JP2809601B2 - 塩基配列増幅方法 - Google Patents
塩基配列増幅方法Info
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】高感度かつ高特異的な塩基配
列増幅法であって、単一塩基の正確な区別を可能とし、
さらに未反応のプローブを容易に分離可能とする、リガ
ーゼチェイン反応（ＬＣＲ）用プローブを用いた塩基配
列増幅方法、および該塩基配列増幅方法を用いた塩基配
列検出方法に関する。
列増幅法であって、単一塩基の正確な区別を可能とし、
さらに未反応のプローブを容易に分離可能とする、リガ
ーゼチェイン反応（ＬＣＲ）用プローブを用いた塩基配
列増幅方法、および該塩基配列増幅方法を用いた塩基配
列検出方法に関する。
【０００２】
【従来技術】一般に、ブロッティングした膜や、固定し
た細胞等において、検出対象物（例えば、ポリヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチド等の塩基配列）の位置を検出
する方法は、（１）極微量の被検出物を検出可能とする
高感度性、（２）バックグランドを極力抑えるために被
検出物に対する高い特異性、さらに、（３）単一塩基の
違いを正確に区別可能とする高識別性、さらに（４）過
剰の未反応プローブ等を容易に除去可能とする被検出物
との高親和性等が要求される。
た細胞等において、検出対象物（例えば、ポリヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチド等の塩基配列）の位置を検出
する方法は、（１）極微量の被検出物を検出可能とする
高感度性、（２）バックグランドを極力抑えるために被
検出物に対する高い特異性、さらに、（３）単一塩基の
違いを正確に区別可能とする高識別性、さらに（４）過
剰の未反応プローブ等を容易に除去可能とする被検出物
との高親和性等が要求される。
【０００３】従来知られているハイブリダイゼーション
による方法は、固定された被検出物とラベル化したプロ
ーブとによるハイブリッドを形成し、該ラベルにより被
検出物の位置を検出するものであり、これにはサザンハ
イブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーショ
ン、in situ ハイブリダイゼーションなどがよく知られ
ている。
による方法は、固定された被検出物とラベル化したプロ
ーブとによるハイブリッドを形成し、該ラベルにより被
検出物の位置を検出するものであり、これにはサザンハ
イブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーショ
ン、in situ ハイブリダイゼーションなどがよく知られ
ている。
【０００４】しかし、上記のハイブリダイゼーションに
よる方法では、検出操作の前に被検出物の増幅を伴わ
ず、従って、検出感度は低い。また、極微量の被検出物
を検出するためには数時間から数日という長時間を要す
るという問題点がある。さらにプローブが被検出物に対
して十分高い特異性を有せず、例えば単一塩基の正確な
区別等は実際上不可能であり、被検出物に対する特異
性、識別性が悪い、またバックグランドが高くなる等の
問題点があった。さらに、未反応のプローブの分離には
試行錯誤的要素が多く、また激しい洗浄の条件が使用し
難い等の問題点があった。
よる方法では、検出操作の前に被検出物の増幅を伴わ
ず、従って、検出感度は低い。また、極微量の被検出物
を検出するためには数時間から数日という長時間を要す
るという問題点がある。さらにプローブが被検出物に対
して十分高い特異性を有せず、例えば単一塩基の正確な
区別等は実際上不可能であり、被検出物に対する特異
性、識別性が悪い、またバックグランドが高くなる等の
問題点があった。さらに、未反応のプローブの分離には
試行錯誤的要素が多く、また激しい洗浄の条件が使用し
難い等の問題点があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】以上説明したように従
来技術に伴う問題点に対応するため、被検出物を検出す
る前に増幅するステップを設ける方法が考えられてお
り、例えばin situ ハイブリダイゼイションにおいて、
ポリメラーゼチェイン反応（Polymerase chain reactio
n;ＰＣＲ）との組合せによるin situ ＰＣＲが開発され
ている。しかしながら、この方法では増幅を伴うために
高い感度であるという点は優れているが、特異性が低く
なり、そのためバックグラウンドが高くなるという欠点
が生じる場合も多い。さらに、単一塩基の正確な区別も
難しいという問題点の解決には充分ではない。さらに、
増幅産物が被検出物に固定されないため、未反応のプロ
ーブの分離の操作、例えば洗浄操作に限界があり、ひい
ては、増幅産物の検出を困難にしているという問題点も
ある。
来技術に伴う問題点に対応するため、被検出物を検出す
る前に増幅するステップを設ける方法が考えられてお
り、例えばin situ ハイブリダイゼイションにおいて、
ポリメラーゼチェイン反応（Polymerase chain reactio
n;ＰＣＲ）との組合せによるin situ ＰＣＲが開発され
ている。しかしながら、この方法では増幅を伴うために
高い感度であるという点は優れているが、特異性が低く
なり、そのためバックグラウンドが高くなるという欠点
が生じる場合も多い。さらに、単一塩基の正確な区別も
難しいという問題点の解決には充分ではない。さらに、
増幅産物が被検出物に固定されないため、未反応のプロ
ーブの分離の操作、例えば洗浄操作に限界があり、ひい
ては、増幅産物の検出を困難にしているという問題点も
ある。
【０００６】一方、前記説明したＰＣＲ法とは異なる原
理に基づく方法であって、優れた特徴をもつ増幅反応と
して、リガーゼチェイン反応(ligase chain reaction;
ＬＣＲ) が知られている（EP-A-320308 、Barany,Proc.
