JP2022535169A - 脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス及びその応用 - Google Patents
脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス及びその応用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は腫瘍生物療法の分野に関し、具体的には、腫瘍の成長及び転移を抑制する複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５－ＡｐｏＡ１及び抗腫瘍薬物の調製における使用に関している。本発明はＡＤ５－ＡｐｏＡ１の設計及び構築方法を開示し、複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５－ＡｐｏＡ１を取得できた。このウイルスは腫瘍細胞内で迅速に複製し、腫瘍溶解作用を生じることができる。このウイルスに感染した腫瘍細胞はアポリポタンパク質ＡｐｏＡ１を高発現することができ、このタンパク質分子は細胞外に大量に分泌され、腫瘍細胞の浸潤及び移動を顕著に抑制し、腫瘍促進性炎症経路を抑制し、腫瘍免疫逃避を引き起こすキー分子ＩＤＯ－１を顕著に低下させることができる。このアデノウイルスは肝臓癌、乳癌、結腸癌及び肺癌に罹ったマウスにおいて、腫瘍の成長を顕著に抑制し、腫瘍の浸潤を抑制し、悪液質の進行を遅らせ、担癌マウスの生存期間を延長することができ、抗腫瘍薬物の開発において大きな見通し及び価値がある。
Description
本発明は腫瘍生物療法の分野に関し、腫瘍の成長、浸潤及び転移を効果的に抑制する複製腫瘍溶解性アデノウイルス及びその応用に関している。
我が国では、毎年約４００万人の癌患者が新たに増加し、毎年３００万人近くが癌で亡くなっている。従来の手術、放射線療法、化学療法などの方案は、腫瘍の進行をある程度抑制するが、腫瘍の浸潤、転移及び再発を制御することが困難である。
近年、腫瘍の生物療法手段は不可欠な部分になっている。腫瘍溶解性ウイルス自体は、腫瘍細胞内で複製し、腫瘍溶解作用を発揮できると同時に、免疫細胞を活性化し、免疫細胞の腫瘍の局所への浸潤を引き起こし、抗腫瘍免疫応答を誘発することができる。また、腫瘍溶解性ウイルスは、外来遺伝子を運び、腫瘍の局所で外来タンパク質を発現し、タンパク質薬物の抗腫瘍作用を直接発揮することができる。２０１５年に、最初の腫瘍溶解性ウイルス薬物（T-Vec、Amgen社）の販売がＦＤＡにより承認され、組換え単純疱疹ウイルス－１は、ＧＭ－ＣＳＦを発現し、ＤＣを活性化し、抗腫瘍活性を発揮することができる。従来技術では、腫瘍溶解性ウイルス薬物の開発には、主に組換え発現ベクターを構築し、ウイルスに免疫活性化因子又は免疫チェックポイント抗体を放出させ、患者の免疫機能を活性化し、抗腫瘍作用を発揮し、例えば、ヒト細胞膜透過性ペプチドｐ５３とＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を有する組換え腫瘍溶解性アデノウイルス（CN201310460980）、及びＰＤ－Ｌ１一本鎖抗体を発現する腫瘍溶解性ニューカッスル病ウイルス（CN201811560794）である。しかし、現在の従来技術は、腫瘍の転移を効果的に制御することができない。
アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１は、ＡｐｏＡファミリーの中で最も多くの成分であり、肝臓と小腸で合成され、２４３個のアミノ酸残基で構成される単一のポリペプチドである。ＡｐｏＡ１は、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの活性化剤であり、主に高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に存在し、ＨＤＬの主なアポリポタンパク質である。ＡｐｏＡ１の主な機能は、コレステロールの逆輸送、つまり末梢細胞から肝臓へのコレステロールの輸送を媒介することである。ＡｐｏＡ１は、細胞表面の特異的受容体であるアデノシン三リン酸結合カセット輸送体Ａ１（ＡＢＣＡ１）に結合することにより、細胞の遊離コレステロールとリン脂質を取り込み、新しいＨＤＬを生成する。レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）により、ＨＤＬ粒子中の遊離コレステロールをコレステロールエステルに変換し、続いて肝臓に輸送して代謝する。従来の文献には、ＡｐｏＡ１野生型（ＷＴ）又は変異型（Ｖ１５６Ｖ）を運ぶプロテオリポソーム（ＰＬ）と腫瘍溶解性アデノウイルスを結合させて複合体を形成することにより、腫瘍溶解性ウイルスのＨｅｐ３Ｂ細胞に対する抗腫瘍活性を効果的に促進できることが報告されている（Mol Cells. 2012; 34: 143-148）。しかし、この技術方案は、腫瘍の浸潤、転移及び再発に対して対応する技術的効果を有するか否かが分かっていない。また、この文献の方案では、まずジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、遊離コレステロール（ＦＣ）、ＡｐｏＡ１の組成比が２００：９：１であるＰＬをインビトロで構築し、次に腫瘍溶解性アデノウイルスと複合物を形成することにより、作用を発揮する。このような方法は、調製プロセスが複雑であるだけでなく、薬効の持続時間が短い。
したがって、現在、腫瘍の成長を効果的に抑制し、転移及び再発を制御するという効果を達成できる、脂質代謝に関連する遺伝子を発現できる複製腫瘍溶解性ウイルスベクター及び腫瘍溶解性ウイルスがまだ存在していない。
本発明の目的は、腫瘍の成長を抑制できるだけでなく、腫瘍の浸潤及び転移を抑制できる複製腫瘍溶解性アデノウイルス及びその応用を提供することである。
上記した発明の目的を実現するために、本発明は以下の技術方案を採用する。
アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１を分泌できる複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び組換え腫瘍溶解性ウイルスである。具体的には、この複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの構築方案には、実験レベルのタグ付きアデノウイルスベクター及び薬用レベルのタグなしアデノウイルスベクターが含まれる。実験レベルのアデノウイルス複製エレメントＥ１Ａは、第１の構成的プロモーターＣＭＶにより制御され、Ｅ１Ａの上流にＧＦＰ配列が接続され、中間にＡ２リンカー配列が接続される。Ｅ１領域に挿入された外来標的遺伝子ＡｐｏＡ１は、第２の構成的プロモーターＣＭＶにより制御され、ＡｐｏＡ１の５’末端にシグナルペプチド配列を有し、３’末端にＨｉｓタグ配列とＰＡ配列を有する。
この方案により構築される組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍細胞内で複製して腫瘍細胞を殺し、腫瘍の成長を抑制することができ、また、脂質代謝に関与する輸送タンパク質であるＡｐｏＡ１タンパク質を発現して分泌することができる。組換え融合ＡｐｏＡ１腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍細胞の浸潤と移動を抑制するという効果を達成できることを見出した。
そこで、以下の発明を提供する。
（１）本発明の一側面は、以下の外来遺伝子を操作可能に挿入又は含有する複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５-ＡｐｏＡ１ベクターの構築に関する。
この外来遺伝子はＡｐｏＡ１の標的遺伝子配列又はその縮重配列であり、そのヌクレオチド配列が配列番号１に示される。具体的には、その５’末端にシグナルペプチド認識配列を有する。
ここで、ＡｐｏＡ１はアデノウイルスのＥ１領域に位置し、優先的にＥ１Ｂ領域に位置している。
以下の外来遺伝子を操作可能に挿入又は含有する、本発明のいずれか一項に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５－ＡｐｏＡ１ベクターの構築。
実験レベル：第１のプロモーター、ＧＦＰ配列、２Ａリンカー配列、Ｅ１Ａ初期活性化複製エレメント、絶縁配列、第２のプロモーター、標的遺伝子配列又はその縮重配列、Ｈｉｓタグ配列、ＰＡ配列は順次接続されている。
具体的には、第１のプロモーター、ＧＦＰ配列、２Ａリンカー配列、Ｅ１Ａ初期活性化複製エレメントは同じ発現カセット内にある。
第２のプロモーター、標的遺伝子配列又はその縮重配列、Ｈｉｓタグ配列、ＰＡ配列は同じ発現カセット内にあり、プロモーターは構成的プロモーター、誘導的プロモーター、特異的プロモーターであってもよく、好ましくは、第１のプロモーターは構成的プロモーター、誘導的プロモーター、特異的プロモーターであってもよく、第２のプロモーターは同様に構成的プロモーターであってもよい。構成的プロモーターは、好ましくはＣＭＶ、ＳＶ４０又はＥＦ１ａであり、より好ましくはＣＭＶプロモーターであり、核酸配列が配列番号２に示される。
薬用レベル：第１のプロモーター、Ｅ１Ａ初期活性化複製エレメント、絶縁配列、第２のプロモーター、標的遺伝子配列又はその縮重配列、ＰＡ配列は順次接続されている。
発現されたＡｐｏＡ１遺伝子のタンパク質アミノ酸配列は配列番号３に示される。
前記腫瘍溶解性アデノウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦサブクラス、好ましくはＣサブクラスアデノウイルス、より好ましくはヒトアデノウイルス５型ＡＤ５を含むことを特徴とする、本発明のいずれか一項に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５－ＡｐｏＡ１ベクターの構築。
