JP2020517272A - 癌の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)原核宿主内に存続するように構成された第1のベクターであって、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクターと、
(ii)一本鎖DNAのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む第2のベクターと、を含み、原核宿主からの組換えファージミド粒子の形成および押し出しをもたらす、システムを提供する。
(i)原核宿主内に存続するように構成された第1のベクターであって、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
(ii)バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを宿主に導入することと、
(iii)一本鎖DNAが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
(i)(a)原核宿主内に存続するように構成された第1のベクターであって、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクター、ならびに(b)一本鎖DNAのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む、第2のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
(ii)一本鎖DNAが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
(i)原核宿主内に存続するように構成された第1のベクターであって、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、または1つ以上の養子移入されたT細胞である1つ以上の抗原、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクターと、
(ii)一本鎖DNAのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む第2のベクターと、を含み、原核宿主からの組換えファージミド粒子の形成および押し出しをもたらす、システムを提供する。
(i)原核宿主内に存続するように構成された第1のベクターであって、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、または1つ以上の養子移入されたT細胞によって認識される1つ以上の抗原、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
(ii)バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを宿主に導入することと、
(iii)一本鎖DNAが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
(i)原核宿主内に存続するように構成された第1のベクターであって、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、または1つ以上の養子移入されたT細胞によって認識される1つ以上の抗原、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクター、ならびに(b)一本鎖DNAをパッケージングするのに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む第2のベクターを、原核宿主細胞に導入することと、
(ii)一本鎖DNAが構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で宿主を培養して、原核宿主から組換えファージミド粒子を形成および押し出すことと、を含む、方法を提供する。
遺伝子送達技術の開発は、基礎研究の社会への成功を収める転換に有益である。過去10年間に、多数のウイルスおよび非ウイルスベクターが、産業および治療用途の潜在的な送達ベクターとして出現した。ベクターの重要な特性は、遺伝子を送達するのに有効であることに加えて、容易に産生され、商業的に実行可能でなければならないということである。2006年に、Hajitouらは、アデノ随伴ウイルス/ファージ(AAVP)と呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)と線状バクテリオファージ(ファージ)との間のハイブリッドを作成することによってそのようなベクターの必要性を満たすことを試みた(Nature protocols 2,523−531(2007);Cell 125,385−398(2006))。得られるAAVPベクターは、哺乳動物および原核生物ウイルスの好ましい特性を有するが、それらの個々のベクターが通常保有する欠点を受けない。しかしながら、有意な改善の余地をまだ残しているAAVPベクターの特定の局面が存在する。とりわけ、これには、その生産および治療特性に影響を及ぼすベクターの遺伝子設計が含まれる。最終的に、これは、哺乳動物ウイルスと比較した場合、AAVPの比較的低い遺伝子導入効率をもたらす。
1.ハイブリッドファージミド−AAVベクター(PAAV)粒子発現システムを設計および構築し、
2.ファージミド/AAVベクター(PAAV)が、以下を含むがこれに限定されない様々な段階で、既知のAAVPシステムよりも遺伝子導入においてより効率的であるかどうかを特徴付け、決定し、
a.細胞表面への結合、
b.細胞表面からのベクターの内部化、
c.組換え導入遺伝子の発現。
図2を参照すると、本発明のヘルパーファージゲノムおよびファージミドゲノム(PAAV DNA)の実施形態が示されており、これらは図1にも示されているように、原核生物における発現に際して共に一緒にしてファージミド−AAV(PAAV)粒子を産生する。構造遺伝子は、ウイルス粒子へのDNAのパッケージングに不可欠であり、以下に詳細に論じられる複製欠損ヘルパーファージによって供給される。ファージミドゲノムは、ヘルパーファージに対して極めて寄生的であり、複製およびパッケージングの両方において、それが複製欠損ヘルパーファージを打ち負かすことを意味する。
ここで図3を参照すると、2つの複製起点および2つの他の遺伝子要素を含むプラスミドであるファージミドゲノムの一実施形態が示されている。ファージミドゲノムは、原核(例えば、細菌)宿主内でのその複製およびヘルパーウイルスによってレスキューされたときのファージミド粒子へのパッケージングの両方を促進するために、2つの複製起点を必要とする。
図7を参照すると、ヘルパーファージ(本明細書においてM13KO7と呼ぶ)は、図3に示すファージミドゲノムを保有および/または含有する原核宿主からファージミド粒子(すなわちPAAV)をレスキューするために特別に設計されたバクテリオファージである。へルパーファージは、破壊された複製起点(p15a、中程度のコピー数)および、ファージ粒子にそれ自身のパッケージングする能力を著しく低下させるパッケージングシグナルを含む。その結果、ファージミドゲノムは、複製およびパッケージングの両方において、ヘルパーファージを打ち負かすであろう。
