CN104619354A - 用于治疗糖尿病的组合物和方法 - Google Patents

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达伦·J·法尔克
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拉拉·罗伯特·德鲁伊索
曹特里·马
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Abstract

本发明提供了使用涉及rAAV介导之治疗有效分子的递送来治疗疾病如庞皮病的组合物和方法。这些组合物与多种施用途径和方法组合，导致治疗性分子在特定器官、组织和细胞中靶向表达。

Description

用于治疗糖尿病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请是于2012年6月19日提交的美国申请序列号13/527,350的部分继续申请；其是于2010年4月12日提交的美国申请序列号12/305,869的部分继续申请；其是于2008年2月25日提交的国际申请号PCT/US2008/054911的§371国家阶段申请，其要求于2007年2月23日提交的美国临时申请号60/891,369的优先权权益，所有这些均通过引用以其整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在国立卫生研究院心肺血液研究所(Heart，Lung and BloodInstitute of the National Institutes of Health)授予的基金号HL59412和NIH 5F32HL095282-03的美国政府支持下完成的。美国政府对本发明享有某些权力。
技术领域
本发明一般性地涉及分子生物学、基因疗法和医学领域。在一个实施方案中，本发明提供了用于神经肌肉疾病和溶酶体贮积病的基于基因疗法的治疗。
背景技术
庞皮病(Pompe disease)是酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺陷导致的溶酶体和糖原贮积病二者。GAA通常在溶酶体中作用，在溶酶体中，其通过切割α-1，4和α-1，6糖苷键降解过量的糖原。GAA活性不足时，所有细胞中将积累大量糖原。虽然在庞皮病中溶酶体糖原为全身性积累，但是常规上将骨骼肌和心肌功能障碍视为这种疾病中肌肉无力的主要基础。
发明内容
本发明提供了用于向多种组织、器官和细胞(包括骨骼肌、心脏和CNS)递送治疗性基因以用来恢复神经肌肉接点(neuromuscularjunction)完整性和/或治疗神经肌肉疾病以及糖原贮积病的rAAV载体。有利地，本发明的rAAV载体提供了目的治疗性基因在对象中的长期、持续表达。
在某些实施方案中，本发明提供了用于神经肌肉疾病的治疗，所述神经肌肉疾病包括，但不限于：庞皮病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、1a型糖原贮积病、肢带型肌营养不良(limb Girdle musculardystrophy)、Barth综合征(Barth syndrome)和重症肌无力。
在一个实施方案中，本文描述了用于治疗溶酶体贮积病(例如，糖原贮积病，如庞皮病)的组合物和方法。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。
在一个实施方案中，本文描述的方法包括向具有酸性α-葡糖苷酶缺陷的哺乳动物对象施用包含至少一种rAAV病毒体的组合物，所述rAAV病毒体包含编码酸性α-葡糖苷酶的多核苷酸，所述多核苷酸设置在第一AAV反向末端重复和第二AAV反向末端重复之间，其中所述组合物的施用导致所述哺乳动物对象中运动神经元功能的提高。所述哺乳动物对象可患有庞皮病。所述组合物经静脉内、鞘内或肌内施用。在一个实施方案中，所述至少一种rAAV病毒体可包含血清型1、8、9和/或rh10衣壳蛋白。所述组合物可施用至哺乳动物对象的隔膜(diaphragm)并通过逆行运输(retrograde transport)输送到至少一个运动神经元，或者可以直接施用至中枢神经系统。
本文描述的另一种方法包括向患有庞皮病的哺乳动物对象施用包含编码酸性α-葡糖苷酶之至少一种病毒载体的组合物，其中所述组合物的施用导致所述哺乳动物对象中运动神经元功能的提高并治疗庞皮病。所述至少一种病毒载体可以是rAAV载体。所述组合物可经鞘内、静脉内、肌内或肠胃外途径施用。在一个实施方案中，所述rAAV载体可在包含血清型1、8、9和/或rh10衣壳蛋白的rAAV病毒体内。
所述组合物可施用至哺乳动物对象的隔膜然后通过逆行运输输送到至少一个运动神经元，或者可以施用至中枢神经系统。
虽然可使用与本文描述的那些类似或相当的组合物和方法来实践或测试本发明，但是下文描述了合适的组合物和方法。本文提到的所有出版物、专利申请和专利均通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。以下讨论的一些特定实施方案仅用于说明，而不旨在进行限制。
附图简述
在所附权利要求中具体指明了本发明。通过参考以下结合附图的描述，本发明的上述以及其他优点将更容易理解，其中：
图1A、图1B和图1C是染色的心脏组织的扫描照片，并且图1D是示出静脉内递送rAAV2/9导致心脏高水平转导的图。通过之前描述的颞静脉递送途径，向1天大的C57BL6/129SvJ新生小鼠(n＝5)注射携带有CMV-lacZ构建体之1×1011vg的rAAV假型AAV2/1、AAV2/8和AAV2/9。在注射后4周时，进行β-半乳糖苷酶检测测定以量化lacZ表达水平。图1A、图1B和图1C示出了来自用AAV2/1(图1A)、AAV2/8(图1B)和AAV2/9(图1C)注射之心脏的X-Gal染色的冷冻切片。图1D示出了心脏中的β-半乳糖苷酶水平(n＝5)。
图2A和图2B是示出了在递送rAAV2/8-CMV-lacZ或rAAV2/9-CMV-lacZ构建体之后的多个标本中检测的β-半乳糖苷酶水平的表达分布分析的图。图2A示出了与心肌相比整个肌肉组织中的生物学分布。Ht表示心脏；Di，隔膜；Qu，四头肌；So，比目鱼肌；ED，趾长伸肌；TA，胫骨前肌(tibialis anterior)。图2B示出了非骨骼肌中表达的生物学分布。Br表示脑；Lu，肺；Sm，小肠；Ki，肾；Spl，脾。
图3A、图3B和图3C是示出了在rAAV2/9介导的CMV-lacZ递送后之时间进程测定的图。图3A：在使用rAAV2/9递送转基因之后，施用后4周时骨骼肌中的表达水平达到平台，而心脏中在实验的8周持续时间内持续提高。图3B示出，在实验持续期间，心脏组织中每个细胞的载体基因组也持续增加，但是骨骼肌中并非如此。图3C示出在实验期间，心脏组织中的RNA转录本也增加(每个时间点n＝4)。
图4A是示出了来自在出生1天时注射1×1011vg rAAV2/9-CMV-lacZ之小鼠的心脏和骨骼肌(施用后4周时)的β-半乳糖苷酶表达水平分析的图。图4B是示出了来自在3个月大时通过颈静脉注射1×1011vgrAAV2/9-CMV-lacZ之小鼠(n＝3)的心脏和骨骼肌(施用后4周)的β-半乳糖苷酶表达水平分析的图。图5A是示出了来自在出生时静脉内注射rAAV2/1-CMV-hGaa或rAAV2/9-CMV-hGaa之恒河猴(rhesus macaque)的心脏组织标本中的GAA活性的图。Y轴表示每个递送的载体基因组的总GAA活性减去来自未注射的对照的背景活性。图5B是证明来自在出生时静脉内注射rAAV2/9-CMV-hGaa之恒河猴的心脏和骨骼肌组织之间的载体基因组生物学分布谱的图。所有数据是载体施用后6个月时的数据。
图6A、图6B和图6C是示出了6个月(图6A)、12个月(图6B)和＞21个月(图6C)的对照和GAA-/-小鼠在基线和高二氧化碳(hypercapnia)下10分钟期间的分钟通气量(minute ventilation)(mL/分钟)之结果的图。平均值±SEM；＊＝GAA-/-与对照有差异，
图7A是示出了对照、GAA-/-和肌肉特异性GAA小鼠在基线下的分钟通气量以及对高二氧化碳之平均响应的结果的图。肌肉特异性GAA小鼠被维持在GAA-/-背景下，但是仅在骨骼肌中表达GAA。图7B是示出了12个月大的对照、GAA-/-和肌肉特异性GAA小鼠隔膜之隔膜收缩功能的结果的图。
图8是示出了平均吸气流量(inspiratory flow)的图，提供了对神经驱动呼吸的估计。6个月、12个月和21个月的对照和GAA-/-小鼠中的基线平均吸气流量。平均值±SEM；＊＝与对照不同；没有年龄或性别差异。
图9A是这样的图，而且图9B是这样的组织染色，其示出了对于6个月、12个月和＞21个月大的对照和GAA-/-小鼠的脊髓节段C3-C5的糖原定量的结果(图9A)。膈运动神经元群(phrenic motor pool)在颈部脊柱节段C3-C5中。用高碘酸希夫染色的组织学糖原检测(图9B)。通过向隔膜施加逆行神经元示踪剂来鉴定膈运动神经元(箭头)。
图10A是示出了对照和GAA-/-小鼠在运动时间平均值的30秒峰振幅之结果的图。PaCO2值类似。图10B是示出来自机械通气的对照和具有类似PaCO2值的GAA-/-小鼠的原始膈神经纤维分布图(neurogram)(上图)和运动时间平均值(下图)之结果的神经纤维分布图。两个图中的比率尺、放大器增益、过滤器设置和记录配置相同。
图11是示出静脉内注射rAAV2/1导致受影响的隔膜组织中糖原清除的图。注射后1年，将来自静脉内施用rAAV2/1-CMV-GAA的Gaa-/-小鼠和未处理的年龄匹配的对照Gaa-/-小鼠的隔膜组织固定并用高碘酸-希夫(PAS)通过标准方法染色(Richard Allen，Kalamazoo，MI)。使用Zeiss光学显微镜、Olympus相机和数字记录系统拍照。放大率为×400。
图12A、图12B、图12C和图12D是一系列图，示出递送(systemicdelivery)rAAV2/1-CMV-hGAA在处理后6个月时能够改善响应于高二氧化碳的通气。使用气压全身体积描记术对经处理的Gaa-/-(n＝6)和年龄匹配的未处理Gaa-/-以及C57BL6/129SvJ(n＝10)的通气进行评估。＊＝p≤0.05。
图13A、图13B、图13C和图13D是一系列图，示出全身递送rAAV2/1-CMV-hGAA在处理后12个月时改善了响应于高二氧化碳的通气。使用气压全身体积描记术对经处理的Gaa-/-(n＝12)和年龄匹配的未处理Gaa-/-以及C57BL6/129SvJ(n＝10)的通气进行评估。＊＝p≤0.05。
图14A、图14B、图14C和图14D是一系列图，示出在AAV2/1处理小鼠中通气功能显著改善。通气功能通过醒的、无束缚的全身气压体积描记术评估。图示出了10分钟时段内响应于高二氧化碳的分钟通气量。
图15A、图15B、图15C和图15D是一系列图，示出在AAV2/1处理小鼠中通气功能显著改善。图示出了在10分钟的时段内响应于高二氧化碳的峰吸气流量。
图16是Fuller膈脉冲串振幅-混合(Fuller Phrenic BurstAmplitude-Hybrid)的示意图。以伏特测量的膈脉冲串振幅描述了随每次吸气的膈神经的量级。GAA动物中的较低电压指示缺陷的膈运动神经元功能。该图示出了在向隔膜递送AAV-GAA后膈输出的恢复。
图17A、图17B、图17C、图17D、图17E、图17F和图17G是说明颈脊髓(C3-C5)糖原含量的膈运动神经元的图(图17A)和一系列照片(图17B-图17G)。对6、12和＞21个月大的对照和Gaa-/-小鼠中脊髓的生物化学糖原定量(μg糖原/mg湿重)(图17A)。＊＝Gaa-/-与对照差异，p＜0.01，p＜0.01。相对于对照(图17B)，在Gaa-/-小鼠颈脊髓(图17E)中，多运动神经元群表现出对糖原的阳性染色。用标记对照(图17C)和Gaa-/-(图17F)小鼠中的膈运动神经元。Gaa-/-标记的膈运动神经元表现出相对于对照膈运动神经元(图17D)对糖原更强的染色(图17G)。
图18A和图18B是一对图，示出了分钟通气量的年龄依赖性下降。评估6、12、＞21个月的对照和GAA缺陷小鼠的Ve/VCO2(A)和分钟通气量(B)。与对照相比，GAA KO小鼠的Ve/VCO2和分钟通气量为正常值的1/2。
图19A、图19B和图19C说明了响应于高二氧化碳的分钟通气量。6个月(图19A)、12个月(图19B)和＞21个月(图19C)大的对照和Gaa-/-小鼠的60分钟基线(21％O2，余下为N2)和10分钟响应于高二氧化碳(7％CO2，余下为O2)的分钟通气量。＊＝对照与Gaa-/-有差异，p＜0.01。
图20A和图20B是一对图，并且图20C是示出了肌肉特异性hGaa小鼠的一系列迹线(tracing)。B6/129(n＝3)、Gaa-/-(n＝3)和肌肉特异性hGaa小鼠(n＝6)的力频率测量(“force frequency measurement”)(图20A)。与对照和肌肉特异性hGaa小鼠有差异。B6/129、Gaa-/-和肌肉特异性hGaa小鼠(n＝8/组)的基线分钟通气量以及对高二氧化碳的平均响应(图20B)。＊＝与对照有差异，￥＝所有组彼此有差异。所有值在p＜0.01时被认为是显著的。图20C中提供了平静呼吸(基线)和呼吸攻击(高二氧化碳)期间来自未麻醉小鼠的代表性气流迹线。所有图中的比例相同。气流刻度为mL/秒。
图21A是这样的图，并且图21B是这样的一系列迹线，其示出了膈吸气脉冲串振幅(burst amplitude)。具有类似动脉PaCO2值的对照、Gaa-/-和肌肉特异性hGaa小鼠的30秒平均膈吸气脉冲串振幅(在图中示出)。＊＝与对照差异，p＜0.01。示出了代表性对照、Gaa-/-和MTP小鼠的原始膈振幅(上迹线)和校正、整合的迹线(下迹线)(每个图中的比例尺相同)。
图22是琼脂糖凝胶的照片，其示出在载体递送后分离自隔膜的基因组DNA包含对照基因。
图23是凝胶的照片，其示出分离自膈细胞核的基因组DNA。
图24是示出在用AAV-CMV-GAA(2.52×1010颗粒)注射后4周通气改善的图。
图25示出了在直接向Gaa-/-动物中肌内注射AAV2/9-GAA的基因组拷贝后，胫骨前肌(TA)和腰脊髓(lumbar spinal cord)中载体基因组的拷贝。简言之，Gaa-/-动物在胫骨前肌肌肉中接受AAV2/9-DES-GAA或AAV2/9-CMV-GAA载体的单次注射。注射后28天，评估胫骨前肌和腰脊髓中的载体基因组拷贝。两种构建体均证明骨骼肌有效转导并逆行运输治疗性转基因。图26示出了在胫骨前肌中单次注射AAV2/9-hGAA之后庞皮病动物中的载体基因组拷贝和GAA酶活性。示出了注射后1个月时胫骨前肌(A)和(B)腰脊髓中的Vg拷贝。PCR数据表明脊髓中AAV载体的充分逆行转导。(C)注射部位(TA)的GAA活性水平，导致Gaa-/-小鼠中的酶促水平显著提高。
图27示出了在胫骨前肌中单次注射AAV2/9-DES-hGAA之后神经肌肉接点(NMJ)的染色。NMJ的免疫染色表明rAAV2/9介导的hGAA递送导致庞皮病的病理逆转，以及经处理Gaa-/-动物中的NMJ恢复。
图28示出了在小鼠C3-C5区直接脊柱内注射AAV报道构建体之后，膈运动神经元群的转导。(A)固定的完整脑和脊髓制备物中注射部位的AAV报道构建体的阳性检测(＊)。(B)AAV-GFP的截面表面荧光检测证明了膈运动群的转导。
图29示出了在小鼠C3-C5区直接脊柱内注射AAV-GAA之后，膈运动神经元群中GAA蛋白表达的免疫组织化学检测。在(A)低放大率和(B)更高放大率下示出了膈运动神经元群中AAV-GAA的检测。深褐色染色对于GAA蛋白检测呈阳性。
图30示出了小鼠中胸内注射红外染料。图像指示了整个隔膜表面染料的阳性检测。
图31示出了胸内注射AAV载体之后，高二氧化碳条件下的隔膜和膈运动神经元活性。与AAV2/9-CMV-GAA和AAV2/9-DES-GAA处理的动物相比，未处理的Gaa-/-动物表现出弱的钝性EMG(隔膜)和脉冲串振幅(膈神经)。
图32示出颈和胸脊髓中AAV报道基因的检测。抗GFP免疫组织化学染色检测了阳性膈(左)和肋(右)运动神经元染色，证明胸内施用AAV2/9导致逆行转导。
图33示出向Gaa-/-动物胸内施用rAAV2/9-CMV-GAA或rAAV2/9-DES-GAA载体之后，隔膜EMG(A)、AAV基因组载体的拷贝(B)和改善的膈神经信号传播(C)。
图34示出了静脉内施用AAV2/9-CMV-GAA或AAV2/9-DES-GAA载体之后，Gaa-/-动物中病理症状的校正。(A)示出了注射后三个月时的射血分数(ejection fraction)。AAV-DES处理的动物表现出射血分数的显著提高。平均值和sem(n＝6)。(B)示出了在注射后一个月和三个月时，所有的处理均导致体重显著增加。(C)示出了处理后一个月和三个月时的PR间隔。(D)示出了静脉内注射后心脏功能的改善。(E)示出了静脉内施用后心脏中的GAA酶促活性。(F)经AAV2/9-CMV和AAV2/9-DES-GAA处理动物之隔膜的体外力频率测量，表现出提高的最大强直(titanic)力。平均值和sem(n＝6)。＊与未处理小鼠相比，P值≤0.05。AAV2/9-GAA处理导致频率超过60Hz的收缩功能改善。(G)示出了呼吸肌中的GAA酶活性。(H)示出了静脉内施用AAV2/9-CMV和AAV2/9-DES-GAA载体之后，心脏、隔膜和脊髓中的载体基因组拷贝。(I)示出了静脉内施用AAV2/9-CMV和AAV2/9-DES-GAA载体之后GAA的表达水平。
图35是AAV和HSV病毒的示意图。示出了野生型和重组基因组的主要遗传元件。
图36说明了使用贴壁细胞通过HSV共感染法产生AAV。1以及2)rHSV储液(stock)的产生；3)用rHSV共感染；4)收获和恢复rAAV。
图37示出了通过pI沉淀和柱色谱对rAAV2/9进行流线式纯化。(A)粗制裂解物(泳道1)、微流化后的粗制裂解物(泳道2)、pI沉淀后保留AAV2/9的上清液(泳道3)的银染色的PAGE；(B)SP琼脂糖凝胶IEC和浓缩后，pI纯化的含rAAV2/9之级分(泳道2至7)的银染色的PAGE。
图38是对野生型和Gaa-/-小鼠中坐骨神经截面的评估。Gaa-/-小鼠表现出不规则的形态(morphometry)，并且胞外基质的量增加。
图39示出了H&E的染色的纵向神经切片。野生型和Gaa-/-小鼠的比较揭示了增加的细胞核染色，这表明施万细胞的去分化和增殖。
图40是对野生型和Gaa-/-小鼠中比目鱼肌的神经肌肉接点完整性的评估。(A)来自比目鱼肌的纵切片。注意，其中神经肌肉接点解离的Gaa-/-的显著变化很明显。(B)小鼠隔膜整体装片(whole mount)中的神经肌肉接点。Gaa-/-隔膜中的典型完整神经肌肉接点(箭头)和非典型神经肌肉接点(＊)。α-银环蛇毒素(红色)和神经丝H(绿色)。
图41示出了隔膜NMJ的形态测定分析。与WT相比，Gaa-/-乙酰胆碱受体(AcR)显著更多。注意Gaa-/-中α-银环蛇毒素标记的表观聚焦(apparent focal)和不一致的外观。
图42示出了WT和Gaa-/-小鼠中坐骨神经的截面。Gaa-/-小鼠显示出不规则的轴突形态和胞外基质的增加。
图43示出了NMJ处突触结合蛋白的丧失。与野生型(A)相比，Gaa-/-动物(B)表现出突触结合蛋白表达的明显丧失。洋红色-NFH。
图44示出了动物中rAAV介导之GAA表达的一种实验设计。
图45示出了用AAV2/9-结蛋白-GAA注射的Gaa-/-小鼠的腿中乙酰胆碱受体尺寸的减小。Gaa-/-动物表现出AChR尺寸的显著增加，而AAV2/9-结蛋白-GAA处理后，AChR尺寸的减小提供了对NMJ病理的积极治疗效果。在23月龄的Gaa-/-小鼠中，在将AAV2/9-结蛋白-GAA载体直接注射到右胫骨前肌肌肉中后2个月，测量注射的腿和对侧腿中乙酰胆碱受体(AChR)的尺寸。
图46示出与野生型(WT)动物相比，Gaa-/-动物表现出NMJ完整性的丧失。接点的正常化似乎发生在施用AAV9-GAA后一个月(右图)。
图47示出了AAV2/9-GAA处理的Gaa-/-动物中的轴突标记(Gap43)。
图48示出了脊柱内递送AAV-GAA后Gaa-/-小鼠的通气。载体处理的小鼠(虚线)在基线(左图)和高二氧化碳呼吸挑战(右图)下表现出改善的通气参数。
发明详述