（２）本発明の他の側面は、Ｅ１Ａ複製エレメント及びＡｐｏＡ１独立発現カセットを含む本発明のいずれか一項に記載の組換え腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む複製腫瘍溶解性アデノウイルスに関し、この複製腫瘍溶解性アデノウイルスは、具体的には、組換え腫瘍溶解性ウイルスベクターにより２９３Ｔ細胞において組換えることにより得られる。
（３）本発明のまた他の側面は、いずれか一項に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター又は本発明のいずれか一項に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスの、腫瘍の浸潤と転移への抵抗、腫瘍悪液質の緩和、腫瘍の炎症への抵抗、抗腫瘍免疫薬物における使用に関する。具体的には、前記癌又は腫瘍は、肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、胆嚢癌、食道癌、腎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、甲状腺腫瘍、縦隔腫瘍又は神経膠腫であり、好ましくは肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌である。
腫瘍の浸潤と転移は、腫瘍患者の死亡を引き起こす根本的な原因である。現在、腫瘍の浸潤と転移を効果的に制御できる抗腫瘍薬物はなく、腫瘍の浸潤と転移に確実に抵抗できる腫瘍溶解性ウイルス薬物もない。これまで、本発明に記載の組換え複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５－ＡｐｏＡ１は、悪性腫瘍の浸潤及び転移を確実に抑制できる初めての腫瘍溶解性ウイルスである。
また、進行腫瘍における悪液質の発生率は約６０％以上であり、進行癌患者の死亡を引き起こす重要な要因でもあり、悪液質の最も顕著な症状は、進行性削痩（体重減少）である。臨床的には、腫瘍悪液質を効果的に遅らせる薬物又は方法は未だにない。本発明に記載の組換え複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５－ＡｐｏＡ１は、意外にも悪液質の進行に抵抗する作用を有し、結腸癌マウスの体重を効果的に維持し、生存期間を顕著に延長することができる。
複製腫瘍溶解性アデノウイルスは、感染した腫瘍細胞におけるＡｐｏＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１の高発現を効果的にアップレギュレートし、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１のコレステロール輸送作用を大幅に向上させ、予想外の相乗効果を生じることもできる。最後に、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、腫瘍促進性炎症経路を効果的に制御し、腫瘍の免疫逃避を媒介するキー酵素ＩＤＯ－１を抑制し、生体の腫瘍に対する免疫監視を効果的に回復させることもできる。要するに、本発明に記載の組換え複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、腫瘍の浸潤及び転移を抑制し、悪性腫瘍悪液質の進行を遅らせ、感染した腫瘍細胞におけるＡｐｏＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１の高発現をアップレギュレートし、抗腫瘍に相乗効果をもたらし、ＩＤＯ－１、腫瘍促進性炎症を抑制し、抗腫瘍免疫監視を回復させるという複数の抗腫瘍作用を同時に有する。以上の作用が相乗的に機能することにより、優れた抗腫瘍作用が生じ、抗腫瘍薬物の調製に用いることができる。
具体的には、本発明では、
１）複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１の構築方案を提供する。細胞はＡＤ５ ＡｐｏＡ１に感染した後、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１を発現して分泌することができる。
２）対照ウイルスに比べて、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、腫瘍細胞においてより強い複製及び腫瘍溶解能力を有する。
３）アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１は、乳癌細胞の浸潤と移動を顕著に抑制する。
４）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス乳癌皮下腫瘍の成長を顕著に抑制する。
５）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス上皮内乳癌の浸潤と転移を顕著に抑制し、マウスの生存期間を顕著に延長する。
６）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス肺癌の成長を顕著に抑制する。
７）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス結腸癌の成長を顕著に抑制し、マウス悪液質の進行を顕著に緩和することができる。
８）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス肝臓癌の成長を顕著に抑制し、マウスの生存期間を顕著に延長する。
９）ヒト化マウスモデルでは、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、肝臓癌の成長を顕著に抑制し、マウスの生存期間を顕著に延長する。
１０）乳癌細胞では、複製ＡｐｏＡ１は、腫瘍の浸潤を促進するキータンパク質Ｋ１４を顕著に抑制する。
１１）癌細胞では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、ＡＰＯＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１を顕著にアップレギュレートする（ＡＰＯＡ１のコレステロール輸送能力を向上させる）。
１２）マクロファージ及び肝臓癌細胞では、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１は、腫瘍の炎症を促進するキー分子ＳＴＡＴ３の活性化を顕著に抑制する。
１３）マクロファージ及び肝臓癌細胞では、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１は、抗腫瘍免疫を抑制するキー酵素ＩＤＯ－１を大幅に減少させる。
１）複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１の構築方案を提供する。細胞はＡＤ５ ＡｐｏＡ１に感染した後、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１を発現して分泌することができる。
２）対照ウイルスに比べて、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、腫瘍細胞においてより強い複製及び腫瘍溶解能力を有する。
３）アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１は、乳癌細胞の浸潤と移動を顕著に抑制する。
４）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス乳癌皮下腫瘍の成長を顕著に抑制する。
５）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス上皮内乳癌の浸潤と転移を顕著に抑制し、マウスの生存期間を顕著に延長する。
６）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス肺癌の成長を顕著に抑制する。
７）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス結腸癌の成長を顕著に抑制し、マウス悪液質の進行を顕著に緩和することができる。
８）動物実験では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、マウス肝臓癌の成長を顕著に抑制し、マウスの生存期間を顕著に延長する。
９）ヒト化マウスモデルでは、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、肝臓癌の成長を顕著に抑制し、マウスの生存期間を顕著に延長する。
１０）乳癌細胞では、複製ＡｐｏＡ１は、腫瘍の浸潤を促進するキータンパク質Ｋ１４を顕著に抑制する。
１１）癌細胞では、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、ＡＰＯＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１を顕著にアップレギュレートする（ＡＰＯＡ１のコレステロール輸送能力を向上させる）。
１２）マクロファージ及び肝臓癌細胞では、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１は、腫瘍の炎症を促進するキー分子ＳＴＡＴ３の活性化を顕著に抑制する。
１３）マクロファージ及び肝臓癌細胞では、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１は、抗腫瘍免疫を抑制するキー酵素ＩＤＯ－１を大幅に減少させる。