本発明者らは、ファージミド−AAVベクター(PAAV)粒子を産生するための2つの異なる方法(方法1および2)を発明し、これらを図9および10に示す。
−TG1:繁殖因子(F’線毛)を保有するE.coli株。
−2×YT:TG1 E.coliを培養するために使用される液体ブロス。
−カナマイシン:ヘルパーファージ上に存在する抗生物質耐性選択マーカー。
−アンピシリン:ファージミドベクター上に存在する抗生物質耐性選択マーカー。
−TYEトップアガー:TG1 E.coliを培養するために使用される固体培地で、1.25%細菌用寒天の添加により2xTYから適合させた。
図9を参照すると、
1.1%のグルコースを補充した2×YT(100μg/mLのアンピシリン)60mlに4〜5mlの前培養(一晩)のPAAVゲノムを保有するTG1 E.coliを加える。
2.シェーカー(250 RPM)中に37°で培養物をインキュベートする。
3.OD600が0.5〜0.8(対数期)の範囲になってすぐに、少なくとも1×1010のヘルパーファージ(M13KO7)の形質導入単位を培養物に加える。
4.混合のため反転させる。37°で30分間インキュベートする。
5.ステップ3からの感染したスターター培養物を、1%のグルコースを補充した2×YT(100μg/mLのアンピシリン+25μg/mLのカナマイシン)を含む2Lのフラスコに最終容量400〜450mLまで注ぐ。
6.オービタルシェーカーで37°、250rpmで16〜20時間一晩インキュベートする。
7.培養上清からファージミド(PAAV)粒子を精製する。
図10を参照すると、
パート1:コンピテントプロデューサー細胞株の産生
1.ヘルパーヘッジM13KO7由来のssDNAゲノムでTG1コンピテントE.coli(Zymo Research、USA)を形質転換し、TYEトップアガー(50μg/mLのカナマイシン)に蒔き、
1.個々のコロニーを選択し、1%のグルコースを補充した5mL 2×YT培地(50μg/mLのカナマイシン)に接種する。
2.オービタルシェーカーで37°、250rpmで16〜20時間一晩インキュベートする。
3.市販の抽出キット(QIAGEN、オランダ)を使用して5mLの一晩培養物からDNAを抽出し、DNAラダーに対して1%アガロースゲル(100ボルト、2.5mA)で泳動させることにより、真の陽性形質転換体を確認する。
4.公表されたプロトコル(Krantz et al.,UC Berkeleyにより出版されたものに適合)を使用して、ステップ4で同定された正確な形質転換体から化学的にコンピテントな細胞を調製する。
1.パート1で作成したコンピテント細胞株をファージミド/AAVゲノムで形質転換し、TYEトップアガー(100μg/mLのアンピシリン+50μg/mLのカナマイシン)に蒔く。
2.コロニーを選択し、1%のグルコースを補充した5mL 2×YT(100μg/mLのアンピシリン+50μg/mLのカナマイシン)に接種する。
3.オービタルシェーカーで37°、250rpmで4時間インキュベートする。
4.ステップ3の感染したスターター培養物を、1%のグルコースを補充した2×YT(100μg/mLアンピシリン+25μg/mLカナマイシン)を含む2Lのフラスコに、400〜450mLの最終容量まで注ぐ。
5.オービタルシェーカーで37°、250rpmで16〜20時間一晩インキュベートする。
6.培養上清からファージミド粒子を精製する。
1.温かい一夜培養物を遠心分離ボトルに移し、3300G、4°で30分間遠心分離することによって細菌をペレット化する。
2.ペレットを捨て、上清を清潔な遠心分離ボトルに移す。
3.各ボトルに上清の30%容量を氷冷20%PEG−8000/2.5M NaClと共に加え、混合のため渦状撹拌する。
4.氷上で4〜24時間インキュベートする
5.10000G、4°で30分間の遠心分離によってファージミド粒子を沈殿させる。上清を捨てる。
6.ファージミド粒子ペレットを10000G、4°で1分間遠心分離して乾燥させる。
7.PEG/NaClで残りの上清を除去する
8.ファージミド粒子ペレットを0.5〜2mLのPBSに再懸濁する
9.再懸濁したファージミド粒子調製物を0.45ミクロンのフィルターを使用してろ過する。
10.調製物を4°に保つ。この調製物は4°で2年まで安定である。25%のグリセロールストックは無期限に−80°で保存することができる。
実施例1および2は、ファージミド−AAVベクター(PAAV)粒子および2つの産生方法を産生するために必要とされる本発明の構成要素(すなわち、図3に示すファージミドゲノムおよび図7に示すヘルパーファージ)を記載する。一旦産生され、精製されると、PAAV粒子は、遺伝子治療などの使用範囲を有することができる。
遺伝子治療に加えて、本明細書に記載されるPAAV粒子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)を産生するための新規な方法に使用することができる。ファージ誘導AAV産生は、大量のdsDNAをパッケージングするファージミド粒子の能力を利用する。典型的なAAV産生システムは、組換えAAV粒子の産生に一緒に機能するrAAV、rep−cap、およびアデノヘルパー遺伝子の3つの主要な要素からなる。本発明者らは、2つの異なる戦略を考案した。
DMEM:ダルベッコの改良イーグル培地。
FBS:胎児ウシ血清、成長補助剤。
完全培地:DMEM+10%FBS。
EDTA:エチル−ジアミン四酢酸、タイトジャンクション形成に必要なカルシウムイオンを隔離することによって細胞を解離するために使用されるイオンキレーター。
GlutaMax:成長補助剤、L−グルタミンの類似体。
1.15cm組織培養プレート中の完全培地(10%のFBS、20mM GlutaMax、ペニシリン/ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸を補充したDMEM)に、HEK293細胞を播種し、80%コンフルエンスに到達するまで、最低48時間、増殖させる。
2.ファージミド/AAV、rep−capファージミド、およびアデノヘルパーファージミドを混合して全容量5mL未満で1:1:1の形質導入単位比を達成するか、または、1細胞あたり百万個の形質導入単位を達成するために統合されたベクター(単一粒子中に3つの要素をすべて含む単一ベクター)を分取する。
3.ステップ3で作製した形質導入混合物に、等容量の無血清DMEM(20mMのGlutaMaxで補充)を添加する。
4.混合のため反転させる。室温で15分間インキュベートする。
5.ステップ1で蒔いたHEK293細胞をPBSで洗浄し、3回繰り返す。
6.形質導入混合物を加え、穏やかに渦状撹拌して混合物を均一に分散させる。
7.細胞培養インキュベーター中、37°、5%のCO2で72時間インキュベートする:
a.形質導入混合物との6時間のインキュベーションの後、等容量の完全培地(10%のFBS、20mMのGlutaMax、ペニシリン/ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸を補充したDMEM)を補充する、
