JP2007517865A - ヒトアポリポ蛋白質(a)クリングルLK68またはLK8遺伝子を有効成分として含有する抗癌治療剤及びそれを使用した癌治療方法 - Google Patents
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Abstract
Description
遺伝子伝達体は、治療対象にした個体に本発明のLK8またはLK68遺伝子を導入させるための遺伝子の運搬媒介体を意味し、治療対象になる個体で発現するのに適切な、プロモーター、エンハンサー、前記LK8またはLK68の遺伝子、転写終結部位等を含み、線形DNA断片、原型プラスミドベクター、ウイルス性発現ベクターを含むベクター、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えヘルペスシンプレックスウイルス及び組換えレンチウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを全て含む。前記プロモーターは、特定器官及び組織特異的プロモーターが使用でき、該当器官及び組織で増殖できるよう複製起点を含むことができる。
前記目的を達成するために、本発明はヒトアポリポ蛋白質(a)クリングル(kringle)KIV9-KIV10-KV(LK68)またはKV(LK8)遺伝子を含む遺伝子伝達体または細胞を有効成分として含有する抗癌または転移抑制用遺伝子治療剤を提供する。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのもので、本発明が下記の実施例に限定されるものではない。
レトロウイルスを使用してLK68またはLK8蛋白質をコードする遺伝子を結腸癌細胞株に導入した。前記遺伝子を導入した細胞株製造の過程を下記に詳細に示す。
まず、配列番号3で記載されるLK68遺伝子のセンスプライマーまたは配列番号4で記載されるLK8遺伝子のセンスプライマー及び配列番号5で記載されるウイルスベクターのセンスプライマーを使用して、各々配列番号1及び配列番号2で記載されるヒトの肝(liver)のLK68蛋白質またはLK8蛋白質をコードする遺伝子(以下、「LK68またはLK8遺伝子」と略称する)を含むDNA断片を得られるように、DNAの鎖分離(denaturation)のために94℃で5分、以後94℃で30秒、プライマー結合(annealing)のために56℃で30秒、プライマーにつなぐDNA合成(extension)のために72℃で1分の過程を30回反復した後、追加的に72℃で5分間さらに反応させるポリメラーゼ連鎖反応方法(PCR)で増幅した。各々のセンスプライマーには、制限酵素SfiI、アンチセンスプライマーには制限酵素XhoIの切断部位が各々挿入されているように製造してベクターと目的DNAとの連結(DNA ligation)を容易にした。増幅されたポリメラーゼ連鎖反応産物のベクター内導入で得られた組換えベクターの蛋白質発現及び標的蛋白質(LK68またはLK8蛋白質)が細胞外部に円滑に分泌されるようにするために、先で使用した制限酵素のSfiI及びXhoI制限酵素で前もって切断したpSecTag ベクター(Invitrogen, 米国)に前記ポリメラーゼ連鎖反応産物を連結(ligation)した後にIgκ信号配列(leader sequence)のSfiI制限酵素サイトに挿入して各LK68またはLK8遺伝子上流(upstream)に位置するようにpSecTag-LK68及びpSecTag-LK8を製造した。
LK68またはLK8遺伝子を含む組換えレトロウイルスを生産するために、常用リポソーム(LipofectaminTM, Life Technologies Inc., Rockville, MD, 米国)を使用して前記実施例1-1で製造したpLXSN-LK68またはpLXSN-LK8ベクターでパッケージング細胞株(packaging cell line)のPT67(Clontech, 米国)を形質感染(transfection)させた。感染したPT67細胞株から作られた組換えウイルスを零下80℃で保管して、必要な場合に結腸癌細胞株のCT26(韓国細胞株銀行)を感染させるのに使用した。前記ウイルスで感染したCT26細胞株は、pLXSNベクターに存在するレポータ遺伝子によりG418抗生剤(濃度:1mg/ml)に耐性を示すので、このような抗生剤耐性を使用してLK68またはLK8蛋白質を安定的に発現する細胞株を確保した。LK68遺伝子を導入した細胞株をCT-LK68と、LK8遺伝子を導入した細胞株をCT-LK8と各々命名した。対照群として前記蛋白質(LK68またはLK8)をコードする遺伝子のベクターへの導入なしにpLXSNベクターだけを導入した細胞株をCT-vectorと、ウイルス感染を実施していない細胞株をCT-mockと命名した。