用語「ＡｐｏＡ１」は、ＮＣＢＩで遺伝子ＩＤ：３３５である。この遺伝子は、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主なタンパク質成分であるアポリポタンパク質Ａ－Ｉをコードしている。コードされた前駆体タンパク質は、タンパク質加水分解処理により、成熟タンパク質を生成し、組織外から肝臓へのコレステロールの排出を促進し、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の補因子であり、ＬＣＡＴは、ほとんどの血漿コレステロールエステルの形成を担う酵素である。この遺伝子は、１１番染色体上の他の二つのアポリポタンパク質遺伝子と密接に関連している。この遺伝子の欠陥は、高密度リポタンパク質欠乏に関連し、タンジール病、及び非神経性全身性アミロイドーシスを含む。選択的スプライシングにより複数の転写変異体が生じ、そのうちの少なくとも一つは前駆体タンパク質をコードする。
ＡｐｏＡ１遺伝子は複数の転写物があり、それぞれNM_000039.2/NP_000030.1（ｃＤＮＡ配列／タンパク質配列）、NM_001318017.2/NP_001304946.1、NM_001318018.2/NP_001304947.1、NM_001318021.1/NP_001304950.1である。
用語「Ｅ１Ａ」ウイルスのＥ１領域遺伝子は、さらにＥ１ＡとＥ１Ｂに分けられる。Ｅ１Ａは、主に２８９Ｒ（又は１３Ｓ）と２４３Ｒ（又は１２Ｓ）の二つの成分で構成される。アデノウイルスゲノムが細胞核に入った後、細胞転写因子はまずＥ１Ａ領域の上流のエンハンサーに結合し、Ｅ１Ａタンパク質を発現する。このタンパク質の作用は、細胞代謝を調節し、ウイルスＤＮＡを細胞内で複製しやすくすることである。Ｅ１Ａタンパク質は、他の初期遺伝子（Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、及びＥ４）のプロモーターを活性化することもでき、Ｅ２Ｂは、ウイルス複製に関連する他の三つの初期遺伝子転写ユニットである前駆体末端タンパク質（ｐＴＰ、precursor terminal protein）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ｓｓＤＢＰ、single-stranded DNA binding proteins）及びＤＮＡポリメラーゼ（DNA pol、DNA polymerase）の発現を駆動し、これらの三つの遺伝子の発現産物は、複合物として緊密に結合され、少なくとも三つの細胞タンパク質と相互作用し、ウイルスゲノムの複製を開始する。本発明では、Ｅ１Ａの前に独立したＣＭＶプロモーターが含まれる。ＧＦＰとＥ１Ａとは２Ａリンカー配列で接続される。
理論に制限されることなく、リンカー配列としての２Ａ自体には翻訳後タンパク質切断部位のみがあり、２Ａペプチド断片は２Ａの前後のタンパク質に残っている。２Ａを用いてＧＦＰとＥ１Ａを接続し、初期複製エレメントとＧＦＰタグタンパク質とを分離する。
理論に制限されることなく、アデノウイルス血清型の選択には、１００を超える血清型が発見されており、ヒトアデノウイルスは５２種あり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの六つのサブグループ（subgroup）に分けられ、それらの宿主細胞への指向性、腫瘍形成性及び病歴は異なっている。遺伝子治療で一般的に使用される２型及び５型アデノウイルスは、血清学的にいずれもＣサブグループに属し、ＤＮＡ配列に９５％の相同性がある。細胞がアデノウイルスに感染するプロセスは、アデノウイルス繊毛の頭節領域が細胞表面の特異的受容体に付着することから始まる。ヒトアデノウイルスは主にコクサッキーウイルスＢと受容体を共有しているため、このような受容体はコクサッキー／アデノウイルス受容体、即ちＣＡＲ（coxsackie/adenovirus receptor）と呼ばれる。ＣＡＲを低いレベルで発現することにより、間違いなくアデノウイルスの形質導入効率を制限している。しかし、Ｃサブグループアデノウイルスベクターは臨床応用に成功したため、その安全性についてヒトで広くテストされており、ベクターとして安全性が高い。本発明の組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞において複製することができる。
本発明に記載の薬物は、本分野における周知の方法、例えば不活化ワクチン又はワクチンウイルスなどを含む通常の生物活性製剤により製造することができる。好ましくは、生物製剤としては、弱毒化生ワクチンウイルスを選択する。
本発明に記載の薬物の応用には、予防製品、治療製品、診断製品の三つが含まれる。好ましくは、応用は治療製品である。治療は、単一治療、補助治療又は併用治療である。
本発明に記載の薬物の投与経路は、経口、直腸、経粘膜、経腸投与、又は局所、経皮、吸入、腸管外、舌下、膣内、鼻腔内、眼内、腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内、腫瘍部位でのin situ投与を含むが、これらに限定されていない。好ましい投与経路は、静脈注射、腫瘍部位でのin situ投与である。
以下に具体的な実施例を参照し、本発明を更に解釈して説明するが、示される実施例は、単なる例示にすぎず、いかなる方法でも本発明を制限するものではないと理解される。
本発明に係わる実験器具及び試薬は以下のとおりである。
（１）実験細胞系
ヒト胚性腎臓細胞株２９３Ｔ、ヒト肝臓癌細胞株ＨＣＣ－ＬＭ３、ＳＭＭＣ－７７２１、ヒト腎明細胞癌細胞株７８６－Ｏ、ヒト肝臓癌細胞株ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４、ヒト肺癌細胞株Ｈ１２９９、マウス肝臓癌細胞株Ｈ２２、マウス乳癌細胞株４Ｔ１に対し、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／Ｉペニシリン及び１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
（２）実験器具
生物学的安全キャビネット（SteriGARD（登録商標）III advance、Class II Biological Safety Cabinet、The Baker Company）、二酸化炭素インキュベーター（FORMA SERIES II WATER JACKET CO2 incubator、Thermo）、低温遠心分離機（HERAEUS MEGAFUGE 1.0R、Thermo）、垂直電気泳動セル（BIO-RAD）、電気泳動装置（BIO-RAD）、セミドライ電気泳動転写セル装置（BIO-RAD）、免疫ブロット露光システム（Alpha Innotech）、ＰＣＲ装置（PCR Thermal Cycler Dice、TaKaRa）、リアルタイム定量的ＰＣＲ装置及び分析ソフトウェア（ABI384、Sequence Detection Software、Version 1.3.1）、マイクロプレートリーダー（VERSA max microplate reader）、ピペットキット（eppendorf及びRAININ）、細胞カウンター（Countstar Automated cell counter、Inno-Alliance Biotech Inc.、Wilmington、USA）、フローサイトメーター（FACSCalibur、Becton、Dickinson and Company、USA）、FlowJoソフトウェア（Version 7.6.5、Tree Star Inc、Ashland、Oregon）、マイクロプレートシェーカー（QiLinBeiEr）、核酸純度濃度検出器（Biophotometer plus、eppendorf）、デジタル恒温水浴（国華電器）。
（３）主な実験試薬及び消耗品
プライマーはいずれもGenScript社により合成された。腫瘍細胞の培養に必要なＤＭＥＭ高グルコース培地、二重抗体、血清は、いずれもInvitrogen（上海）社から購入された。定量的ＲＴ－ＰＣＲ試薬はFaststart Universal SYBR Green Master（Roche、04913914001）であった。ウェスタンブロッティングに必要な試薬及び消耗品は、プロテアーゼ阻害剤（Roche、11873580001）、細胞溶解液（Beyotime：P0013）、ＰＶＤＦ膜（Roche、03010040001）、WB Immobilon ECL発光液（Millipore、WBKLS0500）、一次抗体希釈液（Beyotime、P0023A）、ＨＲＰ標識二次抗体（Multisciences、GAR007及びGAM007、１：５０００で希釈）であった。他の必要な試薬はいずれも国産分析用試薬であり、南京大学化学工学部から購入された。トリパンブルー（Beyotime、C0011）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭはInvitrogen（上海）社から購入された。ウェスタンブロッティング用抗体は抗Ｈｉｓ（GenScript、MB001、１：５０００で希釈）であった。
（１）実験細胞系
ヒト胚性腎臓細胞株２９３Ｔ、ヒト肝臓癌細胞株ＨＣＣ－ＬＭ３、ＳＭＭＣ－７７２１、ヒト腎明細胞癌細胞株７８６－Ｏ、ヒト肝臓癌細胞株ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４、ヒト肺癌細胞株Ｈ１２９９、マウス肝臓癌細胞株Ｈ２２、マウス乳癌細胞株４Ｔ１に対し、１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／Ｉペニシリン及び１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む高グルコースＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