b.24時間後、培地を完全培地(10%のFBS、20mMのGlutaMax、ペニシリン/ストレプトマイシン、および非必須アミノ酸を補充したDMEM)と交換する。
1.0.5MのEDTA溶液を組織培養プレート中の培地に0.010Mの最終濃度まで添加し、室温で5分間インキュベートする。
2.細胞および培地を吸引し、粉砕し、50mLの遠心分離管に移す。
3.1500RPM、5分間、室温で遠心分離することにより細胞をペレット化する:
a.オプション:さらなるAAV精製のために上清を回収する。
4.2〜5mLの無血清DMEMに細胞ペレットを再懸濁する。
5.エタノール−ドライアイスバスおよび37°に設定された水浴中で4回の凍結−解凍サイクルを行うことによって、懸濁液中の細胞を溶解する。
6.室温で10分間、10000Gで細胞溶解物を遠心分離する:
a.定量化/さらなる精製/濃縮のために上清を分取する。
図16を参照すると、本発明者らは、PAAVを使用したAAV粒子のインサイチュ生産のための方法を考案した。
透過型電子顕微鏡法
粒子を特徴付ける際に、本発明者らは、ファージミドベースのベクターシステムを使用する場合、ベクターサイズが実質的に減少することを示すためにPAAV粒子を画像化した。透過型電子顕微鏡法を使用して、本発明者らは、ウラニルアセテートでネガティブ染色した後、メッシュ銅TEMグリッド上の本発明のPAAVおよび既知のAAVP粒子の長さを画像化し、測定した(図17参照)。平均AAVP粒子は長さが1455.02nmであり(図17A)、本発明による典型的なPAAV粒子は長さがわずか729.96nmであり(図17B)、これは粒子サイズの約50%の減少に相当することが分かった。PAAV粒子(典型的には1186.03nm、図17B)を産生するために使用されるヘルパーファージと比較して、相対ベクターサイズはヘルパーウイルスよりも約38%短い。
結合後、ベクターは標的細胞による受容体介在性エンドサイトーシスを受ける。ベクター内在化の潜在的な差異を調べるために、本発明者らは、フローサイトメトリー(図18参照)を使用して、2つの時点(2時間、2H、4時間、4H)における標的細胞の内在化ベクターの数をアッセイした。両方の細胞株でAAVPと比較した場合、PAAVベクターは2時間でより効果的に内在化され(中央値蛍光強度(MFI)=1031.7、AAVPよりも335高い、p<0.05)、そして4時間で全体的な程度がより大きく内在化することが見出された。PAAVの2時間でのMFIは、AAVPより293AAVで335およびU87細胞で207(p<0.05)有意に高かった。形質導入の4時間後、この差は293AAV(829MFI、p<0.05)では有意に大きかったが、U87(157MFI、有意ではない)ではそれほど少なかった。全体として、MFIはPAAV1処理細胞について2092(293AAV、p<0.05、図18A)および1137(U87、図18B)でピークに到達し、AAVPよりも有意に高く、それぞれ1063(293AAV)および980(U87)でピークに到達した。このデータは、PAAVが両方の細胞株における両方の時点について内在化の速度および程度においてAAVPより一貫して良好に実施されたことを実証する。
ベクター内在化の差異が遺伝子発現の増加につながるかどうかを調べるために、本発明者らは、RGDおよびNT PAAV.GFPおよびAAVP.GFPベクターを使用してGFP発現アッセイを行った(図19参照)。この実験において、それらをまた、WO2014/184529に記載されているように、カチオン性ポリマーDEAE.DEXTRAN(Dex)の添加がPAAVベクターのバイオアベイラビリティーおよびエンドソームエスケープを増加させることにより遺伝子導入を増強できるかどうかを試験した。形質導入の9日後、細胞をトリプシン処理し、計数し、フローサイトメーターを使用して分析した。ベクター形質導入を補助するためにDexを使用したかどうかに関わらず、導入遺伝子の発現は一般にU87よりも293AAV細胞で高かった。ベクターのみを使用する場合、標的RGD.PAAV.GFPベクターは、AAVPと比較して、より高い有効性(それぞれ293AAVおよびU87細胞におけるGFP+ve細胞で7.7%、p<0.01および1.4%、p<0.05)で標的細胞に形質導入し、これは293AAVおよびU87細胞でそれぞれ2.44倍および1.56倍の増加となる(図19A、C)。
本発明者らは、PAAVおよびファージミド由来のベクターが市販のプロデューサー細胞株においてrAAVを産生するために使用することができるかどうかを評価するために、通常、遺伝子導入のためのトランスフェクションを必要とする3つの標的ベクターで293AAV細胞を形質導入した。彼らは、細胞溶解物からrAAV粒子を採取し、ファージミド誘導形質導入後の3つの時点(図20A)にわたってmL当たりrAAV遺伝子コピー数(GC)を定量化することができた。FuGene6(トランスフェクション試薬、3.99e11 GC/mL、図20B)による従来のトランスフェクションと比較すると、ファージミド誘導rAAV産生は、rAAV収量において168時間(7.69e11 GC/mL、図21A)で1.9倍以上の増加をもたらす。ファージミド誘導遺伝子導入は、(トランスフェクションとは異なり)広範囲の細胞内プロセシングを必要とするため、ウイルス遺伝子を発現させて機能性粒子にパッケージングするのにより長い時間を必要とする。しかしながら、同じ72時間の時点で収率を比較すると、トランスフェクションはファージ誘導rAAV産生より1.76e11 GC/mL高い値を示した。すべての時点でのトランスフェクションまたはファージミド誘導産生皿からの1mLの培養上清あたりのrAAV収率は、観察可能な傾向はなくおよそ8〜9e10 GC/mLであった(データは示さず)。
トリペプチドRGDは、フィブロネクチンを含む細胞外マトリックスのタンパク質に見出される。インテグリンは、αVβ3インテグリンへの細胞接着部位においてフィブロネクチンに位置するRGDモチーフに結合することによりフィブロネクチンの受容体として働き、組換えファージミド粒子のpIIIマイナーコートタンパク質に9アミノ酸変異を順に誘導したその特異性をαVβ3およびαVβ5インテグリンを発現する腫瘍細胞および血管新生腫瘍関連内皮細胞に付与する。したがって、第2のベクターのゲノムは、RGD4C標的ペプチド(CDCRGDCFC−配列番号7)を含む。
プロトコル:
HEK細胞を、完全培地(DMEM、10%のFCS、1%のグルタミン、1%のペニシリン/ストレプトマイシン)中48ウェルプレートに蒔き、70〜80%のコンフルエンスに到達するまで少なくとも48時間インキュベートした。次に、細胞をPBSで洗浄し、無血清培地(DMEM)に懸濁したハイブリッドファージ/ファージミドベクターで12時間形質導入した後、培地に完全培地を補充した。ルシフェラーゼ発現は、調製したQuanti−luc(InvivoGen、USA)試薬50μLに10μLの培地を加えることによって測定した。ルミノメーター(promega、USA)を備えたプレートリーダーを使用して光の放出を測定した。
プロトコル:
293AAV細胞を、完全培地(DMEM+10%のFCS、1%のグルタミン、1%のペニシリン/ストレプトマイシン)中24ウェルプレートに蒔き、最低48時間、70〜90%のコンフルエンスに到達させた。細胞を500uLのPBSで2回洗浄し、氷上に置いた後、200uLの無血清DMEMに懸濁した200000 TU/細胞(形質導入単位/細胞)のPAAVベクターで形質導入した。氷上で1時間インキュベートした後、培地をウェルから回収し、ファージミド粒子の量をTG1 E.coliで滴定し、コロニー計数によって定量化した。