本发明提供了用于向多种组织、器官和细胞(包括骨骼肌、心脏和CNS)递送治疗性基因以用于恢复神经肌肉接点完整性和/或用于治疗神经肌肉疾病的rAAV载体。有利地，本发明的rAAV载体提供了目的治疗性基因在对象中的长期、持续表达。
在一个实施方案中，本发明提供了包含rAAV载体的重组腺相关病毒(AAV)病毒体，所述rAAV载体包含异源核酸分子(也称为转基因或治疗性基因)，并且所述AAV载体被病毒衣壳包裹。
在一些特定实施方案中，rAAV病毒体包含含有编码目的蛋白质或多肽的异源核酸分子(也称为转基因或治疗性基因)的rAAV载体，
其中所述异源核酸分子与能够指导目的蛋白质或多肽之体内或体外表达的控制元件(例如，启动子、增强子)有效连接，
其中所述异源核酸分子每一端侧翼均为AAV反向末端重复，并且
其中所述rAAV载体被病毒衣壳包裹。
在一个优选实施方案中，本发明涉及假型rAAV载体。在某些实施方案中，本发明涉及rAAV2/x载体，其包含AAV2载体基因组和AAVx(例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAVrh10)的衣壳。在一些优选实施方案中，本发明涉及rAAV2/1(在图中也被称为rAAV1)、rAAV2/5、rAAV2/8(在图中也被称为rAAV8)和rAAV2/9(在图中也被称为rAAV9)载体。
在一个实施方案中，rAAV载体包含巨细胞病毒(CMV)启动子。在另一个实施方案中，rAAV载体包含结蛋白(DES)启动子。在一个特定实施方案中，rAAV载体包含用于转基因之组织特异性表达的调控元件，例如，肌细胞特异性增强子因子2(MEF2)和myoD增强子元件。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的包含本发明rAAV载体的组合物。
在一个特定实施方案中，本发明提供了用于恢复对象中神经肌肉接点完整性和/或用于改善神经肌肉接点完整性受损的方法，其中所述方法包括向所述对象施用有效量的包含本发明rAAV载体的组合物。在某些实施方案中，神经肌肉完整性受损是由神经肌肉疾病或损伤造成的。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于通过向目的细胞中递送治疗性基因来治疗疾病的方法，其中所述方法包括向细胞中引入有效量的包含本发明rAAV载体的组合物。
在某些实施方案中，通过静脉内、肌内、胸内、鞘内、脑池内或脊柱内注射来施用本发明的rAAV载体。在某些实施方案中，将rAAV载体施用到对象的骨骼肌、隔膜、肋和/或心肌细胞。在某些实施方案，通过直接或逆行运输将rAAV载体递送到外周和/或中枢神经系统的神经元细胞。
在某些实施方案中，本发明提供了对于神经肌肉疾病的治疗，所述神经肌肉疾病包括但不限于：庞皮病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、1a型糖原贮积病、肢带型肌营养不良、Barth综合征和重症肌无力。
在一个实施方案中，rAAV载体包含编码GAA的治疗性基因，并且将所述rAAV载体递送到中枢神经系统(例如，脊髓和脑)以减少患有庞皮病对象之中枢神经系统中的糖原积累。
在另一个实施方案中，本发明提供了对于非庞皮病的神经肌肉疾病的治疗。在另一个实施方案中，本发明改善了未患有庞皮病之对象中的神经肌肉接点完整性受损。使用庞皮病的动物模型作为一个实例，说明了本发明的rAAV载体导致编码GAA的治疗性基因被有效递送到了目的细胞、组织或器官中。还使用庞皮病的动物模型作为一个实例，说明了本发明的rAAV载体导致神经肌肉接点完整性得到了改善。鉴于这些实例，本领域技术人员将容易认识到，本发明的rAAV载体还可用于向目的细胞、组织和器官(例如，神经元细胞)递送其他治疗基因，从而提供对未患有庞皮病的对象中神经肌肉疾病的治疗和/或改善神经肌肉接点完整性。
在某些实施方案中，本文描述了用于治疗具有GAA缺陷之哺乳动物对象的组合物和方法，所述组合物和方法包括具有表达GAA之rAAV载体的rAAV病毒体。在一个实施方案中，包含表达治疗性分子之rAAV血清型(例如，血清型1-10，或者其衍生物)的组合物结合静脉内施用途径导致rAAV血清型更容易能够穿过脉管系统并优选转导特定组织类型(例如，心脏组织、隔膜组织、中枢神经系统组织)。
在另一个实施方案中，对AAV进行修饰以包含细胞和/或组织特异性配体，使得能够系统地施用组合物并且直接特异性吸收到靶标中。
当考虑到载剂(vehicle)用于在哺乳动物中递送基因的那些期望特性时，(4.7-kb)非致病性细小病毒rAAV作为一种有吸引力的选择浮现了出来，主要是因为其小的尺寸以及被证明能够在被感染细胞中持续很长一段时间的能力。rAAV是需要辅助病毒(例如疱疹病毒或腺病毒)以进行复制的单链DNA病毒。伴随最近发现的rAAV的额外血清型，已经有可能根据需要选择具有最有利向性来靶向和/或避开组织的那些以用于特定应用。用于任何治疗应用的最佳基因递送系统将结合临床有利的物理递送途径以及对特异性目的靶组织具有最高天然亲和力的rAAV血清型。
在一个典型实施方案中，组合物包含rAAV病毒体，所述rAAV病毒体具有编码GAA的rAAV载体，其改善具有GAA缺陷(例如，庞皮病)之哺乳动物对象中的膈神经功能。所述rAAV病毒体可直接转导到中枢神经系统中，或可转导到其他组织类型(例如，隔膜)中并通过逆行运输输送到中枢神经系统。通过改善具有GAA缺陷之哺乳动物(例如人)对象中的膈神经功能，使得可校正呼吸缺陷(例如，降低的通气、降低的心脏功能等)。
在另一个实施方案中，通过静脉内施用(例如，全身递送)来进行rAAV的施用。在一个典型实施方案中，使用全身递送，因为其影响疾病的心脏、肌肉和呼吸方面。
用于治疗溶酶体贮积病(LSD)的不同治疗分子的其他实例包括但不限于：胡尔勒病(Hurler disease)：α-L-艾杜糖醛酸酶；Hunter症：艾杜糖醛酸硫酸酯酶；桑菲利波(Sanfilippo)：类乙酰肝素N-硫酸酯酶；Morquio A：半乳糖-6-硫酸酯酶；Morquio B：酸性-β-半乳糖苷酶；斯莱病(Sly disease)：β-葡萄糖醛酸苷酶；I-细胞病：N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移酶；Schindler病：α-N-乙酰半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶B)；沃尔曼病(Wolman disease)：酸性脂肪酶；胆固醇酯：酸性脂肪酶；贮积病；法伯病(Farber disease)：溶酶体酸性神经酰胺酶；尼-皮病(Niemann-Pickdisease)：酸性鞘磷脂酶；戈谢病：β-葡糖苷酶(葡糖脑苷酯酶)；克拉伯病(Krabbe disease)：半乳糖神经酰胺酶；法布里病(Fabry disease)：α-半乳糖苷酶A；GM1神经节苷脂病：酸性β-半乳糖苷酶；半乳糖唾液酸贮积病：β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；泰-萨病(Tay-Sach’s disease)：己糖胺酶A；桑德霍夫病：己糖胺酶A和B；神经元蜡样质：棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT)；神经元蜡样质：三肽基氨基肽酶I1(TPP-I)。可将编码目的治疗性分子的异源核酸分子或转基因插入到本发明的rAAV载体中用于治疗溶酶体贮积病。
II型糖原贮积病(GSD II；庞皮病；酸性麦芽糖酶缺陷)是溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(酸性麦芽糖酶)缺陷造成的。区分了三种临床形式：婴儿、幼年和成人。婴儿GSD II在出生后不久就发作，并且表现为进行性肌无力和心脏衰竭。在生命的头两年中，这种临床变化是致命的。成人和幼年患者中的症状在生命中出现的稍晚，主要涉及骨骼肌和神经元。患者最终死于呼吸功能不全。患者可例外地存活超过60十年。疾病的严重程度和残余的酸性α-葡糖苷酶活性有良好的联系，在晚发类型中，活性是正常的10-20％，而在早发的疾病形式中，活性小于2％。
庞皮病是具有溶酶体糖原降解酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺陷的先天性代谢缺陷，其最终导致所有组织，尤其是横纹肌中的糖原积累。在历史上，肌肉无力被认为是患者群体中呼吸功能缺陷的主要原因，而其他机制尚未被研究。为了进一步评估呼吸功能不全的起作用机制，使用庞皮病的动物模型(Gaa-/-小鼠模型)。在平静呼吸和高二氧化碳期间，对Gaa-/-和对照小鼠的通气(ventilation)进行量化。在6、12和＞21月龄的Gaa-/-小鼠中，削弱所有通气变量，并且伴随有提高的颈脊髓(C3-C5)糖原含量。仅在骨骼肌中表达Gaa的转基因小鼠具有与Gaa-/-类似的分钟通气量，但是隔膜肌肉功能正常，证明肌肉功能障碍以外的机制也对通气受损有贡献。与对照(49.7±13.9mV)相比，Gaa-/-小鼠中的传出膈神经吸气脉冲串振幅(mV)较低(5.2±1.2mV)，但是其具有类似的PaCO2水平(53.1±1.2vs.52.2±1.4mmHg)。数据表明，在庞皮病中通气的神经控制是缺陷的，并且支持以下结论：1)Gaa-/-小鼠再演(recapitulate)临床GSDII呼吸缺陷，2)骨髓糖原积累可损害运动输出(motor output)，以及3)在GSDII中，呼吸神经控制可能受损。
婴儿型庞皮病具有快速发展的心肌病，并且表现出肌病和神经病，导致通常在生命的第一年死亡。使用高碘酸-希夫试剂(PAS)染色以评估小鼠中的隔膜切片，检查Gaa-/-小鼠中糖原沉积的进展。在12月龄时，在Gaa-/-动物的隔膜切片中有明显的分布广泛的和扩散的糖原沉积物。Gaa-/-动物中不仅有下降的隔膜收缩性能，而且收缩功能也随着年龄进行性恶化。体外力频率测量说明了3、6和12月龄的Gaa-/-小鼠中收缩功能的进行性损失。GAA中的缺陷导致效率低下的糖原清除，导致细胞形态和功能的破坏。庞皮病患者的组织活检显示了空泡化、溶酶体糖原积累以及随之发生的呼吸肌肉无力。
另外，最近发现了中枢神经系统内糖原积累的效果及其对骨骼肌功能的影响。本发明人检测到了Gaa-/-小鼠脊髓内的大量糖原沉积。特别地，PAS染色示出了脊髓截面的运动神经元中糖原的程度和定位。在一些情况下，运动神经元表现为溶胀，并且在整个截面中溶胀程度不同。在高二氧化碳攻击(hypercapnic challenge)后，野生型和Gaa-/-动物中的膈神经记录表现出脉冲串幅度水平的明显差异。在体积描记术测量的过程中，本发明人还发现肌肉特异性GAA小鼠(在骨骼肌中表达GAA，但是在CNS中不表达)依然表现出功能呼吸缺陷。所述结果表明了Gaa-/-动物和庞皮病患者中CNS介导的呼吸功能障碍。
动物模型中出现的庞皮病的显著特征是深度骨骼肌病造成的严重驼背。Gaa-/-动物在约9-12月龄时发生严重驼背。已经描述了庞皮病影响的个体中发生的中性白细胞减少，并且这在动物模型中是明显的，其中肌肉无力最终影响营养摄取。用AAV-CMV-GAA处理的Gaa-/-小鼠未发生驼背。随着骨骼肌质量和强度的保留，经处理动物能够保持充足的营养摄取，因此在功能上与野生型小鼠类似。
Gaa-/-小鼠模型表现出与CNS和骨骼肌中的糖原贮积有关的进行性病理。本发明人已报道了在庞皮病鼠模型中CNS在促进呼吸功能障碍中的特定作用。在其他神经肌肉病症中，由于CNS或骨骼肌异常，出现了NMJ和运动神经元中的适应。已报道在晚发型庞皮病患者中疲劳明显，并且可能是由基于神经的缺陷造成的，但是多数保持集中于骨骼肌的缺陷。
根据本发明，由18个月大的野生型或Gaa-/-动物收获坐骨神经。如图38所示，在来自Gaa-/-动物的神经截面中，髓鞘质的量和厚度、轴突的直径似乎有变化，并且表现出胞外基质量的增加。另外，来自Gaa-/-动物坐骨神经的纵切面表现出细胞核染色的增加，表明施万细胞的去分化和增殖(图39)。还在常规神经肌肉疾病中观察到了庞皮病中坐骨神经样品的染色模式，所述常规神经肌肉疾病例如肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、Ia型糖原贮积症、肢带型肌营养不良、Barth综合征和重症肌无力。
存在于患有神经肌肉疾病的患者中的疲劳可能是由于E-C偶联受损和其他机制。在比较了来自比目鱼肌和整体装片隔膜制备物之纵切片的神经肌肉接点(图40)之后，本发明人注意到与神经肌肉接点相关的突然变化。引入整体装片隔膜制备物提供了对神经肌肉接点整体状态的深入图像。与野生型隔膜相比，来自Gaa-/-动物的隔膜制备物表现出接点的进一步和清楚变形(distortion)。
戈谢病是常染色体隐性溶酶体贮积病，其以水解糖脂葡糖脑苷脂的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(“GCR”)的缺陷为特征。在戈谢病中，降解酶的缺陷造成糖脂葡糖脑苷脂主要在肝、脾和骨髓中之吞噬细胞的溶酶体中大量积累，糖脂葡糖脑苷脂主要产生自白细胞和衰老红细胞之膜的葡糖鞘脂类降解。疾病的临床表现包括脾肿大、肝肿大、骨骼病症、血小板减少和贫血。例如，参见美国专利号6,451,600。
泰-萨病是脂质代谢的致死性遗传病症，其特别在CNS组织中由于β-己糖胺酶的A(酸性)同工酶缺陷为特征。编码β-己糖胺酶α亚基的HEXA基因的突变造成A同工酶缺陷。泰-萨病是一组病症(GM2神经节苷脂病)的原型，其以缺陷的GM2神经节苷脂降解为特征。GM2神经节苷脂(单唾液酸化神经节苷脂2)在胎儿时就开始在神经元中积累。GM1神经节苷脂病由β-半乳糖苷酶的缺陷造成，其导致GM1神经节苷脂(单唾液酸化神经节苷脂1)的溶酶体贮积。桑德霍夫病由β-己糖胺酶的A和B(碱性)同工酶二者的缺陷造成。编码β-己糖胺酶β亚基的HEXB基因的突变造成B同工酶缺陷。
另一种LSD由碳水化合物切割溶酶体酶α-L-艾杜糖醛酸酶的遗传缺陷造成，其造成粘多糖病I型(MPS I)(E.F.Neufeld和J.Muenzer，1989；美国专利号6,426,208)，还参见The Metabolic Basis of Inherited Disease(C.R.Scriver，A.L.Beaudet，W.S.Sly和D.Valle，编著)，第1565-1587页，McGraw-Hill，New York中的″The mucopolysaccharidoses″。在严重形式下，MPS I通常被称为胡尔勒综合征，并且与多种问题有关，例如精神发育迟缓、角膜混浊、粗糙的脸部特征(coarsened facial feature)、心脏病、呼吸疾病、肝和脾增大、疝和关节僵硬。患有胡尔勒综合征的患者通常在10岁之前死亡。在称为胡-沙综合征(Hurler-Scheie syndrome)的中间形式中，精神功能通常不会被严重影响，但是生理问题可导致到十几岁或二十几岁时死亡。沙伊综合征(Scheie syndrome)是最温和形式的MPS I，并且通常伴随着正常寿命，但是关节僵硬、角膜混浊以及心脏瓣膜疾病造成严重问题。
法布里病是X连锁的遗传性溶酶体贮积病，其以症状(例如严重的肾损害、血管角质瘤和心血管异常)为特征，包括心室增大和二尖瓣关闭不全(美国专利号6,395,884)。所述疾病还影响外周神经系统，造成痛的发作(episode of agonizing)、四肢中的灼痛。法布里病由酶α-半乳糖苷酶A(α-gal A)的缺陷造成，其导致细胞和血流中中性糖鞘脂的分解代谢阻滞，以及酶底物神经酰胺三己糖苷的积累。由于疾病的X连锁遗传方式，基本所有的法布里病患者都是雄性。虽然已经观察到了少数严重受影响的雌性杂合子，但是雌性杂合子通常无症状或具有相对轻微的症状，大多局限于角膜的特征性不透明。法布里病的一种非典型变型表现出低的残余α-gal A活性以及非常轻微的症状或者看起来没有法布里病的其他症状特征，其与左心室肥大和心脏病有关。已经推断，α-gal A的减少可能是这样的心脏异常的原因。
I-细胞病是一种由于溶酶体酶中不存在甘露糖-6-磷酸残基而造成的致死性溶酶体贮积病。N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移酶是在溶酶体酶原上产生M6P信号必需的。
影响中枢神经系统的LSD需要替代酶穿过BBB。为了实现这一点，可以将替代酶的来源放置在对象的脑中，从而通过BBB。因此，神经胶质祖细胞是理想的治疗递送载体，因为其具有增殖、迁移和分化成少突胶质细胞以及星形胶质细胞亚型的优异能力。因此，可以以多种方式治疗影响中枢神经系统的LSD，包括遗传上编码神经胶质祖细胞以分泌溶酶体酶原(例如溶酶体酶原)，并且将细胞递送到受损组织和/或替代缺陷细胞。
在另一个实施方案中，本发明的组合物被用于治疗神经病症(neurological disorder)。“神经病症”是指与神经元或神经胶质细胞缺陷有关的任何中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)疾病，包括但不限于：神经元缺失、神经元退化、神经元脱髓鞘、神经胶质增生(即，星形神经胶质增生)或者异常蛋白质或毒素(例如，β-淀粉样蛋白或α-突出核蛋白)的神经元或神经元外积累。神经病症可为慢性或急性。
示例性神经病症包括但不限于戈谢病及其他LSD，包括法布里病、泰-萨病、庞皮病和粘多糖病；帕金森病；阿尔兹海默病；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；多发性硬化(MS)；亨廷顿病；弗里德赖希共济失调；轻度认知障碍；和运动障碍(包括共济失调、脑性瘫痪、舞蹈手足徐动症、肌张力紊乱、图雷特综合征、核黄疸)；震颤病症、脑白质营养不良(包括肾上腺脑白质营养不良、异染性脑白质营养不良、卡纳万病(Canavandisease)、亚历山大病(Alexander disease)、佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacherdisease))；神经元蜡样质脂褐素病；共济失调毛细血管扩张症；以及雷特综合征(Rett syndrome)。该术语还包括脑血管事件，例如中风和脑缺血发作(ischemic attack)。
本文使用的术语“对象”描述了生物体，包括哺乳动物，例如灵长类动物。可受益于所述主题方法的哺乳动物物种包括但不限于：猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；以及其他动物，例如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。通常，对象是人。
在一些实施方案中，具有“神经病症”的对象包括处于发生神经病症、疾病或状况风险的对象，和/或已经被诊断患有神经病症、疾病或状况的对象。
注射包含编码GAA之核酸分子的rAAV载体(例如，rAAV2/9)可导致Gaa-/-动物中AChR尺寸的尺寸减小，因此rAAV介导的GAA递送可用于恢复或增强膈神经和隔膜之间的神经肌肉传递。在一个实施方案中，除施用包含编码GAA之核酸分子的AAV载体(例如，AAV2/9)之外，还可单独或同时共施用一种或更多种乙酰胆碱酯酶抑制剂(ACI)以改善患有庞皮病之对象中的神经递质释放。
多种乙酰胆碱酯酶抑制剂(ACI)在本领域中是已知的，包括但不限于：四氢氨吖啶、多奈哌齐、加兰他敏、雷司替明、他克林(tacrine)、美曲磷酯和石杉碱甲(huperzine-A)(参见美国专利申请公开号2013/0131110)。
治疗性分子
用于调节GAA表达的核酸分子：
作为一个实例，使用GAA来说明本发明。然而，根据疾病，治疗性分子可以被代替(下文)。使用包含插入在两个AAV ITR之间的编码功能性GAA蛋白之多核苷酸的核酸实现将功能性GAA蛋白转移到细胞或动物中。编码GAA的多核苷酸序列可以采用多种不同形式。例如，序列可以是天然哺乳动物GAA核苷酸序列，例如以登录号NM_008064、NM_000152、X55080、X55079、M34425和M34424保存在Genbank的一种小鼠或人编码GAA的序列。编码GAA的核苷酸序列还可以是非天然编码序列，其由于遗传密码子的冗余或简并，与天然哺乳动物GAA核苷酸序列编码相同的多肽。本发明内的另一些编码GAA的核苷酸序列是编码天然GAA蛋白之片段、类似物或衍生物的那些。这些变体可以是例如天然编码GAA之核酸的天然存在的等位基因变体，天然编码GAA之核酸的同源物，或天然编码GAA之核酸的非天然存在的变体。这些变体具有与天然编码GAA之核酸在一个或更多个碱基上不同的核苷酸序列。例如，这些变体的核苷酸序列的特征可以是天然编码GAA之核酸的一个或更多个核苷酸的缺失、添加或替换。核酸插入通常为约1至10个连续核苷酸，而缺失通常为约1至30个连续核苷酸。在本发明的大部分应用中，编码GAA的多核苷酸基本上保留了将苯丙氨酸转化为酪氨酸的能力。