Natl.Acad.Sci.,88,189(1991))。ＬＣＲはＰＣＲと比べ
た場合、一般的に被検出物への特異性が高く、従ってバ
ックグラウンドの低い検出が可能となるという利点を有
している。さらにＬＣＲは、単一塩基の正確な区別をす
る能力も比較的高いことが知られている。しかしＬＣＲ
法においても、被検出物の位置の検出をする場合、反応
したプローブが非検出物に固定されないため未反応のプ
ローブの分離が困難となり、またさらに増幅産物の検出
のためにゲル電気泳動法等の抽出分離操作が必要なため
に被検出物の一の検出が困難であるという問題は解決さ
れていない。これらの問題点のために、被検体の位置を
同定する目的においては、ＬＣＲ法はいまだ充分ではな
いと考えられている。
理に基づく方法であって、優れた特徴をもつ増幅反応と
して、リガーゼチェイン反応(ligase chain reaction;
ＬＣＲ) が知られている（EP-A-320308 、Barany,Proc.
Natl.Acad.Sci.,88,189(1991))。ＬＣＲはＰＣＲと比べ
た場合、一般的に被検出物への特異性が高く、従ってバ
ックグラウンドの低い検出が可能となるという利点を有
している。さらにＬＣＲは、単一塩基の正確な区別をす
る能力も比較的高いことが知られている。しかしＬＣＲ
法においても、被検出物の位置の検出をする場合、反応
したプローブが非検出物に固定されないため未反応のプ
ローブの分離が困難となり、またさらに増幅産物の検出
のためにゲル電気泳動法等の抽出分離操作が必要なため
に被検出物の一の検出が困難であるという問題は解決さ
れていない。これらの問題点のために、被検体の位置を
同定する目的においては、ＬＣＲ法はいまだ充分ではな
いと考えられている。
【０００７】一方、ハイブリダイゼーションの際に、ハ
イブリッドを形成するプローブを被検出物の塩基配列
に、強く固定する方法が知られている(Landegren et.a
l, Science, 265, 2085(1994)) 。従って、この方法で
は、未反応のプローブの分離（例えば洗浄操作による除
去）、および被検出物の検出が容易と考えられる。また
固定する際の反応が、プローブの両端部分が正確にハイ
ブリッド形成した場合にしか起こらないため、高い特異
性を有し、単一塩基の正確な区別も可能であると考えら
れる。しかしこの方法では、被検出物検出の前に増幅反
応操作を伴わないために検出の感度が低いという問題点
が解決されていない。
イブリッドを形成するプローブを被検出物の塩基配列
に、強く固定する方法が知られている(Landegren et.a
l, Science, 265, 2085(1994)) 。従って、この方法で
は、未反応のプローブの分離（例えば洗浄操作による除
去）、および被検出物の検出が容易と考えられる。また
固定する際の反応が、プローブの両端部分が正確にハイ
ブリッド形成した場合にしか起こらないため、高い特異
性を有し、単一塩基の正確な区別も可能であると考えら
れる。しかしこの方法では、被検出物検出の前に増幅反
応操作を伴わないために検出の感度が低いという問題点
が解決されていない。
【０００８】従って、ブロッティングした膜や、固定し
た細胞等において、検出対象物（例えば、ポリヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチド等の塩基配列）の位置を検出
するために、（１）極微量の被検出物を検出可能とする
高感度性、（２）バックグランドを極力抑えるために被
検出物に対する高い特異性、さらに、（３）単一塩基の
違いを正確に区別可能とする高識別性、さらに（４）過
剰の未反応プローブ等を容易に除去可能とする被検出物
との高親和性等を有する検出方法がなく、その開発が強
く要望されている。
た細胞等において、検出対象物（例えば、ポリヌクレオ
チド、オリゴヌクレオチド等の塩基配列）の位置を検出
するために、（１）極微量の被検出物を検出可能とする
高感度性、（２）バックグランドを極力抑えるために被
検出物に対する高い特異性、さらに、（３）単一塩基の
違いを正確に区別可能とする高識別性、さらに（４）過
剰の未反応プローブ等を容易に除去可能とする被検出物
との高親和性等を有する検出方法がなく、その開発が強
く要望されている。
【０００９】そこで本発明者は、前記の諸問題点を解決
し、前記要望を満たすべく鋭意研究した結果、被検出物
の検出の前の操作として、新規な構造を有するプローブ
を調製し、ＬＣＲ反応により増幅することにより、
（１）極微量の被検出物を検出可能とする高感度性、
（２）バックグランドを極力抑えるために被検出物に対
する高い特異性、さらに、（３）単一塩基の違いを正確
に区別可能とする高識別性、さらに（４）過剰の未反応
プローブ等を容易に除去可能とする被検出物との高親和
性を有する検出方法を見出し本発明を完成するに至っ
た。
し、前記要望を満たすべく鋭意研究した結果、被検出物
の検出の前の操作として、新規な構造を有するプローブ
を調製し、ＬＣＲ反応により増幅することにより、
（１）極微量の被検出物を検出可能とする高感度性、
（２）バックグランドを極力抑えるために被検出物に対
する高い特異性、さらに、（３）単一塩基の違いを正確
に区別可能とする高識別性、さらに（４）過剰の未反応
プローブ等を容易に除去可能とする被検出物との高親和
性を有する検出方法を見出し本発明を完成するに至っ
