入LK68基因的CT-LK68中的肿瘤生长受到明显抑制。准确地讲，在从移植所述细胞系的第33天，在CT-载体处理组，CT-模拟处理组和CT-LK68处理组中比较肿瘤生长率，结果肿瘤生长在CT-LK68处理组中被80％的抑制(图3a)。在结束观察后，处死小鼠并将肿瘤从小鼠中分离。测量那些肿瘤的重量。在其中引入了LK68基因的CT-LK68处理组中的肿瘤比在CT-载体处理组中的肿瘤更轻，这与测量那些肿瘤的体积的结果相似(图3b和3c)。

<实施例4>通过引入LK68基因来抑制从脾向肝的转移

为了研究在结肠癌细胞中表达的LK68或LK8蛋白质是否能抑制实体肿瘤的转移，通过将结肠癌细胞移植到Balb/c小鼠的脾中来制备动物模型，随后观察向肝的转移。

具体地，将5×10⁴CT-LK68细胞移植到Balb/c小鼠的脾中。在从移植的第14天，将肝从小鼠中提取并计算转移的肿瘤群体的数量从而确定转移的程度。图4a是照片，其显示其中结肠癌细胞被转移的最典型的肝。在CT-载体处理组情形中，在肝中异常是显而易见的，所述肝的表面被覆盖了大或小的肿瘤群体。与此相对，在CT-LK68和CT-LK8处理组中转移被显著减少，并且肝的形状似乎象是正常的。还对在肝的表面上形成的结节的数量进行计数。结果，结节的数量在CT-LK68处理组中是47±30/单位面积，而在CT-LK8处理组中是86±50。在另一方面，在CT-载体处理对照组中，结节是125±14。上述结果显示其中被插入LK68或LK8基因的细胞系，与对照组相比(图4b)显示显著减少的通过转移形成的结节数量。

将肝样品固定在甲醛水溶液中。接着，进行H&E染色来观察结肠癌的一般转移。还进行PCNA染色来观察癌症细胞生长，并且使用TUNEL染色的免疫组化方法来研究程序性细胞死亡(图5a，Junqueria 等，BasicHistology，Lange，2003)。将针对每种染色试剂被证实为阳性的细胞的数量计算为对在确定区域中的总细胞数量的百分比，从而计算癌细胞的生长指数和程序性细胞死亡指数。

H&E染色的结果显示与对照，移植了CT-载体的小鼠相比，一般转移减少，并且在其中移植了CT-LK68细胞的宿主小鼠肝中，在第二位置新形成的肿瘤的尺寸非常小。从上述结果，证实了LK68基因还通过血管发生抑制了微转移向大转移的发展。

PCNA染色细胞与总细胞的比率在CT-LK68处理组和在CT-载体处理组中分别是64.5±3％和64.3±2％，显示了在两个组之间相似的比率(图5b)。然而，在CT-LK68处理组和在CT-载体处理组中TUNEL染色细胞与总细胞的比率分别是5.36±1.35％和0.47±0.14％，显示了在CT-LK68处理组中的癌症细胞的预期程序性细胞死亡显著增加(图5c)。上述结果显示在结肠癌细胞中表达的LK68蛋白质不影响癌症细胞的生长，但是有效增加癌症细胞的程序性细胞死亡。即，LK68基因的引入大大有利于对结肠癌细胞生长和向肝转移的抑制。

因此，在考虑H&E，PCNA和TUNEL的所有结果中，认为LK68基因插入的转移抑制效果是通过LK68蛋白质的表达，使预期的癌症细胞的程序性细胞死亡的增加所导致的。

<实施例5>通过将LK68基因引入肝转移模型中来增加宿主的存活率

将在上述实施例4中制备的，其中诱导了移植在脾中的结肠癌细胞向肝中转移的动物模型用于研究LK68基因的引入对宿主的存活率的影响，所述LK68基因在前被证实了抑制了向肝的转移。