编码GAA的核苷酸序列还可以是编码GAA融合蛋白的核苷酸序列。这样的序列可以通过连接编码融合在框内的GAA蛋白的第一多核苷酸与编码另一种蛋白质的第二多核苷酸(例如，编码可检测标记的多核苷酸)来制备。编码这样的融合蛋白的多核苷酸可用于使细胞中多核苷酸的表达可视化。
为了有助于长期表达，将编码GAA的多核苷酸插入在AAV反向末端重复(ITR)(例如，第一和第二AAV ITR)之间。AAV ITR发现于WT AAV基因组的两端，并且充当DNA复制的起始点和引物。需要顺式的ITR进行AAV DNA复制，以及用于从原核质粒拯救(rescue)或切除。包含在核酸内的AAV ITR序列可来源于任何AAV血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)或可来源于超过一种血清型。为在载体中使用，第一和第二ITR应至少包含WT或经改造ITR对于包装和复制必需的最小部分。
除了AAV ITR和编码GAA的多核苷酸外，本发明的核酸还可包含与编码GAA之多核苷酸有效连接的一个或更多个表达控制序列。多种这样的序列是已知的。待包含在本发明核酸内的那些可以根据其在其他应用中的已知功能进行选择。表达控制序列的实例包括启动子、绝缘子、沉默子、响应元件、内含子、增强子、起始位点、终止信号和pA尾。
为了取得合适的GAA水平，可使用任意数量的适于在所选宿主细胞中使用的启动子。例如，可使用不同强度的组成型启动子。根据本发明的表达载体和质粒可包含一种或更多种组成型启动子，例如通常具有促进转录活性的病毒启动子或来自哺乳动物基因的启动子。组成型病毒启动子的实例包括单纯疱疹病毒(HSV)、胸苷激酶(TK)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、Ad E1A和巨细胞病毒(CMV)启动子。组成型哺乳动物启动子的实例包括多种管家基因启动子，例如β-肌动蛋白启动子。如下文实例中描述的，鸡β-肌动蛋白(CB)启动子已被证明是对于表达GAA特别有用的组成型启动子。
还可预期诱导型启动子和/或调控元件用于本发明的核酸。合适的诱导型启动子的实例包括来自基因(例如细胞色素P450基因、热休克蛋白基因、金属硫蛋白基因)的那些以及来自激素诱导型基因的启动子，例如雌激素基因启动子。诱导型启动子的另一个实例是响应于四环素的tetVP16启动子。
可根据本发明使用的启动子还包括，但不限于：神经元特异性启动子，例如突触蛋白I(SYN)启动子；肌肉肌酸激酶(MCK)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子；和结蛋白(DES)启动子。在一个实施方案中，可通过突触蛋白启动子在神经元或通过MCK启动子在骨骼肌中实现异源核酸(例如，人GAA)的AAV介导的表达。
组织特异性启动子和/或调控元件对于本发明的某些实施方案有用。可用于本发明表达载体的这样的启动子的实例包括：(1)肌酸激酶、肌细胞生成蛋白、α肌球蛋白重链、人脑和利尿钠肽，特别用于肌细胞，以及(2)白蛋白、α-1抗胰蛋白酶、乙型肝炎病毒核心蛋白启动子，特别用于肝细胞。
本发明还包括可用于校正或改善多亚基蛋白造成的基因缺陷的方法及其组合物。在某些情况下，可使用不同转基因来编码蛋白质的每个亚基。这一点在编码蛋白质亚基的DNA尺寸大时是期望的，例如对于免疫球蛋白或血小板衍生生长因子受体。为了使细胞产生多亚基蛋白，可用表达每个不同亚基的rAAV感染细胞。
或者，可由相同转基因编码蛋白质的不同亚基。在这种情况下，单个转基因将包含编码每个亚基的DNA，并且每个亚基的DNA由内部核糖体进入位点(IRES)隔开。IRES的使用允许产生多基因或多顺反子mRNA。IRES元件能够绕开5′甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型，并且在内部位点开始翻译。例如，已经描述了来自丙型肝炎和小核糖核酸病毒家族成员(例如，脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件，以及来自哺乳动物mRNA的IRES。IRES可与异源开放阅读框连接。借助IRES元件，核糖体可接近每个开放阅读框以有效翻译。因此，可使用单启动子/增强子有效表达多个基因以转录单信息。当编码每个亚基的DNA的尺寸足够小使得编码亚基之DNA和IRES的总和不大于病毒可包含之DNA插入片段的最大尺寸时，这是尤其有用的。例如，对于rAAV，插入片段尺寸可不大于约4.8千碱基；但是，对于缺少其全部辅助病毒功能的腺病毒，插入片段尺寸为约28千碱基。
可使用的基因产物包括激素和生长以及分化因子，包括但不限于：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、降钙素、生长激素释放因子(GRF)、促甲状腺激素(TSH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、催乳素、褪黑素、血管升压素、β-内啡肽、met-脑啡肽、leu-脑啡肽、催乳素释放因子、催乳素抑制因子、促肾上腺皮质激素释放激素、促甲状腺素释放激素(TRH)、促卵泡激素(FSH)、黄体生成素(LH)、绒毛膜促性腺激素(CG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、制管张素、内皮抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、bFGF2、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，包括TGFβ、激活蛋白、抑制素在内的转化生长因子β(TGFβ)超家族的任意一员，或者任何骨形态发生蛋白(BMP)BMP 1至15，生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任意一员，神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白NT-3、NT-4/5和NT-6，睫状神经营养因子(CNTF)，神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、neurtuin、persephin、聚集蛋白，脑信号蛋白/脑衰蛋白家族的任意一员，导蛋白-1和导蛋白-2，肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白(noggin)、音猬因子(sonic hedgehog)和酪氨酸羟化酶。
其他有用的基因产物包括调节免疫系统的蛋白质，其包括但不限于：细胞因子和淋巴因子，例如血小板生成素(TPO)、白细胞介素(IL)IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-17，单核细胞趋化蛋白(MCP-1)、白血病抑制因子(LIF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β(TNFα和TNFβ)，干扰素(IFN)IFN-α、IFN-β和IFN-γ，干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也被本发明所涵盖。这些包括但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体，I类和II类MHC分子，以及经改造的MHC分子(包括单链MHC分子)。有用的基因产物还包括补体调节蛋白，例如膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CR2和CD59。
另外一些有用的基因产物包括激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白之受体的任意一种。这些受体的实例包括flt-1、flk-1、TIE-2；trk家族受体，例如TrkA、MuSK、Eph、PDGF受体，EGF受体、HER2、胰岛素受体、IGF-1受体，FGF家族受体，TGFβ受体，白细胞介素受体、干扰素受体、5-羟色胺受体、α-肾上腺素能受体、β-肾上腺素能受体、GDNF受体、p75神经营养蛋白受体等。本发明涵盖胞外基质蛋白的受体(例如整联蛋白)，跨膜结合蛋白的反受体(例如细胞间粘附分子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3和ICAM-4)、血管细胞粘附分子(VCAM)以及选择蛋白E选择蛋白、P选择蛋白和L选择蛋白)。本发明涵盖用于胆固醇调节的受体，包括LDL受体、HDL受体、VLDL受体和清除受体(scavenger receptor)。本发明涵盖这些受体的脱脂载脂蛋白配体，包括ApoAI、ApoAIV和ApoE。本发明还涵盖这样的基因产物，例如类固醇激素受体超家族，其包括糖皮质素受体和雌激素受体，维生素D受体以及其他核受体。另外，有用的基因产物包括抗微生物肽(例如防卫素和maginin)，转录因子例如jun、fos、max、mad、血清应答因子(SRF)、AP-1、AP-2、myb、MRG1、CREM、Alx4、FREAC1、NF-κB、亮氨酸拉链家族成员、C2H4锌指蛋白(包括Zif268、EGR1、EGR2)、C6锌指蛋白(包括糖皮质素受体和雌激素受体)、POU结构域蛋白质(如Pit 1)、同源结构域蛋白质(包括HOX-1)、碱性螺旋-环-螺旋蛋白质(包括myc、MyoD和肌细胞生成蛋白)、含ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调节因子1(IRF-1)、维耳姆斯肿瘤蛋白(Wilms’tumor protein)、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白(例如GATA-3)以及翼状螺旋蛋白(winged helix protein)的叉头(forkhead)家族。
另外一些有用的基因产物包括氨甲酰合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂合酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子VII、因子VIII、因子IX、因子II、因子V、因子X、因子XII、因子XI、von Willebrand因子、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和还原酶、血红素加氧酶、血管紧张素转变酶、内皮素-1、心房钠尿肽、尿激酶原、尿激酶、纤溶酶原激活物、肝素辅因子II、活化的蛋白C(莱顿第V因子(Factor V Leiden))、蛋白C、抗凝血酶、胱硫醚β-合酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-CoA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶(也称作P蛋白)、H蛋白、T蛋白、门克斯病(Menkes disease)蛋白、肿瘤抑制因子(例如，p53)、囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)威尔逊病(Wilson’s disease)基因PWD的产物、Cu/Zn超氧化物歧化酶、芳香族氨基酸脱羧酶、酪氨酸羟化酶、乙酰胆碱合成酶、激素原转变酶、蛋白酶抑制剂、乳糖酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胃肠酶(包括胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶)、腺苷脱氨酶、α1抗胰蛋白酶、金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)、GLUT-1、GLUT-2、海藻糖磷酸合酶、己糖激酶I、II和III，葡糖激酶，胶原蛋白的任意一种或更多种个体链或类型，弹性蛋白、纤连蛋白、血小板反应蛋白、玻连蛋白和生腱蛋白，以及自杀基因(例如胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶)。另外一些有用的蛋白质包括参与溶酶体贮积病的那些，包括：酸性β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-1-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、溶酶体酸性α-葡糖苷酶、鞘磷脂酶、己糖胺酶A、己糖胺酶A和B、芳基硫酸酯酶A、酸性脂肪酶、酸性神经酰胺酶、半乳糖基神经酰胺酶、α-岩藻糖苷酶，α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰氨基葡糖苷酶、神经氨酸酶(neuramidase)、半乳糖基神经酰胺酶、类乙酰肝素-N-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoA：α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuoronidase)以及己糖胺酶A和B。
另外一些有用的转基因包括非天然存在的多肽，例如嵌合或杂合多肽，或具有非天然存在氨基酸序列的多肽，包含插入、缺失或氨基酸替换。例如，单链经改造的免疫球蛋白可用在某些无免疫应答的患者中。另一些有用的蛋白质包括缺少其跨膜和细胞质结构域的截短的受体。这些截短的受体可用于拮抗其各自配体的功能，这通过与其各自配体结合而无伴随的受体信号转导实现。另外一些类型的非天然存在基因序列包括正义和反义分子以及催化性核酸(例如，核酶)，其可用于调节基因的表达。
病毒载体
本文所述组合物(例如，包含编码GAA之病毒载体的组合物)可通过任何合适的技术向哺乳动物对象施用。提供了使用病毒载体将GAA基因引入到细胞中的多种技术，用于根据本文所述的组合物和方法。病毒是有效将其基因递送到宿主细胞中的天然进化的载体，因此是用于递送治疗性基因的理想载体系统。优选的病毒载体对宿主细胞表现出低毒性，并且产生治疗性量的GAA蛋白(例如，以组织特异性方式)。病毒载体方法和方案综述于Kay等，Nature Medicine，7：33-40，2001中。
虽然以下描述的实验涉及rAAV，但是可以使用任何合适的病毒载体。许多病毒载体在本领域中已知用于向哺乳动物对象递送基因，并且将非穷举性实例列在下面。讨论了使用重组腺病毒作为基因治疗载体的方法，例如在W.C.Russell，J.Gen.Virol.，81：2573-2604，2000；和Bramson等，Curr.Opin.Biotechnol.，6：590-595，1995中。讨论了使用单纯疱疹病毒载体的方法，例如在Cotter和Robertson，Curr.Opin.Mol.Ther.1：633-644，1999中。也可使用复制缺陷的慢病毒载体，包括HIV。讨论了使用慢病毒载体的方法，例如在Vigna和Naldini，J.Gene Med.，5：308-316，2000，以及Miyoshi等，J.Virol.，72：8150-8157，1998中。也可使用逆转录病毒，包括基于鼠白血病病毒的载体。讨论了使用基于逆转录病毒之载体的方法，例如在Hu和Pathak，Pharmacol.Rev.52：493-511，2000和Fong等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，17：1-60，2000中。另外一些可以使用的病毒载体包括甲病毒属(alphavirus)，包括semliki病毒(Semliki Forest Virus)和新培斯病毒(Sindbis Virus)。可使用杂合病毒载体递送gaa基因到靶组织(例如，肌肉、中枢神经系统)。构建杂合载体的标准技术是本领域技术人员公知的。这样的技术可见于例如Sambrook等，In MolecularCloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，NY)，或者任何讨论重组DNA技术的许多实验手册中。
rAAV载体和病毒体
在一些实施方案中，将本文所述组合物和方法的核酸并入rAAV载体和/或病毒体中，以有利于将其引入到细胞中。本发明中可用的rAAV载体是重组核酸构建体，其包含：(1)待表达的异源序列(例如，编码GAA蛋白的多核苷酸)和(2)有利于整合并表达所述异源基因的病毒序列。病毒序列可包含对于DNA的顺式复制以及将其包装(例如，功能ITR)到病毒体中所需的那些AAV序列。在典型应用中，异源基因编码GAA，其可用于校正细胞中的GAA缺陷。这样的rAAV载体还可包含标志物或报道基因。有用的rAAV载体整体上或部分上具有一个或更多个AAV WT基因的缺失，但是保留了功能性侧翼ITR序列。AAV ITR可以是适合特定应用的任何血清型(例如，来源于血清型2)。讨论了使用rAAV载体的方法，例如在Tal，J.Biomed.Sci.，7：279-291，2000；以及Monahan和Samulski，Gene Delivery，7：24-30，2000中。
通常将本发明的核酸和载体并入rAAV病毒体中以有助于将核酸或载体引入到细胞中。AAV的衣壳蛋白构成了病毒体的外部非核酸部分，并且由AAV cap基因编码。Cap基因编码病毒体组装所需的三种病毒外壳蛋白VP1、VP2和VP3。已经描述了rAAV病毒体的构建。参见，例如美国专利号5,173,414、5,139,941、5,863,541和5,869,305、6,057,152、6,376,237；Rabinowitz等，J.Virol.，76：791-801，2002；以及Bowles等，J.Virol.，77：423-432，2003。
本发明可用的rAAV病毒体包括来源于许多AAV血清型的那些，包括1、2、3、4、5、6、7、8和9。为了靶向肌肉细胞，包含至少一种血清型1衣壳蛋白的rAAV病毒体可特别有用，因为本文报道的实验表明，其比仅具有血清型2衣壳的rAAV病毒体诱导显著更高的GAA细胞表达。也可使用包含至少一种血清型6衣壳蛋白的rAAV病毒体，因为血清型6衣壳蛋白在结构上与血清型1衣壳蛋白类似，因此预期也可在肌肉细胞中引起高的GAA表达。rAAV血清型9也被发现是肌肉细胞的有效转导物。不同血清型AAV载体和AAV蛋白质的构建和使用在Chao等，Mol.Ther.2：619-623，2000；Davidson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：3428-3432，2000；Xiao等，J.Virol.72：2224-2232，1998；Halbert等，J.Virol.74：1524-1532，2000；Halbert等，J.Virol.75：6615-6624，2001；以及Auricchio等，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081，2001中讨论。
本发明还可使用假型rAAV。本发明的假型载体包括具有来源于给定血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9等)以外的血清型之衣壳基因的给定血清型(例如，AAV2)假型的AAV载体。例如，本发明的代表性假型载体是编码具有来源于不同血清型(例如，AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9)AAV的衣壳基因之GAA假型的rAAV2载体。在一个实施方案中，观察到使用IV施用途径和rAAV2/9假型衣壳递送LacZ转基因导致心脏组织中的表达水平比相同剂量的rAAV2/1高约200倍。另外的实验表明使用rAAV2/9向成年小鼠IV递送转基因还导致心脏组织的转导。涉及构建和使用假型rAAV病毒体的技术是本领域中已知的，并且在Duan等，J.Virol.，75：7662-7671，2001；Halbert等，J.Virol.，74：1524-1532，2000；Zolotukhin等，Methods，28：158-167，2002；以及Auricchio等，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081，2001中描述。