（２）実験器具
生物学的安全キャビネット（SteriGARD（登録商標）III advance、Class II Biological Safety Cabinet、The Baker Company）、二酸化炭素インキュベーター（FORMA SERIES II WATER JACKET CO2 incubator、Thermo）、低温遠心分離機（HERAEUS MEGAFUGE 1.0R、Thermo）、垂直電気泳動セル（BIO-RAD）、電気泳動装置（BIO-RAD）、セミドライ電気泳動転写セル装置（BIO-RAD）、免疫ブロット露光システム（Alpha Innotech）、ＰＣＲ装置（PCR Thermal Cycler Dice、TaKaRa）、リアルタイム定量的ＰＣＲ装置及び分析ソフトウェア（ABI384、Sequence Detection Software、Version 1.3.1）、マイクロプレートリーダー（VERSA max microplate reader）、ピペットキット（eppendorf及びRAININ）、細胞カウンター（Countstar Automated cell counter、Inno-Alliance Biotech Inc.、Wilmington、USA）、フローサイトメーター（FACSCalibur、Becton、Dickinson and Company、USA）、FlowJoソフトウェア（Version 7.6.5、Tree Star Inc、Ashland、Oregon）、マイクロプレートシェーカー（QiLinBeiEr）、核酸純度濃度検出器（Biophotometer plus、eppendorf）、デジタル恒温水浴（国華電器）。
（３）主な実験試薬及び消耗品
プライマーはいずれもGenScript社により合成された。腫瘍細胞の培養に必要なＤＭＥＭ高グルコース培地、二重抗体、血清は、いずれもInvitrogen（上海）社から購入された。定量的ＲＴ－ＰＣＲ試薬はFaststart Universal SYBR Green Master（Roche、04913914001）であった。ウェスタンブロッティングに必要な試薬及び消耗品は、プロテアーゼ阻害剤（Roche、11873580001）、細胞溶解液（Beyotime：P0013）、ＰＶＤＦ膜（Roche、03010040001）、WB Immobilon ECL発光液（Millipore、WBKLS0500）、一次抗体希釈液（Beyotime、P0023A）、ＨＲＰ標識二次抗体（Multisciences、GAR007及びGAM007、１：５０００で希釈）であった。他の必要な試薬はいずれも国産分析用試薬であり、南京大学化学工学部から購入された。トリパンブルー（Beyotime、C0011）、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭはInvitrogen（上海）社から購入された。ウェスタンブロッティング用抗体は抗Ｈｉｓ（GenScript、MB001、１：５０００で希釈）であった。
実施例１：ＡＤ５－ＡｐｏＡ１ウイルスのプラスミド構築、レスキュー及び増幅
（１）ＡＤ５－ＡｐｏＡ１完全長プラスミドの構築：
構築されたシャトルベクターＡＤ５－ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＡｐｏＡ１をＰｍｅＩで線形化し、コンピテントｐＡｄＥａｓｙ－ＢＪ５１８３に移し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートを用いてスクリーニングした。陽性クローンを選択して培養同定を行い、正しいと同定されたクローンプラスミドをＤＨ５ａコンピテント細胞に再形質転換し、二次スクリーニング及び同定を行い、正しいと同定された後、プラスミドを抽出し、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１完全長プラスミドを得た。
（２）ＡＤ５－ＡｐｏＡ１ウイルスのレスキュー：
ＡＤ５－ＡｐｏＡ１完全長プラスミドをＰａｄＩで線形化し、精製後、６ウェルプレートに１μｇ／ウェルで２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、５％ＣＯ２、３７℃で培養し、２日後に細胞を消化し、１０ｃｍプレートに移し、８０％の細胞に変性が起こるまで２～３日で培地を交換し、１０ｍｌ培地を使用して細胞を吹き落とし、１５ｍｌ遠心チューブに回収し、２回繰り返して凍結融解し、３０００ｒｐｍ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離し、ウイルス上清を回収し、ウイルスシードとして－８０℃で保存した。
（３）ウイルスの増幅：
ウイルスシード液５０μｌを取り、１０ｃｍプレートで６０％２９３Ｔ細胞に加え、５％ＣＯ２、３７℃で細胞密度が９０％以上になるまで培養し、８０％の細胞、即ち約１０枚のプレートの細胞に変性が起こるまで１：３の割合で継代し、上記方法でウイルスを回収し、塩化セシウム密度勾配遠心分離によりウイルスを精製し、ＴＣＩＤ５０方法を用いて力価を測定した。
（１）ＡＤ５－ＡｐｏＡ１完全長プラスミドの構築：
構築されたシャトルベクターＡＤ５－ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＡｐｏＡ１をＰｍｅＩで線形化し、コンピテントｐＡｄＥａｓｙ－ＢＪ５１８３に移し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢプレートを用いてスクリーニングした。陽性クローンを選択して培養同定を行い、正しいと同定されたクローンプラスミドをＤＨ５ａコンピテント細胞に再形質転換し、二次スクリーニング及び同定を行い、正しいと同定された後、プラスミドを抽出し、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１完全長プラスミドを得た。
（２）ＡＤ５－ＡｐｏＡ１ウイルスのレスキュー：
ＡＤ５－ＡｐｏＡ１完全長プラスミドをＰａｄＩで線形化し、精製後、６ウェルプレートに１μｇ／ウェルで２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、５％ＣＯ２、３７℃で培養し、２日後に細胞を消化し、１０ｃｍプレートに移し、８０％の細胞に変性が起こるまで２～３日で培地を交換し、１０ｍｌ培地を使用して細胞を吹き落とし、１５ｍｌ遠心チューブに回収し、２回繰り返して凍結融解し、３０００ｒｐｍ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離し、ウイルス上清を回収し、ウイルスシードとして－８０℃で保存した。
（３）ウイルスの増幅：
ウイルスシード液５０μｌを取り、１０ｃｍプレートで６０％２９３Ｔ細胞に加え、５％ＣＯ２、３７℃で細胞密度が９０％以上になるまで培養し、８０％の細胞、即ち約１０枚のプレートの細胞に変性が起こるまで１：３の割合で継代し、上記方法でウイルスを回収し、塩化セシウム密度勾配遠心分離によりウイルスを精製し、ＴＣＩＤ５０方法を用いて力価を測定した。
実施例２：ＡＤ５－ＡｐｏＡ１ウイルス力価の測定
（１）２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり約１×１０３細胞で９６ウェルプレートに接種し、細胞が壁に付着した後に力価を測定した。
（２）ウイルス勾配の希釈：ＥＰチューブを準備し、ウシ胎児血清を含む１１７０μｌのＤＭＥＭを各ＥＰチューブに加えた。１番目のＥＰチューブに１３０μｌのウイルス溶液を加え、均一に混合し、１０－１とした。１番目のＥＰチューブから２番目のＥＰチューブに５０μｌをピペットで移し、均一に混合し、１０－２とした。以下同様に、所望の勾配に達するまで希釈した。
（３）各ウェルに対応する勾配のウイルス希釈液１００μｌを加え、勾配ごとに１０個のウェルでこの操作を繰り返し、３７℃で一晩培養した。
（４）５日後、９６ウェルプレートを顕微鏡でＧＦＰを観察し、各勾配でＧＦＰがあるウェル数を記録し、ウイルス力価を計算した。
（５）ウイルス力価ＴＣＩＤ５０の計算式は以下のとおりである。
Ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）＝Ｌ＋ｄ（ｓ－０．５）＋ｌｏｇ１０（１／ｖ）
Ｌ＝Ｌｏｇ１０ 最高希釈度（最高希釈度が１０倍希釈であると、Ｌ＝１である）
Ｖ＝１ウェルあたりの細胞培養液の初期体積（ｍｌ／ｗｅｌｌ）
ｄ＝Ｌｏｇ１０ 希釈度（１０倍希釈であると、ｄ＝１である）
ｓ＝各勾配でのＧＦＰ比の合計
（１）２９３Ｔ細胞を１ウェルあたり約１×１０３細胞で９６ウェルプレートに接種し、細胞が壁に付着した後に力価を測定した。
（２）ウイルス勾配の希釈：ＥＰチューブを準備し、ウシ胎児血清を含む１１７０μｌのＤＭＥＭを各ＥＰチューブに加えた。１番目のＥＰチューブに１３０μｌのウイルス溶液を加え、均一に混合し、１０－１とした。１番目のＥＰチューブから２番目のＥＰチューブに５０μｌをピペットで移し、均一に混合し、１０－２とした。以下同様に、所望の勾配に達するまで希釈した。
（３）各ウェルに対応する勾配のウイルス希釈液１００μｌを加え、勾配ごとに１０個のウェルでこの操作を繰り返し、３７℃で一晩培養した。
（４）５日後、９６ウェルプレートを顕微鏡でＧＦＰを観察し、各勾配でＧＦＰがあるウェル数を記録し、ウイルス力価を計算した。
（５）ウイルス力価ＴＣＩＤ５０の計算式は以下のとおりである。
Ｌｏｇ１０（ＴＣＩＤ５０）＝Ｌ＋ｄ（ｓ－０．５）＋ｌｏｇ１０（１／ｖ）
Ｌ＝Ｌｏｇ１０ 最高希釈度（最高希釈度が１０倍希釈であると、Ｌ＝１である）
Ｖ＝１ウェルあたりの細胞培養液の初期体積（ｍｌ／ｗｅｌｌ）
ｄ＝Ｌｏｇ１０ 希釈度（１０倍希釈であると、ｄ＝１である）