た。
【００１０】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、新
規なＬＣＲ増幅反応用の２種類のプローブを用いて、Ｌ
ＣＲ法により、増幅産物が被検出物に固定して増幅し、
従って、増幅操作後に、未反応のプローブを洗浄等で完
全に除去可能とする塩基配列の増幅方法に係るものであ
る。
規なＬＣＲ増幅反応用の２種類のプローブを用いて、Ｌ
ＣＲ法により、増幅産物が被検出物に固定して増幅し、
従って、増幅操作後に、未反応のプローブを洗浄等で完
全に除去可能とする塩基配列の増幅方法に係るものであ
る。
【００１１】具体的には本発明は、通常のＬＣＲ法で必
要とされる４種類のプローブのうち、被検出塩基配列鎖
上で隣り合いリガーゼ反応により結合されるべき２つの
プローブを適当な連結部で結合してなるプローブと、該
被検出塩基配列の相補鎖上で隣り合いリガーゼ反応によ
り結合されるべき２つのプローブを適当な連結部で結合
してなるプローブとを用意し、ＬＣＲを行い、検出対象
の塩基配列に特異的にプローブをリガーゼによって環状
化することによって、鎖のように多数つなげるという塩
基配列増幅方法に係るものである。
要とされる４種類のプローブのうち、被検出塩基配列鎖
上で隣り合いリガーゼ反応により結合されるべき２つの
プローブを適当な連結部で結合してなるプローブと、該
被検出塩基配列の相補鎖上で隣り合いリガーゼ反応によ
り結合されるべき２つのプローブを適当な連結部で結合
してなるプローブとを用意し、ＬＣＲを行い、検出対象
の塩基配列に特異的にプローブをリガーゼによって環状
化することによって、鎖のように多数つなげるという塩
基配列増幅方法に係るものである。
【００１２】さらに本発明は、上記の本発明に係る塩基
配列増幅方法においてプローブを標識し、検出対象の塩
基配列の有無や変異を検出する塩基配列検出方法に係る
ものである。
配列増幅方法においてプローブを標識し、検出対象の塩
基配列の有無や変異を検出する塩基配列検出方法に係る
ものである。
【００１３】より詳しくは、本発明は、被検体たる１本
鎖ポリヌクレオチド中の、連続する塩基配列Ａ１および
Ａ２からなる塩基配列Ａ１Ａ２を検出する方法におい
て、(1) 塩基配列Ａ１に相補的な塩基配列Ｂ１からなる
ポリヌクレオチドと、塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列
Ｂ２からなるポリヌクレオチドとを連結部を介して連結
してなるプローブＢと、被検体ポリオリゴヌクレオチド
中の塩基配列Ａ１Ａ２とハイブリッド形成するステップ
と、(2) プローブＢの塩基配列Ｂ１の５’末端と、塩基
配列Ｂ２の３’末端とを、リガーゼにより結合するステ
ップと、(3) ハイブリッド形成した２本鎖を熱変性する
ステップと、(4) 前記熱変性したポリヌクレオチド複合
物と、プローブＢ、または塩基配列Ａ１からなるポリヌ
クレオチドと、塩基配列Ａ２からなるポリヌクレオチド
とを連結部を介して連結してなるプローブＡとハイブリ
ッド形成するステップと、(5) プローブＢの塩基配列Ｂ
１の５末端と、前記塩基配列Ｂ２の３’末端とを、また
はプローブＡの塩基配列Ａ１の３’末端と、塩基配列Ａ
２の５’末端とを、リガーゼにより結合するステップと
を、少なくとも含む塩基配列増幅方法に関するものであ
る。
鎖ポリヌクレオチド中の、連続する塩基配列Ａ１および
Ａ２からなる塩基配列Ａ１Ａ２を検出する方法におい
て、(1) 塩基配列Ａ１に相補的な塩基配列Ｂ１からなる
ポリヌクレオチドと、塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列
Ｂ２からなるポリヌクレオチドとを連結部を介して連結
してなるプローブＢと、被検体ポリオリゴヌクレオチド
中の塩基配列Ａ１Ａ２とハイブリッド形成するステップ
と、(2) プローブＢの塩基配列Ｂ１の５’末端と、塩基
配列Ｂ２の３’末端とを、リガーゼにより結合するステ
ップと、(3) ハイブリッド形成した２本鎖を熱変性する
ステップと、(4) 前記熱変性したポリヌクレオチド複合
物と、プローブＢ、または塩基配列Ａ１からなるポリヌ
クレオチドと、塩基配列Ａ２からなるポリヌクレオチド
とを連結部を介して連結してなるプローブＡとハイブリ
ッド形成するステップと、(5) プローブＢの塩基配列Ｂ
１の５末端と、前記塩基配列Ｂ２の３’末端とを、また
はプローブＡの塩基配列Ａ１の３’末端と、塩基配列Ａ
２の５’末端とを、リガーゼにより結合するステップと
を、少なくとも含む塩基配列増幅方法に関するものであ
る。
【００１４】また本発明は、さらにステップ(3) から
(5) を繰返すことを特徴とする塩基配列増幅方法に関す
るものである。
(5) を繰返すことを特徴とする塩基配列増幅方法に関す
るものである。
【００１５】また、本発明は、連結部の一部が、少なく
ともポリヌクレオチドまたはヘキサエチレングリコール
であることを特徴とする塩基配列増幅方法に関するもの
である。
ともポリヌクレオチドまたはヘキサエチレングリコール
であることを特徴とする塩基配列増幅方法に関するもの
である。
【００１６】また本発明は、その連結部が、少なくとも
塩基配列Ａ１Ａ２の１．２倍〜３倍の核酸塩基を有する
ポリヌクレオチドであることを特徴とする塩基配列増幅
方法に係るものである。
塩基配列Ａ１Ａ２の１．２倍〜３倍の核酸塩基を有する