病毒体衣壳内具有突变的AAV病毒体可用于比非突变衣壳病毒体更有效地感染特定细胞类型。例如，合适的AAV突变体可具有用于促进将AAV靶向特定细胞类型的配体插入突变。包含插入突变、丙氨酸筛选突变和表位标签突变的AAV衣壳突变体的构建和特征在Wu等，J.Virol.，74：8635-45，2000中描述。另外一些可用于本发明方法的rAAV病毒体包括通过病毒的分子育种以及通过外显子改组产生的那些衣壳杂合体。参见Soong等，Nat.Genet.，25：436-439，2000；以及Kolman和Stemmer，Nat.Biotechnol.，19：423-428，2001。
调节A细胞中的GAA水平
上述核酸、载体和病毒体可用于调节细胞中的GAA水平。方法包括向细胞施用包含核酸的组合物的步骤，所述核酸包含插入在两个AAVITR之间的编码GAA的多核苷酸。所述细胞可来自可以施用本发明核酸的任何动物。来自具有GAA缺陷之对象的哺乳动物细胞(例如，人类、狗、猫、猪、绵羊、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊等)通常是本发明所用的靶细胞。
在一些实施方案中，细胞是心肌细胞(myocardial cell)，例如心肌细胞(myocardiocyte)。在另一些实施方案中，细胞是神经元(例如，膈运动神经元)。
提高哺乳动物中的运动神经元(例如，膈神经元)功能
本文所述的rAAV载体、组合物和方法可用于提高具有庞皮病和/或GAA水平不足之哺乳动物中的膈神经活性。例如，可向中枢神经系统(例如，神经元)施用编码GAA的rAAV。在另一个实例中，编码GAA之rAAV载体从隔膜(或其他肌肉)向膈神经或其他运动神经元的逆行运输可导致对庞皮病进行生物化学和生理学校正。这些相同的原理可应用于其他神经退行性疾病(neurodegenerative disease)。
提高对象中的GAA活性
上述核酸、载体和病毒体可用于调节动物对象中功能GAA的水平。方法包括提供动物对象以及向所述动物对象施用包含核酸的组合物的步骤，所述核酸包含插入在两个AAV ITR之间的编码GAA的多核苷酸。所述对象可以是可施用本发明核酸的任何动物。例如，哺乳动物(如，人类、狗、猫、猪、绵羊、小鼠、大鼠、兔、牛、山羊等)是合适的对象。本发明方法和组合物尤其适用于GAA缺陷的动物对象。
上述组合物可以在任何合适的制剂中以任何合适的方法向动物(包括人类)施用。例如，可将rAAV病毒体(即，颗粒)直接引入到动物中，包括通过静脉内(IV)注射、腹膜内(IP)注射或原位注射到靶组织(例如，肌肉)中。例如，可使用常规注射器和针头来将rAAV病毒体混悬剂注射到动物中。根据期望的施用途径，注射可以是原位(即，注射到特定组织或组织上的位置)、IM、IV、IP或通过其他肠胃外途径。可以通过注射进行病毒体的肠胃外施用，例如，通过快速注射(bolus injection)或持续输注。用于注射的制剂可以以单位剂型存在于例如安瓶中，或者多剂量容器中，具有添加的防腐剂。组合物可以采用油性或水性载剂中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，并且可包含配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，rAAV病毒体可以是粉末形式(例如，冻干)，以用于在使用前与合适的载剂(例如无菌无热原水)组构。
为了促进rAVV病毒体向动物递送，本发明的病毒体可与载体或赋形剂混合。可使用的载体和赋形剂包括盐水(尤其是无菌无热原盐水)、盐水缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、脲、醇类、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和甘油。USP级载体和赋形剂尤其可用于向人对象递送病毒体。用于制备这样的制剂的方法是公知的，并且可见于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences。
除了前述剂型外，还可将病毒体配制成长效(depot)制剂。这些长效制剂可通过植入(例如，皮下或肌内)或通过IM注射施用。因此，例如，可以将病毒体与合适的聚合物或疏水材料(例如，可接受油中的乳剂)或离子交换树脂一起配制，或者配制成略溶衍生物。
类似地，可使用多种方法向动物对象施用rAAV载体。可通过腹膜内施用(IP注射)以及肠胃外施用(例如，IV注射、IM注射和原位注射到靶组织中)来将rAAV载体直接引入到动物中。用于上述肠胃外施用rAAV病毒体的方法和制剂可用于施用rAAV载体。
本发明内还提供了离体递送经rAAV病毒体转导的细胞。离体基因递送可用于将rAAV转导之宿主细胞移植回宿主。类似地，可使用离体干细胞(例如，间充质干细胞)治疗来将rAAV载体转导之宿主细胞移植回宿主。合适的离体方案可包括多个步骤。可由宿主收获靶组织(例如，肌肉、肝组织)的部分，并且用rAAV病毒体将编码GAA的核酸转导到宿主细胞中。然后将这些经遗传改造的细胞移植回宿主。可使用多种方法来经细胞再引入到宿主中，包括静脉内注射、腹膜内注射或原位注射到靶组织中。离体用经改造rAAV转导或感染之细胞的微囊化是可在本发明内使用的另外的技术。可根据本发明使用自体细胞和同种异体细胞移植。
有效剂量
通常以有效量(即，能够在经处理对象中产生期望结果(例如，提高对象中的WT GAA活性)的量)将上述组合物施用到哺乳动物中。这样的治疗有效量可如下确定。
可通过标准药学程序测定本发明方法中使用的组合物的毒性和治疗功效，使用培养物中的细胞或实验动物以确定LD50(群体的50％致死剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并可将其表示为LD50/ED50比。表现出大治疗指数的那些组合物是优选的。尽管可使用具有毒性副作用的那些，但是应当仔细设计使这种副作用的潜在损害最小化的递送系统。本文所述组合物的剂量一般处于包括极小毒性或无毒性之ED50的范围内。根据所使用剂型和所使用施用途径，剂量可以在该范围内变化。
如医学和兽医领域中公知的，用于任意一个动物的剂量取决于许多因素，包括对象的大小、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、施用时间和途径、总体健康以及同时施用的其他药物。预期用于静脉内施用颗粒的合适剂量为约1012-1015颗粒。对于70kg的人，目前认为1012-1015颗粒的1至10mL(例如，5mL)注射是合适的剂量。
以下实施例中说明了本发明组合物和方法的一些实施方案。提供这些实施例用于说明目的，而不是考虑限制本发明组合物和方法的范围。
实施例
材料和方法
病毒的产生
如之前所述(Zolotukhin，S，等，Methods，28：158-167，2002)在弗罗里达大学鲍威尔基因治疗中心载体核心实验室(University of Florida PowellGene Therapy Center Vector Core Laboratory)产生纯化并滴定重组AAV载体。
静脉内注射
所有动物程序都根据弗罗里达大学实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)指南(小鼠)或加利福尼亚大学(UC)戴维斯IACUC(猴，见下)进行。如之前所述(Sands MS，等，Lab.Anim.Sci.，49：328-330，1999)通过颞浅静脉注射一天大的小鼠幼仔。简单地说，通过诱导低体温使动物麻醉。使用29.5规格的结核菌素注射器将总体积35μL的载体直接递送到左侧颞静脉中。通过颈静脉注射两个月大的成年小鼠。首先使用1.5％异氟烷与O2的混合物(1至2L)使小鼠麻醉。产生0.5cm的切口以暴露颈静脉。然后使用29规格的无菌针头和注射器递送150μL体积的病毒。止血；将皮肤紧靠并用Vetbond(3M，St.Paul，Minn)保持紧固(secure)。
β-半乳糖苷酶检测
使用Galacto-Star化学发光报道基因测定系统(Tropix Inc，Bedford，Mass)测定组织裂解物的β-半乳糖苷酶活性。使用Bio-Rad DC蛋白质测定试剂盒(Hercules，Calif)测定组织裂解物的蛋白质浓度。
ECG分析
使用右肩、右前肢、左前肢、左后肢和尾巴中的标准皮下针状电极(MLA1203，1.5mm Pin 5；AD Instruments)和Power Laboratory DualBioAmp仪器获得ECG。使用ADInstrument’s软件分析每个动物的5分钟ECG迹线。
非人灵长类研究
在位于加利福尼国家亚灵长类研究中心(UC Davis)的心脏、肺和血液疾病的胎猴基因转移中心(Center for Fetal Monkey Gene Transfer forHeart，Lung，and Blood Diseases)进行猴子研究。在妊娠期间通过超声监测怀孕的恒河猴(n＝6)，并且到期时使用已建立的技术通过剖宫产术分娩新生猴。出生一小时内，通过外周血管向新生猴静脉内注射载体(≈1mL)。幼猴接受rAAV2/1-CMV-hGaa(n＝3)或rAAV2/9-CMV-hGaa(n＝3)。将幼猴在保育室饲养并监测6个月，然后通过剂量过多的戊巴比妥实施安乐死，并且使用已建立的方法进行全组织收获(每组一个)。来自年龄相差不大的对照动物的标本可由胎猴基因转移中心得到。测量来自注射后6个月收获的组织中的GAA活性，并且减去未注射的对照的背景活性，得到图5A中的结果。根据制造商(Qiagen；DNeasy tissue试剂盒)的方案由组织提取基因组DNA(gDNA)。使用EppendorfBiophotometer(型号6131；Eppendorf，Hamburg，Germany)测定来自提取程序的所得DNA浓度。使用1微克提取的gDNA根据之前使用的方案(Song，S，等，Mol Ther.，6：329-335，2002)和反应条件(Perkin-Elmer/Applied Biosystems所建议的)进行全定量PCR，所述反应条件包括94.8℃40秒，37.8℃2分钟，55.8℃4分钟和68.8℃30秒的50个循环。如(Donsante A，等，Gene Ther.，8：1343-1346，2001)所述为CMV启动子设计的引物对，并且通过含相同启动子之质粒DNA的峰(spike-in)浓度建立标准曲线。一式三份地测定DNA样品。第三份以100拷贝/μg gDNA的比补充CBATDNA。如果检测到峰DNA的至少40个拷贝，则认为DNA样品对于报道载体DNA拷贝是可接受的。
实施例1：重组腺相关病毒导致体内优先的心脏转导
直接比较rAAV2/1和两种较少表征的血清型(rAAV2/8和rAAV2/9)体内转导心肌的能力。通过将侧翼为AAV2反向末端重复(ITR)的目的转基因插入到另一种血清型的衣壳中来产生这些重组体或假型载体。以35μL的注射体积，通过全身静脉途径向1天大的小鼠(每组5只新生鼠)中递送携带CMV-lacZ构建体(细胞质lacZ)之3种不同血清型(rAAV2/1、rAAV2/8或rAAV2/9)各自的1×1011载体基因组(vg)(图1A-图1D)。在注射后4周时收获来自注射小鼠的心脏，并且在冷冻切片上进行5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色以观察生物分布在心肌的β-半乳糖苷酶表达程度(图1A-图1C)。另外，测定β-半乳糖苷酶活性以量化LacZ的表达(图1D)。还对这些心脏进行SYBR色绿定量PCR技术以比较存在的载体基因组的相对量。发现经rAAV2/1、rAAV2/8和rAAV2/9注射的小鼠心脏中分别存在0.19、16.12和76.95vg每二倍体细胞。
如之前所述(Wei JF，等，Gene Ther.，1：261-268，1994)测定每细胞的载体基因组计算值。
结果表明在与本研究比较的这些血清型中，在无法选择性心脏施用时，全身静脉递送AAV2/9导致载体和转基因产物在心肌中广泛并均匀的分布。示出基因表达的水平为，导致比在rAAV2/1中观察到的大200倍的表达水平。rAAV2/8提供了优异的心肌转导，比使用rAAV2/1获得的那些水平大约20倍，但是利用这种血清型在肝细胞中也有显著的转导。X-Gal染色的冷冻切片证明rAAV2/8和rAAV2/9二者均提供了转基因在整个心脏中广泛并均匀的分布。相比之下，用rAAV2/1注射的那些心脏表现出低得多的整体表达。另外，用心肌钙蛋白抗体(Santa CruzBiotechnology)进行免疫组织化学，并发现表达β-半乳糖苷酶的细胞是心肌细胞。
另外，研究证明，体外rAAV2/9转导心肌细胞比成肌细胞更有效。然后对来自这些相同动物的其他组织进行β-半乳糖苷酶检测测定以表征lacZ表达的生物分布。发现rAAV2/8和rAAV2/9二者均能够在一定程度上转导骨骼肌(图2A)。一般来说，除心脏外，rAAV2/8能够在整个肌肉中提供整体上广泛和均匀表达的生物分布，而rAAV2/9递送的转基因表达在心脏中比任何其他组织中高得多。
还对来自这些小鼠的非心脏、非骨骼肌组织样品进行了β-半乳糖苷酶测定(图2B)。这些结果表明，虽然rAAV2/8和rAAV2/9能够转导组织(例如脑、肺和肾)，但是在脾和小肠中较少转导。
一旦确定rAAV2/9对心肌具有最高的自然亲和力，则进一步体内表征rAAV2/9活性。这些研究选择了CMV启动子，因为这种表达盒具有合适的尺寸和在目的靶组织中的表达谱。对来自经rAAV2/9注射之小鼠的心脏、肝和四头肌组织标本进行SYBR绿色定量PCR，以比较存在于这些组织中的载体基因组的相对量。这些结果表明，在心肌中有≈76.95vg/细胞(载体基因组每二倍体细胞)，而在肝和四头肌中分别有2.89vg/细胞和11.47vg/细胞。这些发现的临床应用在于，即使当使用对特定组织表现出高自然亲和力的AAV衣壳时，组织特异性启动子的使用对于最终确保将转基因表达限制于目的区域是关键的。
进行另外的研究以评估心脏和骨骼肌中rAAV2/9-CMV-lacZ表达的时间进程测定。向1天大的新生小鼠注射5×1010vg，并在注射后1、7、14、28和56天收获心脏和骨骼肌(图3A)。结果表明施用载体后1至7天之间转基因开始在这两种组织中表达。骨骼肌中表达的量在最初的28天逐渐增加，然后变平，并保持恒定水平超过(out to)至少56天。心脏组织中转基因表达的量始终比骨骼肌中的高，并且在整个实验持续期间(56天)持续地稳定增加。
接下来对这些组织进行SYBR绿色定量PCR以确定心脏组织中转基因表达的增加是否是由于与骨骼肌组织相比心脏组织中β-半乳糖苷酶蛋白稳定性的提高(图3B)。心脏组织中载体基因组拷贝数增加，但是骨骼肌组织中未增加。另外，还从这些组织中分离了RNA，并且发现RNA转录本的数目在实验持续期间也增加(图3C)。
目前还不知道AAV9的细胞受体，但是，优先的心脏转导保证进一步评估被AAV结合的心脏配体。数据表明AAV9衣壳可能不如之前研究的血清型那样容易其他组织吸收，因为其不能与遍布身体的更普遍的受体结合，例如硫酸乙酰肝素蛋白聚糖受体。因此，AAV9衣壳可能需要更多时间到达心脏组织。对于载体基因组浓度随实验进程增加的另一种解释是心脏中可能存在所递送转基因双链合成的延迟，这可潜在地使载体基因组加倍。
接下来，在成年小鼠中进行研究以确定在新生小鼠中观察到的rAAV2/9行为是否与在成年动物中类似。使用静脉内递送途径通过颈静脉向3个月大的小鼠施用rAAV2/9-CMV-lacZ(1×1011vg)(图4B)。在注射后4周收获组织，并测定心脏和骨骼肌二者中转基因表达的水平。结果表明在成年小鼠中，rAAV2/9确实转导心脏和骨骼肌，但是与向新生小鼠施用相同剂量的情况相比，其表达水平低得多(图4A)。成年小鼠中rAAV2/9递送的表达水平与向新生小鼠静脉内递送相同剂量rAAV2/1-CMV-lacZ后观察到的情况相差不大。未预料到与新生小鼠中相同剂量相比成年小鼠中较低的整体rAAV2/9转导，因为每千克体重的剂量降低了。但是，这些数据证明，无论是将rAAV2/9静脉内递送至成年小鼠或新生小鼠，都观察到了类似的生物分布谱，并且进一步提供了rAAV2/9优先转导心脏组织的证据。
使用遗传性心肌病模型来评估这种病症的基因转移方式。庞皮病是酸性β-葡糖苷酶(Gaa)基因突变造成的肌营养不良和代谢性肌病的一种形式。不足量的GAA酶导致溶酶体中糖原的积累以及随之发生的细胞功能障碍。在人患者中，所产生的GAA的量与疾病严重程度之间直接相关。不进行治疗，在早发型患者中通常在生命的第一年发生心肺衰竭。
为了证明rAAV2/9假型能够递送治疗性转基因以校正和/或阻止疾病表型的发作，用rAAV2/9-CMV-hGaa(人Gaa)处理Gaa-/-小鼠模型。由于rAAV2/9标记基因结果，预期比通常所需低的治疗剂量将足以在小鼠心肌病模型中提供校正。因此，使用静脉内递送途径向1天龄的Gaa-/-小鼠施用每个新生小鼠4×105或4×108vg剂量的rAAV2/9-CMV-hGaa。注射后3个月时，对每个剂量组的经处理小鼠和未注射的年龄匹配Gaa-/-以及健康野生型(B6/129)对照进行ECG。
与这种疾病的人形式类似，未处理的Gaa-/-小鼠ECG表现出比健康B6/129对照缩短的PR间隔(PR＝33.41±1.35ms，或者比野生型[PR＝44.95±1.58ms]缩短26％)。用低剂量(4×105vg)rAAV2/9-CMV-hGaa处理的小鼠表现出36.76±1.12ms的PR间隔，或仅比野生型、年龄匹配的对照短18％(P＝0.062)。用4×108vg处理的剂量组表现出39.38±2.42ms的PR间隔，或仅比B6/129年龄匹配的对照短12％(P＝0.058)。基本上，在这些低剂量，观察到延长的PR间隔，其可随时间推移增加。
尽管小鼠通常是基因治疗研究广泛接受的模型，但是多种AAV衣壳在人中的行为可能非常不同。因此，目前在非人灵长类动物中进行长期试验以评估系统发生上更类似人的动物模型中随时间的表达。来自该正在进行的研究的结果表明，在通过外周血管(出生时)向婴儿恒河猴静脉内递送rAAV2/9-CMV-hGaa或rAAV2/1-CMV-hGaa后6个月时，血清型之间的表达谱与在用rAAV2/9的小鼠中观察到的类似，提供了为rAAV2/1≈4倍的GAA表达(图5A)。在这些非人灵长类动物组织中观察到的载体基因组生物分布谱与用rAAV2/9的小鼠组织(图5B)中发现的类似，证明与骨骼肌相比对于心脏组织显著优先。对于非人灵长类动物心脏标本的表达和载体基因组分析二者，数值为包括心房和心室之右心和左心的平均值。表达和载体基因组的生物分布表现为在整个心脏上均匀。
实施例2：AAV9衣壳优先转导心脏组织并且证明了独特的体内行为
用于治疗遗传性心肌病之基因治疗方法的开发：
通过评估向成年、新生小鼠和非人灵长类动物静脉内(IV)施用病毒之后整个身体组织中的表达谱，(已评估的那些)确定的对于转导心脏组织的最佳AAV血清型是AAV2/9。通过MRI、ECG和组织分析，证明IV递送410vg携带治疗性转基因的AAV2/9可改善庞皮病(一种糖原贮积病)小鼠模型中的心脏表型。3月龄的ECG分析表明PR间隔提高，并且MRI评估证明与未处理对照相比心排血量增加。在施用后6个月时，这些提高还在持续，并且心脏标本的PAS染色证明成功清除了糖原。AAV2/9对于心脏组织的高自然亲和力表明其优先与心肌细胞中普遍的受体结合。该研究揭示了之前研究的那些中，这种衣壳独特的有趣特征。向1天大的小鼠施用510vg的AAV2/9-CMV-LacZ，并在超过56天的时间进程中收获心脏和肌肉以量化表达。虽然在骨骼肌组织中β-gal表达水平变平，但是在心脏中其持续增加。vg的分析揭示了相同的现象。数据表明，在IV递送之后，AAV9衣壳可随时间持续从组织释放并且需要更多时间以到达心脏。
rAAV2/9介导的酸性α-葡糖苷酶的基因递送校正庞皮病小鼠模型中的心脏表型：
庞皮病是酸性α葡糖苷酶(GAA)基因突变导致的肌营养不良和代谢性肌病的一种形式。不足量的GAA导致溶酶体中糖原的积累以及随之发生的细胞功能障碍。在人患者中，所产生的GAA的量与疾病严重程度之间直接相关。不进行治疗，在早发型患者中通常在生命的第一年发生心肺衰竭。