現在、癌の従来の治療法は、手術、化学療法、および放射線療法の3つのうち1つ以上のオプションからなる。これらの介入によって病気が治癒することもあるが、多くの場合、癌細胞は完全に排除されないため、再発率は高くなる。さらに悪いことに、化学療法および放射線療法は不快な副作用が伴う。その結果、癌治療の代替アプローチの開発に大きな関心が寄せられている。これらの新しい治療法の最も有望なものの1つは、癌細胞を排除するために患者自身の免疫システムの力および特異性を利用することを目的とする癌免疫療法である。癌免疫療法は発展途上の治療法である。2つの主な戦略には、腫瘍関連抗原(TAA)を標的とする能動免疫療法、および既存の抗腫瘍応答を強化する受動免疫療法が含まれる。
各PAAV−CMV−CD28−IL4、PAAV−CMV−GPI−IL4、およびPAAV−CMV−PSMA(図32f)が、PAAV−CMV−GFPプラスミド(図3)を、pUC57−CD28−IL4プラスミド、pUC57−GPI−IL4またはpUC57−PSMAプラスミドのいずれかと組み合わせることによって構築され、PAAV−Grp78−GFPプラスミドを、pUC57−CD28−IL4プラスミド、pUC57−GPI−IL4またはpUC57−PSMAプラスミドのいずれかと組み合わせて、PAAV−Grp78−CD28−IL4、PAAV−Grp78−GPI−IL4、およびPAAV−Grp78−PSMAを構築した。
10%のウシ胎児血清(FBS)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、L−グルタミン(2mM、シグマ)、ペニシリン(100単位/ml、シグマ)、およびストレプトマイシン(100mg/ml、シグマ)からなる完全培地中に各ベクター(1,000,000TU/細胞)により、12ウェルプレートに約60%コンフルエントなHEK 293細胞を24時間インキュベートした。未処理の細胞を陰性対照として使用した。翌日、すべてのベクターを培養物から除去し、細胞を完全培地の単層として5%のCO2の37℃の加湿インキュベーターで維持した。培地は2日ごとに更新した。
HEK 293細胞は、106TU/細胞のRGD標的化PAAV(RGD)または非標的化PAAV(NT)のいずれかによって形質導入された。図33は得られたデータを示す。未処理のHEK 293細胞(Ctrl)、および488個のみの二次抗体染色(Ant.488)を有する標的化PAAV形質導入−HEK 293細胞を対照として示した。(A)CMVプロモーター駆動PAAVベクターによって形質導入されたHEK 293細胞のMUC−1またはPSMA発現を表す。DEAE−デキストランを添加した。(B)DEAEデキストランが添加されていないCMVプロモーター駆動PAAVベクターによって形質導入されたHEK 293細胞のMUC−1またはPSMA発現を表す。(C)DEAEデキストランが添加されていないGrp78プロモーター駆動PAAVベクターによって形質導入されたHEK 293細胞のMUC−1発現を表す。
細胞表面にMUC−1.CD28、MUC−1.GPI、またはPSMA抗原を発現する安定した細胞株を選択するために、ピューロマイシン耐性配列をPAAV−CMV−CD28−IL4、PAAV−CMV−GPI−IL4、PAAV−CMV−PSMA、PAAV−Grp78−CD28−IL4、PAAV−Grp78−GPI−IL4、およびPAAV−Grp78−PSMAプラスミドに挿入した。
MUC1またはPSMA導入遺伝子のいずれかをコードするPAAVベクターは、ヘルパーファージシステムを使用して産生された。これらの導入遺伝子産物は、PAAVによって形質導入された後、腫瘍細胞表面にディスプレイされる。MUC1およびPSMA抗原は、MUC1−CAR T細胞およびPSMA−CAR T細胞によって特異的に認識される。
標的PAAVベクターは、商業的および疾患細胞株の両方における遺伝子導入において、AAVPベクターよりも効率的であることを示唆する強力な証拠がある。内在化および遺伝子発現の両方のデータは、PAAVがAAVPよりも効率的であることを一致して示している。また、遺伝子導入において、それについてのAAVPを上回るDexとPAAVベクターとの間に強い相乗効果があることを示唆する証拠も提供されている。これらのデータは、PAAVがAAVPよりも優れていることを示唆しているが、PAAVベクターサンプルがヘルパーファージ汚染を含むとも考えなければならない。ベクター産生中の実験条件を最適化する努力にもかかわらず、ヘルパーファージの混入は(この場合、約1/10)避けられず、その小さなコートタンパク質上にRGDターゲティング配列をもディスプレイするので、形質導入を競合的に阻害する。これを考慮すると、内在化と遺伝子発現データは、RGD.PAAVの「真の」効能を非常に過小評価している可能性がある。さらに、内在化アッセイはシグナル検出のための細胞内ファージカプシドの染色を利用するため、PAAVの全体的なサイズ(および粒子当たりの利用可能なカプシドタンパク質)が小さいことは、内在化粒子の比例数が、TEMを用いてPAAV粒子と比較して2倍の長さであることを示しているAAVPの比例数と直接比較できないことを意味する。したがって、本発明の方法は、ヘルパーファージを除去するための精製工程(例えばFPLC)を含む。
哺乳動物細胞への遺伝子導入において非常に効率的なハイブリッドファージミドベクターが記載されている。これらのファージミド/AAV(PAAV)ベクターは非常に大きなクローニング能力を有し、哺乳動物細胞を標的としており、トランスフェクション試薬は必要でないことを意味する。このプラットフォームにより、治療用遺伝子治療に好適なベクターを産生することができる。このプラットフォームが養子T細胞移入治療またはCAR T細胞治療による標的化に好適な抗原を含む遺伝子を腫瘍細胞に送達することができるという証拠が提供されている。
1.標的化の特異性および遺伝子導入の有効性は、pVIIIコートタンパク質上のRGD−4Cリガンドまたは組換えpVIIIコートタンパク質上のH5Wペプチドをディスプレイすることによって強化することができる。
2.TRAILは、インビトロ実験およびインビボ同所性DIPG動物モデルでDIPG細胞死を特異的に誘発する効果的な治療遺伝子である。
1.所望の遺伝子の最適な発現によりDIPG細胞を特異的に標的化するためのウイルスベクターを設計および産生する。
3.TRAIL発現をインビボでDIPGに標的化する特異性を評価し、同所性ヒトDIPGが確立された免疫不全マウスにベクターを静脈内投与した後の治療効果を調査する。
細胞培養
HEK293T細胞株を、10%のウシ胎児血清(FBS)ならびに1%のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で維持した。DIPG腫瘍細胞株は、サンジョアンドドゥバルセロナ病院から入手した。それらを、10%のFBSを補充した腫瘍幹培地(TSM)ベースで維持した。TSMは、提供されているレシピに従って作製されている(表XXX)。