ポリヌクレオチドであることを特徴とする塩基配列増幅
方法に係るものである。
【００１７】また本発明は、プローブＡの連結部が、前
記塩基配列Ａ１の５’末端と、塩基配列Ａ２の３’末端
で連結部を介して連結されていること、またはプローブ
Ｂの連結部が、塩基配列Ｂ１の３’末端と、塩基配列Ｂ
２の５’末端で連結部を介して連結されていることを特
徴とする塩基配列増幅方法に関するものである。
記塩基配列Ａ１の５’末端と、塩基配列Ａ２の３’末端
で連結部を介して連結されていること、またはプローブ
Ｂの連結部が、塩基配列Ｂ１の３’末端と、塩基配列Ｂ
２の５’末端で連結部を介して連結されていることを特
徴とする塩基配列増幅方法に関するものである。
【００１８】また本発明は、生成するポリヌクレオチド
複合物において、１本鎖被検体ポリヌクレオチドが、リ
ガーゼによる結合反応により形成したプローブＢの環状
構造を介してプローブＢと連繋されてなることを特徴と
する塩基配列増幅方法に関するものである。
複合物において、１本鎖被検体ポリヌクレオチドが、リ
ガーゼによる結合反応により形成したプローブＢの環状
構造を介してプローブＢと連繋されてなることを特徴と
する塩基配列増幅方法に関するものである。
【００１９】さらに本発明は、生成する増幅生産物にお
いて、１本鎖被検体ポリヌクレオチドが、リガーゼによ
る結合反応により形成したプローブＡの環状構造と、リ
ガーゼによる結合反応により形成した環状構造を有する
プローブＢの該環状構造を介してプローブＡと連繋され
てなることを特徴とする塩基配列増幅方法に関するもの
である。
いて、１本鎖被検体ポリヌクレオチドが、リガーゼによ
る結合反応により形成したプローブＡの環状構造と、リ
ガーゼによる結合反応により形成した環状構造を有する
プローブＢの該環状構造を介してプローブＡと連繋され
てなることを特徴とする塩基配列増幅方法に関するもの
である。
【００２０】さらに、本発明は、上記の塩基増幅方法に
基づき生成される増幅生産物を検出することを特徴とす
る塩基配列検出方法に係るものである。
基づき生成される増幅生産物を検出することを特徴とす
る塩基配列検出方法に係るものである。
【００２１】また、本発明は、ラベル化したプローブＡ
またはラベル化したプローブＢを用いることを特徴とす
る塩基配列検出方法に関するものである。
またはラベル化したプローブＢを用いることを特徴とす
る塩基配列検出方法に関するものである。
【００２２】また、本発明は、ラベル化が、放射線同位
元素、蛍光色素、ジゴキニゲニン、またはビオチンによ
ることを特徴とする塩基配列検出方法に係るものであ
る。
元素、蛍光色素、ジゴキニゲニン、またはビオチンによ
ることを特徴とする塩基配列検出方法に係るものであ
る。
【００２３】
【発明の実施の形態】 （被検体としてのポリヌクレオチド）本発明においては
被検体としてのポリヌクレオチドについては特に制限は
なく、通常のハイブリダイゼーション反応、およびＬＣ
Ｒ反応が使用可能なポリヌクレオチド、またはオリゴヌ
クレオチド等が好適に検出可能である。
被検体としてのポリヌクレオチドについては特に制限は
なく、通常のハイブリダイゼーション反応、およびＬＣ
Ｒ反応が使用可能なポリヌクレオチド、またはオリゴヌ
クレオチド等が好適に検出可能である。
【００２４】さらに、被検体ポリヌクレオチドの存在状
態については特に制限はなく、溶液中でもよく、また
は、ブロッティングにより膜等に固定されていてもよ
い。それぞれの状態において、通常のＬＣＲ反応条件が
適用可能である。
態については特に制限はなく、溶液中でもよく、また
は、ブロッティングにより膜等に固定されていてもよ
い。それぞれの状態において、通常のＬＣＲ反応条件が
適用可能である。
【００２５】被検体中の検出されるべき塩基配列の種
類、長さについては特に制限はないが、その塩基配列は
知られていることが必要である。このた検出されるべき
塩基配列は、一般的な塩基配列の決定法により決定可能
である（例えば、ジデオキシ法（Sanger F.et.al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)））。
類、長さについては特に制限はないが、その塩基配列は
知られていることが必要である。このた検出されるべき
塩基配列は、一般的な塩基配列の決定法により決定可能
である（例えば、ジデオキシ法（Sanger F.et.al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)））。
【００２６】（プローブＡおよびＢ、および連結部）本
発明において使用する２種類のＬＣＲ用プローブＡおよ
びＢは、それぞれハイブリッドを形成させるための塩基
配列を両末端に含み、さらに適当な長さの連結部で連結
された構造を有するものである。
発明において使用する２種類のＬＣＲ用プローブＡおよ
びＢは、それぞれハイブリッドを形成させるための塩基
配列を両末端に含み、さらに適当な長さの連結部で連結
された構造を有するものである。
【００２７】前記必要なプローブＡおよびＢの塩基配
列、および連結部の構造は、前記被検体中の検出される
べき塩基配列に依存する。すなわち、検出されるべき塩
基配列が連続する塩基配列Ａ１、およびＡ２からなるＡ
１Ａ２とすると、塩基配列Ａ１、Ａ２それぞれの核酸塩
基の数には特に制限はない。一般にＬＣＲ法で使用され