本文描述的是通过ECG迹线、MRI数据分析不同年龄GAA敲除小鼠模型(gaa-/-)中心脏表型的特征研究，并且使用高碘酸希夫(PAS)染色以可视化地评估组织切片中的糖原含量。通过ECG分析，在3月龄观察到缩短的PR间隔(gaa-/-33.41±1.35ms，对照44.95±1.58ms)，其模拟在人庞皮病群体中观察到的传导表型。两周龄时，可以在心脏细胞的溶酶体中观察到异常的糖原量，如通过PAS染色证明的。MRI分析表明，在3个月时，每搏量(SV)降低(gaa-/-36.13±1.19μL，对照51.84±3.59μL)，并且心排血量(CO)降低(gaa-/-7.95±0.26mL/分钟，对照11.40±0.79mL/分钟)，而到12月龄时心肌质量显著增加(gaa-/-181.99±10.7mg，对照140.79±5.12mg)。
使用这种心脏功能障碍模型以开发可应用于许多基因遗传心肌病的心脏基因递送技术。之前已经表明向1天大的Gaa-/-新生小鼠IV递送具有携带CMV-hGAA构建体之血清型1病毒衣壳的重组假型AAV2病毒载体(rAAV2/1)，在施用后12个月观察到多种组织中恢复了GAA活性。最近以来，发现使用IV施用途径和rAAV2/9假型衣壳递送LacZ转基因导致在心脏组织中比相同剂量rAAV2/1高约200倍的表达水平。另外的实验表明，使用rAAV2/9经IV递送转基因至成年小鼠还导致心脏组织的转导。
现在已经将用于心脏转导的最佳rAAV血清型(rAAV2/9)与临床相关IV施用途径组合以向Gaa-/-小鼠递送人GAA(hGAA)基因。使用该策略用rAAV2/9-CMV-hGAA以一系列剂量(4×105vg、4×108vg和4×1010vg)处理新生小鼠证明了持续的校正，如通过ECG分析(39.38±2.42ms)评估的。冷冻组织切片的PAS染色以及对冷冻组织的NMR分析已经表明，与未处理对照相比，在新生时处理的gaa-/-小鼠的心脏组织中积累了较少糖原。非侵入性MRI分析表明SV和CO增加。也使用IV递送途径处理了成年Gaa-/-小鼠，目前正在进行评估以逆转已经开始呈现心脏表型之小鼠中的庞皮病作用。
全身递送途径、使用CMV启动子以及GAA是分泌性酶的事实均促进了整个身体的表达和校正。在经处理小鼠的多种其他组织(包括骨骼肌和肝)中已经观察到了GAA活性。总之，这些研究已经证明了使用相对非侵入性的IV递送途径全身施用rAAV2/9、穿过脉管系统、转导全身组织并且最终阻止庞皮病心脏表型呈现的能力。
实施例3：用于在肌营养不良的鼠模型中表征和基因治疗评估的MRI
进行了研究以确认腺相关病毒(AAV)血清型、启动子和递送途径的哪一种组合对于心脏基因递送最有利。进行了研究以非侵入性地表征多种形式的可以治疗的肌营养不良小鼠模型中的心脏。多种形式的肌营养不良的模型的实例包括：肢带型肌营养不良的模型；α-sarcoglycan敲除(ASG-/-)，其中MBNL的外显子3已经缺失之1型强直性肌营养不良(MDNL1-/-)的模型，以及缺少肌养蛋白之迪谢纳肌营养不良的MDX小鼠模型。
在初始的特征研究中，收获来自一系列年龄的这些模型的心脏组织，并发现在所有情况下，疾病的表现随年龄增加。因为变坏之肌肉组织的异常透性，其能够摄入并结合(sequester)荧光染料伊文思蓝染料(EvansBlue Dye，EBD)，所以在发展的早期阶段就可以鉴定并确定营养不良病灶的位置和大小。还证明了使用1H-磁共振技术非侵入性鉴定和监测骨骼肌中营养不良病灶发展之进展的能力。为了在冷冻切片上识别发展晚期阶段的病灶，使用三色染色。这对浸润更加严重的营养不良病灶之胶原蛋白的存在进行染色，因为它们经历了纤维化。
心脏MR提供了高分辨率的图像，所述图像提供了结构以及全局和局部功能信息。在较老的MDX小鼠(6-52周)中，心脏表现出通常位于心室或隔(septum)的炎性细胞浸润、肌细胞损伤和纤维化的局部病灶。还发现较老的MDX心脏(＞48周)表现有MR信号强度提高的区域。高强度的区域与肌细胞损伤的区域相关，如使用EBD积累、H&E和三色染色在组织学上确定。还可使用心脏MR来监测肌细胞功能。通过在不同年龄的这些模型上进行心脏MRI，获得了能够鉴定扩张型心肌病、收缩性缺陷和心律失常之存在的图像。除了标准心脏成像测量和技术外，建立了心脏标记方案以允许鉴定局部收缩性缺陷的区域。由于坏死组织的区域遍布心脏，这对于可表现出区域功能障碍的小鼠模型可能有益。
在完成这些特征研究之后，下一步包括向这些小鼠提供基因治疗并阻止这些疾病的表现。然后使用建立的MRI方案对经处理动物定期进行非侵入性评估，以最终证明心肌病小鼠模型中的功能校正。
实施例4：神经缺陷促进庞皮病的呼吸功能不全
主要目的是确定GAA-/-小鼠是否具有改变的呼吸模式，类似于在患者群体中观察到的通气困难，以及GSD II中的通气缺陷是否是由中枢组成部分(central component)介导的。
体积描记术：使用气压体积描记术测量GAA-/-小鼠和年龄匹配对照(B6/129品系)中的分钟通气量(MV)和吸气时间(Ti)。在驯化期(30分钟)和基线(60分钟；FiO2＝21％，FiCO2＝0％)后，将小鼠暴露于高二氧化碳攻击(10分钟，FiCO2＝6.5％)以刺激呼吸运动输出。
采血：将对照(B6/129)和GAA-/-小鼠麻醉，并且将～100μL尾血液收集到一次性G8+药筒中并用便携式I-Stat机(Heska Corp.)阅读。
糖原检测：使用改进的酸性水解法对糖原进行量化。进行高碘酸希夫染色用于组织糖原检测；将(4％)涂到小鼠隔膜上，48小时后进行处死以检测膈运动神经元。
体外力频率测量：确定每个隔膜条的等张强直张力的最佳长度，然后逐渐增加刺激频率。将产生的力归一化至膈膜条的长度和重量。
神经生理学：在麻醉(尿烷，i.v.，1.0-1.6g/kg)、机械通气、被麻痹并切断迷走神经的小鼠中，分离右侧膈神经并用双极钨电极记录电活动。
结果和总结：图6A-图6C是示出了6个月(图6A)、12个月(图6B)和＞21个月(图6C)的对照以及GAA-/-小鼠的基线和10分钟高二氧化碳期间分钟通气量(mL/分钟)之结果的图。
总之，结果如下：
与年龄匹配的对照小鼠相比，GAA-/-小鼠具有改变的呼吸模式(图7A)。
神经系统中的GAA缺陷导致通气缺陷，如通过肌肉特异性GAA小鼠(其具有正常功能的隔膜)中削弱的分钟通气量证明(图7B)。
削弱的平均吸气流量表明GAA-/-小鼠中对于呼吸的驱动可能下降(图8)。
在6个龄时开始观察到GAA-/-小鼠脊髓中糖原的积累(图9A和图9B)。
与对照相比，GAA-/-中的传出吸气膈输出降低(图10A和图10B)。
结论：GAA-/-小鼠中的通气缺陷与患者群体的类似。平均吸气流量、糖原量化、肌肉特异性GAA小鼠呼吸模式和膈神经纤维分布图数据符合这些通气困难反映了GSD II中的肌肉和神经组成部分的假设。
实施例5.使用rAAV2/1载体对庞皮病的生理校正
材料和方法：
之前已经描述了重组AAV2质粒p43.2-GAA(Fraites，T.J.，Jr.等，Mol.Ther.5：571-578，2002)。使用p43.2-GAA产生基于血清型1的重组AAV颗粒，并且如之前所述(Zolotukhin，S等，Methods，28：158-167，2002)在弗罗里达大学鲍威尔基因治疗中心载体核心实验室产生、纯化和滴定。
所有动物研究根据弗罗里达大学实验动物护理和使用委员会的指南进行。本研究中使用的庞皮病小鼠模型(Gaa-/-)在之前已经描述，并且通过Gaa基因外显子6的靶向破坏产生(Raben，N.等，J.Biol.Chem.，273：19086-19092，1998)。如之前所述(Sands，M.S.和Barker，J.E.，Lab.Anim.Sci.，49：328-330，1999)通过颞浅静脉向1天大的Gaa-/-小鼠静脉内施用5×1010颗粒(30μL总体积)的rAAV2/1-CMV-GAA。
注射后10、24和52周，测定组织均浆的GAA酶活性。简单地说，在37℃孵育1小时后，通过测量合成底物4-甲基伞形酮-α-D-葡糖苷(Sigma M9766，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的切割来测定裂解物的GAA活性。成功切割产生在448nm处发光的荧光产物，如用FLx800微板荧光阅读器(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)测量。使用Bio-RadDC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)测量蛋白质浓度。数据呈现为为减去未处理Gaa-/-组织水平后每个组织中GAA正常水平的百分比。通过ELISA进行抗GAA抗体的检测。
将处理的和未处理的隔膜部分在PBS中的2％戊二醛中固定过夜，包埋在Epon(Shell)中，切片并用高碘酸希夫(PAS)通过标准方法染色。
用1.5-2％异氟烷和1L/分钟氧气的混合物使小鼠麻醉，然后仰卧放置在加热垫上。将ECG导线皮下放置在右肩、右前肢、左前肢、左后肢和尾巴中。使用PowerLab ADInstruments单元和Chart采集软件(ADInstruments，Inc.，Colorado Springs，CO)获得每个动物5分钟的ECG迹线。将每个动物所有迹线的峰间隔平均，然后在每个实验组内平均。
心脏质量的评估：
在弗罗里达大学高级磁共振成像和光谱学(AMRIS)设施中，在4.7TBruker Avance分光计(Bruker BioSpin Corporation，Billerica，MA)上进行心脏MRI。使用1.5％异氟烷(Abbott Laboratories，North Chicago，IL)和1L/分钟氧气使动物麻醉。将动物俯卧放置在自制正交传输和接收表面线圈上，使心脏尽可能接近线圈中心。使用心脏门控(gating)获得图像，并且在R-R波峰触发图像(SA Instruments，Inc.，Stony Brook，NY)。通过获得沿着左心室长度的单短轴切片对心脏可视化。使用梯度回波(gradient recalled echo，GRE)序列(矩阵＝256×128，TE＝2.4ms，FOV＝4cm×3cm，7-8切片，厚度＝1mm)获得图像。有效TR(脉冲重复时间)取决于动物的心率，对其进行观察以保持一致性并相应地调整麻醉。R-R间隔通常为250ms。
使用CAAS MRV处理小鼠的图像(Pie Medical Imaging，Maastricht，The Netherlands)。画出在舒张末期和收缩末期二者时沿着左心室长度之每个切片的心外膜和心内膜的轮廓。输出结果并进行分析，计算舒张末期的心肌质量。
使用等张力-频率关系评估隔膜收缩力。分离附有肋骨和中心腱的隔膜，放在冰上用95％O2/5％CO2气体混合物平衡的Krebs-Henseleit溶液中。使用平行于结缔组织纤维从腹部肋隔膜切割的单肌肉条来确定力-频率关系。通过夹住肋骨和中心腱使夹附着至隔膜条。使肌肉条带垂直悬浮于水夹套组织浴(Radnoti，Monrovia，CA)中，所述浴中含有用95％O2/5％CO2气体混合物平衡的Krebs-Henseleit溶液，维持在37℃、pH7.4并且平衡15分钟。为了测量等张收缩性能，将附着于中心腱的夹与力传感器(型号FT03，Grass Instruments，West Warwick，RI)连接。传感器输出被运算放大器放大和差分，并且使用基于计算机的数据采集系统进行A/D转换(Polyview，Grass Instruments)。为了确定肌肉条最佳长度(L0)的等张强直张力，使用铂丝电极沿着其整个长度对肌肉进行场刺激(型号S48，Grass Instruments)。诱发单次颤搐收缩，然后逐步增加肌肉强度，直至获得最大等张颤搐张力。在Lo下等张地测量所有收缩性能。在10、20、40、80、100、150和200Hz下测量峰等张强直力。使用单500ms训练，训练之间有4分钟恢复期以防止疲劳。在从仪器上移除肌肉之前，使用卡尺测量Lo。然后从肋骨和中心腱切下肌肉组织，吸干(blotted dry)并且称重。使用方程CSA(cm2)＝[肌肉条质量(g)/纤维长度Lo(cm)×1.056(g/cm3)]确定肌肉截面积(CSA)，其中1.056g/cm3为假设的肌肉密度。使用计算的CSA来归一化等张张力，将其表示为N/cm2。
使用气压全身体积描记术测定呼吸功能。将未麻醉、无束缚的C57BL6/129SvJ、Gaa-/-和rAAV2/1处理的Gaa-/-小鼠放在透明室(Buxco，Inc.，Wilmington，NC)中。持续监测室气流、压力、温度和湿度，通过使用Drorbaugh和Fenn的方法测量并分析参数(例如频率、分钟通气量、潮气量和峰吸气流量)，并且使用BioSystem XA软件(Buxco，Inc.)记录(Drorbaugh，J.E.和Fenn，W.O.，Pediatrics，16：81-87，1955)。在常氧(FIO2：0.21，FICO2：0.00)条件下1小时然后暴露于高二氧化碳(FIO2：0.21，FICO2：0.07)10分钟来获得基线测量值。
结果：
检查rAAV2/1处理的小鼠中的心脏和呼吸功能。与庞皮病患者群体类似，小鼠模型中的心电图(ECG)量度(P-R间隔(P-R interval))显著缩短。在rAAV2/1处理的小鼠中示出显著提高的心脏传导，与未处理的对照(35.58±0.57ms)相比，具有39.34±1.6ms的延长的P-R间隔(p≤0.05)。另外，使用心脏磁共振成像(MRI)，注意到心脏左心室质量的显著降低，从未处理的年龄匹配之对照中的181.99±10.70mg降低到rAAV2/1处理之小鼠中的141.97±19.15mg。另外，小鼠表现出提高的隔膜收缩力，为野生型峰力的约90％，以及相应地显著改善的通气(尤其是频率、分钟通气量和峰吸气流量)，如使用气压全身体积描记术测量的。这些结果证明，在致死性心肌病和肌营养不良的模型中，除了生物化学和组织学校正外，rAAV2/1载体可介导对心脏和呼吸功能的持续生理校正。
全身递送rAAV2/1可导致Gaa-/-小鼠中心脏和隔膜GAA酶活性的持续恢复
将5×1010颗粒的rAAV2/1-CMV-hGAA通过颞浅静脉注射到1天大的Gaa-/-小鼠中。收集系列血清样品以测定抗hGAA抗体的形成，并且在注射后10、24和52周分析心脏和隔膜组织的GAA酶活性。通过循环抗hGAA抗体的存在检测瞬时体液免疫应答。在注射后第11周，抗体效价最高，平均为背景水平以上的16.08±4.66倍。15周后，抗体效价显著降到背景以上的4.72±1.28倍，并且到注射后31周时进一步降低到背景水平。在24周时检测到峰GAA酶活性水平，在心脏和隔膜中分别为正常(Gaa+/+)活性的4223±1323％和138.18±59.7％，在注射后1年时，水平分别降到正常的593.79±197.35％和39.81±17.43％。
重组AAV2/1介导的治疗可校正Gaa-/-小鼠的心脏质量和传导异常
上述结果证明，递送rAAV2/1-CMV-hGAA载体导致对庞皮病心脏表型持续地生物化学和组织学校正，如通过超出生理水平的GAA酶活性和伴随的糖原清除证明，如通过高碘酸希夫试剂染色确定。心脏组织之高氯酸提取物的质子磁共振波谱(1H-MRS)进一步支持了这些发现。如图11所示，在1岁大的Gaa-/-小鼠中可检测到显著的糖原峰。与未处理小鼠相比，在新生时用rAAV2/1-CMV-hGAA处理的1岁大的Gaa-/-小鼠心脏中，观察到糖原含量平均降低70％。
检查了rAAV2/1介导的治疗对心脏功能的生理作用。缩短的P-R间隔是庞皮病患者心电图的特征。在1岁时，Gaa-/-小鼠也表现出显著缩短的P-R间隔。如表1所示，在新生时施用rAAV2/1-CMV-hGAA的1岁Gaa-/-小鼠证明心脏传导显著提高，并且与未处理的对照(35.58±0.57ms)相比，具有39.32±1.6ms的延长的P-R间隔(p＜0.05)。除了异常的心脏传导外，庞皮病的患者群体和小鼠模型还表现出显著的心脏肥大。使用磁共振成像(MRI)，之前的研究已经表明可精确、非侵入性地量化小鼠模型中的心脏质量。使用MRI评估Gaa-/-模型中的左心室(LV)质量。在1岁时，Gaa-/-小鼠具有比年龄匹配的野生型Gaa+/+(C57BL6/129SvJ)小鼠(140.79±5.12mg)显著更高的LV质量(181.99±10.7mg)。如表1所示，rAAV2/1处理的Gaa-/-小鼠在1岁时具有与野生型小鼠类似的LV质量(141.97±19.15mg)。虽然在rAAV2/1处理小鼠中LV质量的减小在统计学上不是非常显著(p＝0.06)，但是更小LV质量的趋势被认为是真实的，并且可能在更大的样本群体中显著。
表1：静脉内注射rAAV2/1导致降低的心脏质量和延长的P-R间隔
注射后1年，对经rAAV2/1处理的小鼠(n＝7)以及未处理的年龄匹配的对照Gaa-/-(n＝7)和C57(n＝5)小鼠进行心电描记术以及磁共振成像。
施用rAAV2/1载体后隔膜收缩性和通气功能显著改善
由于呼吸功能不全表现为庞皮病最普遍的临床并发症之一，所以在Gaa-/-小鼠中检查了rAAV2/1介导的基因治疗对通气功能的作用(Kishnani，P.S.等，Genet.Med.，8：267-288，2006；Hagemans，M.L.等，Neurology，66：581-583，2006；Mellies，U.等，Neurology，64：1465-1467，2005)。对静脉内施用rAAV2/1-CMV-hGAA的1岁大Gaa-/-小鼠的隔膜进行PAS染色，表明积累的糖原的量显著减少，对应于GAA表达的治疗水平。分离隔膜肌并且评估等张力的产生。与年龄匹配的未处理对照以及甚至更年轻的3个月大的未处理动物相比，rAAV2/1处理小鼠产生的隔膜收缩力显著提高。在最大刺激频率(200Hz)下，来自rAAV2/1处理小鼠的隔膜产生的力为21.98±0.77N/cm2，而对照1岁Gaa-/-小鼠隔膜产生平均13.95±1.15N/cm2的力。
为了测量通气，使用气压全身体积描记术。体积描记术允许同时测量通气的多个参数，包括未麻醉、无束缚小鼠的频率(呼吸/分钟)、潮气量(mL/呼吸)、分钟通气量(mL/分钟)和峰吸气流量(mL/秒)(DeLorme，M.P.和Moss，O.R.，J.Pharmacol.Toxicol.Methods，47：1-10，2002)。使小鼠遭受90分钟常氧空气，然后暴露于高二氧化碳(7％CO2)条件10分钟。提高的CO2水平增加了对呼吸的驱动，并且允许评估呼吸能力的扩展范围。在6月龄和12月龄时进行体积描记术。未处理的Gaa-/-小鼠在6月龄和12月龄二者时均表现出显著降低的通气量，如通过响应于高二氧化碳时显著降低的频率、潮气量、分钟通气量和峰吸气流量(p＜0.01)证明的。相反地，在6个月时，rAAV2/1处理的Gaa-/-小鼠在响应于高二氧化碳测量的所有参数显著提高的通气(图12A-图12D)，并且在处理后1年，频率、分钟通气量和峰吸气流量依然显著高于未处理的年龄匹配的对照(p＜0.05)(图13A-图13D)。
本文描述的实验证明，除了对疾病表型的生物化学校正外，施用治疗性rAAV2/1载体还可导致功能校正。治疗性rAAV2/1载体的处理导致心脏功能显著提高，如通过经处理动物心电图中延长的P-R间隔指示。
这些实验还证明，平均约39％正常GAA活性可导致对隔膜(参与通气的主要肌肉)中糖原的清除，以及显著提高隔膜的收缩能力。另外，在高二氧化碳条件下观察到了呼吸功能的显著改善。与心脏功能类似，虽然在通气功能中注意到了显著的改善，但是校正仅是部分的。在暴露于常氧条件期间，未观察到经处理动物和各自未处理对照之间通气的显著差异。
在Gaa-/-小鼠模型中进行的实验表明，Gaa-/-小鼠中膈运动神经元活性被削弱，并且证明在代谢肌肉营养不良的小鼠模型中单次静脉内施用治疗性rAAV2/1载体可引起对心脏-呼吸表型的持续校正。
实施例6-凝胶介导rAAV2/1载体递送以校正具有进行性形式疾病之庞皮氏病小鼠中的通气功能
在于3、9和21个月时处理的Gaa-/-小鼠中，对凝胶介导的递送具有血清型1病毒衣壳的治疗性重组假型AAV2病毒载体(rAAV2/1)之方法的结果进行表征。在3月龄时处理的小鼠中，与年龄匹配的未处理对照相比，观察到隔膜收缩强度在6个月时显著提高，并且持续超过1岁。类似地，在9月龄和21月龄时处理的小鼠中，观察到处理后3个月时收缩强度显著提高(p≤0.05)。与未处理的年龄匹配的对照相比，在3月龄时处理并且在6个月时测试的小鼠中，在常氧条件下的通气(潮气量/吸气时间的比，分钟通气量与呼出CO2的比，以及峰吸气流量)均提高(p≤0.05)，但未持续到1岁时。在所有rAAV2/1凝胶处理的小鼠(在3、9和21月龄时处理)中，在高二氧化碳条件下的分钟通气量和峰吸气流量均显著提高。这些结果证明，凝胶介导的rAAV2/1载体递送可在肌营养不良的模型中介导通气功能的显著生理改善。