DIPG細胞を24ウェルプレートのポリ−D−リジン被覆カバースリップに播種し、60〜70%コンフルエントになるまで成長させた。5つのウェル:対照、二次抗体のみ、αv、β3、およびβ5インテグリンを使用して染色した。細胞を洗浄し、4%のホルムアルデヒドで室温(RT)で10分間固定した。細胞をPBSで3回洗浄し、50mMの塩化アンモニウムで5分間インキュベートした。細胞を再びPBSで3回洗浄し、2%のウシ血清アルバム(BSA−PBS)で30分間ブロックした。その後、細胞を1%のBSA−PBSで希釈した一次抗体抗αv(1:100)、抗β3(1:50)、および抗β5インテグリン(1:100)と共に1日間インキュベートし、4℃の湿室に保存した。その後、細胞を1%のBSA−PBSで3回洗浄し、二次Alex Fluor 488結合抗体(1:750)および4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI、1:2000)で1時間インキュベートした。カバーガラスを1%のBSA−PBSで3回、PBSで3回、および滅菌水で1回洗浄した。風乾後、カバースリップをMowiol封入剤に封入した。細胞を観察し、蛍光顕微鏡で画像を撮影した。
野生型M13ファージDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってpVIIIコートタンパク質上でRGD−4Cを発現するように改変した。PCRで使用されるプライマーは、このプロジェクトの開始前に同僚(Sajee Waramit)によって設計された。T4 DNAリガーゼ(NEB)を使用してPCR産物を連結し、クローニングのためにDH5α細菌に形質転換した。プラスミドは、Miniprep(QIAGEN)によって抽出され、制限消化およびゲル電気泳動によって検証され、次に、DNA配列(MRC CSC Genomics Core)の完全性を確保するためにシーケンスに送られる。次に、選択されるクローンをTG1コンピテントE.coli(Zymo research)に形質転換し、37°Cのインキュベーターで50μg/mlのカナマイシンを含む2×YT(Sigma)寒天に蒔いた。
DIPG細胞の形質導入の効率を評価するために、レポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質(GFP)およびlucia(InvivoGen)を含むファージミドを含むベクターを構築した。GFP発現は蛍光顕微鏡で検出することができるが、luciaは分泌型ルシフェラーゼであり、これは相対ルシフェラーゼユニット(RLU)を測定することによって、その基質Quanti−Lucで定量化することができる。以下のプロトコルでは、PAAV−GFPプラスミドまたはPAAV−luciaプラスミドを使用する。
H5W RGD pIIIヘルパーファージは、このプロジェクトの開始前に同僚(Sajee Waramit)によって産生された。産生は、H5W RGD pIIIベクターを選択するために1mMのイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)も添加されたことを除いて、前述のプロトコルとほぼ同様であった。以前の調査に従って、ベクターの精製と滴定を実施した。
形質導入に使用される細胞(HEK293TまたはDIPG)は、60〜70%コンフルエントになるまでプレートに播種された。その後、培地を除去し、細胞をOptiMEMで希釈したベクターと一晩インキュベートし、ベクターの量は、滴定から得られたウイルス力価に基づいている。次に、形質導入培地を除去し、完全な培地と交換する。GFPで形質導入された細胞については、指定された時点で蛍光下で細胞を観察し、GFPを発現する細胞を探すために画像を撮影する。luciaで形質導入された細胞については、指定された時点で、10μlの細胞培地および25μlのluciaの基質であるQuanti−Luc(InvivoGen)を、白いポリスチレン96ウェルプレートで混合し、次に、室温で5分間インキュベートした。Promega Glomaxマイクロプレートリーダーを使用して、ルシフェラーゼ発現を定量化した。
トランスフェクション用のPAAV−ヒトTRAIL(hTRAIL)プラスミドの産生(図46)
PAAV−GFPプラスミドのGFP配列を、PCRによってhTRAIL遺伝子配列に置き換えた。特定のプライマーを使用して、pUNO1−hTRAIL(InvivoGen)をクローニングすることによって、hTRAIL遺伝子を増幅し、末端にEcoRIおよびSalIの制限部位を含むように設計した(表1)。以前の調査に従って、分子クローニング、プラスミド抽出、およびDNA配列の検証を実施した。選択されるクローンを増幅のためにTG1細菌に形質転換し、次に、Maxiprep(QIAGEN)で抽出した。
DIPG細胞を48ウェルプレートに60〜70%コンフルエントになるまで播種した。実験を開始する前に、細胞をOptiMEM低血清培地で1〜2時間インキュベートした。48ウェルプレートについては、FuGENE HDトランスフェクションプロトコル(Promega)は、0.5〜2.0mlの培地容量、0.6〜1.8μlのFuGENE容量、0.2〜0.6μgのDNA量を目指すことを推奨する。トランスフェクション効率は、FuGENEとDNAとの比率に依存し、この場合、3:1の比率が使用される。
DIPG細胞は、RGD−4Cリガンド結合のためにインテグリン受容体を発現する
標的遺伝子送達のためのこの細胞株におけるこのベクターモデルの適合性を確立するために、蛍光顕微鏡の手段によって、インテグリンαvβ3およびαvβ5の発現について、最初に細胞を調査した。図47に示されるように、試験したDIPG細胞は、αv、β3、およびβ5ユニットの発現が陽性であり、抗体または二次抗体のみなしでインキュベートした細胞では蛍光は観察されなかった。
発明者の実験室からの以前のデータは、標的RGD−4C pIIIベクター媒介遺伝子送達および発現が、非標的ベクターと比較して選択的かつ効率的であることを示した。形質導入を最適化するために、仮説のうちの1つは、ファージあたりのリガンドのコピー数を増やすために、pVIIIコートタンパク質上にRGD−4Cをディスプレイすることであった(図48)。
ベクターを最適化する別の戦略は、組換えpVIIIコートタンパク質上にH5Wペプチドをディスプレイすることであった。実験室からの以前のデータは、レポーター遺伝子luciaを含むベクターを使用した形質導入実験(Sajee Waramit、未公開データ)において、RGD pIII単独と比較して、H5WペプチドのディスプレイがHEK293T細胞でルシフェラーゼ発現を増加させることを示した(図51)。
ベクターの最適化後、さらに実験を行う前に、選択される対象となる遺伝子であるヒトTRAIL(hTRAIL)がトランスフェクションを介してDIPG細胞の細胞死を誘発することができるかどうかを決定することが不可欠であった。
特定の理論に縛られることを望まないが、データはこれまでのところ、pIIIコートタンパク質上でH5WおよびRGD−4Cを発現するベクターがDIPG細胞での所望の遺伝子の標的化および発現の誘発において最も最適であったことを示している。トランスフェクション実験からのデータは、治療遺伝子TRAILがDIPG細胞死を誘発することができることも示唆しているため、さらなる調査が必要である。