具体地，将4×10⁵CT-LK68细胞和CT-载体细胞(对照)，分别注射到小鼠的脾中，并且接着每天检查小鼠的状况和生存力。从注射的第23天，移植了CT-载体的小鼠开始迅速死亡。组的50％存活过24天，但是没有任何小鼠存活超过28天。同时，以CT-LK68细胞移植的小鼠的50％存活过36天，但是没有任何小鼠存活超过48天(图6)。通过Kaplan-Meier存活曲线的对数等级检验检查了两组的存活率的统计学显著性。从所述结果，证实了LK68基因的插入通过抑制转移大大有利于宿主存活率的增加。

<实施例6>在腹腔转移模型中通过引入LK68基因导致的宿主存活率的增加

除了肝以外，结肠癌细胞可以转移到腹腔中。转移的两种方式是具有结肠癌的患者在治疗后复发和死亡的主要原因。因此，本发明人研究了LK68基因的引入在结肠癌的腹腔转移模型中是否能够增加宿主的生存力。

具体地，将4×10⁵CT-LK68细胞和CT-载体细胞(对照)分别注射于在上述实施例3中使用的Balb/c小鼠的腹腔中，随后观察那些小鼠的状况和生存力达32天。从移植的第14天，在移植了CT-载体细胞的组中，开始迅速有死亡的报道。在该组中，没有任何小鼠存活超过21天。同时用CT-LK68细胞处理的组的50％存活过23天，并且没有任何小鼠存活超过28天(图7)。通过Kaplan-Meier存活曲线的对数等级检验检查了在两组之间的存活率的差异的统计学显著性。从上述结果，证实了LK68基因的引入通过抑制结肠癌细胞向腹腔的转移，大大有利于宿主的生存力的增加。

<实施例7>构建质粒载体pAAV-LK68和pAAV-LK8用于制备重组腺病毒相关病毒基因载体

本发明人将LK68和LK8基因引入腺病毒相关病毒载体，接着将它们称为pAAV-LK68和pAAV-LK8。其后详细阐述pAAV-LK68和pAAV-LK8质粒的构建方法。

<7-1>LK68或LK8 cDNA的扩增

为了扩增由SEQ.ID.No.1表示的LK68 DNA，用由SEQ.ID.No.7和SEQ.ID.No.8代表的引物，通过使用人肝细胞cDNA文库(Clontech，Palo Alto，CA，USA)作为模板以如实施例1-1所用的相同反应条件和方法来进行PCR。将编码LK68的氨基基团末端的碱基序列组合以信号核苷酸序列Igk，接着将其克隆到pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中从而诱导蛋白质的细胞外分泌。在克隆后，通过使用DNA测序仪(Applied Biosystems，CA，USA)来分析DNA的核苷酸序列从而证实是否LK68 DNA被成功插入。将上述载体命名为pcDNA-LK68。通过将上述pcDNA-LK68用作模板，使用SEQ.ID.No.8和SEQ.ID.No.9表示的引物进行PCR来扩增LK8 DNA。通过用于克隆LK68 DNA的相同方法来克隆LK8 DNA，并且将得到的载体命名为pcDNA-LK8。

通过使用pcDNA-LK68和pcDNA-LK8作为模板，以SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所代表的引物来进行PCR从而扩增LK68和LK8 DNA。在那时，设计由SEQ.ID.No.10表示的引物从而与连接LK68和LK8 cDNA的5’末端的Igk的信号核苷酸序列的5’末端结合，并且在所述引物的5’末端包括EcoR I识别位点。设计由SEQ.ID.No.11表示的引物从而将编码FLAG的核苷酸序列包括在内从而用于FLAG与LK68或LK8 cDNA的3’末端的成功连接。将FLAG抗原标志物用于容易地检测LK68或LK8DNA。

将用作模板的100ng pcDNA-LK68或pcDNA-LK8载体，2μl的每种25mM引物，5μl的10×PCR缓冲液，4μl的dNTP混合物(每种2.5mM)和2.5U的Ex-Taq聚合酶加入0.2ml的PCR管中。通过使用三蒸(tertially distilled)水将混合物的最终体积调整到50μl，随后如下进行PCR；在95℃变性5分钟，在95℃30秒，在52℃30秒，在72℃1分钟，并且将循环重复30次，接着在72℃诱导另外的反应3分钟。进行琼脂糖凝胶电泳来证实PCR是否正确进行(图8)。