材料和方法：
重组AAV2/1载体的包装和纯化
之前已经描述了重组AAV2质粒p43.2-GAA。使用p43.2-GAA产生基于血清型1的重组AAV颗粒，并且在弗罗里达大学鲍威尔基因治疗中心载体核心实验室产生、纯化和滴定。
体内递送
所有动物研究根据弗罗里达大学实验动物护理和使用委员会的指南进行。如之前所述(参见2005年2月10日提交的美国专利申请号11/055,497)，将凝胶基质中的1×1011颗粒的rAAV2/1-CMV-GAA直接施用至3、9和21个月大的Gaa-/-小鼠隔膜。
糖原清除的组织学评估
将经处理和未处理的隔膜的部分在PBS中的2％戊二醛中固定过夜，包埋在Epon(Shell)中，切片并用PAS通过标准方法染色。
隔膜收缩力的评估
使用等张力-频率关系来评估隔膜收缩力。分离附有肋骨和中心腱的隔膜，放在冰上用95％O2/5％CO2气体混合物平衡的Krebs-Henseleit溶液中。使用平行于结缔组织纤维由腹部肋隔膜切割的单肌肉条来确定力-频率关系。通过夹住肋骨和中心腱使夹附着至隔膜条。使肌肉条垂直悬浮于水夹套组织浴(Radnoti，Monrovia，CA)中，所述浴中含有用95％O2/5％CO2气体混合物平衡的Krebs-Henseleit溶液，维持在37℃、pH7.4并且平衡15分钟。为了测量等张收缩性能，将附着于中心腱的夹与力传感器(型号FT03，Grass Instruments，West Warwick，RI)连接。传感器输出被运算放大器放大并且差分，并使用基于计算机的数据采集系统进行A/D转换(Polyview，Grass Instruments)。为了确定肌肉条最佳长度(Lo)的等张强直张力，使用铂丝电极沿着其整个长度对肌肉进行场刺激(型号S48，Grass Instruments)。诱发单次颤搐收缩，然后逐步增加肌肉长度，直至获得最大等张颤搐张力。在Lo下等张地测量所有收缩性能。在10、20、40、80、100、150和200Hz下测量峰等张强直力。使用单500ms训练，训练之间有4分钟的恢复其以防止疲劳。在从仪器上移除肌肉之前，使用卡尺测量Lo。然后从肋骨和中心腱切下肌肉组织，吸干并且称重。使用以下方程式确定肌肉截面积(CSA)：
CSA(cm2)＝[肌肉条质量(g)/纤维长度Lo(cm)×1.056(g/cm3)]，其中1.056g/cm3为假设的肌肉密度。使用计算的CSA来归一化等张张力，将其表示为N/cm2。
通气功能的评估
使用气压全身体积描记术测定通气功能。将未麻醉、无束缚的C57BL6/129SvJ(n＝10)、Gaa-/-(n＝10)和rAAV2/1处理的Gaa-/-小鼠(n＝8)放在透明室(Buxco，Inc.，Wilmington，NC)中。持续监测室气流、压力、温度和湿度，通过使用Drorbaugh和Fenn的方法测量并分析参数(例如频率、分钟通气量、潮气量和峰吸气流量)，并且使用BioSystemXA软件(Buxco，Inc.)记录。在常氧(FIO2：0.21，FICO2：0.00)条件下1小时然后暴露于高二氧化碳(FIO2：0.93，FICO2：0.07)10分钟来获得基线测量值。
传出膈神经记录
用2-3％异氟烷使小鼠麻醉，向气管插管并连接到呼吸机(ventilator)(型号SAR-830/AP，CWE，Incorporated)。操作呼吸机设置以产生45-55mmHg的动脉CO2的分压。植入颈部导管(0.033外径，；RenaPulseTM管，Braintree Scientific)并用于使小鼠从异氟烷麻醉过渡到尿烷(1.0-1.6g/kg)麻醉。插入颈总动脉导管(小鼠颈总动脉导管，BraintreeScientific)以能够进行血液测量(Ohmeda P10-EZ)并且抽取0.15-mL样品用于测量动脉PO2和PCO2(I-Stat便携式血液气体分析仪)。切断小鼠双侧迷走神经并将其麻痹(泮库溴铵，2.5mg/kg，i.v.)。分离右侧膈神经并放在双极钨丝电极上。将神经电活动放大(2000×)并滤波(100-10,000Hz；型号BMA 400，CWE，Incorporated)。当在膈神经纤维分布图中监测到自发吸气活动时，以时间常数100ms对放大的信号进行全波整流以及平滑，使用Spike2软件(Cambridge Electronic Design；Cambridge，UK)在计算机上数字化并记录。所有实验动物中的放大器增益设置和信号处理方法相同。每次抽血前30秒分析来自这些数字化记录的平均膈吸气脉冲串振幅。
结果：
凝胶介导的rAAV2/1递送可导致有效转导隔膜并清除积累的糖原
来自施用1×1011颗粒的编码CMV启动子驱动β-半乳糖苷酶(lacZ)之rAAV的小鼠的转导隔膜的组织学分析表明，施用rAAV2/1不仅可导致施加了载体的隔膜整个表面上的均匀转导，而且rAAV2/1载体还可转导隔膜组织的整个厚度。相比之下，rAAV2载体仅可以转导前几层细胞。
使用凝胶方法向3、9和21个月大的成年Gaa-/-小鼠的隔膜施用1×1011颗粒的rAAV2/1-CMV-GAA。在处理后3个月评估每个年龄组的GAA酶活性，并且在另外一些在3月龄处理的小鼠群组中，在处理后9个月时评估隔膜GAA活性。在处理的隔膜中，观察到为正常GAA活性84.97±38.53％的平均值。在处理时的年龄或处理后的时间方面，在三个月时处理小鼠并且分别在6个月和1岁时进行分析的情况下，未看到GAA活性的显著差异。隔膜组织的高碘酸-希夫(PAS)染色还揭示，在所有处理年龄组的组织中贮积的糖原量减少。
施用rAAV2/1载体后隔膜收缩性显著改善
类似于庞皮病患者群体，Gaa-/-小鼠具有随疾病的持续进行性弱化的隔膜收缩强度。分离自未处理Gaa-/-小鼠(每组n＝3)的隔膜肌的等张力-频率关系示出，从三月龄到2岁，收缩强度显著降低。与年龄匹配的未处理对照相比，在向Gaa-/-小鼠的隔膜凝胶介导地施用rAAV2/1-CMV-hGAA后，在隔膜肌中发现收缩强度显著提高。对于在3月龄时处理的动物，与年龄匹配的未处理对照相比(峰力在6个月和1年时分别为16.53±0.74和13.94±1.15N/cm2)，在6个月时隔膜收缩强度显著提高(峰力为24.83±3.31N/cm2)一直持续超过1岁(21.59±1.59N/cm2)。在9月龄(峰力为21.28±1.49)和21月龄(峰力为17.21±0.29)时处理的小鼠中，依然看到与年龄匹配的未处理对照(在2岁时峰力为12.71±0.94)相比，在处理后3个月时经处理隔膜的收缩功能显著改善。
在向成年庞皮病小鼠施用rAAV2/1载体后通气功能改善
使用气压体积描记术同时测量有知觉的无束缚小鼠中通气的多个特征。在本研究中，在常氧(正常呼吸空气氧水平；FIO2：0.21，FICO2：0.00)条件下测量通气，并且来评估在高二氧化碳条件(高于正常的二氧化碳水平，FIO2：0.93，FICO2：0.07)下通气能力的扩展范围。
在常氧条件下，与未处理的年龄匹配的对照相比，在3月龄时处理并且在6个月时测试的小鼠中通气(潮气量/吸气时间的比(VT/Ti；mL/秒)(2.2±0.1vs1.79±0.16)，分钟通气量与呼出的CO2的比(VE/VCO2)(18.65±0.73vs13.3±0.74)，以及峰吸气流量(mL/秒)(4.11±0.17vs3.21±0.29))均提高(p≤0.05)。然而在常氧条件下对于通气功能的校正未持续，如在1岁(处理后9个月)时，这些参数均无显著的提高。在9月龄和21月龄时处理的动物，在处理后三个月也未表现出改善的常氧通气。相比之下，高二氧化碳呼吸攻击导致所有处理组中通气功能改善。如图14A-图14D以及图15A-图15D中所示，对于在3个月时处理并且在6个月和1岁时测定的动物以及在9月龄和21月龄时处理的动物中，分钟通气量(图14A-图14D)和峰吸气流量(图15A-图15D)比年龄匹配的未处理对照动物显著提高。
向Gaa-/-小鼠隔膜进行凝胶介导的rAAV2/1递送后膈神经活性提高
有意思的是检查了向隔膜肌施用rAAV2/1的动物中膈神经的活性。如图16所示，在21月龄时通过凝胶方法施用rAAV2/1-CMV-hGAA的2岁Gaa-/-小鼠中的吸气膈脉冲串振幅比年龄匹配的未处理动物中的大，表明可能校正了庞皮病中潜在的神经缺陷。
由于小鼠隔膜的物理性质(尺寸和厚度)，因此使用基于凝胶的载体递送方法。rAAV2/1载体可传播整个隔膜的厚度，而rAAV2载体仅可转导前几层细胞。载体的传播可归因于衣壳通过细胞受体赋予的差异性感染和/或经由胞转过程运输通过组织。
在本研究中，向隔膜直接施用rAAV2/1载体导致与未处理对照相比经处理动物中提高的膈神经活性。综合考虑，这些结果表明可由基于rAAV2/1的基因治疗介导隔膜功能的生理校正，并且即使更老的动物(如21个月大的动物(注意野生型C57BL小鼠的平均寿命为约2年))也可从基因治疗处理获益。
实施例7-神经缺陷促使庞皮病小鼠模型中的呼吸功能不全
呼吸功能障碍是庞皮病的一个标志性特征，并且肌肉无力被认为是根本原因，但是之前未探究相关神经作用的可能性。在本文所述实验中，检查了庞皮病动物模型——Gaa-/-小鼠——以及仅在骨骼肌中表达GAA的第二转基因系(MTP)中呼吸的行为和神经生理方面。在Gaa-/-小鼠颈脊髓中(包括在逆行标记的膈运动神经元中)，糖原含量显著提高。相对于野生型对照，在Gaa-/-小鼠(6至＞21月龄)中通过气压体积描记术评估的通气在平静呼吸和高二氧化碳攻击期间均削弱。MTP小鼠具有正常的隔膜收缩性能，但是，在平静呼吸期间MTP小鼠具有类似于Gaa-/-小鼠的通气。神经生理记录表明相对于对照，Gaa-/-和MTP小鼠中的传出膈神经吸气脉冲串振幅大幅降低。推断Gaa-/-小鼠中到隔膜的神经输出有缺陷，并且在庞皮病中仅靶向肌肉的治疗可能无效。
方法
动物
Gaa-/-和肌肉特异性hGAA(MTP)小鼠在之前已经进行了描述(Raben等，Hum.Mol.Genet.，10：2039-2047，2001；Raben等，I.Biol.Chem.，273：19086-19092，1998)。使用同期性别匹配的C57Bl/6X 129X1/SvJ小鼠作为所有实验的对照。小鼠饲养在弗罗里达大学特定的无病原体动物设施中。弗罗里达大学实验动物护理和使用委员会批准了所有动物程序。
气压体积描记术
之前已经描述了量化通气的气压体积描记术(Buxco Inc.，Wilmington，NC)，并且适用于小鼠。在雄性和雌性小鼠中表征通气。仅当在雄性小鼠和雌性小鼠之间检测到显著差异时，才将性别分开。来自在这些实验中使用的动物子集的数据已经被报道作为用于基因治疗介入的对照。
血红蛋白、血细胞比容、葡萄糖和血钠水平
从麻醉的小鼠(2％异氟烷，其余为O2)将尾静脉血直接采集到市售血气分析药筒(I-stat，Heska Corporation；Ft.Collins，CO)中。
膈运动神经元的逆行标记
使用小绘画刷(artist’s brush)将神经元逆行示踪剂(4％，Fluorochrome，LLC，Denver，CO)施加到隔膜的腹表面(～75μL)。小心地将示踪剂仅少量地施加至隔膜，以最小化向肝和周围组织渗漏。在施加后48小时，移出颈脊髓(C3-C5)，用石蜡包埋并且截成10μm的横断面。通过荧光显微术鉴定标记的膈运动神经元。
统计
推断地确定该项目的统计学显著性为p＜0.01。使用3阶协方差分析(ANCOVA)对通气数据进行分析。未使用体积∶体重比，因为体重比可能引入偏差，并且该方法不具有除去体重对数据之影响的预期效果。通过使用ANCOVA方法，分析作为所有呼吸体积数据之协变量的体重，其更加精确地移除了体重对数据的影响。对于基线测量，使用性别、品系和年龄作为因子，而使用性别、品系和时间(高二氧化碳的1至10分钟)作为因子分析高二氧化碳数据。使用学生t检验分析血红蛋白、血细胞比容、葡萄糖和钠(麻醉的小鼠)。使用2阶ANOVA和t检验分析糖原定量，并且进行Bonferroni校正以用于事后测量。使用2阶ANOVA重复测量分析隔膜肌收缩功能。从膈神经纤维分布图提取膈吸气脉冲串振幅、呼吸频率和膈脉冲串提高速率。用1阶ANOVA分析这些变量和动脉PaCO2，并且进行Fischer’s LSD检验以用于事后分析。所有数据均表示为平均值±SEM。
如所描述的进行动脉采血、糖原定量、运动神经元中的组织学糖原检测、体外隔膜收缩性能和传出膈神经记录(Martineau，L，和Ducharme，M.B.，Contemp.Top.Lab.Anim.Sci.，37(5)：67-72，1998；Lo等，J.Appl.Physiol.，28：234-236，1970；Guth，L，和Watson，P.K.，Exp.Neurol.，22：590-602，1968；Staib等，Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.，282(3)：R583-90，2002；Doperalski，N.J.和Fuller，D.D.，Exp.Neurol.，200(1)：74-81，2006)。
结果
Gaa-/-小鼠的一般特性
在所有年龄中，Gaa-/-小鼠的重量显著低于其野生型对照。未观察到年龄相关的性别差异，并且在所有年龄中，雄性重量显著高于雌性。
颈脊髓的糖原定量和PAS染色
在所有年龄中，Gaa-/-小鼠颈脊髓(C3-C5)中的糖原含量提高，并且与6个月时相比，在＞21个月时差异更突出(图17A)。这些数据在一系列独立实验中得到了验证，在这些实验中，确定了神经轴(neuraxis)多个水平下的糖原水平。
相关组织化学也证明了在Gaa-/-小鼠遍布颈脊髓灰质的神经元细胞体中显著的糖原反应产物，其在运动神经元中尤其突出(图17E、图17F和图17G)。用逆行标记的腹侧颈脊髓中的运动神经元表现出遍布细胞体细胞质之显著的PAS液滴(阳性糖原)(图17G)。来自对照标本之PAS染色切片的可比较神经元示出实际上无PAS阳性内含物的神经元(图17B、图17C和图17D)。
通气
基于分钟通气量/呼出CO2的比，Gaa-/-小鼠似乎通气不足，其将分钟通气量归一化到代谢性CO2产生。相对于野生型对照，Gaa-/-小鼠中该量度在基线减小。在所研究的所有年龄中，与对照相比，Gaa-/-小鼠中的基线分钟通气量(非归一化)、呼吸频率、潮气量、峰吸气流量、峰呼气流量和潮气量/吸气时间比也减小(表2，图18)。检测到的唯一年龄差异是在＞21个月时降低的频率(相对于6个月)和在＞21个月时提高的潮气量(相对于6个月)。在分析中未检测到年龄相互作用的品系。
表2：基线通气特征
对照和Gaa-/-小鼠的频率、潮气量(TV)、分钟通气量(MV)、峰吸气流量(PIF)、峰呼气流量(PEF)以及潮气量：吸气时间比(TV/Ti)的60分钟基线(21％O2，其余为N2)值。
＊＝Gaa-/-与对照有差异(p＜0.01)。
(p＜0.01)。
使用高二氧化碳攻击作为呼吸刺激以测试Gaa-/-小鼠中提高通气的能力。在每个年龄中，Gaa-/-小鼠对于高二氧化碳的以下方面的响应均低于对照：分钟通气量(图18A和图18B)，以及频率、潮气量、峰吸气流量、峰呼气流量和潮气量/吸气时间比。仅在6个月年龄组中检测到了性别差异，由此对于测试的所有呼吸变量，雌性对高二氧化碳具有不同的响应。
采血
Gaa-/-小鼠中血红蛋白(Hb)和血细胞比容(Hct)二者提高(表3)，最大可能地弥补不足的动脉O2分压(PaO2；见下文)。另外，对照和Gaa-/-小鼠之间的葡萄糖和钠水平没有变化，表明测量的Hb和Hct差异不反映血浆体积差异。Gaa-/-小鼠具有比对照低的PaO2(表3)，支持了这些小鼠通气不足的观点。
表3：12个月的Gaa-/-和对照小鼠的血液特征
12月龄的对照和Gaa-/-小鼠的血红蛋白、血细胞比容、钠和葡萄糖值(n＝9/组)。12月龄的对照和Gaa-/-小鼠的动脉O2分压。＊＝Gaa-/-与对照有差异(p＜0.01)。
肌肉特异性hGAA小鼠
接下来，对具有肌肉特异性GAA活性校正的转基因动物(MTP小鼠)中的呼吸功能进行量化。为了首先获得隔膜肌功能指数，体外测量来自B6/129、Gaa-/-和MTP小鼠的收缩性能。对照和MTP小鼠具有类似的力，而Gaa-/-小鼠产生显著较小的力。这些数据证实了MTP隔膜肌中正常的糖原水平(MTP vs.B6/129；1.7±1.3vs.1.4±0.2μg/mgww)，对应于在功能上类似于B6/129小鼠的隔膜肌。
虽然具有表观正常功能的隔膜肌(图19C)，但是MTP中的呼吸模式改变了。基线期间的分钟通气量在MTP和Gaa-/-小鼠中类似，并且二者与B6/129小鼠相比均显著降低(图19A-图19C)。另外，MTP小鼠中对于高二氧化碳的响应削弱，虽然其表现出比Gaa-/-小鼠更大的响应(图19B)。产生了来自B6/129、Gaa-/-和MTP小鼠(图20C)的代表性气流迹线(图19C)。
传出膈活性
为了确定在Gaa-/-和MTP中看到的受损的通气是否与下降的膈运动输出有关，我们测量了Gaa-/-、MTP和对照小鼠中的传出膈神经活性。在类似的动脉PCO2水平(参见图例，图20A)下，Gaa-/-和MTP小鼠具有显著降低的膈吸气脉冲串振幅(图20A和图20B)。来自Gaa-/-和MTP小鼠的神经纤维分布图记录也揭示了较少频率的脉冲串，以及整合的吸气脉冲串之减小的斜率(即，较慢的“上升速率”，表4)。
表4：膈神经生理学特征
上升速率(mV/s) 频率(呼吸/分钟) 振幅(mV)
对照： 346±86 167±14 52.8±14.1
Gaa-/：- 44±15＊ 107±14＊ 6.6±1.7＊
MTP： 101±27＊ 124±17＊ 11.8±1.8＊
12个月大的对照(n＝8)、Gaa-/-(n＝8)和MTP(n＝6)小鼠之膈脉冲串的上升速率(mV/s)，膈脉冲串的频率(神经呼吸/s)和膈脉冲串的振幅(mV)。
＊＝与对照有差异(p＜0.01)。
庞皮病鼠模型的这项研究已经揭示了与GAA缺陷和伴随的呼吸困难有关的许多观察结果。首先，如通过气压体积描记术揭示的，Gaa-/-小鼠中通气下降。其次，Gaa-/-小鼠中颈脊髓糖原增加，并且PAS染色鉴定了颈运动神经元中突出的糖原内含物(inclusion)，包括通过逆行示踪间接鉴定的膈运动神经元。第三，Gaa-/-小鼠相对于野生型对照具有减弱的膈输出。最后，MTP小鼠也表现出呼吸损伤以及与在Gaa-/-小鼠中观察到的类似的膈神经纤维分布图特征，尽管有表观上正常的隔膜收缩功能(图21A和图21B)。这些首次表明Gaa-/-小鼠中呼吸减弱的正式证据链，并且推断庞皮病患者中，可能是神经和肌肉缺陷的组合造成的。
脊髓(包括膈运动神经元)内过量的糖原导致在本文所述实验中在对照和Gaa-/-小鼠之间吸气膈脉冲串振幅的量化。测量膈神经活性，这是呼吸系统的最终运动输出。负责Gaa-/-小鼠中输出降低的机制可能来自超出膈运动神经元的领域，其包括更高(神经)呼吸输入和/或由于长期减弱的PaO2水平和推测提高的PaCO2水平造成的化学感觉传入的损伤。然而，应注意，在更高呼吸驱动(PaCO2～90mmHg)的条件下，这两个组均能够提高膈吸气脉冲串振幅，但是Gaa-/-小鼠继续具有较低输出(对照：68.7mv±20.0，Gaa-/-：14.0mv±4.8)。在Gaa-/-小鼠中最终膈神经活动的终产物改变，因此证明了呼吸控制的神经缺陷。
为了确定肌肉功能障碍不仅是由于GAA缺陷导致的通气缺陷，使用仅在骨骼肌中表达hGAA的双转基因小鼠(在Gaa-/-背景下维持)。由于这些小鼠具有正常肌肉收缩性能，因此假设MTP和对照品系通气之间的任何差异将反映呼吸肌之神经控制中的不一致。与该假设一致，在平静呼吸期间，MTP和Gaa-/-小鼠的通气类似。当用高二氧化碳刺激呼吸驱动时，MTP小鼠的通气响应依然弱于对照，但是比Gaa-/-小鼠提高。因此，在提高的呼吸驱动条件下，肌肉和神经组成部分均促使通气缺陷。
实施例8-向肌肉施用的AAV能够通过具有肌纤维的突触运输到运动神经体
参考图22、图23和图24，向肌肉施用的AAV能够通过具有肌纤维的突触运输到运动神经体。在小鼠接受胸内注射AAV-CMV-LacZ(2.18×1011颗粒)的实验中(图22)，载体递送后，分离自隔膜的基因组DNA包含控制基因。在小鼠接受胸内注射AAV-CMV-LacZ(2.18×1011颗粒)的实验中(图23)，由膈细胞核分离基因组DNA。图24表明在用AAV-CMV-GAA(2.52×1010颗粒)注射后4周，通气改善。