る条件に適合すればよい。好ましくは、塩基配列Ａ１、
Ａ２の核酸塩基数がほぼ同じ数となることが望ましい。
この場合ハイブリッド形成後のリガーゼによる反応によ
りリン酸エステル結合される部分がほぼ塩基配列Ａ１Ａ
２の中央部分に位置することとなる。
列、および連結部の構造は、前記被検体中の検出される
べき塩基配列に依存する。すなわち、検出されるべき塩
基配列が連続する塩基配列Ａ１、およびＡ２からなるＡ
１Ａ２とすると、塩基配列Ａ１、Ａ２それぞれの核酸塩
基の数には特に制限はない。一般にＬＣＲ法で使用され
る条件に適合すればよい。好ましくは、塩基配列Ａ１、
Ａ２の核酸塩基数がほぼ同じ数となることが望ましい。
この場合ハイブリッド形成後のリガーゼによる反応によ
りリン酸エステル結合される部分がほぼ塩基配列Ａ１Ａ
２の中央部分に位置することとなる。
【００２８】さらに本発明に係るプローブＡは、前記塩
基配列Ａ１からなるポリヌクレオチドと、前記塩基配列
Ａ２からなるポリヌクレオチドとを前記連結部を介して
連結されてなる。それぞれの塩基配列部分Ａ１、Ａ２の
調製は特に制限はなく、公知のオリゴまたはポリヌクレ
オリド合成方法を使用可能である。または通常の市販の
ＤＮＡ合成機等により合成可能である（平尾一郎「新基
礎生化学実験法７、遺伝子工学」、丸善、１９８８）。
基配列Ａ１からなるポリヌクレオチドと、前記塩基配列
Ａ２からなるポリヌクレオチドとを前記連結部を介して
連結されてなる。それぞれの塩基配列部分Ａ１、Ａ２の
調製は特に制限はなく、公知のオリゴまたはポリヌクレ
オリド合成方法を使用可能である。または通常の市販の
ＤＮＡ合成機等により合成可能である（平尾一郎「新基
礎生化学実験法７、遺伝子工学」、丸善、１９８８）。
【００２９】同様に本発明に係るプローブＢは、前記塩
基配列Ａ１に相補的な塩基配列Ｂ１からなるポリヌクレ
オチドと、前記塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列Ｂ２か
らなるポリヌクレオチドとをさらに連結部を介して連結
してなる。それぞれの塩基配列部分Ｂ１、Ｂ２はプロー
ブＡと同様の方法で合成可能である。
基配列Ａ１に相補的な塩基配列Ｂ１からなるポリヌクレ
オチドと、前記塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列Ｂ２か
らなるポリヌクレオチドとをさらに連結部を介して連結
してなる。それぞれの塩基配列部分Ｂ１、Ｂ２はプロー
ブＡと同様の方法で合成可能である。
【００３０】さらに本発明においては、塩基配列Ａ１
と、塩基配列Ａ２を連結部により連結し１本鎖のプロー
ブＡとする。同様に塩基配列Ｂ１と、塩基配列Ｂ２を連
結部により連結し１本鎖のプローブＢとするが、これら
プローブＡおよびＢに用いる連結部の位置、または連結
基の種類、長さについては特に制限はない。プローブＡ
またはＢのハイブリッド形成塩基配列と被検体ポリヌク
レオチドとのハイブリッド形成を阻害せず、その連結が
通常のＬＣＲ条件下で安定であればよい。
と、塩基配列Ａ２を連結部により連結し１本鎖のプロー
ブＡとする。同様に塩基配列Ｂ１と、塩基配列Ｂ２を連
結部により連結し１本鎖のプローブＢとするが、これら
プローブＡおよびＢに用いる連結部の位置、または連結
基の種類、長さについては特に制限はない。プローブＡ
またはＢのハイブリッド形成塩基配列と被検体ポリヌク
レオチドとのハイブリッド形成を阻害せず、その連結が
通常のＬＣＲ条件下で安定であればよい。
【００３１】従って、本発明においては連結される位置
は特に制限はなく、連結基の種類により、３’または
５’末端での連結が好ましい場合、または該末端から数
個隔てた核酸での連結が好ましい場合等が可能である。
さらに連結部の位置は、リガーゼによる反応を阻害しな
いように該活性中心から十分離れていることも必要と考
えられる。
は特に制限はなく、連結基の種類により、３’または
５’末端での連結が好ましい場合、または該末端から数
個隔てた核酸での連結が好ましい場合等が可能である。
さらに連結部の位置は、リガーゼによる反応を阻害しな
いように該活性中心から十分離れていることも必要と考
えられる。
【００３２】上記説明した塩基配列を有するプローブＢ
は、被検出体ポリヌクレオチドとハイブリッド条件にお
いては、相補的でありハイブリッドを形成する。さら
に、相補的２重鎖を形成する際に２重らせん構造をとる
と考えられ、従って、リガーゼによる該塩基配列Ｂ１、
Ｂ２の結合に基づいてプローブＢが環状化することによ
り、被検出ポリヌクレオチド１本鎖が、該環状プローブ
の環に貫通する構造を取り得る。
は、被検出体ポリヌクレオチドとハイブリッド条件にお
いては、相補的でありハイブリッドを形成する。さら
に、相補的２重鎖を形成する際に２重らせん構造をとる
と考えられ、従って、リガーゼによる該塩基配列Ｂ１、
Ｂ２の結合に基づいてプローブＢが環状化することによ
り、被検出ポリヌクレオチド１本鎖が、該環状プローブ
の環に貫通する構造を取り得る。
【００３３】この際、連結部の長さがあまりに短い場合
は、上記のハイブリッド形成が不十分となり、さらに上
記の２重らせん構造形成が不十分となり、被検出ポリヌ
クレオチド１本鎖が、該環状プローブの環に貫通する構
造を取り固定され難くなる。従って、検出されるべき塩
基配列Ａ１Ａ２の少なくとも１．２倍から３倍の核酸塩
