CN100594038C - 人禽流感特异系列靶向药物及其制备方法 - Google Patents

人禽流感特异系列靶向药物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人禽流感特异系列靶向药物及其制备方法，用单克隆抗体筛选抗人禽流感病毒及致炎因子的杂交瘤细胞株；分别提取不同杂交瘤细胞，用RT-PCR扩增出每种单抗的重链可变区和轻链可变区基因；通过SOE-PCR将单抗的VH、VL基因以一段15个氨基酸的短肽相连，构建人禽流感病毒HA/NA的单链抗体基因或单链双特异抗体基因及致炎因子的单链抗体基因；将人禽流感病毒的单链抗体基因或单链双特异抗体基因通过酶切、连接方法分别与致炎因子的单链抗体基因或绿脓杆菌外毒素PE40基因连接，构建原核表达载体，转化Ecoli.BL21工程菌，经发酵、提取及纯化后获得系列靶向拮抗剂，本药物用于人禽流感的紧急预防与救治。

Description

人禽流感特异系列靶向药物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人禽流感特异系列靶向药物及其制备方法，尤其是提供了以人禽流感病毒中和性单链抗体或单链双特异抗体为载体的系列靶向药物及其制备方法，用于人禽流感的紧急预防与救治，属于重要人畜共患病防治药物制备技术领域。
背景技术：
据世界卫生组织公布资料，截至2006年8月23日，全球已有241人确诊感染了H5N1亚型HPAIV，造成141人死亡，病死率高达58.5％，如此高的病死率说明目前尚缺少有效的救治药物，一旦这种病毒发生变异获得了人间传播的能力，就有可能引发一场流感的人间大流行。因此，必须加紧进行疫苗与药物的研究与储备，作好流感人间大流行的应对准备。
中和性抗流感病毒抗体具有中和病毒的作用，给感染初期人群和高危人群进行抗体注射可使机体快速获得保护，从而可达到紧急预防与治疗目的，但特异抗体只能中和体内游离病毒，对于已进入细胞内的病毒则无办法，因为病毒的复制必须在活的宿主细胞内进行，因此，如果能够在中和游离病毒的基础上再破坏已经被禽流感病毒感染了的宿主细胞，则可控制流感病情的发展。
研究发现流感病毒感染会引起患者肺部组织内细胞因子大量表达，造成严重的肺部炎症，这些细胞因子包括IP-10、β-IFN、IL-6、IL-8、ICAM-1、HMGB1及MIF等。在致炎因子引发肺部炎症的过程中，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)起到了极为重要的介导作用，其介导的炎症细胞与内皮细胞间的粘附是许多炎症性疾病的重要病理生理基础。巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是早期发现的一促炎症细胞因子，其可直接或间接促进促炎症分子的生成和表达，包括TNF、IL-1、IL-6、IL-8等；高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是新近发现的一种强大的致炎细胞因子，研究表明其同样可刺激TNF、IL-1、IL-6、IL-8的释放，是启动和维持炎症瀑式反应的中心分子，与急性肺炎的发病机理关系密切。拮抗上述致炎细胞因子的作用，就会降低炎症的发生和发展，达到救治的目的。当前研究已证明使用致炎因子单克隆抗体可降低炎症反应。但抗致炎因子的单克隆抗体使用后在全身内分布，无法在感染最严重的肺组织内聚集，从而降低了其疗效。
近十几年来，国内外学者纷纷将单克隆抗体、基因工程抗体、细胞因子等作为载体，与化学药物、毒素、同位素及酶类等相连接，制成靶向制剂，将其带至病灶部位，特异性的杀伤肿瘤细胞，这种治疗称为导向治疗，有关的药物称为“生物导弹”或“免疫靶向药物”。绿脓杆菌外毒素A(PE)对细胞具有杀伤作用，已广泛用于肿瘤治疗，但目前尚没有以禽流感病毒中和性抗体为载体的靶向药物研究报道。
流感病毒复制过程中核酸的复制和病毒结构蛋白的合成是基本同步的，其中病毒囊膜表面蛋白----血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)在翻译合成后通过高尔基体到达宿主细胞表面并嵌于细胞膜上，在病毒在出芽时随宿主细胞膜包裹在核衣壳上。以特异识别感染细胞膜表面上的HA/NA的单链抗体或单链双特异抗体为靶向载体、以具有细胞杀伤作用的毒素或致炎因子的单链抗体为弹头而研制的靶向药物，可在病毒感染早期中和游离病毒、杀伤感染细胞、降低炎症反应，从而达到紧急预防与治疗的目的。
发明内容：
本发明公开了一种人禽流感特异系列靶向药物，是以人禽流感病毒中和性单链抗体或单链双特异抗体为载体的系列靶向药物，可以中和游离病毒，并通过PE的细胞毒性作用杀伤病毒感染细胞。
本发明还公开了上述药物的制备方法，并适合于工业化生产。
本发明所述的靶向药物由两个部分组成，其中，共同的部分是人禽流感病毒HA/NA的中和性单链抗体或者同时具有HA和NA中和活性的单链双特异抗体，作为靶向载体，不同的部分是分别带上各种致炎因子的单链抗体，将其作为弹头。
所述的单链抗体选自绿脓杆菌外毒素PE40或MIF、HMGB1、ICAM-I等。
本发明的技术解决方案如下：用单克隆抗体制备技术筛选抗人禽流感病毒HA和NA及致炎因子的杂交瘤细胞株；分别提取不同杂交瘤细胞RNA，用RT-PCR方法扩增出每种单抗的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因；通过重叠延伸拼接法(SOE-PCR)将HA或NA单抗的VH、VL基因以一段15个氨基酸的短肽相连，构建人禽流感病毒HA/NA的单链抗体(anti HA/NA ScFv)基因或HA、NA的单链双特异抗体基因(anti HA-NA BsAb)，以相同的方法构建致炎因子的单链抗体(anti MIF ScFv、anti HMGB1 ScFv、anti ICAM-I ScFv)基因；将人禽流感病毒的单链抗体基因或单链双特异抗体基因通过酶切、连接方法分别与致炎因子的单链抗体基因或绿脓杆菌外毒素PE40基因连接，构建原核表达载体，转化Ecoli.BL21工程菌，经发酵、提取及纯化后获得系列靶向拮抗剂。
具体制备方法包括以下步骤：
1.HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I等致炎因子抗体可变区基因的克隆
①采用单克隆抗体制备技术制备HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I单抗；
②以RT-PCR方法克隆HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I抗体可变区基因；
2.单链抗体基因或单链双特异抗体基因的构建
①将HA或NA的抗体可变区基因通过SOE-PCR法构建成HA/NA单链抗体基因或单链双特异抗体基因；
②将MIF、HMGB1、ICAM-I的抗体可变区基因通过SOE-PCR法构建MIF、HMGB1、ICAM-I等致炎因子单链抗体基因；
3.系列靶向药物原核表达载体的构建与靶向药物的制备
①通过酶切、连接的方法将HA/NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与MIF单链抗体基因相连，装入PET-28中，构建MIF靶向拮抗剂原核表达载体；
