ES2238330T3 - Transferencia genica en linfocitos humanos usando vectores retroviricos de scfv dirigidos a celulas. - Google Patents
Transferencia genica en linfocitos humanos usando vectores retroviricos de scfv dirigidos a celulas.Info
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Abstract
Vector dirigido a células, que contiene una secuencia de ADN que codifica para un fragmento de anticuerpo monocatenario (single chain variable fragment, scFv), caracterizado porque el fragmento de anticuerpo monocatenario presenta una secuencia de aminoácidos según la Figura 1.
Description
Transferencia génica en linfocitos humanos usando
vectores retrovíricos de scFv dirigidos a células.
La invención se refiere a la transferencia génica
en linfocitos humanos, particularmente linfocitos T, por medio de
vectores retrovíricos de scFv dirigidos a células y a la utilización
de dichos vectores para la terapia génica, vacunaterapia o
diagnóstico, en particular para la terapia de enfermedades asociadas
a células T.
La mayoría de los vectores retrovíricos
utilizados en la actualidad en la investigación de la terapia génica
proceden de los virus de leucemia del ratón anfótropos (MLV). El
área de las células del huésped del MLV anfótropo es determinada por
la proteína de envoltura superficial (SU) que es codificada por el
gen env. Los productos de proteínas del gen env forman la envoltura
exterior del vector retrovírico Las proteínas SU participan en su
interacción, es decir, se unen a una proteína determinada (receptor)
en la superficie de la célula del huésped. Los productos del gen env
del MLV anfótropo permiten la transferencia génica a un gran número
de diferentes células de mamíferos. Sin embargo, los vectores
anfótropos MLV no permiten una transferencia génica a tipos
determinados de células o tejidos humanos o de otros mamíferos,
puesto que el receptor para las proteínas de envoltura MLV en la
superficie de las células de mamíferos que media la entrada de los
vectores MLV anfótropos y la transferencia génica se encuentra en
casi todas éstas células. Por tanto, el área de las células del
huésped del MLV anfótropo no es específica.
Sin embargo, una especificidad de las células del
huésped resulta ventajosa por ejemplo para la utilización en la
terapia génica, puesto que de esta manera se evitan purificaciones
costosas de células en la terapia génica fuera del organismo (ex
vivo) (Anderson et al. 1992; Yu et al., 1997).
Para su utilización en la terapia, diagnóstico y vacunación es
deseable que los vectores retrovíricos se dirijan de forma selectiva
a las células del huésped deseadas y, a continuación, transfieran el
gen terapéutico. Ha resultado posible conseguir un estrechamiento
del área de las células del húesped del MLV anfótropo modificando la
proteína de envoltura superficial. Se realizó una modificación de la
proteína de envoltura superficial por fusión con un dominio de
hormona. Tuvo lugar una transducción de las células que llevaban el
receptor de hormona específico (Kasahara et al., 1995).
Además, se modificó la proteína de envoltura superficial por fusión
con un fragmento de anticuerpo monocatenario (single chain
variable fragment, en lo sucesivo también denominado
"scFv"). El fragmento representaba el dominio de un anticuerpo
unido al antígeno y es una proteína de fusión constituida por los
dominios variables Vh y Vl de un anticuerpo monoclonal. Los dos
dominios están ligados entre sí a través de un oligopéptido de
glicina y serina
[-(ser-gly4)3-gly-)] que
permite el plegado correcto de la proteína de fusión (Huston et
al., 1991; Whitlow et al., 1991). Todas las
modificaciones realizadas hasta la actualidad de la proteína de
envoltura superficial MLV con un scFv han demostrado que, pese a que
los vectores se unieron a la célula diana del huésped, no tuvo lugar
la entrada de los mismos en la célula (Russel et al., 1993).
Además, es conocido que por lo general la proteína de envoltura
superficial MLV no permite modificaciones extensivas (Cosset et
al., 1995). Las modificaciones en las que se reemplazó una parte
del dominio de unión de la proteína MLV-SU a menudo
dieron lugar a un procesamiento incorrecto y por tanto a un
transporte defectuoso de la proteína SU a la superficie celular
(Weiss et al., 1993; Morgan et al., 1993; Russel et
al., 1993). Así pues, el desarrollo de vectores retrovíricos a
base de MLV específicos para células utilizando proteínas de
envoltura superficial modificadas no es muy prometedor.