基に相当する長さが必要と推定される。この連結部の適
当な長さについては、連結基の種類、検出されるべき塩
基配列の長さ等により適時選択可能である。
は、上記のハイブリッド形成が不十分となり、さらに上
記の２重らせん構造形成が不十分となり、被検出ポリヌ
クレオチド１本鎖が、該環状プローブの環に貫通する構
造を取り固定され難くなる。従って、検出されるべき塩
基配列Ａ１Ａ２の少なくとも１．２倍から３倍の核酸塩
基に相当する長さが必要と推定される。この連結部の適
当な長さについては、連結基の種類、検出されるべき塩
基配列の長さ等により適時選択可能である。
【００３４】本発明において、連結部、または連結基に
ついて特に制限はなく、種々の種類、長さ、構造の連結
基が使用可能である。例えばオリゴヌクレオオチドを使
用する場合は、被検出体ポリヌクレオチドとのハイブリ
ッド形成を阻害しないことも望ましく、この場合は、該
プローブの合成と同時に、該連結部も合成することも可
能となる。例えば、本発明に係る実施例では、上記連結
部としてポリＴを使用しているが、１つの好ましい使用
態様である。
ついて特に制限はなく、種々の種類、長さ、構造の連結
基が使用可能である。例えばオリゴヌクレオオチドを使
用する場合は、被検出体ポリヌクレオチドとのハイブリ
ッド形成を阻害しないことも望ましく、この場合は、該
プローブの合成と同時に、該連結部も合成することも可
能となる。例えば、本発明に係る実施例では、上記連結
部としてポリＴを使用しているが、１つの好ましい使用
態様である。
【００３５】一般的にはオリゴヌクレオチドによる連結
部は、バックグラウンドを下げる目的で、被検体中の塩
基配列と相補性がないことが好ましい。さらにリガーゼ
との反応を阻害せず、単一塩基の違いを識別可能とする
目的で、検出対象塩基配列と相補性がないことが好まし
い。さらにハンマーヘッドなど特殊な構造を形成し、連
結部の長さが足りなくなることを避けるため、ハンマー
ヘッドなど特殊な構造を形成しにくい配列が望ましい。
部は、バックグラウンドを下げる目的で、被検体中の塩
基配列と相補性がないことが好ましい。さらにリガーゼ
との反応を阻害せず、単一塩基の違いを識別可能とする
目的で、検出対象塩基配列と相補性がないことが好まし
い。さらにハンマーヘッドなど特殊な構造を形成し、連
結部の長さが足りなくなることを避けるため、ハンマー
ヘッドなど特殊な構造を形成しにくい配列が望ましい。
【００３６】さらに、連結基が例えばヘキサエチレング
リコール等のポリエーテルアルコールもまた好適に使用
可能である(A.Jaechke, et al. Tetrahedron Lett.34,3
01,1993)。該連結基と前記プローブ塩基配列との結合は
特に制限はされないが例えばＤＮＡ合成機で合成する
際、ヘキサエチレングリコール部分を同時に調製可能で
ある（例えばClontech社製、スペーサーホスホアミダイ
ト（Spacer Phosphoramidite) ，Zhang,Y et al,Nuclei
c Acids Res.,19,3929,1991)。ヘキサエチレングリコー
ル部分を連結基とすることは、少ない合成ステップで、
長い鎖を調製可能であり、従って合成収率が良いと考え
られる。
リコール等のポリエーテルアルコールもまた好適に使用
可能である(A.Jaechke, et al. Tetrahedron Lett.34,3
01,1993)。該連結基と前記プローブ塩基配列との結合は
特に制限はされないが例えばＤＮＡ合成機で合成する
際、ヘキサエチレングリコール部分を同時に調製可能で
ある（例えばClontech社製、スペーサーホスホアミダイ
ト（Spacer Phosphoramidite) ，Zhang,Y et al,Nuclei
c Acids Res.,19,3929,1991)。ヘキサエチレングリコー
ル部分を連結基とすることは、少ない合成ステップで、
長い鎖を調製可能であり、従って合成収率が良いと考え
られる。
【００３７】（ＬＣＲ反応）本発明においては使用可能
なＬＣＲ反応条件は特に制限はなく、通常の方法に準じ
て可能である（EP-A-320308 、Barany F.Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,88,189(1991)）。例えば、リガーゼとして
は、耐熱性があり、相補鎖上に並んでハイブリッド形成
した２本のＤＮＡのみを結合するものが好適に使用可能
であり、例えば、Stratagene社のPfu Ligase等である。
また反応溶液組成は、上記のリガーゼの使用条件に準じ
て実施可能である。
なＬＣＲ反応条件は特に制限はなく、通常の方法に準じ
て可能である（EP-A-320308 、Barany F.Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,88,189(1991)）。例えば、リガーゼとして
は、耐熱性があり、相補鎖上に並んでハイブリッド形成
した２本のＤＮＡのみを結合するものが好適に使用可能
であり、例えば、Stratagene社のPfu Ligase等である。
また反応溶液組成は、上記のリガーゼの使用条件に準じ
て実施可能である。
【００３８】また、市販のＬＣＲ反応キット（例えばＳ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ＬＣＲ Ｋｉｔ）を使用する