ｓ＝各勾配でのＧＦＰ比の合計
実施例３：ＡＤ５－ＡｐｏＡ１ウイルス機能の評価
（１）ＡｐｏＡ１の発現と分泌機能：
ＡＤ５ ＡｐｏＡ１ウイルスが腫瘍細胞に感染してから７２時間後に、細胞と上清を回収し、ドットブロットによりＡｐｏＡ１の発現と分泌機能を検出した。
（２）ウイルス複製能力：
ＡＤ５ ＡｐｏＡ１及びＡＤ５ ＣＯＮウイルスに同じＭＯＩで腫瘍細胞を感染させ、異なる時点で細胞を回収し、凍結融解と遠心分離を繰り返した後、等量のウイルス懸濁液を得、２９３Ｔ細胞を用いてウイルス力価測定を行い、ウイルス複製能力の変化を分析した。
（３）腫瘍溶解機能：
ＡＤ５ ＡｐｏＡ１及びＡＤ５ ＣＯＮウイルスにＭＯＩが１～１００のウイルスレベルで腫瘍細胞を感染させた。７２時間後にＭＴＴを用いて細胞活性を検出し、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１の腫瘍細胞毒性作用を評価した。
（１）ＡｐｏＡ１の発現と分泌機能：
ＡＤ５ ＡｐｏＡ１ウイルスが腫瘍細胞に感染してから７２時間後に、細胞と上清を回収し、ドットブロットによりＡｐｏＡ１の発現と分泌機能を検出した。
（２）ウイルス複製能力：
ＡＤ５ ＡｐｏＡ１及びＡＤ５ ＣＯＮウイルスに同じＭＯＩで腫瘍細胞を感染させ、異なる時点で細胞を回収し、凍結融解と遠心分離を繰り返した後、等量のウイルス懸濁液を得、２９３Ｔ細胞を用いてウイルス力価測定を行い、ウイルス複製能力の変化を分析した。
（３）腫瘍溶解機能：
ＡＤ５ ＡｐｏＡ１及びＡＤ５ ＣＯＮウイルスにＭＯＩが１～１００のウイルスレベルで腫瘍細胞を感染させた。７２時間後にＭＴＴを用いて細胞活性を検出し、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１の腫瘍細胞毒性作用を評価した。
実施例４：４Ｔ１－ＡｐｏＡ１安定発現株の構築
（１）レンチウイルストランスフェクション前の１８～２４時間に、付着細胞を１×１０５（細胞の大きさにより決定され、通常、トランスフェクション前に細胞が４０～６０％に成長することが好ましい）で２４ウェルプレートに広げた。レンチウイルストランスフェクション時の細胞数を２×１０５／ウェルとした。
（２）６μｇ／ｍｌのポリブレンを加え、同時にＣＭＶをプロモーターとするＡｐｏＡ１を加えてレンチウイルスを過剰発現した。４８ｈ培養し続けた。
（３）２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、細胞をスクリーニングした。ネガティブコントロールウェルの細胞が完全に死ぬまで毎日培地を交換した。
（１）レンチウイルストランスフェクション前の１８～２４時間に、付着細胞を１×１０５（細胞の大きさにより決定され、通常、トランスフェクション前に細胞が４０～６０％に成長することが好ましい）で２４ウェルプレートに広げた。レンチウイルストランスフェクション時の細胞数を２×１０５／ウェルとした。
（２）６μｇ／ｍｌのポリブレンを加え、同時にＣＭＶをプロモーターとするＡｐｏＡ１を加えてレンチウイルスを過剰発現した。４８ｈ培養し続けた。
（３）２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを加え、細胞をスクリーニングした。ネガティブコントロールウェルの細胞が完全に死ぬまで毎日培地を交換した。
実施例５：４Ｔ１クローンの形成及び浸潤実験
（１）細胞クローンの取得
１）細胞密度を１００細胞／３０マイクロリットルに調整した。
２）１０ｃｍ培養プレートの底部に滅菌ＰＢＳを適量加え、３０マイクロリットルの細胞懸濁液を蓋に滴下した。
３）２～３日間培養し、細胞球状化状態を顕微鏡で観察した。
４）細胞クローンが形成された後、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレートに細胞クローンを接種し、細胞クローンの形態をリアルタイムで監視した。
（２）Transwell実験
１）Matrixを３０倍希釈し、各チャンバーに４０マイクロリットル加え、使用するために凝固させた（前日にウェルプレートに広げた）。
２）細胞に対して消化と遠心分離を行い、無血清培地（又は２％血清）に交換してカウントした。
３）５～１０万細胞／２００マイクロリットルで各チャンバーに加え、下部チャンバーに７００マイクロリットルの完全培地を加えた。
４）約２４ｈに固定と染色を行い、綿球でマトリゲルを拭き取り、顕微鏡で写真を撮った。
（１）細胞クローンの取得
１）細胞密度を１００細胞／３０マイクロリットルに調整した。
２）１０ｃｍ培養プレートの底部に滅菌ＰＢＳを適量加え、３０マイクロリットルの細胞懸濁液を蓋に滴下した。
３）２～３日間培養し、細胞球状化状態を顕微鏡で観察した。
４）細胞クローンが形成された後、Ｉ型コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレートに細胞クローンを接種し、細胞クローンの形態をリアルタイムで監視した。
（２）Transwell実験
１）Matrixを３０倍希釈し、各チャンバーに４０マイクロリットル加え、使用するために凝固させた（前日にウェルプレートに広げた）。
２）細胞に対して消化と遠心分離を行い、無血清培地（又は２％血清）に交換してカウントした。
３）５～１０万細胞／２００マイクロリットルで各チャンバーに加え、下部チャンバーに７００マイクロリットルの完全培地を加えた。
４）約２４ｈに固定と染色を行い、綿球でマトリゲルを拭き取り、顕微鏡で写真を撮った。
実施例６：ＡＤ５ ＡｐｏＡ１の抗腫瘍効果及びメカニズムに対するインビボでの研究
６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、右腋窩又は皮下に皮下腫瘍モデルを確立し、４～６日後、腫瘍の大きさは２００ｍｍ３と測定された。マウスを未処理グループ、対照ＡＤ５ ＣＯＮウイルス治療グループ、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１ウイルス治療グループの３つのグループにランダムに分けた。グループ別に対応するウイルスを腫瘍内注射し、各マウスへのウイルス注射量が２．５×１０８ｐｆｕであり、腫瘍の体積及びマウスの体重を追跡して測定した。マウスが自然死した後、マウスの生存期間を記録した。
６～８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを選択し、右腋窩又は皮下に皮下腫瘍モデルを確立し、４～６日後、腫瘍の大きさは２００ｍｍ３と測定された。マウスを未処理グループ、対照ＡＤ５ ＣＯＮウイルス治療グループ、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１ウイルス治療グループの３つのグループにランダムに分けた。グループ別に対応するウイルスを腫瘍内注射し、各マウスへのウイルス注射量が２．５×１０８ｐｆｕであり、腫瘍の体積及びマウスの体重を追跡して測定した。マウスが自然死した後、マウスの生存期間を記録した。
実施例７：細胞全タンパク質の抽出及び濃度の測定
６ウェルプレートを例として、細胞培養上清を捨て、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨て、各ウェルに２００μｌのトリプシンを加え、細胞を消化してピペッティングし、細胞をＥＰチューブに回収し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
６ウェルプレートを例として、細胞培養上清を捨て、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨て、各ウェルに２００μｌのトリプシンを加え、細胞を消化してピペッティングし、細胞をＥＰチューブに回収し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
上清を捨て、ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
ＰＢＳを捨て、細胞数に応じて各ウェルに対応するプロテアーゼ阻害剤含有細胞溶解液を加え、３０ｓボルテックスをかけ、氷上に１０ｍｉｎ置き、操作を３回繰り返した。４℃、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離した。上清を別の清潔なＥＰチューブに回収した。
タンパク質濃度の測定：ＢＣＡタンパク質濃度測定キットの説明書に従って検出した。９６ウェルプレートに２μｌのタンパク質サンプルを取り、１８μｌのＰＢＳを加えてサンプルを希釈し、最後に２００μｌの測定用作業液（作業液は試薬Ａ：試薬Ｂ＝５０：１で構成される）を更に加え、６０℃のオーブンに入れ、３０ｍｉｎ後、マイクロプレートリーダーで５６２ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線に基づき、タンパク質サンプルの濃度を計算した。
各チューブにタンパク質溶解液の体積の１／４の５×loading bufferを加え、均一に混合した後、１００℃の金属浴に５ｍｉｎ入れ、冷却した後、使用するために－２０℃で保存した。
実施例８：ウェスタンブロッティング実験
ゲルの配合及び電気泳動：異なる要求に応じて、異なる濃度のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離ゲル及び濃縮ゲルを配合した。タンパク質定量の計算結果に応じて、各サンプルのローディング量を３０μｇに調整した。電気泳動条件：バンドが出ることなく分離されることを前提に、濃縮ゲルの場合に８０Ｖ、３０ｍｉｎであり、分離ゲルの場合に１２０Ｖ、約８０ｍｉｎであった。