腫瘍部位内のTNFaの標的局所領域産生を増加させるために、本発明者らは、IL−2からシグナルペプチドを挿入して膜貫通ドメインを欠くTNFa配列に先行することによって、分泌型TNFaをコードするファージミドを構築した。発明者の知る限り、これはハイブリッドIL2−TNFaが設計された初めての例であり、それらのデータは、IL2シグナルペプチド配列を有するTNFa遺伝子に先行して癌細胞におけるTNFaの発現および分泌を著しく増強したことを示唆している。そのような改変は、腫瘍微小環境におけるTNFaの標的化された産生および放出に利用可能な技術の著しい進歩を表し、TNFaの治療レベルを増加させるために考慮されるべきである。
PAAV.Grp78.IL−2SP.hTNFaの構築
ファージミドに挿入されたコーディング治療配列は、グルコース調節タンパク質(Grp78)の腫瘍特異的プロモーター、IL−2からのシグナルペプチド(SP)配列(図57)、およびTNFaのヒト配列を含むハイブリッド配列である。Grp78プロモーターはストレス誘発性であり、グルコース欠乏、慢性無酸素症、および酸性pHの条件によって強力に活性化され、攻撃的で灌流不良の腫瘍内に存続する。さらに、Grp78プロモーターは多種多様な腫瘍で誘発されるため、遺伝子治療での使用に魅力的な候補となっている。以前の研究では、このプロモーターがウイルスのプロモーターよりも優れている点がいくつか実証されている。このプロモーターの安全性および腫瘍特異性がまた、LacZ導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスでもエレガントに報告されている。これらのトランスジェニックマウスで確立された腫瘍では高いLacZ発現が示されたが、主要な正常組織ではプロモーター活性は検出されなかった。さらに、遺伝子治療ベクターで使用されるウイルスプロモーターとは異なり、Grp78などの哺乳動物プロモーターは真核細胞ではサイレンシングされない。発明者の以前に発表された研究において、彼らは、二重標的RGD4C/ファージ−Grp78がサイトメガロウイルスCMVプロモーターを保有するRGD4C/ファージ−CMVよりも持続的な導入遺伝子発現を提供することを報告した。RGD4CリガンドおよびGrp78プロモーターの両方を含めると、細胞侵入レベルおよび転写レベルの両方を標的とするデュアル腫瘍を有するベクターが生成される。
序論
びまん性内在性橋グリオーマ(DIPG)は、2年後の生存率がわずか6〜10%の小児にのみ発生する最も攻撃的な脳腫瘍である。そのびまん性および脳幹内のその繊細な位置のため、外科的切除は不可能であり、この種の癌に対する効果的な治療戦略はない。DIPGに対する現在の標準治療は放射線療法であり、放射線増感剤と組み合わせても、すべての小児がその後再発するため、いかなる成功も示していない。多くの臨床試験では、化学療法の効果を従来の放射線療法と組み合わせて試験したが、高用量の化学療法薬を組み合わせた場合でも、全生存期間の延長に関して改善はない。化学療法に対するこの抵抗性は、無傷の血液脳関門なたびに橋内のDIPGの解剖学的位置により、任意の薬物が標的位置に到達することをより困難にしている。この問題を克服するために、臨床試験では、2人の小児のDIPGの治療のために、対流強化送達(CED)の使用を適用して化学作用因子トポテカンを送達した。このパイロット研究では、両方の患者が治療後に死亡したが、最初は腫瘍サイズが縮小していた。CEDは、持続的な流れを通した脳腫瘍への化学療法薬の送達を配向する技術である。この技術は最近、血液脳関門を迂回することで薬物送達の課題を克服するために臨床試験で使用されている。
膜貫通型tmTNFαおよび分泌型sTNFα導入遺伝子を保有するPAAVによるDIPGの形質導入:
膜貫通TNFα遺伝子および分泌型TNFαは、PAAVベクター、PAAV−tmTNFαおよびPAAV−sTNFα(実施例12に示されるベクターを含む)にクローン化され、続いて標的ウイルス(RGD4C)および非標的ウイルス(M13/対照)の産生が行われた。DIPG細胞を形質導入し、形質導入後7日目に細胞生存率を測定した。40ng/μgのファージタンパク質DEAEデキストランにより、形質導入効率がさらに向上した。DIPG細胞は、PAAV−tmTNFαと比較して、細胞死の誘発においてPAAV−sTNFαに対してより良好な反応を示し、前者は、図59に示される膜貫通型によって誘発された20%のみの細胞死と比較して、7日目に約50%の細胞死を示す。併せて、これらのデータは、sTNFαがDIPGの治療に対する良好な候補であることを示唆している。
形質導入後のmRNAレベルを測定することによって、PAAV遺伝子送達の効率を評価した。図60Aに示されるように、非標的(M13)型は標的化PAAV(RGD4C)と比較して、TNFαの無視できるmRNA発現を示すため、TNFαの両方の形態は形質導入細胞において高い特異性で発現された。タンパク質レベルでは、PAAV−tmTNFαの形質導入は、ELISAによって検出されたように、培地中のTNFαの分泌を引き起こさなかった(図60B)。両方の形態での形質導入はmRNAレベルでTNFα発現を示すが、分泌型形態のみがTNFαタンパク質のレベルに関連していた。これはさらに、導入遺伝子の形質導入が効率的であることを確認し、膜貫通型による細胞死の誘発の非効率性は可溶性分泌タンパク質の欠如によるものであることを示唆し得る。初期の膜結合型からのsTNFαの放出には、酵素活性またはTNFα変換酵素(TACE)の発現が必要である。したがって、TACE酵素の発現はウエスタンブロットによって測定され、他の小児脳腫瘍細胞(髄芽腫)と比較された。TACE酵素のDIPG発現は、UW228の発現レベルよりも4倍低く、Daoy細胞の発現レベルよりも2倍低かった。
Claims (38)
- 癌を治療、予防、または改善する方法においての使用のための、組換えファージミド粒子が形質導入された標的腫瘍細胞内で導入遺伝子を発現するための組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも50%を欠くゲノムを含み、前記方法が、1つ以上のサイトカインが発現されるように、前記腫瘍細胞に少なくとも隣接して前記核酸配列を送達することを含む、組換えファージミド粒子。