实施例9-用rAAV2/9载体恢复神经肌肉接点完整性
在开发用于肌营养不良的治疗时，存在同时取得对所有受影响组织之广泛校正的独特挑战。
本实施例表明，编码hGAA的rAAV2/9载体导致转基因(人GAA)逆行运输到运动神经元，并且有效转导骨骼肌、CNS和心脏组织(图25)。另外，施用rAAV2/9-GAA载体使得恢复了神经肌肉接点完整性，并且逆转了庞皮病的轴突病理。运动神经元中充足的GAA水平的恢复提供了庞皮病动物中通气参数的显著提高。
(A)直接肌内或脊柱内注射
简单地说，将1岁大的庞皮病小鼠(Gaa-/-)随机分成以下组：未处理(Gaa-/-)、AAV2/9-CMV-hGAA或AAV2/9-DES-hGAA。AAV2/9处理的动物在右胫骨前肌肌肉中接受1×1011vg载体的单次肌内注射。注射后1个月，分析胫骨前肌肌肉和腰脊髓中载体基因组的拷贝数和GAA活性。
如图26中所示，在胫骨前肌(AAV2/9-DES-hGAA 1.5×105±3.1×104vg/μg DNA；AAV2/9-CMV-hGAA 8.4×104±1.7×104vg/μg DNA)，和腰脊髓(AAV2/9-DES-hGAA 1.5×103±1.7×102vg/μg DNA；AAV2/9-CMV-hGAA 2.5×103±1.3×103vg/μg DNA)中检测到了高水平的载体基因组，表明骨骼肌的有效转导以及AAV2/9载体的逆行运输。在AAV2/9-DES-hGAA和AAV2/9-CMV-hGAA动物中，胫骨前肌裂解物中GAA的活性分别为野生型以上的2396％和1770％(p＜0.05)。胫骨前肌中神经肌肉接点的免疫组织化学评估揭示了AAV2/9处理之动物中完整性的恢复(图27)。
在该实验中，比较了常规CMV启动子和更加组织受限的结蛋白(DES)启动子之间转基因(GAA)的组织特异性表达。简单地说，本实验中描述的人结蛋白构建体包含肌细胞特异性增强子因子2(MEF2)和MyoD增强子元件二者。人组织的分析揭示了小脑、子宫内膜、骨骼肌、侧脑室的神经元细胞和心脏中结蛋白的表达。这对于AAV构建体是有利的，因为与常规CMV启动子(病毒，广泛的细胞表达)相比，结蛋白充当了非病毒和组织受限的启动子。另外，来自脊髓的表达谱也显示了结蛋白的表达，使得其成为用于驱动通过AAV载体之治疗性转基因的有利启动子。
注射后28天对于GAA的酶促活性测定证明了TA和腰脊髓中显著的酶水平和载体基因组拷贝(图25)。直接向骨骼肌施用AAV2/9导致有效转导被注射肌肉，并且表现出逆行转导腰运动神经元，如通过腰脊髓区中载体基因组拷贝以及Gaa-/-动物中神经肌肉接点(NMJ)完整性的恢复所证明。结果还表明，肌内递送rAAV载体转导CNS和骨骼肌组织，并因此可用于治疗庞皮病的CNS和骨骼肌组成部分。
材料和方法
重组AAV2/9载体的包装和纯化
使用p43.2-GAA产生基于血清型9的重组AAV颗粒，并且在弗罗里达大学鲍威尔基因治疗中心载体核心实验室产生、纯化和滴定。
实验动物
使用外显子6GAA敲除动物模型来检查AAV2/9介导的GAA(AAV2/9-GAA)治疗的转导效率和载体构建体的特异性，所述动物模型表现出庞皮病相关的心脏和骨骼肌表型。
向Gaa-/-/129SvE(Gaa-/-)小鼠注射20μl乳酸林格溶液或者在乳酸林格溶液中稀释的1×1011vg rAAV2/9-CMV-GAA或rAAV2/9-DES-GAA(QS20μl)。
整体装片神经肌肉接点
切下骨骼肌并且在α-银环蛇毒素(TRITC标记)中孵育10分钟。洗涤并且固定在4％多聚甲醛中。将组织封闭在4％BSA(1％TritonX)中并且用NFH孵育。进行直接针对NFH的第二抗体(Alexa 488)并且将组织装片用于随后的显微术。
坐骨神经
分离坐骨神经并且放在盒中进行OCT固定。切下5微米的切片，并且进行第一和第二Ab孵育以及NFH、MBP、SMI-32或H&E可视化。基因组DNA提取和实时PCR
在肌内注射后，使用PCR测量AAV基因组在TA和腰脊髓中的分布。使用DNAeasy试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明分离DNA。针对AAV载体的SV40聚A区设计引物和探针。
GAA活性测定
收获组织，立即急冻并且储存在-80℃。匀浆在4℃下14,000rpm离心10分钟。通过在37℃孵育1小时后测量4-甲基伞形酮-α-D吡喃葡糖苷的切割来测定所得上清液的GAA活性。使用Bio-Rad DC蛋白质测定试剂盒根据制造商说明书测量蛋白质浓度。数据相对于未处理GAA组织水平的测量值表示(％WT)。
(B)直接脊柱内施用
为了直接转导颈脊髓区和膈运动神经元群，通过直接脊柱内注射将rAAV-GAA载体施用到Gaa-/-小鼠脊髓的C3-C5区中。
如图28所示，在小鼠C3-C5区直接注射rAAV2/9报道构建体导致膈运动神经元群的转导。在Gaa-/-动物中递送治疗性转基因(GAA)显著改善了呼吸功能，并且通过免疫组织化学检测确认了膈运动神经元群中GAA的表达(图29)。观察到提高的呼吸功能只是由于CNS转导，因为未在隔膜中检测到载体基因组拷贝。所述结果还表明CNS中的糖原积累损害骨骼肌功能。
(C)直接胸内施用
随着观察到CNS中GAA的表达极大改善呼吸肌功能，进行了实验以靶向呼吸肌(例如，隔膜和肋)和CNS(颈和胸区)二者(图30)。在这些实验中，比较了AAV2/9-CMV-GAA和AAV2/9-DES-GAA以检查DES启动子在CNS中的逆行效率。
简单地说，Gaa-/-动物接受AAV2/9-CMV-GAA或AAV2/9-DES-GAA载体的单次注射。在与AAV2/9-CMV-GAA相比时，AAV2/9-DES-GAA的施用导致类似或更优的靶组织转导效率，并且导致心脏和呼吸功能改善。
在Gaa-/-动物中胸内注射导致在隔膜和脊髓的C3-C5区(膈运动神经元区)中检测出了载体基因组。所述结果表明使用AAV2/9载体发生了逆行运输现象。
为了确定呼吸肌和CNS二者转导的生理影响，Gaa-/-动物接受AAV2/9-CMV-GAA或AAV2/9-DES-GAA的单次胸内注射，并且在注射后6个月进行神经生理学测量。膈神经的直接原位测量揭示了通过高二氧化碳条件下增加的脉冲串振幅和膈膜EMG活性证明的明显治疗效果(图31)。
另外，进行实验以确定膈运动神经元群中的逆行运输是否明显，这会显著影响适当的呼吸功能。庞皮病的一种标志是呼吸功能不全。虽然传统上认为呼吸功能不全是由呼吸肌肉无力造成的，但是本发明人发现呼吸功能不全可由糖原积累导致的膈神经活动的损伤引起。
为了直接可视化膈运动神经元群中AAV介导的逆行转导，通过胸内注射将AAV2/9-GFP载体注射到Gaa-/-动物中。注射后一个月时，灌注动物并固定整个脊髓用于截面免疫组织化学分析以检测和定位GFP表达。
如图32所示，在脊髓的C3-C5和T2-T5区中检测到了GFP的阳性染色。每个区域的插图分别指示膈(左)和肋(右)运动神经元群的阳性染色。图33表明施用rAAV-CMV-GAA和rAAV-DES-GAA提高了膈神经信号传播。
(D)静脉内施用
静脉内施用rAAV-GAA载体提供了对庞皮病的治疗，包括校正心脏和呼吸肌功能障碍。简单地说，将4x108vg的rAAV2/9-CMV-hGAA载体通过静脉内(IV)注射施用至1天大的Gaa-/-小鼠。对心脏量度(例如，P-R间隔、心排血量和射血分数)的评估揭示了在注射后超过6个月与未处理的动物相比，经处理Gaa-/-小鼠中的显著改善。另外，由于恢复的GAA活性，经处理动物的心脏和隔膜组织中的糖原沉积显著减少。
在另一个实验中，三个月大的Gaa-/-小鼠接受1×1011vg(～5x106vg/kg)AAV2/9-(CMV或DES)-GAA的单次静脉内注射。在注射后3个月时(6月龄)测量心脏和隔膜功能，并且平行测量年龄匹配的未处理Gaa-/-和野生型129SVe(WT)小鼠。DES-GAA处理的动物表现出显著改善的与WT类似的心脏功能水平(图34)和减少的左心室质量。测量了来自未处理Gaa-/-、AAV2/9-CMV、AAV2/9-DES和WT之隔膜条的收缩功能，所述结果显示AAV2/9/-CMV-GAA和AAV2/9-DES-GAA处理组中的功能改善(图34F)。所述结果还表明在全身处理的动物中，DES驱动的GAA更有效。
实施例10-使用基于HSV的系统产生rAAV载体
在基因治疗应用中使用rAAV的一个主要障碍是缺少高产率地产生高效价和高纯度之载体的能力。使用基于转染的生产系统的1×1014至1×1015载体基因组的生产量依然麻烦、耗时并且高成本。
本实施例涉及使用基于单纯疱疹病毒I型系统(HSV)的生产平台大量生产rAAV载体(例如，rAAV2/9-hGAA)。当前系统使用两种重组HSV：一种携带AAV rep和cap，或“辅助物”，而另一种携带含转基因表达盒的重组AAV基因组。在用两种重组HSV共感染细胞后起始AAV的生产，并且通常在52小时内进行收获。生产者细胞(HEK293或BHK21)可在贴壁支持物(烧瓶或细胞工厂)上生长或在Wave Bioreactor型技术中悬浮。
在基因治疗应用中使用rAAV的另一个挑战是缺少对AAV载体(例如，AAV2/9)的有效、高回收的流线式纯化方法。本实施例还提供了用于从粗制细胞提取物纯化rAAV9颗粒的一种流线式方案，其可应用于大规模生产方案。
需要建立基于HSV系统的可扩展并且灵活的平台以产生足够量的高纯并浓缩的rAAV载体(例如，rAAV2/9-GAA)。基于以下参数比较在293细胞中使用HSV系统或标准共转染方案制备的rAAV9载体储液：i)制备物的生化纯度(即，不存在污染的蛋白质)；ii)感染性颗粒与自然(physical)颗粒的比；iii)VP1：VP2：VP3衣壳蛋白的比；以及iv)实心(full)颗粒与空颗粒的比例。
基于HSV系统和AAV9的流线式纯化方案之可扩展生产方法的实施能够以时间和成本有效的方式制备大量高纯并有效的rAAV载体(例如，rAAV2/9-GAA)。使用HSV系统制备的rAAV载体(例如，rAAV2/9-GAA)的特征在于具有比得上或超过使用转染方法在HEK293细胞中制备之载体的纯度和生物学效力水平。
图35是基于HSV之生产系统的载体构建体的示意图。图36示出了通过pl沉淀和柱色谱法流线式纯化rAAV载体。图37示出了使用贴壁细胞通过HSV共感染方法产生AAV。
HSV-AAV-hGAA和HSV-AAV/rep2cap9辅助物的制备
通过同源重组将两种重组HSV-AAV-hGAA(HSV-hGAA和HSV-coGAA)改造到复制缺陷的rHSV-1载体的胸苷激酶(tk)基因座中，ICP27缺失(感染的细胞蛋白质27)。AAV-DES-hGAA包含结蛋白启动子下游的人GAA ORF，并且两侧为AAV血清型2末端重复(ITR)。AAV-DES-cohGAA包含人GAA ORF的密码子优化形式，用于更高地在真核细胞中表达(GeneArt，Invitrogen)。
通过插入PCR产生的AAV2rep序列和来自质粒pRep2Cap9(获自Jim Wilson博士，UPenn)的AAV9cap产生HSV-AAV9辅助物。通过噬菌斑测定筛选和分离重组病毒，并且通过在V27细胞(Vero衍生细胞，其提供ICP27)上克隆繁殖进一步扩增。
用于产生rHSV的方法
从细胞上清液回收HSV病毒，并且在滴定之前进一步过滤并浓缩。在生长在烧瓶(T225或细胞工厂)的HEK293中或者在旋转培养物中悬浮适应的BHK细胞(达1L或约1×109细胞)中进行小规模和中等规模的rAAV生产。在适当的MOI下，用rHSV-hGAA(或rHSV-cohGAA)和rHSV-rep2/cap9WVB共感染细胞。在感染后约52小时收获细胞。使用我们的标准纯化方法用冻融和碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化AAV9，然后使用Apollo离心装置进行浓缩。通过Q-PCR分析储液的载体基因组效价，并且通过银染色SDS-PAGE分析纯度。
中等规模生产(＞1×109细胞)的一种替代纯化方法包括通过微流化制备细胞粗制裂解物，并且通过pI共沉淀和柱色谱法纯化AAV9颗粒。在处理和显影期间，在产率/细胞，空/实心比、纯度以及颗粒与感染单位的比方面用上述方法以及通过常规CaPO4转染在HEK293中制备小批次AAV9进行评估。
基于悬浮之形式的放大对于大规模rAAV9生产是必要的。简单地说，将sBHK细胞培养在旋转培养物(1L及以上)或一次性生物反应器型Wave 10升及以上(WaveTM，GE Healthcare)中，并且用rHSV-hGAA和rHSV-rep2/cap9WVB共感染。悬浮BHK系统的优点是增加的细胞密度(达2×109细胞/L)和降低的HSV输入(或MOI)，这通常导致rAAV产率的净增加。约52小时后，将细胞和上清液原位裂解，并且通过深度过滤和绝对过滤澄清。然后浓缩澄清的裂解物并通过切向流过滤(TFF)配制成合适的缓冲液，之后进一步纯化。
纯化AAV9载体的过程
本发明人已经开发了基于等电点(pI)沉淀的新的AAV(例如，AAV9)纯化方案。所述纯化方案可应用于更大规模的粗制裂解物(＞1×109细胞)。使用经验建立的条件，选择性沉淀由转染的HEK293细胞产生的粗制细胞裂解物中的大部分蛋白质，而超过95％的rAAV9保留在溶液中。然后使预纯化的rAAV9进行5mL SP琼脂糖离子交换色谱(HiTrap SP HP，GE Healthcare)，并且将来自洗脱峰的级分通过Apollo 150kD截止过滤器旋出。高分子量的AAV9颗粒被保留并且浓缩，而在SP色谱之后存在的小尺寸蛋白质被除去。该流线式方案得到了高度纯化的载体，并且保留了几乎80％的粗制裂解物中原始存在的病毒。
质量控制测定
评估rAAV9制备物的身份、纯度、载体基因组效价和感染性效价。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定生物化学身份和纯度。通过银染色或考马斯蓝在合适的对照存在下使AAV衣壳蛋白VP1、2和3可视化。利用Quantity-One软件(Bio-Rad)通过凝胶成像对杂质水平进行量化。使用建立的实时定量PCR(Q-PCR)方案测定载体基因组效价，所述方案利用载体基因组特异性的SV40多聚腺苷酸化信号序列的引物。通过用rAAV9制备物和WT腺病毒共感染C12细胞(表达AAV2Rep和Cap的HeLa细胞)进行感染性效价测定。随后将感染的细胞捕捉在硝化纤维素滤器上并探测转基因(GAA cDNA)，并且仅已经成功感染rAAV的细胞在薄膜上产生可见斑。通过电子显微术确定实心衣壳和空衣壳之间的比。
实施例11.用rAAV2/9载体治疗神经肌肉接点病理
在庞皮病患者中，神经和乙酰胆碱受体没有接触，表明存在神经肌肉接点(NMJ)病理。如图41所示，Gaa-/-动物具有神经肌肉接点和外周神经中的不适应。在庞皮病小鼠的坐骨神经中，胞外基质增加并且轴突丧失(图42)。另外，检查了9个月大野生型和Gaa-/-动物隔膜中的NMJ。与野生型动物相比，在庞皮病动物中，隔膜乙酰胆碱受体尺寸显著增加(图41)。另外，Gaa-/-小鼠隔膜中突触前膜处的主要变化明显。标记突触结合蛋白以鉴定NMJ中的突触前间隙(图43)。在庞皮病动物中，突出结合蛋白的表达显著丧失。
向Gaa-/-动物注射包含编码Gaa之核酸分子的AAV2/9载体(1×1011vg)或载剂(vehicle)(参见，图44的实验设计)。用AAV2/9-GAA载体处理Gaa-/-动物削弱了Gaa表达的组织特异性模型中的NMJ发病机理。
在23个月大的Gaa-/-小鼠中，在将AAV2/9-结蛋白-GAA载体直接注射到右侧胫骨前肌中后两个月，测量注射的腿和对侧腿中的乙酰胆碱受体(AChR)尺寸(图45)。所述结果表明在用AAV2/9-结蛋白-GAA注射的Gaa-/-小鼠腿中，乙酰胆碱受体的尺寸减小。AAV2/9-结蛋白-GAA处理后，Gaa-/-动物表现出AChR尺寸显著增加，而AChR尺寸的减小提供了对NMJ病理的积极治疗效果。所述结果表明，AAV2/9-GAA处理可用于恢复或增强膈神经和隔膜之间的神经肌肉传递。除了AAV-GAA处理外，还可施用乙酰胆碱酯酶抑制剂(ACI)以改善庞皮病对象中的神经递质释放。
另外，为了确定AAV2/9的逆行效率和NMJ再组织的潜力，通过肌内途径将AAV2/9-DES-GAA载体直接注射到Gaa-/-的胫骨前肌(TA)中。图46示出了与野生型相比，受影响(Gaa-/)动物中NMJ前和后突触完整性的丧失。图46还示出了肌内施用AAV2/9-DES-GAA后庞皮病动物中NMJ的再组织。相应AAV2/9-GAA坐骨神经的纵切片揭示了生长相关蛋白43(Gap43)标记中增加的信号(图47)。Gap43与轴突再生有关、长期增强相关，并且是轴突前末端的重要组成部分。阳性治疗效果通过注射部位(TA)处和腰脊髓中高的载体基因组拷贝数和GAA的表达介导。
如图48所示，对Gaa-/-动物进行脊柱内注射(C3-C5)AA2/5V-GAA以靶向膈运动神经元群。载体处理的动物在注射部位表现出高的GAA水平、减少的糖原以及改善的呼吸功能，其具有与野生型值类似的水平(图48)。
另一些实施方案
可以对组合物和方法步骤的一部分或全部进行任何改进。本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)，均在此通过引用并入。本文提供的任何以及全部实例或示例性语言(如，“例如”)，旨在说明本发明，并且不对本发明的范围造成限制，除非另外要求。本文对于本发明或者优选实施方案的性质或益处的任何陈述并未旨在限制，并且不应当认为所附权利要求受到这些陈述的限制。更一般性地，说明书的没有语言可以解释为表明任何未要求保护的要素是实践本发明所必需的。本发明包括所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同方案，如适用法律所允许的。另外，上述要素的所有可能变化的任意组合也涵盖在本发明内，除非本文另有说明或者与内容明显矛盾。

Claims (20)

1.一种改善神经肌肉接点完整性受损的方法，其包括向神经肌肉接点完整性受损的对象施用有效量的包含rAAV 2/9载体的组合物，其中所述rAAV 2/9载体包含与启动子有效连接的异源核酸分子，并且通过肌内、胸内、脊柱内、脑池内、鞘内或静脉内注射来向所述对象施用治疗性组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述异源核酸分子编码酸性α-葡糖苷酶(GAA)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、结蛋白(DES)启动子、突触蛋白I(SYN)启动子或肌肉肌酸激酶(MCK)启动子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象具有由神经肌肉疾病造成的神经肌肉受损。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象具有由选自以下的疾病造成的神经肌肉受损：庞皮病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、1a型糖原贮积病、肢带型肌营养不良、Barth综合征和重症肌无力。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象是人。
7.根据权利要求2所述的方法，其还包括向所述对象施用乙酰胆碱酯酶抑制剂(ACI)。
8.一种治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向需要这种治疗的对象施用有效量的包含rAAV 2/9载体的组合物，其中所述rAAV 2/9载体包含与启动子有效连接的异源核酸分子，并且通过肌内、胸内、脊柱内、鞘内、脑池内或静脉内注射来向所述对象施用治疗性组合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述神经肌肉疾病选自庞皮病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、1a型糖原贮积病、肢带型肌营养不良、Barth综合征和重症肌无力。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述神经肌肉疾病是庞皮病。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述异源核酸分子编码酸性α-葡糖苷酶(GAA)。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、结蛋白(DES)启动子、突触蛋白I(SYN)启动子或肌肉肌酸激酶(MCK)启动子。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述对象是人。