LK68及びLK8遺伝子導入がCT26細胞に及ぼす影響を調査するために、インビトロ(in vitro)でCT-LK68及びCT-LK8細胞株の増殖と予想される細胞死を観察した。
同種移植された腫瘍モデルを使用して、LK68遺伝子の導入により結腸癌細胞で発現したLK68蛋白質が固形癌の成長抑制効能があるかどうかを観察した。
遺伝子導入により結腸癌細胞で発現したLK68蛋白質またはLK8蛋白質が固形癌の転移抑制効能があるかどうかを観察するために、前記実施例3で使用した同種Balb/cマウスの脾臓に結腸癌細胞が注入された肝転移動物モデルを使用して癌の肝転移程度を観測した。
前記実施例4の結腸癌細胞の肝転移動物モデルを使用して、LK68遺伝子の導入による肝転移抑制がマウスの生存率に及ぼす影響を調査した。
結腸癌細胞は肝への転移以外に腹腔を通じても転移が起きて、前記二種形態の転移が結腸癌患者の手術後、再発及び死亡の主原因である。したがって、LK68遺伝子の細胞内導入が結腸癌細胞の腹腔転移モデルで宿主の生存率を増加させるかどうかを確認した。
本発明者らは、LK68及びLK8遺伝子を組換えアデノ随伴ウイルスベクターに導入して各々 pAAV-LK68とpAAV-LK8と命名した。pAAV-LK68とpAAV-LK8プラスミド製造の詳細な過程を下記に示す。
ヒト肝細胞cDNAライブラリ(Clontech, Palo Alto, CA, 米国)を鋳型(template)にして配列番号7と配列番号8で記載される各プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応を通じて配列番号1で記載されるLK68 DNAを前記実施例1-1と同一な反応条件と方法で増幅した。LK68蛋白質が細胞外に分泌されるようにするために、前記蛋白質のアミノ基末端をコードする塩基配列にIgκの信号塩基配列を連結させてpcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA, 米国)にクローニングした。クローニング後、DNA塩基配列分析機(Applied Biosystems, CA, 米国)を使用した塩基配列の分析でLK68 DNAが正しく挿入されたかどうかを確認して、前記ベクターをpcDNA-LK68と命名した。また、前記pcDNA-LK68を鋳型に配列番号8及び配列番号9で記載されるプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応を遂行してLK8 DNAを増幅し、LK68 DNAと同一な方法でLK8DNAをクローニングして、前記方法で製造したベクターをpcDNA-LK8と命名した。
pAAV-hrGFPベクター(Stratagene, La Jolla, CA, 米国)のGFP遺伝子の前後にあるEcoRIとXhoI部位を切断してGFP遺伝子を除去して、前記部位にLK68またはLK8 cDNAを連結させた。
本発明者らは、アデノ随伴ウイルスLK68及びLK8遺伝子伝達体を製造するために、pAAV-LK68またはpAAV-LK8 DNAをアデノウイルスのE2a、E4、VA遺伝子とアデノ随伴ウイルスのRep、Cap遺伝子を有するヘルパープラスミドと定量比率1:5で混合して、N/P比率5に該当する量の形質導入試薬PEI(PolyPlus, Illkirch, France)と常温で15分間反応させた後、アデノウイルスのE1遺伝子が挿入され安定に発現されるHEK293細胞(Microbix, Toronto, Ontario, Canada)に一滴ずつ徐々に滴下した後、48時間37℃で培養した。前記培養した細胞を集めて3,000rpmで10分間遠心分離して培地と細胞を分離して、再び0.15MのNaClと50mMのTris-HCl(pH 8.5)で構成されたバッファーで前記細胞を浮遊(resuspension)させた後、急冷と解凍を3回反復して細胞を溶解(lysis)させた。