ことも可能である。サーマルサイクルの設定についても
特に制限はなく通常の条件が好適に使用可能である。サ
イクル回数についても特に制限はなく、被検出物の初期
濃度、増幅生産物の検出法、さらに非特異的増幅の発生
等に依存して設定可能である。
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製、ＬＣＲ Ｋｉｔ）を使用する
ことも可能である。サーマルサイクルの設定についても
特に制限はなく通常の条件が好適に使用可能である。サ
イクル回数についても特に制限はなく、被検出物の初期
濃度、増幅生産物の検出法、さらに非特異的増幅の発生
等に依存して設定可能である。
【００３９】本発明においては、さらに前記の環状に固
定されたプローブＢへプローブＡをハイブリッド形成さ
せ、または被検体へプローブＢをハイブリッド形成さ
せ、リガーゼによりプローブＡ、またはＢを環状化す
る。このためにまず、前記のプローブＢをリガーゼ反応
により環状化した後、熱変性により生成２重鎖を解く。
熱変性の条件については特に制限はないが、通常のＰＣ
ＲまたはＬＣＲで使用される条件に準じて可能である。
例えば、９２℃で１分が好適に使用可能な条件である。
定されたプローブＢへプローブＡをハイブリッド形成さ
せ、または被検体へプローブＢをハイブリッド形成さ
せ、リガーゼによりプローブＡ、またはＢを環状化す
る。このためにまず、前記のプローブＢをリガーゼ反応
により環状化した後、熱変性により生成２重鎖を解く。
熱変性の条件については特に制限はないが、通常のＰＣ
ＲまたはＬＣＲで使用される条件に準じて可能である。
例えば、９２℃で１分が好適に使用可能な条件である。
【００４０】ここで例えばさらに環状化したプローブＢ
にハイブリッド形成させるプローブＡは、塩基配列Ａ１
からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ａ２からなるポ
リヌクレオチドとを連結部を介して連結してなるプロー
ブである。プローブＡは、上記環状化したプローブＢと
ハイブリッドを形成する。この場合プローブＡの塩基配
列Ａ１Ａ２はプローブＢの塩基配列Ｂ１Ｂ２と相補的で
あり、ハイブリッドを形成可能である。さらに、ハイブ
リッド形成の際、２重らせん構造をとり得る。
にハイブリッド形成させるプローブＡは、塩基配列Ａ１
からなるポリヌクレオチドと、塩基配列Ａ２からなるポ
リヌクレオチドとを連結部を介して連結してなるプロー
ブである。プローブＡは、上記環状化したプローブＢと
ハイブリッドを形成する。この場合プローブＡの塩基配
列Ａ１Ａ２はプローブＢの塩基配列Ｂ１Ｂ２と相補的で
あり、ハイブリッドを形成可能である。さらに、ハイブ
リッド形成の際、２重らせん構造をとり得る。
【００４１】ＬＣＲの条件に従って、リガーゼによりプ
ローブＡを環状化することにより、環状化したプローブ
ＢとプローブＡは相互に連繋したチェイン構造を有する
複合体を形成し、従って、被検出体ポリヌクレオチドに
固定される。この際使用され得る条件は上記で説明した
条件と同様である。
ローブＡを環状化することにより、環状化したプローブ
ＢとプローブＡは相互に連繋したチェイン構造を有する
複合体を形成し、従って、被検出体ポリヌクレオチドに
固定される。この際使用され得る条件は上記で説明した
条件と同様である。
【００４２】本発明においては、上記説明したステップ
を望ましい回数繰返すことが可能である。通常のＬＣＲ
条件を用いて、プローブＡおよびプローブＢの混合物を
増幅反応させることにより、上で説明したように、被検
出ポリヌクレオチド１本鎖に固定された、多くの環状化
したプローブＡまたはＢが相互に連繋された高分子量の
増幅生産物を形成することになる。
を望ましい回数繰返すことが可能である。通常のＬＣＲ
条件を用いて、プローブＡおよびプローブＢの混合物を
増幅反応させることにより、上で説明したように、被検
出ポリヌクレオチド１本鎖に固定された、多くの環状化
したプローブＡまたはＢが相互に連繋された高分子量の
増幅生産物を形成することになる。
【００４３】ここで調製されたプローブの塩基配列は、
検出されるべき塩基配列と相補的であり、従って、上記
ＬＣＲ反応に高い特異性が達成され得る。従って、バッ
クグラウンドも極めて小さくすることが可能となる。
検出されるべき塩基配列と相補的であり、従って、上記
ＬＣＲ反応に高い特異性が達成され得る。従って、バッ
クグラウンドも極めて小さくすることが可能となる。
【００４４】さらに、増幅（即ち環状化）されたプロー
ブＡまたはＢは、その大部分がチェイン構造による相互
に固定され、しかも被検出ポリヌクレオチドの１本鎖に
固定されている構造を有する。
ブＡまたはＢは、その大部分がチェイン構造による相互
に固定され、しかも被検出ポリヌクレオチドの１本鎖に
固定されている構造を有する。
【００４５】（被検出ポリヌクレオチドの検出）従っ
て、本発明による反応の終了後は、環状化プローブＡ、
またはＢが局在化した被検出ポリヌクレオチドを検出す
ることは極めて容易となる。例えば該プローブＡまたは
Ｂを種々のラベル化法でラベル化可能であり、この場合
ラベルからのシグナルが、検出されるべき被検体に局在
することにより容易に検出可能となる。本発明において
使用可能なプローブのラベル化方法においては特に制限
はなく、公知のラベル化法が使用可能である。例えば、