<7-2>质粒载体pAAV-LK68和pAAV-LK8的构建

在将定位在pAAV-hrGFP载体(Stratagene，La Jolla，CA，USA)的GFP基因之前和之后的EcoRI和Xho I区域切除从而消除GFP基因。接着，将LK68或LK8 cDNA连接于该区域。

具体地，用限制性内切核酸酶EcoRI和XhoI消化通过PCR制备的LK68和LK8 DNA，并且接着通过凝胶提取来分离DNA片段。使得到的DNA片段与T4 DNA连接酶在16℃反应4小时，导致了感受态细胞系DH5α(ATCC)的转化(图9)。在次日，从增殖的被转化DH5α细胞中提取DNA。进行以EcoRI和XhoI进行的消化从而证实是否LK68和LK8 DNA成功地插入缺乏GFP基因的pAAV-hrGFP(其后，称为’pAAV’)。将正确插入LK68 DNA的媒介质粒载体命名为pAAV-LK68，并将LK8 DNA成功插入的媒介质粒载体称为pAAV-LK8(图10)。

<实施例8>递送LK68或LK8基因的重组腺病毒相关病毒的制备和分离

为了制备递送腺病毒相关病毒LK68或LK8基因的基因载体，以1∶5的比率将pAAV-LK68或pAAV-LK8 DNA混合以包含腺病毒的E2a，E4和VA基因和腺病毒相关病毒的rep和cap基因的辅助质粒。在室温，以对应于N/P为5的量，使混合物与转化用试剂PEI(PolyPlus，Illkirch，France)反应15分钟。将得到的溶液逐滴滴到被插入并稳定表达腺病毒的E1基因的HEK293细胞(Microbix，Toronto，Ontario，Canada)上，并接着将细胞培养在37℃48小时。回收培养的细胞，随后在3,000rpm离心10分钟从而分离培养基和细胞。将细胞重悬在由0.15M NaCl和50mM Tris-HCl(pH8.5)组成的缓冲液中，随后冻融三次，导致细胞的裂解。为了除去没有被病毒壳体覆盖的DNA，在37℃用50U/ml的脱氧核糖核酸酶来处理它30分钟从而进行进一步的反应。接着，在3,000rpm进行离心20分钟从而分离上清液。为了从上清液分离病毒，进行iodixanol密度梯度超离心(Zolotukhin，S.等，Gene Therapy，6：973-985，1999)。将通过上述方法制备的得到的病毒各自称为rAAV-LK68或rAAV-LK8。

<实施例9>通过重组腺病毒相关病毒递送的LK68或LK8基因的表达

为了证实通过在上述实施例8中制备的媒介质粒载体pAAV-LK68和pAAV-LK8递送的LK68或LK8基因是否成功进行表达，将质粒载体在体外插入HEK 293细胞中，接着在体内以及体外研究LK68或LK8基因的表达和细胞外分泌。

<9-1>通过体外转导和腺病毒相关病毒基因载体来表达LK68或LK8基因

通过使用PEI试剂(PolyPlus，Illkirch，France)以3mg的pAAV-LK68或pAAV-LK8质粒载体转染在6孔板中被培养到70-80％汇合的HEK 293细胞，随后在37℃进一步培养24小时。

同时，用在上述实施例8中制备的rAAV-LK68或rAAV-LK8转染在不含FBS的6孔板中被培养到70-80％汇合的HEK 293细胞，其中接种物的大小是每个细胞5个感染复数。一小时后，用新鲜的培养基取代该培养基，随后在37℃另外培养24小时。

回收上述不同培养的细胞，随后在3,000rpm离心5分钟以分离细胞和培养基。将细胞重悬在1×SDS-PAGE缓冲液(50mM Tris(pH6.8)，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，100mM DTT(二硫苏糖醇)，0.1％BPB(溴酚蓝)，10％甘油)中，并接着在100℃煮沸5分钟。在10,000rpm离心2分钟以分离上清液。通过使用浓缩器(Centricon