②通过酶切、连接的方法将HA/NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与HMGB1单链抗体基因相连，装入PET-28中，构建HMGB1靶向拮抗剂原核表达载体；
③通过酶切、连接的方法将HA/NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与ICAM-I单链抗体基因相连，装入PET-28中，构建ICAM-I靶向拮抗剂原核表达载体；
④通过酶切、连接的方法将HA/NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与含有PE40的PET-28质粒相连，构建重组PE靶向药物原核表达载体；
⑤重组质粒转化、表达，纯化、复性，应用。
本发明的优点在于：以抗人禽流感病毒亲和性单链抗体或单链双特异抗体为载体，可特异引导毒素或致炎因子抗体到达靶器官或组织，高效发挥细胞杀伤作用与致炎因子拮抗作用。
具体实施方式：
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1
anti HA/NA ScFv-PE40抗体融合蛋白的制备
1.禽流感病毒HA和NA抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选
分别以制备的HA、NA经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA/NA抗体可变区基因的克隆
挑选对HA或NA呈特异阳性的杂交瘤细胞，提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA和NA单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增HA和NA抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)。
2.HA/NA单链抗体基因和HA-NA单链双特异抗体基因的构建
将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得HA或NA的单链抗体基因anti HA/NA ScFv，其中反向引物含有XhoI酶切位点，正向引物含有EcoR I位点。
3.anti HA/NA ScFv-PE40原核表达载体的构建
用XhoI和EcoR I酶切anti HA/NA ScFv和装有PE毒素基因的原核表达载体pET-28，用T4连接酶连接构建单链抗体原核表达载体。
4.anti HA/NA ScFv-PE40抗体融合蛋白的制备
将构建的表达载体转化Ecoli.JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化Ecoli.BL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得anti HA/NA ScFv-PE40抗体融合蛋白。
下面实验进一步证明了anti HA/NAScFv-PE40抗体融合蛋白在防治禽流感上的积极效果：
方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射抗体融合蛋白，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有3只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为102.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表1)。
表1anti HA/NA ScFv-PE40或anti HA-NA BsAb--PE40治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>) 肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗组   10   3   30％  11   10<sup>2.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿
实施例2
anti HA-NA BsAb--PE40抗体融合蛋白的制备
1.禽流感病毒HA和NA抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选
分别以制备的HA、NA经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA、NA抗体可变区基因的克隆
挑选对HA、NA呈特异阳性的杂交瘤细胞，分别提取RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA和NA单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF扩增HA和NA抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)
2.HA-NA单链双特异抗体基因的构建
将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得HA和NA的单链双特异抗体基因anti HA-NA BsAb，其中反向引物含有XhoI酶切位点，正向引物含有EcoR I位点。
3.anti HA-NA BsAb--PE40原核表达载体的构建
用XhoI和EcoR I酶切anti HA-NA BsAb--PE40和装有PE毒素基因的原核表达载体pET-28，用T4连接酶连接构建单链抗体原核表达载体。
4.anti HA-NA BsAb--PE40抗体融合蛋白的制备
将构建的表达载体转化Ecoli.JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化Ecoli.BL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得anti HA-NA ScFv-PE40抗体融合蛋白。
下面实验进一步证明了anti HA-NA BsAb--PE40抗体融合蛋白在防治禽流感上的积极效果：
方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射抗体融合蛋白，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有3只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为102.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表2)。
表2anti HA/NA ScFv-PE40或anti HA-NA BsAb--PE40治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>) 肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗组   10   3   30％  11   10<sup>2.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿
实施例3
以人禽流感病毒HA/NA单链抗体为载体的MIF靶向拮抗剂的制备
1.HA、NA及MIF抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选
分别以制备的HA、NA及MIF经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA、NA、及MIF抗体可变区基因的克隆
挑选对HA、NA及MIF呈特异阳性的杂交瘤细胞，提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA、NA及MIF单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增HA、NA及MIF抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)
2.单链抗体基因的构建
①HA或NA单链抗体基因的构建
挑选对HA或NA抗原呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
②MIF单链抗体基因的构建及克隆
挑选对MIF呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
3.靶向拮抗剂的制备
分别通过酶切连接的方法将抗HA或NA单链抗体基因与MIF单链抗体基因重组，构建原核表达载体，将构建的重组质粒转化E.coli JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化E.coli BL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得MIF靶向拮抗剂。
下面实验进一步证明了MIF靶向拮抗剂在防治禽流感上的积极效果：
方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射MIF靶向拮抗剂，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有4只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为103.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表3)。
表3MIF靶向拮抗剂治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>) 肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗   10   4   40％  11   10<sup>3.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿
实施例4
以人禽流感病毒HA-NA单链双特异抗体为载体的MIF靶向拮抗剂的制备
1.HA、NA及MIF抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选
分别以制备的HA、NA及MIF经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA、NA、及MIF抗体可变区基因的克隆
挑选对HA、NA及MIF呈特异阳性的杂交瘤细胞，提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA、NA及MIF单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增HA、NA及MIF抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)
2.单链抗体基因的构建
①HA-NA单链双特异抗体基因的构建
挑选对HA或NA抗原呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链双特异抗体基因。
②MIF单链抗体基因的构建及克隆
挑选对MIF呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
3.靶向拮抗剂的制备
将HA-NA单链双特异抗体基因与MIF单链抗体基因重组，构建原核表达载体，将构建的重组质粒转化E.coli JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化E.coli BL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得MIF靶向拮抗剂。
下面实验进一步证明了MIF靶向拮抗剂在防治禽流感上的积极效果：
方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射MIF靶向拮抗剂，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有4只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为103.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表4)。
表4MIF靶向拮抗剂治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>) 肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗   10   4   40％  11   10<sup>3.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿
实施例5
以人禽流感病毒HA/NA单链/抗体为载体的HMGB1靶向拮抗剂的制备
1.HA、NA及HMGB1抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选
分别以制备的HA、NA及HMGB1经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA、NA、及HMGB1抗体可变区基因的克隆
挑选对HA、NA及HMGB1呈特异阳性的杂交瘤细胞，提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA、NA及HMGB1单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增HA、NA及HMGB1抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)。
2.单链抗体基因的构建
①HA或NA单链抗体基因构建及克隆
挑选对HA或NA抗原呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
②HMGB1单链抗体基因的构建及克隆