Para una transferencia génica selectiva por
ejemplo a células humanas resultan más aptos los vectores
retrovíricos a base del virus de necrosis de bazo SNV ("Spleen
Necrosis Virus"), puesto que la proteína de envoltura superficial
del SNV permite modificaciones extensivas y es procesada
correctamente incluso tras dichas modificaciones (Martinez y
Dornburg, 1995; Chu y Dornburg, 1994, 1995; Jiang et al.,
1998). Para la preparación de vectores de este tipo se necesitan por
lo menos dos componentes. Por un lado, hay que preparar un
denominado constructo de expresión, que permite un empaquetamiento y
la transferencia por medio de un retrovirus. El constructo de
expresión comprende un fragmento de ADN codificador del producto de
gen deseado, por ejemplo un gen para la terapia génica o como
vacuna. El constructo de expresión debe comprender una secuencia de
nucleótidos que se denomina señal de empaquetamiento psi (\Psi) y
controla el empaquetamiento eficaz del m-ARN en las
partículas retrovíricas. Además, se necesita una célula
empaquetadora o colaboradora que proporciona los productos de gen
gag, pol y env del SNV sin que los genes gag, pol y env puedan ser
empaquetados en un retrovirus. Los genes gag, pol y env contenidos
en la célula de empaquetamiento deben ser
psi-negativos. Tras la transferencia del constructo
de expresión por transfección del plásmido de ADN correspondiente en
las células empaquetadoras, se liberan las partículas retrovíricas
al sobrenadante del cultivo celular. Dichas partículas contienen el
constructo de expresión y sólo son capaces de transferir a la célula
diana dicho constructo y no los genes gag, pol y env. Dichos
vectores son incapaces de multiplicarse y solamente pasan por un
ciclo de replicación. El procedimiento general para la preparación
de vectores retrovíricos incapaces de multiplicarse forma parte del
estado de la técnica (Russel et al., 1993; Cosset et
al., 1995; Weiss et al., 1993; Morgan et al.,
1993; Martinez y Dornburg, 1995; Chu y Dornburg, 1994, 1995; Jiang
et al., 1998).
El trofismo (especificidad de las células del
huésped del virus de necrosis de bazo) se encuentra determinado
también por la proteína de envoltura superficial (proteína SU) que
es codificada por el gen env del SNV. El tipo silvestre de la
proteina de envoltura superficial del SNV no admite una
transferencia de gen selectiva en células o tejidos determinados
humanos, puesto que la proteína receptora específica (receptor) no
se encuentra en la superficie de las células humanas (Dornburg,
1995). Por este motivo, Dornburg et al. han desarrollado un
procedimiento para reemplazar la proteína SU del SNV con los
dominios de anticuerpos que reconocen el antígeno. Dichos vectores
[SNV-scFv-Env] que contienen cuatro
scFv diferentes previamente conocidos eran capaces de transferir el
gen "reporter" psi positivo, o sea la
\beta-galactosidasa bacteriana, a las células
diana humanas seleccionadas (Chu et al., 1994; Chu et
al., 1995; Chu y Dornburg, 1997). Específicamente, se trataba de
dos scFv que son exprimidos contra antígenos superficiales
desconocidos en las células del carcinoma de pecho y de colón (Chu
et al., 1995; Chu y Dornburg, 1997; Jiang et al.,
1998), de un scFv que está dirigido contra el receptor de la
transferina humana y de un scFv que reconoce el antígeno superficial
CD34. Se desarrolló una línea empaquetadora
(DSH-CXL) que contiene tanto los genes gag, pol y
env psi negativos del SNV como el constructo de expresión del gen
"reporter" psi positivo (pCXL). Tras la transfección de la
célula empaquetadora con el plásmido de ADN de otro gen env de
expresión (pTC53 [vector de expresión pTC53 y pTC53zeo Jiang et
al., 1998]), en el cual se reemplazó la proteína de envoltura
superficial entera con un fragmento de anticuerpo monocatenario
(scFv), se pasaron los vectores retrovíricos al sobrenadante
celular, los cuales llevaban en su superficie, aparte de la proteína
de envoltura superficial del tipo silvestre, también la proteína
superficial quimera [scFv-Env]. Con la ayuda de
dichos vectores, ha resultado posible transferir el gen
"reporter" a las células diana específicas de scFv. En el
procedimiento descrito por Dornburg et al. para la
preparación de vectores retrovíricos específicos de células, es un
hecho que sólo se pueden utilizar los scFv ya conocidos y
clonados.