YM-10；Amicon，Beverly，MA，USA)来将培养基浓缩10倍，导致通过如上述所用相同的方法进行的样品制备。

通过使用电泳试剂盒，在15％SDS-PAGE中，以20mA进行电泳2小时。通过使用传质单元(transfer unit)在tris-甘氨酸缓冲液(39mM甘氨酸，48mM tris，0.037％SDS，20％甲醇)中再次进行电泳90分钟，导致向PVDF膜(聚偏1，1二氟乙烯膜)的移动。通过使用5％脱脂乳/1×TBST缓冲液(10mM Tris，150mM NaCl，0.1％Tween-20)在室温进行过夜封闭。以1∶3,000的比率将作为初次抗体的小鼠抗-FLAG单克隆抗体(Sigma，St.Louis，MO，USA)进行稀释，将其置于室温约1小时用于反应。接着，以5分钟间隔用TBST缓冲液洗涤反应溶液6次。还将作为次级抗体的小鼠抗-HRP(KPL，Gaithersburg，MD，USA)以1∶5,000的比率稀释在1×TBST缓冲液中，进行反应30分钟。以5分钟间隔，用TBST缓冲液来洗涤溶液6次。通过使用化学发光试剂盒(ECL^TM Chemiluminescent Western Blotting Detection Reagents kit；Amersham，Buckinghamshire，UK)来证实LK68或LK8蛋白质的表达(图11a和11b)。

<9-2>LK68基因在Balb/c裸鼠中的表达

载脂蛋白(a)不是小鼠的特性(assets)。因此，本发明人预期当将由本发明人制备的LK68基因插入野生型小鼠时，LK68蛋白将被在小鼠中存在的免疫应答通过针对该蛋白形成的抗体而破坏。

将在上述实施例8中制备和分离的腺病毒相关病毒基因载体，rAAV-LK68和rAAV-LK8，以1×10⁹IU(感染单位，表示感染病毒的单位)的浓度注射到在上述实施例3中使用的Balb/c裸鼠中的后腿肌肉中的三个不同的点中。将仅注射盐水用作阴性对照，并且将注射rAAV-K13，表达制管张素(K13)的重组腺病毒相关病毒用于阳性对照。以三天间隔，从眼静脉丛中取血液，一直持续到总共取了100μl的血液。接着，处理蛋白酶抑制剂混合物。将血液样品置于室温约1小时，随后在12,000rpm离心10分钟，导致红细胞和血浆的分离。通过ELISA来分析一些分离的血浆从而测量在血液中表达的LK68，LK8和K13基因的量。还进行了如在实施例9-1中的蛋白质印迹分析来研究那些蛋白质的表达。ELISA使用两种不同的抗体，其具有针对在LK68蛋白质的三个三环中的羧酸末端的三环(LK8蛋白质)的不同血清型。它们中的一个是兔抗-LK8抗体，而另一个是小鼠抗-LK8抗体。将兔抗-LK8抗体在板(F8 MAXISORP LOOSE；Nunc，Rosklide，Denmark)中以0.25mg/切片的浓度混合以包被缓冲液(10mM PBS，pH7.2)，将其置于37℃1小时，接着用洗涤缓冲液(1×PBS，0.1％Tween 20)洗涤3次，所述板被设计为使孔结合免疫球蛋白(Ig)。加入补充以1％BSA(牛血清白蛋白)的200ml洗涤缓冲液，其后在室温封闭2小时。以不同的浓度稀释获得的血浆，将其在37℃反应1小时，并接着用洗涤缓冲液洗涤3次。以1∶1,000的比率稀释小鼠抗-LK8抗体，使其于37℃反应1小时。最终，以1∶20,000的比率稀释抗-小鼠HRP(KPL，Gaithersburg，MD，USA)，并接着用洗涤缓冲液洗涤3次。在此处理TMB酶底物(KPL，Gaithersburg，MD，USA)。通过设定在450nm的光度计来研究颜色显现以测量LK68在血液中的表达，并且将该结果与已经量化的LK68蛋白质比较组的结果进行比较。还通过比较已经量化的LK8蛋白质比较组的结果来测量LK8基因在血液中的表达。还通过与上面使用的相同的方法来研究K13的表达。

结果，由病毒载体递送的LK68基因的表达逐渐增加并且在递送2周后达到150-200ng/ml。LK8基因的表达也如LK68基因一样逐渐增加，它是20-30ng/ml，但是表达的总量少于LK68的表达总量(图12a， 12b和12c)。