ウイルス外皮(capsid)で包装されないDNAを除去するために、50U/mlのDNA分解酵素を処理して37℃で30分間反応させた後、3,000rpmで20分間遠心分離して上澄み液(supernatant)を分離した。前記上澄み液からウイルスを分離するために、イオジキサノール(iodixanol)濃度勾配超遠心分離を使用した(Zolotukhin, S. ら, Gene Therapy, 1999年, 第6巻, 973-985頁)。前記の方法で生産及び分離されたウイルスを各々rAAV-LK68とrAAV-LK8と命名した。
前記実施例8で製造した伝達プラスミドベクターpAAV-LK68とpAAV-LK8のLK68及びLK8遺伝子が正常的に発現されるかどうかを確認するために、インビトロ(in vitro)でHEK293細胞に前記プラスミドベクターを導入してLK68及びLK8遺伝子の発現、細胞外部への分泌及びインビトロだけではなくインビボでの発現の有無を下記の方法で確認した。
6-ウェルプレートで70〜80%程度に培養されているHEK293細胞にPEI(PolyPlus, Illkirch, France)試薬を使用してpAAV-LK68またはpAAV-LK8プラスミドベクター3mgを形質導入させた後、24時間37℃で培養した。
アポリポ蛋白質(a)は、マウスにない蛋白質であるため、本発明者らが開発したLK68遺伝子を一般マウスに導入する場合には、前記マウスがLK68蛋白質に対する抗体形成を通じた体内免疫反応によって前記蛋白質が消滅するものと判断した。
25mgのLK68またはLK8遺伝子を各々含んだプラスミドが溶解している1.8mlの0.25%食塩水をC57BL/6正常マウス(Charles River, Yokohama, 日本)の尾静脈に7秒以内に注入した。ここで、陰性対照群にはプラスミドなしに食塩水だけを注入し、陽性対照群には前記rAAV-K13を使用した。注入して1日後に眼窩静脈叢を通じて採血して血液内LK68及びLK8遺伝子の発現量を測定した。その結果、LK68蛋白質は20〜25mg/ml、LK8蛋白質の場合は200〜250ng/ml程度の発現を確認した(図12のD)。前記数値は、アデノ随伴ウイルス伝達体によるものと比較してLK68遺伝子は100倍、LK8遺伝子は10倍程度高い発現量で、前記流体力学的注入は多量のDNAを数秒内に注入することにより短い時間内に体内で高い遺伝子の発現を誘導するのでウイルス伝達体に比べて高い発現数値を示し得る(Liu, F. ら, Gene Therapy, 1999年, 第6巻, 1258-1266頁)。
本発明者らは、LK68またはLK8遺伝子の発現蛋白質がインビボ(in vivo)で転移性癌の転移及び成長を抑制することを下記で確認した。
本発明者らは、アンジオスタチン(K13)の場合同様、LK68またはLK8遺伝子の発現した蛋白質がインビボ(in vivo)で肝癌の転移及び成長を抑制するかどうかを下記の方法で確認した。
Huh-7肝癌細胞(JCRB, Tokyo, Japan)をPBSで2回洗浄した後、1×107個の細胞をBalb/cヌードマウス(Charles River, Wilmington, MA, 米国)の右側脇腹部位に皮下注射して固形性肝癌を誘導した。約10日後から固形性肝癌が大きくなり始めて、80%以上の発生率を示した。毎日〔長さ×幅2×0.52〕式を使用して癌の体積を計算した。癌の大きさが50mm3程度の時、前記実施例8で製造及び分離したアデノ随伴ウイルスLK68遺伝子伝達体(rAAV-LK68)またはLK8遺伝子伝達体(rAAV-LK8)を1×109IUの量でBalb/cヌードマウスの両後ろ足筋肉に各々三カ所に分けて注射した。LK8またはLK68遺伝子伝達体を注射して約2週間後に眼窩静脈叢を通じた採血を遂行して血液内のLK68またはLK8遺伝子の発現量を確認しながら固形性肝癌の成長形態を毎日確認した。ここで、陰性対照群には食塩水だけを投与し、陽性対照群には前記rAAV-K13を使用した。感染効率を測定するために、pAAV-hrGFP(Stratagene, 米国)を導入したrAAV-GFP及び前記rAAV-lacZを使用した。その結果、LK68の場合は50〜150ng/ml、LK8は30〜50ng/ml、K13は50〜100ng/mlの濃度で発現が維持され、固形性肝癌の成長ではLK68、LK8すべて約80〜90%程度の成長抑制を示した(図14)。