El documento DE 19752854 A1 da a conocer un
procedimiento para la preparación de vectores dirigidos específicos
para el tipo de células, derivados de SNV. Hasta el momento, se han
descrito 4 vectores dirigidos de scFv-SNV. Los
mismos están dirigidos contra los marcadores de tumores, el receptor
de transferina y contra el gen superficial CD34 (Chu & Dornburg,
1995, 1997, Jiang et al., 1997). Dichos scFv se han derivado
de anticuerpos monclonales (mAb). Además, hasta el momento se han
descrito vectores del tipo seudo del tipo MLV (VIH) para la
transducción específica de células T CD4-positivas
(Schnierle & Stitz et al., 1997).
Sin embargo, todavía no se han descrito vectores
que sean capaces de transducir células T humanas independientemente
de CD4 con alta selectividad.
Por tanto, el objetivo de la presente invención
es proporcionar vectores específicos para las células T que puedan
transducir células T humanas independientemente de CD4.
Dicho objetivo se alcanza mediante vectores
dirigidos a células que contienen una secuencia de ADN que codifica
un fragmento de anticuerpo monocatenario (single chain variable
fragment, scFv), en el cual el fragmento de anticuerpo monocatenario
presenta una secuencia de aminoácidos según la Figura 1.
En una forma de realización preferida, el vector
dirigidos a células según la invención contiene además una secuencia
de ADN que codifica un líder SNV-env según la Figura
1. Dichos vectores dirigidos a células según la invención son
específicos de las células T, es decir, los vectores inducen
selectivamente células T humanas independientemente de CD4.
En otra forma de realización preferida, el vector
dirigido a células se ha derivado de SNV (virus de necrosis de
bazo), y, de forma particularmente preferida, el vector derivado de
SNV es pTC53.
En otra forma de realización de la presente
invención, los vectores dirigidos a células contienen un gen
terapéutico. Por tanto, la invención se refiere también a la
utilización de los vectores dirigidos a células según la invención
para la terapia génica, vacunaterapia o diagnóstico.
Los vectores de scFv según la invención son los
primeros vectores de scFv dirigidos a células disponibles que son
capaces transducir células T humanas independientemente de CD4 con
alta selectividad y eficacia diferentes.
Los vectores según la invención permiten una
terapia de las enfermedades siguientes asociadas a las células
T:
- (i)
- Inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Se trata de un defecto del gen de adenosina-desaminasa (ada) o del gen que codifica para la tirosinquinasa JAK-3 (Macchi et al., 1995). Como gen terapéutico, el gen ada intacto se transfiere a las células T por medio de los vectores según la invención.
- (ii)
- Inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es causada por la infección de VIH-1. Los genes terapéuticos tienen como objetivo la inhibición de la replicación o integración del virus. Los productos de gen terapéuticos aptos para la inmunización intracelular son los ribozimas, los ARN cebo, los mutantes negativos transdominantes de proteínas de VIH o fragmentos de anticuerpos (Chang et al., 1994, Ramenzani et al., 1997, Smith et al., 1996, Leavitt et al., 1996, Duan et al., 1995, Levy-Mintz et al., 1996). Dichos genes terapéuticos se transfieren en la utilización según la invención de los nuevos vectores dirigidos a células en las células T de los pacientes infectados con VIH-1.
Se ha podido demostrar que los macrófagos humanos
se transducen con una eficacia de un 95% por medio de los vectores
según la invención (por ejemplo vectores que contienen el scFv 7A5
representado en la Fig. 1, en lo sucesivo denominados vectores 7A5).
Por lo tanto, mediante dichos vectores 7A5 la transferencia de los
vectores terapéuticos es posible también a macrófagos infectados con
VIH-1.