転写：濾紙及びＰＶＤＦ膜を準備し、まずＰＶＤＦ膜をメタノールに浸漬し、次に、使用するために濾紙とともに転写バッファーに浸漬した。ガラス板からゲルを注意深く取り除き、転写バッファーに浸漬し、負極－濾紙－ＰＶＤＦ膜－ゲル－濾紙－正極というサンドイッチの順に配置し、気泡を除去し、必要なバンドの大きさに応じて、定電流１１０ｍＡで６０～７０ｍｉｎ転写した。
ブロッキング：転写が終了した後、すぐにＰＶＤＦ膜を取り出し、５％脱脂粉乳に入れ、室温で１ｈブロッキングした。
一次抗体のインキュベーション：一次抗体を４℃で一晩インキュベートした。
二次抗体のインキュベーション：バンドを洗浄緩衝液で１回に１０ｍｉｎ、合計３回洗浄した。次に、対応するＨＰＲ標識二次抗体を室温で１ｈインキュベートした。
露光：バンドを洗浄緩衝液で１回に１０ｍｉｎ、合計３回洗浄した。化学発光液を用いてＷＢ露光装置で露光し、バンド像を取得した。
ゲルの配合及び電気泳動：異なる要求に応じて、異なる濃度のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離ゲル及び濃縮ゲルを配合した。タンパク質定量の計算結果に応じて、各サンプルのローディング量を３０μｇに調整した。電気泳動条件：バンドが出ることなく分離されることを前提に、濃縮ゲルの場合に８０Ｖ、３０ｍｉｎであり、分離ゲルの場合に１２０Ｖ、約８０ｍｉｎであった。
転写：濾紙及びＰＶＤＦ膜を準備し、まずＰＶＤＦ膜をメタノールに浸漬し、次に、使用するために濾紙とともに転写バッファーに浸漬した。ガラス板からゲルを注意深く取り除き、転写バッファーに浸漬し、負極－濾紙－ＰＶＤＦ膜－ゲル－濾紙－正極というサンドイッチの順に配置し、気泡を除去し、必要なバンドの大きさに応じて、定電流１１０ｍＡで６０～７０ｍｉｎ転写した。
ブロッキング：転写が終了した後、すぐにＰＶＤＦ膜を取り出し、５％脱脂粉乳に入れ、室温で１ｈブロッキングした。
一次抗体のインキュベーション：一次抗体を４℃で一晩インキュベートした。
二次抗体のインキュベーション：バンドを洗浄緩衝液で１回に１０ｍｉｎ、合計３回洗浄した。次に、対応するＨＰＲ標識二次抗体を室温で１ｈインキュベートした。
露光：バンドを洗浄緩衝液で１回に１０ｍｉｎ、合計３回洗浄した。化学発光液を用いてＷＢ露光装置で露光し、バンド像を取得した。
実施例９：トリパンブルーを用いたカウント
６ウェルプレートを例として、細胞上清を捨て、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨て、各ウェルに２００μｌのトリプシンを加えて消化を行い、細胞を軽くピペッティングして清潔なＥＰチューブに回収し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。ＰＢＳを捨て、細胞数に応じて一定量のＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、そこから１０μｌの細胞再懸濁液を取り出し、１０μｌの０．２％トリパンブルー溶液を加えて混合し、細胞カウントプレートに２０μｌの混合液を取り、細胞カウンターでカウントした。
６ウェルプレートを例として、細胞上清を捨て、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳを捨て、各ウェルに２００μｌのトリプシンを加えて消化を行い、細胞を軽くピペッティングして清潔なＥＰチューブに回収し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上清を捨て、ＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、１５００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。ＰＢＳを捨て、細胞数に応じて一定量のＰＢＳを加えて細胞を再懸濁し、そこから１０μｌの細胞再懸濁液を取り出し、１０μｌの０．２％トリパンブルー溶液を加えて混合し、細胞カウントプレートに２０μｌの混合液を取り、細胞カウンターでカウントした。
実施例１０：リアルタイム定量的ＰＣＲ
リアルタイム定量的ＰＣＲの１０μｌ系は、２．６μｌのＰＣＲ用水、フォワードプライマー０．２μｌ、リバースプライマー０．２μｌ、テンプレート２μｌ及びSYBR Green蛍光染料５μｌで構成される。サンプルを混合した後、ABI 384 PCR装置で増幅した。
リアルタイム定量的ＰＣＲの１０μｌ系は、２．６μｌのＰＣＲ用水、フォワードプライマー０．２μｌ、リバースプライマー０．２μｌ、テンプレート２μｌ及びSYBR Green蛍光染料５μｌで構成される。サンプルを混合した後、ABI 384 PCR装置で増幅した。
結果及び結論
図１の結果から、複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１の構築に成功したことが示される。設計されたＡｐｏＡ１タンパク質は、それ自体のシグナルペプチドとヒスチジンタグを同時含む。実験によると、設計されたＡｐｏＡ１のシグナルペプチドがＡｐｏＡ１を細胞外に分泌できたことが証明される。
図１の結果から、複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１の構築に成功したことが示される。設計されたＡｐｏＡ１タンパク質は、それ自体のシグナルペプチドとヒスチジンタグを同時含む。実験によると、設計されたＡｐｏＡ１のシグナルペプチドがＡｐｏＡ１を細胞外に分泌できたことが証明される。
図２の結果から、構築された複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、対照ウイルスに比べて、ヒト肝臓癌細胞株ＨＣＣ－ＬＭ３、ＳＭＭＣ－７７２１、ヒト腎明細胞癌細胞株７８６－Ｏ、ヒト肝臓癌細胞株ＨｕＨ－７、ＨｅｐＧ２、ヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４、ヒト肺癌細胞株Ｈ１２９９において強い複製能力を示し、また、Ｈｕｈ－７とＴ２４において強い腫瘍溶解能力を示し、インビボ実験でも、同じ用量のウイルスを２日間注射した後、腫瘍内での複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１ウイルス量がＡＤ５ ｃｏｎよりも顕著に高くなったことが示されており、ＡｐｏＡ１の発現によりアデノウイルスの複製と腫瘍溶解を促進できたことが説明される。
図３の結果から、アポリポタンパク質ＡｐｏＡ１を高発現している乳癌細胞のスクラッチギャップが対照グループのスクラッチギャップよりも大きく、マトリゲルにおいて、ＡｐｏＡ１を発現している乳癌細胞の浸潤と移動の範囲及び距離が対照グループに比べて顕著に小さくなり、チャンバー浸潤実験では、ＡｐｏＡ１を発現している乳癌細胞が対照グループの膜透過性細胞に比べて顕著に少なくなったことが示されており、ＡｐｏＡ１タンパク質が乳癌細胞の移動及び浸潤を抑制できたことが説明される。
図４の結果から、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスを注射したマウスの４Ｔ１皮下腫瘍体積が対照ウイルス及びＰＢＳ処理グループの腫瘍体積よりも小さくなったことが示されており、マウスモデルにおいて、複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１が乳癌の成長を顕著に抑制したことが説明される。
図５の結果から、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスを注射したマウスの４Ｔ１上皮内乳癌の腫瘍体積が対照ウイルス及びＰＢＳ処理グループの腫瘍体積よりも小さくなり、腫瘍の腹腔への浸潤及び肺転移巣が顕著に減少し、マウスの生存率がより優れたことが示されており、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１が上皮内乳癌の浸潤、移動、及び遠隔転移を顕著に抑制し、乳癌マウスの生存期間を顕著に延長したことが説明される。
図６の結果から、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスを注射したマウス肺癌ＬＬＣの皮下腫瘍体積が対照ウイルス及びＰＢＳ処理グループの腫瘍体積よりも小さくなったことが示されており、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスがマウス体内でマウス肺癌の成長を顕著に抑制したことが説明される。
図７の結果から、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１を注射したマウス結腸癌Ｃ２６の皮下腫瘍体積が対照処理グループの腫瘍体積よりも小さくなり、Ｃ２６腫瘍による悪液質症状（急速な体重減少）に対して顕著な緩和作用があったことが示されており、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスがマウス体内でマウス結腸癌Ｃ２６の皮下腫瘍の成長を顕著に抑制し、悪液質の進行を顕著に遅らせたことが説明される。
図８の結果から、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスを注射したマウスのＨ２２肝臓癌の皮下腫瘍体積が対照ウイルス及びＰＢＳ処理グループの腫瘍体積よりも小さくなり、マウスの生存率が高くなったことが示されており、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスがマウス体内で肝臓癌の成長を顕著に抑制し、マウスの生存期間を延長したことが説明される。
図９の結果から、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１がヒト化肝臓癌マウスの生存期間を顕著に延長したことが示される。
図１０の結果から、ＡｐｏＡ１タンパク質が乳癌細胞４Ｔ１の浸潤と移動に関連する分子、特にケラチン１４（Ｋｒｔ１４）の発現を抑制できたことが示される。