前記実施例11-1のような方法でHep3B肝癌細胞(ATCC, Manassas, VA, 米国)を使用し固形性肝癌を誘導した。約21日後から固形性肝癌が大きくなり始めて、その発生率は30%程度を示した。前記例と同様に癌の大きさが50mm3程度の時、LK68またはLK8遺伝子伝達体を筋肉注射してHep3Bから誘導した固形性肝癌の成長形態と伝達されたLK遺伝子の発現量を確認した。その結果、LK8またはLK68発現量はすべて前記実施例11-1の結果と似た程度を示し、固形性肝癌の成長は約80%程度の抑制を示した(図15のa及びb)。
前もって、LK68またはLK8遺伝子伝達体を筋肉注射して血液内発現量がLK68の場合には50〜100ng/ml、LK8の場合は30〜50ng/mlの数値を示す雄Balb/cヌードマウスの脾臓を露出させた後に、2×105EL4リンパ腫瘍細胞(ATCC, Manassas, VA, 米国)を50μl容積で徐々に注入した。同様に、陰性対照群には食塩水だけを投し、陽性対照群にはrAAV-K13を使用した。感染効率を測定するために前記rAAV-GFP及びrAAV-lacZを使用した。前記マウスがエーテル蒸気に過多露出しないように注意し、注入した癌細胞が肝門脈へ流入するように5分程度時間を置いた後に脾臓を切除して縫合した。施術後、約2週間になった時、肝を摘出して転移した肝癌の大きさと個数、そして面積比率を分析プログラム(SigmaScanR Pro 5.0, Systat Software, Point Richmond, CA, 米国)で分析した。その結果、大きさの場合LK68は68〜90%、LK8は70〜91%、そして面積比率では転移した肝癌の成長を各々37〜54%と47〜61%抑制した(図16のa及びb)。
前記の例を通じてLK68及びLK8による癌の転移及び成長が効果的に抑制されたことを確認した。このような治療効果が実際に宿主の生存率をどれくらい増加させるかを測定するために前記実施例11-1で言及したHuh-7固形性肝癌動物モデルで個体が死亡に至るまで継続して肝癌の成長を測定して飼育した。その結果、LK68及びLK8遺伝子伝達体を注入していない比較群は、肝癌細胞を接種して60日以後から個体が急激に死に始めて100日以内にすべて死亡した。一方、LK68遺伝子伝達体を投与した群は80日から個体が死に始めたが140日以後まで40%の生存率を維持し、LK8遺伝子伝達体を投与した群は68日から個体が死に始めて130日以後まで30%の生存率を維持した。カプランマイヤー生存曲線のログランクテストを通じて、遺伝子伝達体非投与群と遺伝子伝達体投与群間の生存率差に対する統計的有意性を検定した。この実験結果から、遺伝子伝達体を通じたLK68及びLK8遺伝子の細胞内導入は、固形性癌の成長を抑制することにより宿主の生存率を顕著に増加させることを確認した(図17)。
配列番号2は、ヒト肝のアポリポ蛋白質(a)から由来したLK8蛋白質をコードする遺伝子であり;
配列番号3及び4は、各々前記LK68蛋白質をコードする遺伝子及び前記LK8蛋白質をコードする遺伝子を増幅するためのセンスプライマーであり;
配列番号5は、前記LK68またはLK8蛋白質をコードする遺伝子を増幅するためのウイルスベクター起源のアンチセンスプライマーであり;
配列番号6は、前記LK68またはLK8蛋白質をコードする遺伝子をレトロウイルスベクターで導入するためのウイルスベクター起源のセンスプライマーであり;
配列番号7及び8は、各々LK68のcDNAを増幅するためのセンスプライマー及びアンチセンスプライマーであり;
配列番号9は、前記配列番号8と共にLK8のcDNAを増幅するためのセンスプライマーであり;
配列番号10は、LK68及びLK8のDNA断片を増幅するためのセンスプライマーであり;かつ配列番号11は、前記LK68及びLK8のDNA断片を増幅するためのアンチセンスプライマーである。
前記の配列番号1〜11は、添付の配列表に記載した。
Claims (21)
- ヒトアポリポ蛋白質(a)クリングル(kringle)KIV9-KIV10-KV(LK68)またはKV(LK8)遺伝子を含む遺伝子伝達体または細胞を有効成分として含有する抗癌または抗転移遺伝子治療剤。