- (iii)
- Linfomas asociadas a células T.
Los vectores dirigidos
(scFv-SNV-env) según la invención
que contienen una secuencia de ADN que codifica para un fragmento de
anticuerpo monocatenario (single chain variable fragment, scFv), en
el que el fragmento de anticuerpo monocatenario presenta una
secuencia de aminoácidos (o un fragmento) según la Figura 1,
permiten de forma selectiva una transducción de líneas de células T
humanas y en parte de linfocitos primarios aislados a partir de la
sangre.
Sorprendentemente, los vectores según la
invención presentan una selectividad para células T humanas
aumentada en muchas veces en comparación con otras células humanas.
Los vectores 7-A5, es decir, los vectores que
codifican el fragmento de anticuerpo monocatenario según la Fig. 1 o
una parte del mismo presentan una selectividad para células T
humanas aumentada en un factor de hasta 1000 en comparación con
otras células humanas (ver la Tabla 2) y una selectividad para
células T aumentada de 4 a 5 veces en comparación con células B.
En la Tabla 1, se han representado 5 scFv
(específicamente 7A5, K6, 7B2, 7EA, 6C3) y sus títulos vectoriales
para células T humanas (C8166), células D17 (línea celular de
osteosarcoma canina, permisiva para SNV) y células HeLa (línea
celular de cerviccarcinoma humana).
En la Tabla 2, se han representado los títulos
vectoriales de vectores 7A5. A través de dichos datos pueden
apreciarse su eficacia y especificidad para las células T humanas.
Por medio de dichos vectores 7A5 ha sido posible transducir incluso
células T silenciosas por medio de vectores SNV modificados por
terapia génica e incluso macrófagos humanos de forma muy eficaz.
Los ejemplos siguientes ilustrarán la invención y
no deben considerarse como limitativos de la misma:
Con dicho fin, se titraron los sobrenadantes de
los cultivos celulares en tres niveles de dilución (1000 \mul, 100
\mul y 10 \mul) en un volumen total de 1000 \mul adicionando
30 \mug/ml de polibren sobre las células (2 x 10^{5} D17 y HeLa,
5 x 10^{5} C8166). Tras un tiempo de incubación de
1,5-2 h, se reemplazó el sobrenadante que contenía
los vectores por un medio fresco.
Tras 48 horas, se realizó una coloración con
X-gal (Mikawa et al., 1992), con el fin de
detectar las células transducidas, y se contaron las células azules.
La Tabla 1 muestra los títulos vectoriales de los cinco scFv
seleccionados de entre células D17, C8166 y HeLa.
La titulación por D17 (línea celular de
osteosarcoma canina, Watanabe et al., 19) sirvió como control
positivo para la producción de vectores. El título de > 10^{6}
UI/ml muestra que todos los clones de las células de empaquetamiento
scFv liberan partículas de vector al sobrenadante del cultivo
celular aproximadamente con la misma eficacia.
Los títulos en las células C8166 varían entre
10^{3} y 10^{6} UI/ml según el tipo de scFv, mientras que la
transducción sobre HeLa no produjo ningún título apreciable. Este
hecho indica una alta selectividad para células T humanas de todos
los cinco vectores de scFv. La transducción más eficaz para células
T humanas la presentan los vectores 7A5 (Tabla 1).
Para una caracterización más detallada, se
llevaron a cabo otros experimentos de transducción con los vectores.
En la Tabla 2, se han representado los resultados de los vectores
7A5.
Las transducciones se llevaron a cabo tal como se
ha descrito anteriormente. A modo de control, se transdujeron todas
las células con vectores de tipo silvestre (ts). Se trata de
partículas de vector que sólo contienen la proteína env del tipo
silvestre de SNV y ningún scFv. Dichas partículas son liberadas por
las líneas de células de empaquetamiento de partida
DSH-cxl (Chu & Dornburg, 1995, Jiang et
al., 1998) al sobrenadante del cultivo. Como era de esperar,
dichos vectores no eran capaces de transducir células humanas. Sólo
eran capaces de transducir con alta eficacia las células D17 que son
permisivas para ellos.