図１１の結果から、複製アデノウイルスがＡｐｏＡ１特異的受容体分子Ａｂｃａ１の発現をアップレギュレートし、ＡｐｏＡ１のコレステロール輸送能力をさらに向上させることができたことが示される。
図１２の結果から、複製ＡＤ５ ＡｐｏＡ１が、マクロファージ及び腫瘍細胞の腫瘍促進性炎症経路ＳＴＡＴ３及びＮＦｋＢの活性化を顕著に抑制し、腫瘍促進性炎症因子ＩＬ－６、ＮＦｋＢ及びＩＬ－１βの産生を減少することができたことが示される。
図１３の結果から、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１アデノウイルスがインビトロで肝臓癌細胞株ＨＣＣ－ＬＭ３及びＳＭＭＣ－７７２１のインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）の発現を抑制し、免疫寛容を抑制し、抗腫瘍免疫を向上させることができたことが示される。
以上の結果から分かるように、本発明は、腫瘍の成長を抑制できるだけでなく、腫瘍の浸潤及び転移を遮断できる複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１を初めて提供する。このウイルスは、腫瘍細胞においてＡＤ５ ｃｏｎウイルスよりも強い複製及び腫瘍溶解能力を有するだけでなく、細胞外に分泌できるアポリポタンパク質ＡｐｏＡ１を高発現し、感染した腫瘍細胞におけるＡｐｏＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１の高発現をアップレギュレートでき、ＡＤ５ ＡｐｏＡ１のコレステロール輸送作用を大幅に向上させ、予想外の相乗効果を生じ、様々な抗腫瘍作用を発揮でき、悪性腫瘍細胞の浸潤及び移動を抑制し、腫瘍促進性炎症経路を遮断し、腫瘍の免疫逃避を媒介するキー酵素ＩＤＯ－１を抑制でき、生体の腫瘍に対する免疫監視を効果的に回復させることができる。そのほか、本発明の組換え複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５－ＡｐｏＡ１は、意外にも悪液質の進行に抵抗する作用を有し、結腸癌マウスの体重を効果的に維持し、生存期間を顕著に延長することができる。要するに、本発明の組換え複製腫瘍溶解性アデノウイルスＡＤ５ ＡｐｏＡ１は、腫瘍の浸潤及び転移を抑制し、悪性腫瘍悪液質の進行を遅らせ、感染した腫瘍細胞におけるＡｐｏＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１の高発現をアップレギュレートして抗腫瘍に相乗効果をもたらし、ＩＤＯ－１、腫瘍促進性炎症を抑制し、抗腫瘍免疫監視を回復させるという複数の抗腫瘍作用を同時に有する。一つのウイルスは、様々な独特の腫瘍治療作用とメカニズムを同時に統合し、相乗的に作用し、予想外の効果を有している。
以上に本発明の基本原理、主な特徴及び本発明の利点を説明したが、当業者は、本発明が上記実施例に限定されず、上記実施例及び明細書に説明されるのが本発明の原理にすぎず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改良を加えることもでき、本発明が保護を請求する範囲が、添付の特許請求の範囲、明細書、及びそれらの同等物により限定されると理解すべきである。
以上に本発明の基本原理、主な特徴及び本発明の利点を説明したが、当業者は、本発明が上記実施例に限定されず、上記実施例及び明細書に説明されるのが本発明の原理にすぎず、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改良を加えることもでき、本発明が保護を請求する範囲が、添付の特許請求の範囲、明細書、及びそれらの同等物により限定されると理解すべきである。
以下に、本願の出願時の特許請求の範囲を実施の態様として付記する。
［１］ 順次接続される外来遺伝子である第１のプロモーター、Ｅ１Ａ初期活性化複製エレメント、絶縁配列、第２のプロモーター、標的遺伝子配列、ＰＡ配列を含有又は挿入する、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、
前記標的遺伝子は腫瘍溶解性アデノウイルスのＥ１Ｂ領域に挿入されており、
前記標的遺伝子配列はＡｐｏＡ１遺伝子又はその縮重配列であり、
前記標的遺伝子配列の前端部にシグナルペプチド認識配列を有することを特徴とする複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
［２］ 以下の（１）～（３）のいずれか一つ又は複数の組み合わせを特徴とする［１］に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
（１）前記ＡｐｏＡ１標的遺伝子の核酸は配列番号１である。
（２）前記第１のプロモーターは構成的プロモーター、特異的プロモーター又は誘導的プロモーターのうちの一つであり、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。
（３）前記アデノウイルスはサブタイプＣである。
［３］ 構成的プロモーターはＣＭＶ、ＳＶ４０又はＥＦ１ａプロモーターを含むことを特徴とする［１］又は［２］に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
［４］ 前記構成的増強プロモーターはＣＭＶであり、その核酸配列は配列番号２であることを特徴とする［３］に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
［５］ ［１］～［４］のいずれか一つに記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［６］ 宿主細胞内で複製する能力を有する、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルスであって、当該複製腫瘍溶解性アデノウイルスは、宿主細胞内で可溶性ＡｐｏＡ１タンパク質を発現して分泌し、腫瘍の増殖、浸潤及び転移を抑制する効果を達成することができることを特徴とする［５］に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［７］ 前記可溶性ＡｐｏＡ１タンパク質のアミノ酸の配列は配列番号３であることを特徴とする［６］に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［８］ ［１］～［４］のいずれか一つに記載の組換え腫瘍溶解性アデノウイルスベクターにより２９３Ｔ細胞において組換えることにより得られることを特徴とする［５］～［７］に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［９］ ［１］～［４］のいずれか一つに記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び［５］～［７］のいずれか一つに記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスの、腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物の調製における使用。
［１０］ 前記治療は単一治療、補助治療又は併用治療であることを特徴とする［９］に記載の使用。
［１１］ 前記腫瘍は、肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、胆嚢癌、食道癌、腎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、甲状腺腫瘍、縦隔腫瘍又は神経膠腫であることを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１２］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、腫瘍の浸潤と転移に抵抗する薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１３］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、腫瘍促進性炎症経路及びＩＤＯ－１を抑制して抗腫瘍免疫監視を回復させる薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１４］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、悪性腫瘍悪液質の進行を遅らせる薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１５］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、感染された腫瘍細胞におけるＡｐｏＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１の発現をアップレギュレートする薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
以下に、本願の出願時の特許請求の範囲を実施の態様として付記する。
［１］ 順次接続される外来遺伝子である第１のプロモーター、Ｅ１Ａ初期活性化複製エレメント、絶縁配列、第２のプロモーター、標的遺伝子配列、ＰＡ配列を含有又は挿入する、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、
前記標的遺伝子は腫瘍溶解性アデノウイルスのＥ１Ｂ領域に挿入されており、
前記標的遺伝子配列はＡｐｏＡ１遺伝子又はその縮重配列であり、
前記標的遺伝子配列の前端部にシグナルペプチド認識配列を有することを特徴とする複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