挑选对HMGB1呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
3.靶向拮抗剂的制备
分别将HA或NA单链抗体基因与HMGB1单链抗体基因重组，构建原核表达载体，将构建的重组质粒转化E.coli JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化E.coliBL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得HMGB1靶向拮抗剂。
下面实验进一步证明了HMGB1靶向拮抗剂在防治禽流感上的积极效果：
方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射HMGB1靶向拮抗剂，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有4只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为103.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表5)。
表5HMGB1靶向拮抗剂治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>)   肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗组   10   4   40％  11   10<sup>3.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿
实施例6
以人禽流感病毒HA-NA单链双特异抗体为载体的HMGB1靶向拮抗剂的制备
1.HA、NA及HMGB1抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选
分别以制备的HA、NA及HMGB1经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA、NA、及HMGB1抗体可变区基因的克隆
挑选对HA、NA及HMGB1呈特异阳性的杂交瘤细胞，提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA、NA及HMGB1单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增HA、NA及HMGB1抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)。
2.单链抗体基因的构建
①HA-NA单链双特异抗体基因的构建及克隆
挑选对HA或NA抗原呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链双特异抗体基因。
②HMGB1单链抗体基因的构建及克隆
挑选对HMGB1呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
3.靶向拮抗剂的制备
将HA-NA单链双特异抗体基因与HMGB1单链抗体基因重组，构建原核表达载体，将构建的重组质粒转化E.coli JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化E.coliBL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得抗HMGB1靶向拮抗剂。
下面实验进一步证明了HMGB1靶向拮抗剂在防治禽流感上的积极效果：
方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射HMGB1靶向拮抗剂，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有4只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为103.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表6)。
表6HMGB1靶向拮抗剂治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>)   肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗组   10   4   40％  11   10<sup>3.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿
实施例7
以人禽流感病毒HA/NA单链抗体为载体的ICAM-1靶向拮抗剂的制备
1.HA、NA及ICAM-1抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选。
分别以制备的HA、NA及ICAM-1经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA、NA、及ICAM-1抗体可变区基因的克隆
挑选对HA、NA及ICAM-1呈特异阳性的杂交瘤细胞，提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA、NA及ICAM-1单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增HA、NA及ICAM-1抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)。
2.单链抗体基因的构建
①HA或NA单链抗体基因的构建及克隆
挑选对HA或NA抗原呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
②HMGB1单链抗体基因的构建及克隆
挑选对HMGB1呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
3.靶向拮抗剂的制备
分别将HA或NA单链抗体基因与ICAM-1单链抗体基因重组，构建原核表达载体，将构建的重组质粒转化E.coli JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化E.coliBL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得ICAM-1靶向拮抗剂。
下面实验进一步证明了ICAM-1靶向拮抗剂在防治禽流感上的积极效果：方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射ICAM-1靶向拮抗剂，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有4只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为103.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表7)。