<9-3>通过流体动力学技术表达插入的LK68或LK8基因

在7秒内，将包括质粒的1.8ml 0.25％的盐水注射到C57BL/6野生型小鼠(Charles River，Yokohama，Japan)的尾静脉中，所述质粒每个包含25mg的LK68或LK8基因。对于阴性对照，仅有盐水而没有任何质粒进行注射，且将rAAV-K13注射用于阳性对照。自注射的1周后，从眼静脉从中取血以测量血液中LK68或LK8基因的表达。结果，LK68蛋白质的表达量是20-25mg/ml，而LK8蛋白质的表达量是200-250ng/ml(图12d)。将这些结果与通过腺病毒相关病毒载体进行的蛋白质的表达进行比较。结果，LK68的表达是100倍更高，而LK8的表达是10倍更高，显示上述的方法是更有效的。即，与病毒载体相比，流体力学注射诱导更高的基因表达，因为其能够快速进行DNA注射(在数秒内)，从而在体内注射后迅速诱导靶基因的高表达(Liu，F.等，Gene Therapy，6：1258-1266，1999)。

<实施例10>通过插入LK68或LK8基因抑制转移性肿瘤的生长

本发明人证实由LK68或LK8基因表达的蛋白质体内抑制了转移性肿瘤的生长和转移。

具体地，将在上述实施例8中制备的1×10⁹IU的腺病毒相关病毒LK68基因载体(rAAV-LK68)或LK8基因载体(rAAV-LK8)注射到在上述实施例3中所用的Balb/c裸鼠的后腿肌肉的三个不同的点中。接着，以三天的间隔从眼丛静脉中取血从而研究LK68或LK8基因在血液中的表达。在那时，将rAAV-lacZ用于阴性对照，而将rAAV-K13用于阳性对照，在所述rAAV-lacZ中插入了表达β-半乳糖苷酶的pAAV-lacZ(Stratagene，USA)。

自重组腺病毒相关病毒LK68或LK8基因载体注射2周后，将2×10⁵ B16F10黑素瘤细胞(ATCC，Manassas，VA，USA)注射到尾静脉中。B16F10黑素瘤细胞是大量转移到肺中的细胞，并且通常，自注射后2周，有小的黑色突起样肿瘤细胞形成于肺的表面上(Fidler，I.J.等，J.Natl. Cancer Inst.，57；1199-1202，1976)。自注射B16F10黑素瘤细胞两周后，取小鼠的肺来对在肺表面上形成的黑色突起的数量进行计数。结果，证实转移约被抑制了30-60％(图13)。

<实施例11>在肝肿瘤模型中，通过插入LK68或LK8基因来抑制肿瘤的生长和转移

本发明人研究了，由LK68或LK8基因表达的蛋白质，是否如制管张素(K13)一样能够在体内抑制肝肿瘤的生长和转移。

<11-1>使用Huh-7细胞(人肝细胞癌细胞)在肝肿瘤模型中通过插入LK68或LK8基因载体来抑制肝肿瘤的生长

用PBS洗涤Huh-7细胞(JCRB，Tokyo，Japan)两次，并且接着将1×10⁷细胞皮下注射到Balb/c裸鼠(Charles River，Wilmington，MA，USA)的右胁区域以诱导实体肝肿瘤。从注射的第10天，实体肝肿瘤开始生长，显示超过80％的发展率。通过式(长×宽²×0.52)每天测量肿瘤的体积。当肿瘤生长到高达50mm³时，将在上述实施例8中制备的1×10⁹ IU的腺病毒相关病毒LK68基因载体(rAAV-LK68)或LK8基因载体(rAAV-LK8)注射在Balb/c裸鼠的后腿肌肉的三个不同点中。在自注射LK8或LK68基因载体两周后，从眼静脉丛取血以研究LK68或LK8基因在血液中的表达，在该过程中，每天检查肿瘤的生长。仅注射盐水来用作阴性对照，而将rAAV-K13注射用于阳性对照。为了检查感染效率，使用其中插入pAAV-hrGFP(Stratagene，USA)的rAAV-GFP，和rAAV-lacZ。结果，LK68的表达量是50-150ng/ml，而LK8的表达量是30-50ng/ml。同时，K13的表达量是50-100ng/ml。LK68和LK8都抑制了实体肝肿瘤生长80-90％(图14)。