- 前記導入遺伝子発現カセットが、前記腫瘍細胞におけるアポトーシス誘発、内因性抗腫瘍応答を促進するための前記腫瘍細胞の変化、他の治療を促進するための前記腫瘍細胞の変化、または治療を促進するための腫瘍微小環境の変化の効果を有するサイトカインをコードする、請求項1に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 前記サイトカインが、IL−4、IL−12、IL−15、TNFα、TRAIL、IFN−γ、またはそれらの任意の組み合わせであり、任意選択的に前記サイトカインがIL−15である、請求項1または2に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 前記サイトカインが、前記サイトカインの発現および/または分泌を増加させるように構成された非内因性シグナルペプチドを含むハイブリッドサイトカインである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 前記非内因性シグナルペプチドが、IL−2シグナルペプチドである、請求項4に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 前記ハイブリッドサイトカインが、TNFαの発現および/または分泌を増加させるように構成されたIL−2シグナルペプチドを含むハイブリッドTNFαである、請求項5に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 前記ハイブリッドTNFαが、実質的に配列番号22に示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体を含む、請求項6に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 前記ハイブリッドTNFαが、配列番号23を含む核酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体によってコードされている、請求項6または7に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 小児脳腫瘍、任意選択的にびまん性内在性橋グリオーマ(DIPG)または髄芽腫の治療、予防、または改善に使用するための、請求項1〜8のいずれか1項に記載の使用のための組換えファージミド粒子。
- 原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するためのシステムであって、前記システムは、
(i)原核宿主内に存続するように構成され、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクター;ならびに
(ii)前記一本鎖DNAのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含み、前記原核宿主からの組換えファージミド粒子を形成させおよび押し出させる第2のベクター
を含む、システム。 - 原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、前記方法が、
i)前記原核宿主内に存続するように構成され、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む第1のベクターを、原核宿主細胞に導入すること;
ii)バクテリオファージ構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージを前記宿主に導入すること;ならびに
iii)前記原核宿主から組換えファージミド粒子を形成して押し出すように、前記一本鎖DNAが前記構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で前記宿主を培養する
ことを含む、方法。 - 原核宿主から組換えファージミド粒子を産生するための方法であって、前記方法が、
i)(a)前記原核宿主内に存続するように構成され、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセット、およびベクターの一本鎖DNAへの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含む、第1のベクター、ならびに(b)前記一本鎖DNAのパッケージングに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含む、第2のベクターを、原核宿主細胞に導入すること;ならびに
ii)前記原核宿主から組換えファージミド粒子を形成して押し出すように、前記一本鎖DNAが前記構造タンパク質によってパッケージングされることをもたらす条件下で前記宿主を培養する
ことを含む、方法。 - 請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される組換えファージミドウイルス粒子、および薬学的に許容されるビヒクルを含む、医薬組成物。
- 請求項13に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスであって、前記プロセスは、治療有効量の、請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される組換えファージミド粒子、および薬学的に許容されるビヒクルを接触させることを含む、プロセス。
- 組換えファージミド粒子が形質導入された標的腫瘍細胞内で導入遺伝子を発現するための組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも50%を欠くゲノムを含み、さらに、使用時に、前記粒子が、1つ以上のサイトカインが発現されるように、前記腫瘍細胞に少なくとも隣接して前記核酸配列を送達するように構成され、前記サイトカインが、IL−4、IL−12、IL−15、TRAIL、IFN−γ、ハイブリッドTNFαのうちのいずれか1つ、またはそれらの任意の組み合わせであり、任意選択的に前記サイトカインがIL−15である、組換えファージミド粒子。
- 治療または診断に使用するための、請求項15に記載の組換えファージミド粒子。
- 組換えファージミド粒子が形質導入された標的腫瘍細胞内で少なくとも1つの抗原を発現するための組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、1つ以上のサイトカインをコードする核酸配列を含む少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットを含み、かつそのバクテリオファージゲノムの少なくとも50%を欠くゲノムを含み、使用時に、前記粒子が、1つ以上のサイトカインが発現されるように、前記腫瘍細胞に少なくとも隣接して前記核酸配列を送達するように構成される、組換えファージミド粒子。
- 治療または診断に使用するための、請求項17に記載の組換えファージミド粒子。
- 癌の治療、予防、または改善に使用するための、請求項17に記載の組換えファージミド粒子。
- 原核宿主から請求項17に記載の組換えファージミド粒子を産生するための、ウイルスベクター構造タンパク質をコードする核酸を含むヘルパーファージの使用。
- 請求項17に記載の、請求項10に記載のシステムによって産生される、請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20の使用によって産生される組換えファージミドウイルス粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、前記ファージミド粒子の前記ゲノム内の前記ウイルスゲノムを含むまたはこれに由来する組換えウイルスベクターの産生のためのものであり、前記組換えウイルスベクターが、1つ以上のサイトカインが発現されるように、少なくとも前記腫瘍細胞に隣接して、1つ以上の抗原をコードする核酸配列を送達するために使用される、組換えファージミドウイルス粒子。
- 癌の治療、予防、または改善に使用するための、rAAV、rep−cap、アデノヘルパー遺伝子、および1つ以上の抗原またはサイトカインをコードする核酸配列を含む、組換えベクター。