表7ICAM-1靶向拮抗剂治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>) 肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗组   10   4   40％  11   10<sup>3.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿
实施例8
以人禽流感病毒HA-NA单链双特异抗体为载体的ICAM-1靶向拮抗剂的制备
1.HA、NA及ICAM-1抗体可变区基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫与特异性单抗杂交瘤细胞株的筛选
分别以制备的HA、NA及ICAM-1经背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗体效价大于27或ELISA结果呈阳性时无菌取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，Western法检测单抗特异性。
②HA、NA、及ICAM-1抗体可变区基因的克隆
挑选对HA、NA及ICAM-1呈特异阳性的杂交瘤细胞，提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，分别以HA、NA及ICAM-1单抗的cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增HA、NA及ICAM-1抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)。
2.单链抗体基因的构建
①HA-NA单链双特异抗体基因的构建及克隆
挑选对HA或NA抗原呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链双特异抗体基因。
②HMGB1单链抗体基因的构建及克隆
挑选对HMGB1呈特异阳性的杂交瘤细胞提取其RNA，以随机六聚体引物完成RT反应，获得cDNA，以cDNA为模板，以轻链可变区引物LB、LF和重链可变区引物HB、HF分别扩增抗体可变区轻链(VL)、重链(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有连接肽序列)，将获得的VL、VH基因等量混合作为模板，以单链抗体正向引物和反向引物对其进行SOE-PCR扩增，获得单链抗体基因。
3.靶向拮抗剂的制备
将HA-NA单链双特异抗体基因与ICAM-1单链抗体基因重组，构建原核表达载体，将构建的重组质粒转化E.coli JM109感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养16h，用质粒(小量)抽提试剂盒提取质粒，经PCR和酶切鉴定正确后，转化E.coliBL21(DE3)感受态，涂布于卡那抗性平板37℃过夜培养后，挑取孤立菌落接种于含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，将菌液按1％加入液体LB培养基中，37℃振荡培养4h后，按1mM加入IPTG诱导6h。菌体发酵，发酵后用IEX和HIC层析方法纯化蛋白，经复性后即获得ICAM-1靶向拮抗剂。
下面实验进一步证明了ICAM-1靶向拮抗剂在防治禽流感上的积极效果：
方法：将20只KM小鼠随机分成两组，每组10只，一组为病毒对照，一组为治疗组。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻击禽流感病毒，每只小鼠3-5个LD50。治疗组在攻毒48小时后静脉注射ICAM-1靶向拮抗剂，30μg/只.d，病毒对照组静脉注射注射用水，连续给药8天。每日观察小鼠发病死亡情况，在攻毒后第6天时每组各捕杀3只小鼠，取肺脏观察病理变化情况，并测定肺脏病毒含量。攻毒后第21天时记录小鼠死亡数量，统计发病率、病死率、病程等指标。
结果：病毒对照组10只小鼠在攻毒第3天后全部发病，临床上主要表现为体重下降、精神沉郁，在第6-7天时全部死亡，死亡小鼠肺脏呈出血、水肿及坏死灶，经细胞病变法检测肺脏病毒含量为106.5/0.1ml，而治疗组10只发病鼠中只有4只死亡，剖检后发现部分小鼠肺脏呈出血水肿症状，经检测肺脏病毒含量为103.5/0.1ml，并且病程较病毒对照组延长6天(见表8)。
表8ICAM-1靶向拮抗剂治疗实验结果
发病数 死亡数 死亡率 病程(d)   肺脏病毒含量(TCID<sub>50</sub>) 肺脏病理变化
  对照组   10   10   100％  5   10<sup>6.5</sup>/0.1ml   全部出血、水肿、坏死
  治疗组   10   4   40％  11   10<sup>3.5</sup>/0.1ml   个别出现出血水肿

Claims (2)

1、一种人禽流感特异系列靶向药物，靶向药物由两个部分组成，其中，各靶向药物的共同部分是人禽流感病毒HA或NA的中和性单链抗体或者是同时具有HA和NA中和活性的单链双特异抗体，作为靶向载体，不同部分是分别带上各种致炎因子的单链抗体或PE40，将其作为药物弹头；
所述的致炎因子的单链抗体选自MIF、HMGB1、ICAM-I的单链抗体中的任意一种。
2、根据权利要求1所述的系列靶向药物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I抗体可变区基因的克隆
①采用单克隆抗体技术筛选获得HA、NA、MIF、HMGB1和ICAM-I的单克隆抗体细胞株；
②以RT-PCR方法克隆HA、NA、MIF、HMGB1和ICAM-I抗体可变区基因；
2)单链抗体基因或单链双特异抗体基因的构建
①将HA或NA的抗体可变区基因通过SOE-PCR法构建成HA或NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因；
②将MIF、HMGB1和ICAM-I抗体可变区基因通过SOE-PCR法构建成MIF、HMGB1和ICAM-I单链抗体基因；
3)系列靶向药物原核表达载体的构建与靶向药物的制备
①通过酶切、连接的方法将HA或NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与MIF单链抗体基因相连，克隆入原核表达载体PET-28中，构建MIF靶向拮抗剂原核表达载体；
②通过酶切、连接的方法将HA或NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与HMGB1单链抗体基因相连，克隆入原核表达载体PET-28中，构建HMGB1靶向拮抗剂原核表达载体；
③通过酶切、连接的方法将HA或NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与ICAM-I单链抗体基因相连，克隆入原核表达载体PET-28中，构建ICAM-I靶向拮抗剂原核表达载体；
④通过酶切、连接的方法将HA或NA单链抗体基因或HA-NA单链双特异抗体基因与与含有PE40的PET-28质粒相连，构建重组PE40靶向药物原核表达载体；
⑤重组质粒转化、表达、纯化、复性。
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