14.根据权利要求11所述的方法，其还包括向所述对象施用乙酰胆碱酯酶抑制剂(ACI)。
15.一种改善神经肌肉接点完整性受损和/或用于治疗神经肌肉疾病的方法，其包括向对象施用有效量的包含rAAV载体的组合物，其中所述rAAV载体包含与启动子有效连接的异源核酸分子，其中所述对象的神经肌肉接点完整性受损和/或患有神经肌肉疾病，并且所述对象未患有庞皮病。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述rAAV载体选自rAAV2/1、rAAV2/8或rAAV2/9载体。
17.根据权利要求15所述的方法，其中通过肌内、胸内、脊柱内、脑池内或静脉内注射来向所述对象施用治疗性组合物。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子、结蛋白(DES)启动子、突触蛋白I(SYN)启动子或肌肉肌酸激酶(MCK)启动子。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述对象患有选自以下的神经肌肉疾病：肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、1a型糖原贮积病、肢带型肌营养不良、Barth综合征和重症肌无力。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述对象是人。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109328231A (zh) * 2015-11-06 2019-02-12 克里斯普治疗股份公司 用于治疗1a型糖原贮积病的材料和方法
CN111902539A (zh) * 2018-02-07 2020-11-06 吉尼松公司 杂合调控元件
CN114828858A (zh) * 2019-10-25 2022-07-29 奥登茨治疗公司 用于治疗糖原贮积症的组合物和方法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120322861A1 (en) 2007-02-23 2012-12-20 Barry John Byrne Compositions and Methods for Treating Diseases
DK3292875T3 (en) 2012-06-19 2020-08-03 Univ Florida Compositions and methods for treating diseases
JP2016523835A (ja) * 2013-05-15 2016-08-12 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 中枢神経系へのアデノ随伴ウイルスを介した遺伝子導入
EP3293259A1 (en) 2016-09-12 2018-03-14 Genethon Acid-alpha glucosidase variants and uses thereof
IL299325A (en) 2016-09-12 2023-02-01 Inst Nat Sante Rech Med Variants of acid alpha glucosidase and their uses
KR20200015932A (ko) 2017-06-07 2020-02-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 효소 내재화를 위한 조성물 및 방법
SG11202002457RA (en) 2017-09-22 2020-04-29 Univ Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
JP6567012B2 (ja) * 2017-09-28 2019-08-28 キヤノン株式会社 情報処理装置、情報処理方法、およびプログラム
JP7134444B2 (ja) * 2018-01-26 2022-09-12 国立大学法人徳島大学 テイ－サックス病及びザンドホッフ病治療用の新規アデノ随伴ウイルスビリオン
CN111936621A (zh) * 2018-02-05 2020-11-13 奥登茨治疗公司 转录调控元件和它的用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003092598A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 University Of Florida Treatment for pompe disease
CN1922313A (zh) * 2004-02-10 2007-02-28 齐斯特治疗公司 酸性α－糖苷酶及其片段
WO2007089632A2 (en) * 2006-01-27 2007-08-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
WO2008103993A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for treating glycogen storage diseases
EP1390490B1 (en) * 2001-05-24 2009-04-15 Genzyme Corporation Muscle-specific expression vectors
CN101636200A (zh) * 2006-11-13 2010-01-27 齐斯特治疗公司 用于治疗庞贝氏症的方法
US20120082653A1 (en) * 2010-10-04 2012-04-05 Duke University Methods of lysosomal storage disease therapy

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US6451600B1 (en) 1989-12-22 2002-09-17 Genzyme Corporation Enzymatically active recombinant glucocerebrosidase
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5869305A (en) 1992-12-04 1999-02-09 The University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
WO1995011640A1 (en) 1993-10-26 1995-05-04 Howmedica Inc. Prosthesis with integral proximal spacer
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US5962313A (en) 1996-01-18 1999-10-05 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors comprising a gene encoding a lyosomal enzyme
US6083725A (en) 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
US6426208B1 (en) 1999-11-12 2002-07-30 Harbor-Ucla Research And Education Institute Recombinant α-L-iduronidase, methods for producing and purifying the same and methods for treating diseases caused by deficiencies thereof
EP3339430A1 (en) 2001-12-17 2018-06-27 The Trustees of The University of Pennsylvania Adeno-associated virus (aav) serotype 9 sequences, vectors containing same, and uses thereof
EP1481067A1 (en) 2002-03-04 2004-12-01 Transgene S.A. Expression cassette for persistence of expression of a gene of interest in muscle cells
US7858367B2 (en) 2002-04-30 2010-12-28 Duke University Viral vectors and methods for producing and using the same
AU2003302724A1 (en) * 2002-08-13 2004-07-09 Mcivor, Scott, R. Methods of using vectors to treat metabolic disorders
ATE521701T1 (de) 2003-01-22 2011-09-15 Univ Duke Verbesserte konstrukte zur expression lysosomaler polypeptide
EP1668110A2 (en) * 2003-08-21 2006-06-14 Q Therapeutics, Inc. Genetically modified somatic cells for sustained secretion of lysosomal proenzymes deficient in lysosomal storage disorders
WO2005049850A2 (en) * 2003-11-14 2005-06-02 University Of Washington Compositions and methods for systemic nucleic acid sequence delivery
JP2007513968A (ja) 2003-12-12 2007-05-31 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 哺乳動物神経細胞へのｓｉＲＮＡのデリバリー
WO2005118611A2 (en) * 2004-01-23 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Microutrophin and uses thereof
WO2005077333A2 (en) 2004-02-10 2005-08-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Gel-based delivery of recombinant adeno-associated virus vectors
AU2005296063A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Neuronal progenitors from feeder-free human embryonic stem cell culture
EP1828390B1 (en) 2004-12-15 2012-06-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric vectors
PL1874282T3 (pl) 2005-04-06 2011-04-29 Adamas Pharmaceuticals Inc Sposoby i kompozycje do leczenia zaburzeń OUN
WO2007056614A1 (en) 2005-11-14 2007-05-18 Merial Limited Gene therapy for renal failure
DK1988823T3 (en) 2006-02-09 2018-12-03 Genzyme Corp SLOW INTRAVENTRICULAR ADMINISTRATION
WO2008058269A2 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Foldrx Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein trafficking
US20120322861A1 (en) 2007-02-23 2012-12-20 Barry John Byrne Compositions and Methods for Treating Diseases
EP2058401A1 (en) * 2007-10-05 2009-05-13 Genethon Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of AAV vectors
EP2430442B1 (en) * 2009-05-14 2015-04-01 Oatmeal Biotechnologies Group, L.L.C. Platform technologies for spontaneously occurring diseases
CN102548986A (zh) * 2009-06-05 2012-07-04 链接医药公司 氨基吡咯烷酮衍生物及其用途
US20130166313A1 (en) 2010-04-02 2013-06-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Systems and methods for managing treatment of an orphan disease
PT3486320T (pt) 2010-04-23 2022-03-30 Univ Florida Composições de ciclase raav-guanilato e métodos para tratar a amaurose congénita 1 de leber (acl1)
US20120141420A1 (en) * 2010-11-30 2012-06-07 Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg Targeted delivery of g-csf for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis
WO2013177367A2 (en) 2012-05-23 2013-11-28 The Johns Hopkins University Compounds and methods of use thereof for treating neurodegenerative disorders
DK3292875T3 (en) 2012-06-19 2020-08-03 Univ Florida Compositions and methods for treating diseases

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1390490B1 (en) * 2001-05-24 2009-04-15 Genzyme Corporation Muscle-specific expression vectors
WO2003092598A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 University Of Florida Treatment for pompe disease
CN1922313A (zh) * 2004-02-10 2007-02-28 齐斯特治疗公司 酸性α－糖苷酶及其片段
WO2007089632A2 (en) * 2006-01-27 2007-08-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Heparin and heparan sulfate binding chimeric vectors
CN101636200A (zh) * 2006-11-13 2010-01-27 齐斯特治疗公司 用于治疗庞贝氏症的方法
WO2008103993A2 (en) * 2007-02-23 2008-08-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Compositions and methods for treating glycogen storage diseases
US20120082653A1 (en) * 2010-10-04 2012-04-05 Duke University Methods of lysosomal storage disease therapy

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAODONG SUN ET AL.: "Correction of Multiple Striated Muscles in Murine Pompe Disease Through Adeno-associated Virus–mediated Gene Therapy", 《MOLECULAR THERAPY》 *
BARRY J. BYRNE ET AL.: "Pompe disease gene therapy", 《HUMAN MOLECULAR GENETICS》 *
CHRISTINA A. PACAK ET AL.: "rAAV2/9 Mediated Gene Delivery of Acid α-Glucosidase Corrects the Cardiac Phenotype in a Mouse Model of Pompe Disease", 《MOLECULAR THERAPY》 *
周旋 等: "神经肌肉接头中乙酰胆碱酯酶的研究进展", 《中国康复理论与实践》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109328231A (zh) * 2015-11-06 2019-02-12 克里斯普治疗股份公司 用于治疗1a型糖原贮积病的材料和方法
CN111902539A (zh) * 2018-02-07 2020-11-06 吉尼松公司 杂合调控元件
CN114828858A (zh) * 2019-10-25 2022-07-29 奥登茨治疗公司 用于治疗糖原贮积症的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3292875A1 (en) 2018-03-14
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EP4124346A3 (en) 2023-04-19
ES2813558T3 (es) 2021-03-24
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BR112014031788A2 (pt) 2017-06-27
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EP3292875B1 (en) 2020-05-27

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