La titulación con los vectores 7A5 demostraba una
transducción eficaz de varias líneas de células T humanas (C8166,
Molt4-8, Jurkat, A301), mientras que otros tipos de
células humanas (HeLa: cervicocarcinoma, TE671: rabdomiosarcoma,
HT1080:fibrosarcoma, 293T:médula renal) no quedaron transducidas.
Con estos resultados queda demostrado que los vectores 7A5 presentan
una alta selectividad para las células T.
También se halló una selectividad aumentada para
las células T para los vectores dirigidos a células que contienen
una secuencia de ADN que codifica para un fragmento de anticuerpo
monocatenario según las Figuras 2, 3, 4 ó 5.
Para la transducción de células T primarias, se
aisló, a partir de la sangre, PBMC humano ("células periféricas
mononucleares", realizándose el aislamiento de PBMC a partir de
la sangre por medio de centrifugación por gradiente de densidad de
sucrosa según los métodos estándares).
Tras tres días de estimulación mediante PHA
(fitohemaglutinina) y IL-2, la población celular
consistió en un 98% de linfocitos T (determinado mediante el
análisis FACS con un anticuerpo contra el marcador CD3 de células T
(estado de la técnica)).
La transducción de dichas células por medio de
los vectores 7A5 proporcionó una eficacia de un 20% de células
vector-positivas (o aproximadamente 1x10^{5}
UI/ml). A título de comparación, se realizaron experimentos de
transducción con células B humanas. Las mismas podían transducirse
con una eficacia aproximadamente cinco veces más débil
(aproximadamente un 4%) que las células T.
Además, también era posible transducir el PBMC
humano estimulado por medio de los vectores K6 y 7B2 (es decir,
vectores que codifican el fragmento de anticuerpo monocatenario
según la Fig. 2 ó 3 o una parte del mismo). Sin embargo, esto se
realizó con una eficacia aproximadamente 10 veces más baja que con
los vectores 7A5.
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<110> República Federal de Alemania, ésta
última representada por el Presidente del Instituto Paul Ehrlich, el
profesor Dr. R. Kurth, D-63225 Langen, Alemania
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<120> Transferencia génica en linfocitos
humanos usando vectores retrovíricos de scFv dirigidos a células
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<160> 10
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 1030
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: secuencia codificadora de scFv
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<400> 1
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<211> 927
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: secuencia codificadora de scFv
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<400> 2
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<210> 3
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: secuencia codificadora de scFv
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: secuencia codificadora de scFv
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: secuencia codificadora de scFv
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<212> PRT
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: scFv de SEC ID nº 1: codificada
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: scFv de SEC ID nº 2: codificada
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 330
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<212> PRT
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: scFv de SEC ID nº 3: codificada
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 315
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<212> PRT
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: scFv de SEC ID nº 4: codificada
\newpage
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<400> 9
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\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 302
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<212> PRT
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<213> Secuencia sintética
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
sintética: scFv de SEC ID nº 5: codificada
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<400> 10
Claims (10)
1. Vector dirigido a células, que contiene una
secuencia de ADN que codifica para un fragmento de anticuerpo
monocatenario (single chain variable fragment, scFv),
caracterizado porque el fragmento de anticuerpo monocatenario
presenta una secuencia de aminoácidos según la Figura 1.
2. Vector dirigido a células según la
reivindicación 1, caracterizado porque el vector contiene
además una secuencia de ADN que codifica para un líder
SNV-env según la Figura 1.
3. Vector dirigido a células según la
reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el vector es
específico de las células T.
4. Vector dirigido a células según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el vector se
ha derivado de SNV (virus de necrosis de bazo).
5. Vector dirigido a células según la
reivindicación 4, caracterizado porque el vector derivado de
SNV es pTC53.
6. Vector dirigido a células según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, que contiene un gen terapéutico.
7. Medicamento que contiene vectores dirigidos a
células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Utilización de los vectores dirigidos a
células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada a la terapia
génica, vacunoterapia o diagnóstico.
9. Utilización de los vectores dirigidos a
células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la
preparación de una composición farmacéutica destinada a la terapia
de enfermedades asociadas a las células T.
10. Utilización según la reivindicación 8, en la
que la enfermedad asociada a las células T es la inmunodeficiencia
adquirida (SIDA) o la inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
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