［２］ 以下の（１）～（３）のいずれか一つ又は複数の組み合わせを特徴とする［１］に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
（１）前記ＡｐｏＡ１標的遺伝子の核酸は配列番号１である。
（２）前記第１のプロモーターは構成的プロモーター、特異的プロモーター又は誘導的プロモーターのうちの一つであり、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。
（３）前記アデノウイルスはサブタイプＣである。
［３］ 構成的プロモーターはＣＭＶ、ＳＶ４０又はＥＦ１ａプロモーターを含むことを特徴とする［１］又は［２］に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
［４］ 前記構成的増強プロモーターはＣＭＶであり、その核酸配列は配列番号２であることを特徴とする［３］に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
［５］ ［１］～［４］のいずれか一つに記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［６］ 宿主細胞内で複製する能力を有する、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルスであって、当該複製腫瘍溶解性アデノウイルスは、宿主細胞内で可溶性ＡｐｏＡ１タンパク質を発現して分泌し、腫瘍の増殖、浸潤及び転移を抑制する効果を達成することができることを特徴とする［５］に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［７］ 前記可溶性ＡｐｏＡ１タンパク質のアミノ酸の配列は配列番号３であることを特徴とする［６］に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［８］ ［１］～［４］のいずれか一つに記載の組換え腫瘍溶解性アデノウイルスベクターにより２９３Ｔ細胞において組換えることにより得られることを特徴とする［５］～［７］に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
［９］ ［１］～［４］のいずれか一つに記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び［５］～［７］のいずれか一つに記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスの、腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物の調製における使用。
［１０］ 前記治療は単一治療、補助治療又は併用治療であることを特徴とする［９］に記載の使用。
［１１］ 前記腫瘍は、肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、胆嚢癌、食道癌、腎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、甲状腺腫瘍、縦隔腫瘍又は神経膠腫であることを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１２］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、腫瘍の浸潤と転移に抵抗する薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１３］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、腫瘍促進性炎症経路及びＩＤＯ－１を抑制して抗腫瘍免疫監視を回復させる薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１４］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、悪性腫瘍悪液質の進行を遅らせる薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
［１５］ 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、感染された腫瘍細胞におけるＡｐｏＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１の発現をアップレギュレートする薬物の調製における使用を含むことを特徴とする［９］又は［１０］に記載の使用。
Claims (15)
- 順次接続される外来遺伝子である第１のプロモーター、Ｅ１Ａ初期活性化複製エレメント、絶縁配列、第２のプロモーター、標的遺伝子配列、ＰＡ配列を含有又は挿入する、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、
前記標的遺伝子は腫瘍溶解性アデノウイルスのＥ１Ｂ領域に挿入されており、
前記標的遺伝子配列はＡｐｏＡ１遺伝子又はその縮重配列であり、
前記標的遺伝子配列の前端部にシグナルペプチド認識配列を有することを特徴とする複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。 - 以下の（１）～（３）のいずれか一つ又は複数の組み合わせを特徴とする請求項１に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
（１）前記ＡｐｏＡ１標的遺伝子の核酸は配列番号１である。
（２）前記第１のプロモーターは構成的プロモーター、特異的プロモーター又は誘導的プロモーターのうちの一つであり、第２のプロモーターは構成的プロモーターである。
（３）前記アデノウイルスはサブタイプＣである。 - 構成的プロモーターはＣＭＶ、ＳＶ４０又はＥＦ１ａプロモーターを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
- 前記構成的増強プロモーターはＣＭＶであり、その核酸配列は配列番号２であることを特徴とする請求項３に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを含む、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 宿主細胞内で複製する能力を有する、脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルスであって、当該複製腫瘍溶解性アデノウイルスは、宿主細胞内で可溶性ＡｐｏＡ１タンパク質を発現して分泌し、腫瘍の増殖、浸潤及び転移を抑制する効果を達成することができることを特徴とする請求項５に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 前記可溶性ＡｐｏＡ１タンパク質のアミノ酸の配列は配列番号３であることを特徴とする請求項６に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え腫瘍溶解性アデノウイルスベクターにより２９３Ｔ細胞において組換えることにより得られることを特徴とする請求項５～７に記載の脂質代謝を調節する複製腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 請求項１～４のいずれか一項に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び請求項５～７のいずれか一項に記載の複製腫瘍溶解性アデノウイルスの、腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物の調製における使用。
- 前記治療は単一治療、補助治療又は併用治療であることを特徴とする請求項９に記載の使用。
- 前記腫瘍は、肝臓癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、リンパ腫、胆嚢癌、食道癌、腎癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、甲状腺腫瘍、縦隔腫瘍又は神経膠腫であることを特徴とする請求項９又は１０に記載の使用。
- 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、腫瘍の浸潤と転移に抵抗する薬物の調製における使用を含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の使用。
- 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、腫瘍促進性炎症経路及びＩＤＯ－１を抑制して抗腫瘍免疫監視を回復させる薬物の調製における使用を含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の使用。
- 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、悪性腫瘍悪液質の進行を遅らせる薬物の調製における使用を含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の使用。
- 前記腫瘍の予防及び／又は治療のための薬物における使用は、感染された腫瘍細胞におけるＡｐｏＡ１特異的受容体ＡＢＣＡ１の発現をアップレギュレートする薬物の調製における使用を含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の使用。
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