- 癌の治療、予防、または改善のための方法において使用するための、請求項22に記載のベクターを含む、組換えファージミド粒子。
- 請求項15もしくは17に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、組換えファージミド粒子であって、前記ファージミド粒子が、前記導入遺伝子発現カセットを前記標的腫瘍細胞に送達するように構成される、組換えファージミド粒子。
- 請求項15、17、もしくは24に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、一本鎖DNAへの前記ファージミドゲノムの複製を可能にするためのパッケージングシグナルを含み、これに続いて、原核宿主内の前記ファージミド粒子にパッケージングされ得、任意選択的に前記パッケージングシグナルが、複製起点、任意選択的にF1 oriを含む、粒子。
- 請求項15、17、24、もしくは25に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、原核宿主内への二本鎖ベクターの複製を可能にするための複製起点、任意選択的にpUC oriを含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜26のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、宿主ゲノムへの標的化された組込みに好ましい、1つ以上のDNA配列を含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜27のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットが、ウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜28のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、複数の導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜29のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシスシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットが、哺乳動物のウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜30のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記導入遺伝子発現カセットが、プロモーター、前記発現された物質に付着可能なポリAテールをコードするための核酸、ならびに左および/または右末端逆位反復配列(ITR)または左および/または右末端長反復配列(LTR)のいずれかからなる群から選択される、前記標的細胞における前記核酸の発現に必要とされる1つ以上の機能的要素を含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜31のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットが、レンチウイルス導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜32のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記少なくとも1つの導入遺伝子発現カセットが、アデノ随伴ウイルス(AAV)導入遺伝子発現カセットを含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜33のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記導入遺伝子発現カセットが、前記標的細胞または組織において治療的または工業的有用性を有する、物質をコードする核酸をさらに含み、任意選択的に、前記核酸によってコードされる前記物質がポリペプチドまたはタンパク質である、粒子。
- 請求項15、17、24〜34のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、1つ以上のカプシドマイナーコートタンパク質を含み、任意選択的に、前記組換えファージミド粒子が、前記粒子の前記標的腫瘍細胞への送達を可能にするための細胞標的化リガンドをディスプレイするように構成されるpIIIカプシドマイナーコートタンパク質を含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜35のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生されるか、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、1つ以上のカプシドメジャーコートタンパク質を含み、任意選択的に、前記組換えファージミド粒子が、その上に外来ペプチドをディスプレイするように構成される少なくとも1つのpVIIIカプシドメジャーコートタンパク質を含む、粒子。
- 請求項15、17、24〜36のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、前記組換えファージミド粒子が、正味の正電荷を有する複合体を形成するようにカチオン性ポリマーと組み合わされ、任意選択的に、前記カチオン性ポリマーが、キトサン;ポリ−D−リジン(PDL);ジエチルアミノエチル(DEAE);ジエチルアミノエチル−デキストラン(DEAE.DEX);ポリエチレンイミン(PEI);ポリブレン;硫酸プロタミン;5およびカチオン性脂質からなる群から選択される、粒子。
- 請求項15、17、24〜37のいずれか1項に記載の、または請求項10に記載のシステムによって産生される、または請求項11もしくは12に記載の方法によって産生される、または請求項20もしくは21に記載の使用によって産生される、または請求項1〜9および22〜23のいずれか1項に記載の使用のための、または請求項13に記載の医薬組成物による、または請求項14に記載の医薬組成物を作製するためのプロセスによる、粒子であって、
a.前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、それが由来する前記バクテリオファージゲノムの少なくとも60%、70%、もしくは少なくとも80%を欠いている、
b.請求項1〜37のいずれか1項に記載の粒子であって、前記組換えファージミド粒子の前記ゲノムが、それが由来する前記バクテリオファージゲノムの少なくとも90%、95%、もしくは少なくとも99%を欠いている、または
c.請求項1〜37のいずれか1項に記載の粒子であって、前記ファージミド粒子が、原核宿主からの前記粒子の形成、パッケージング、または押し出しに必要なそのゲノム中にバクテリオファージ構造遺伝子、好ましくはカプシドタンパク質をコードする構造遺伝子を欠いている、粒子。
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