<11-2>使用Hep3B肝癌细胞在肝肿瘤模型中通过插入LK68或LK8基因载体来抑制肝肿瘤的生长

通过与在实施例11-1中使用的相同的方法，使用Hep3B肝细胞癌细胞(ATCC，Manassas，VA，USA)来诱导另外的实体肝肿瘤。从第21天，实体肿瘤开始生长，显示了约30％的肿瘤化(tumorization)效率。当肿瘤生长到高达50mm³时，将LK68或LK8基因载体注射到肌肉中，并且研究由Hep3B细胞诱导的在肝中的实体肿瘤的生长和LK基因的表达。结果，LK8或LK68的表达量类似于实施例11-1的结果，并且实体肿瘤的生长被抑制了大约80％(图15a和15b)。

<11-3>使用EL4人淋巴瘤细胞，LK68或LK8在转移性肝肿瘤模型中的活性

打开雄性Balb/c裸鼠的脾，并且将50μl的2×10⁵EL4淋巴瘤细胞(ATCC，Manassas，VA，USA)缓慢注射到其中，在所述脾中，通过肌内注射LK68或LK8基因载体，LK68表达了50-100ng/ml，而LK8表达了30-50ng/ml。仅注射盐水作为阴性对照，而将rAAV-K13注射用于阳性对照。为了研究感染效率，使用rAAV-GFP和rAAV-lacZ。小心使小鼠不要接触太多的醚蒸汽，并且给小鼠5分钟的时间来使介入的癌细胞移动到肝门静脉。接着，缝合脾。约2周后，取肝来研究转移的癌细胞的大小和数量，并且还通过分析程序(SigmaScan

Pro5.0，SystatSoftware，Point Richmond，CA，USA)来研究肿瘤区域。结果，与对照组相比，肿瘤大小通过rAAV-LK68的施用变得68-90％更小，而通过rAAV-LK8施用变得70-91％更小。同时，在肝中转移的肿瘤的区域通过rAAV-LK68施用被抑制了37-54％，而通过rAAV-LK8施用被抑制了47-61％(图16a和16b)。

<11-4>使用Huh-7细胞，LK68或LK8在实体肝肿瘤模型中所导致的存活率的增加

上述结果显示LK68或LK8可以有效抑制癌症的生长和转移。为了证实LK68或LK8的治疗效果使宿主的生存力增加了多少，使用在实施例11-1中使用的Huh-7细胞，在实体肝肿瘤动物模型中观察肝肿瘤的生长直到宿主死于它。结果，在没有注射LK68和LK8基因载体的对照组中，动物在注射肝癌细胞60天后开始死亡，并且没有一只存活达到100天。与此相对，在以LK68基因载体注射的实验组中，动物在注射了肝癌细胞后80天开始死亡，并且甚至在自注射140天后，存活率是40％。在以LK8基因载体处理的其它实验组中，动物在注射了肝癌细胞后68天后开始死亡，并且自注射130天后，存活率达到30％。通过Kaplan-Meier存活曲线的对数等级检验检查在基因载体处理组和基因载体未处理组之间存活率的差异的统计学显著性。从上述结果，证实了通过在基因载体上递送来引入LK68或LK8基因大大有利于对实体肿瘤的生长的抑制，导致了宿主生存力的增加(图17)。

工业应用性

如上所阐述，本发明人制备了通过体外基因操作技术具有LK68或LK8基因的重组细胞系(CT-LK68或CT-LK8)，并接着证实被插入的LK68或LK8基因在体内抑制了肿瘤的生长和转移(离体基因治疗)。同时，本发明人制备了其中插入了LK68或LK8基因的腺病毒相关病毒基因载体，并在体内直接注射载体，随后证实插入的LK68或LK8基因有效抑制了肿瘤的生长和转移(体内基因治疗)。总之，本发明的LK68或LK8基因抑制了转移性肿瘤的生长，并且可以通过基因载体更有效地进行递送，从而使它们可以有效地用于预防各种癌症相关疾病和用于基因治疗以及用于开发抗癌剂。