- 前記LK68遺伝子が、配列番号1で記載される塩基配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- 前記LK68遺伝子を含む遺伝子伝達体が、ベクターまたは組換えウイルスであることを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- 前記ベクターが、線形DNA、プラスミドDNAまたは組換えウイルス性ベクターであることを特徴とする、請求項3に記載の治療剤。
- 前記組換えウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、レンチウイルスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項3に記載の治療剤。
- 前記細胞が、造血幹細胞、樹状細胞、自己腫瘍細胞(autologous tumor cells)及び株化腫瘍細胞(established tumor cells)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- 前記遺伝子伝達体が、pSecTag-LK68、pLXSN-LK68、rAAV-LK68及びpAAV-LK68からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- 前記LK8遺伝子が、配列番号2で記載される塩基配列を有することを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- 前記LK8遺伝子を含む遺伝子伝達体が、ベクターまたは組換えウイルスであることを特徴とする、請求項8に記載の治療剤。
- 前記ベクターが、線形DNA、プラスミドDNAまたは組換えウイルス性ベクターであることを特徴とする、請求項9に記載の治療剤。
- 前記組換えウイルスが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、レンチウイルスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項9に記載の治療剤。
- 前記遺伝子伝達体が、pSecTag-LK8、pLXSN-LK8、rAAV-LK8及びpAAV-LK8からなる群から選択されることを特徴とする、請求項9に記載の治療剤。
- 前記ベクターが、0.05〜500mg含有されることを特徴とする、請求項3または請求項9に記載の治療剤。
- 前記組換えウイルスが、103〜1012IU含有されることを特徴とする、請求項3または請求項9に記載の治療剤。
- 前記細胞が、103〜108個含有されることを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- 結腸癌、肝癌、リンパ腫、肺癌、乳癌、脳腫瘍、前立線癌、皮膚癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌及び転移性癌からなる群から選択される癌を治療することを特徴とする、請求項1に記載の治療剤。
- 前記癌が、結腸癌、肝癌、リンパ腫または転移性癌であることを特徴とする、請求項16に記載の治療剤。
- 請求項1の治療剤を個体に非経口的に投与する工程を含む、固形癌の予防または治療の方法。
- 固形癌の成長及び転移の抑制を通じてなされることを特徴とする、請求項18に記載の予防または治療の方法。
- 前記投与する工程が、ヒトアポリポ蛋白質(a)クリングル(kringle)KIV9-KIV10-KV(LK68)またはKV(LK8)遺伝子を含む遺伝子伝達体を化学的方法、物理的方法、リポソームを使用する接合方法、受容体及びウイルスを使用した方法からなる群から選択される方法により、細胞内へ導入する工程を含むことを特徴とする、請求項18に記載の予防または治療の方法。
- 前記投与する工程が、造血幹細胞、樹状細胞、自己腫瘍細胞及び株化腫瘍細胞からなる群から選択した細胞に、前記ヒトアポリポ蛋白質(a)クリングル(kringle)KIV9-KIV10-KV(LK68)またはKV(LK8)遺伝子を導入して、前記細胞を人体に投与する方法からなることを特徴とする、請求項18に記載の予防または治療の方法。
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