序列表正文

SEQ.ID.No.1是来源自人肝载脂蛋白(a)的编码LK68蛋白质的基因；

SEQ.ID.No.2是来源自人肝载脂蛋白(a)的编码LK8蛋白质的基因；

SEQ.ID.No.3和No.4是用于扩增各自编码上述LK68蛋白质和LK8蛋白质的基因的有义引物；

SEQ.ID.No.5是来自病毒载体的用于扩增编码上述LK68或LK8蛋白质的基因的反义引物；

SEQ.ID.No.6是来自病毒载体的用于引入编码上述LK68或LK8蛋白质的基因的有义引物；

SEQ.ID.No.7和No.8是分别用于扩增LK68 cDNA的有义引物和反义引物；

SEQ.ID.No.9，连同SEQ.ID.No.8一起是用于扩增LK8 cDNA的有义引物；

SEQ.ID.No.10是用于扩增LK68或LK8的DNA片段的有义引物；和

SEQ.ID.No.11是用于扩增LK68或LK8的DNA片段的反义引物。

SEQ.ID.No.1-No.11存在于下面的序列表中。

本领域那些技术人员将理解在前面的说明中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计其它实施方案的基础，所述其它实施方案用于实现本发明的相同目的。本领域那些技术人员还将理解这些等价的实施方案没有背离如在后附的权利要求中提出的本发明的精神和范围。

Claims

1.一种用于基因治疗的抗癌剂或抗转移药剂，其包含具有人载脂蛋白(a)LK68基因或LK8基因的基因载体或细胞作为有效成分，所述LK68基因具有由SEQ ID NO：1表示的序列，所述LK8基因具有由SEQ ID NO：2表示的序列。

2.按照权利要求1的抗癌剂或抗转移药剂，其中具有所述LK68基因的基因载体是载体或重组病毒。

3.按照权利要求2的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述载体选自由线性DNA载体，质粒DNA载体和重组病毒载体组成的组。

4.按照权利要求2的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述重组病毒选自由逆转录病毒，腺病毒和腺病毒相关病毒组成的组。

5.按照权利要求3的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述重组病毒是单纯疱疹病毒或慢病毒。

6.按照权利要求1的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述细胞选自由造血干细胞，树突细胞和建立的肿瘤细胞组成的组。

7.按照权利要求1的抗癌剂或抗转移药剂，其中具有所述LK8基因的基因载体是载体或重组病毒。

8.按照权利要求7的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述载体选自由线性DNA载体，质粒DNA载体和重组病毒载体组成的组。

9.按照权利要求7的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述重组病毒选自由逆转录病毒，腺病毒和腺病毒相关病毒组成的组。

10.按照权利要求7的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述重组病毒是单纯疱疹病毒或慢病毒。

11.按照权利要求2的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述载体以0.05-500mg被包括在内。

12.按照权利要求2的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述重组病毒以10³-10¹² IU被包括在内。

13.按照权利要求1的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述细胞的数量以10³-10⁸被包括在内。

14.按照权利要求1的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述癌症选自由下列组成的组：结肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、肾癌、卵巢癌和转移性肿瘤。

15.按照权利要求14的抗癌剂或抗转移药剂，其中所述癌症选自由结肠癌、肝癌、淋巴瘤或转移性肿瘤组成的组。

16.具有人载脂蛋白(a)LK68基因或LK8基因的基因载体或细胞在制备用于预防或治疗实体肿瘤的药剂中的应用，所述LK68基因具有由SEQ IDNO：1表示的序列，所述LK8基因具有由SEQ ID NO：2表示的序列。

17.按照权利要求16的应用，其中对实体肿瘤的预防或治疗通过抑制所述实体肿瘤的生长和转移来实现。

18.按照权利要求16的应用，其中所述基因载体的施用通过选自由化学方法、物理方法、使用脂质体缀合的方法、使用受体和病毒的方法组成的组的方法来实现。

19.按照权利要求16的应用，其中所述细胞选自由下列组成的组：以人载脂蛋白(a)LK68或LK8基因转染的造血干细胞，树突细胞和建立的肿瘤细胞。