放射性同位元素、ジゴキシゲニン、または蛍光試薬によ
るラベル化等である。
て、本発明による反応の終了後は、環状化プローブＡ、
またはＢが局在化した被検出ポリヌクレオチドを検出す
ることは極めて容易となる。例えば該プローブＡまたは
Ｂを種々のラベル化法でラベル化可能であり、この場合
ラベルからのシグナルが、検出されるべき被検体に局在
することにより容易に検出可能となる。本発明において
使用可能なプローブのラベル化方法においては特に制限
はなく、公知のラベル化法が使用可能である。例えば、
放射性同位元素、ジゴキシゲニン、または蛍光試薬によ
るラベル化等である。
【００４６】さらに、本発明において、過剰の、または
未反応の試薬、ラベル化プローブ等の除去方法は極めて
容易となる。例えば、固相に固定して本発明を実施した
場合は、必要なだけ洗浄を繰返すことにより、過剰の、
または未反応の試薬、ラベル化プローブ等の除去が可能
となる。チェイン構造で相互に固定された環状化プロー
ブの被検出体との親和性は極めて高く、これらの通常の
洗浄操作ではほとんど除かれないからである。
未反応の試薬、ラベル化プローブ等の除去方法は極めて
容易となる。例えば、固相に固定して本発明を実施した
場合は、必要なだけ洗浄を繰返すことにより、過剰の、
または未反応の試薬、ラベル化プローブ等の除去が可能
となる。チェイン構造で相互に固定された環状化プロー
ブの被検出体との親和性は極めて高く、これらの通常の
洗浄操作ではほとんど除かれないからである。
【００４７】本発明においては、ラベル化の位置も特に
制限はなく、リガーゼの反応を妨げなければ、プローブ
のどの部分でもよい。
制限はなく、リガーゼの反応を妨げなければ、プローブ
のどの部分でもよい。
【００４８】本発明は固相上に固定された標的核酸の検
出に関して特に有効と考えられるが、液相中の標的核酸
に対する新規な標識、修飾、検出法などに利用できる。
この場合、本発明に係る反応の終了後、高分子量の新し
い生成物が生じるため、通常のゲル電気泳動方法等で確
認は可能である。
出に関して特に有効と考えられるが、液相中の標的核酸
に対する新規な標識、修飾、検出法などに利用できる。
この場合、本発明に係る反応の終了後、高分子量の新し
い生成物が生じるため、通常のゲル電気泳動方法等で確
認は可能である。
【００４９】
【実施例】以下実施例に基づき本発明を具体的に説明す
るが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に
限定されるものではない。
るが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に
限定されるものではない。
【００５０】（１）プローブＡ、およびプローブＢ、標
的核酸（ターゲット）の合成 配列番号１、２、および３に記載された塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドを、プローブＡ、プローブＢ、お
よびターゲットとして合成して用いた。
的核酸（ターゲット）の合成 配列番号１、２、および３に記載された塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドを、プローブＡ、プローブＢ、お
よびターゲットとして合成して用いた。
【００５１】プローブＡ，Ｂは、ＤＮＡ合成機Ｍｏｄｅ
ｌ３９４（パーキンエルマー社）で、ターゲットはＤＮ
Ａ合成機Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９（パースペクチブバ
イオシステム社）で合成した。得られたオリゴＤＮＡを
逆相高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分取、精製
した。精製条件は、以下の示す。
ｌ３９４（パーキンエルマー社）で、ターゲットはＤＮ
Ａ合成機Ｅｘｐｅｄｉｔｅ８９０９（パースペクチブバ
イオシステム社）で合成した。得られたオリゴＤＮＡを
逆相高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で分取、精製
した。精製条件は、以下の示す。
【００５２】 オリゴＤＮＡ プローブＡ，Ｂ ターゲット ＨＰＬＣシステム 島津製作所ＬＣ−６Ａ Ｗａｔｅｒｓ８００ ＨＰＬＣカラム カプセルパックＣ１８ デルタパックＣ１８ 溶出溶媒 アセトニトリル１５〜４０％／０．０５Ｍ ＴＥＡＡ緩衝液 カラム流速 １．０ｍｌ／分 検出波長 ２５４ｎｍ 分取したオリゴＤＮＡは、単一ピークであることを確認
した。
した。
【００５３】（２）プローブＡ、およびプローブＢの
５’末端のリン酸化 前記得られたプローブＡおよびＢの５’末端を以下の方
法でリン酸化した。すなわち、前記プローブ（５０ｐｍ
ｏｌ）、ＡＴＰ（１．５ｎｍｏｌ）、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（２０Ｕ、宝酒造社製）、ＭｇＣｌ2 （１
０ｍＭ）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール、５ｍＭ）、グ
リセロール（５％）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐ
Ｈ９．５）を含む反応溶液５０μｌ中で、３７℃、３０
分間反応させた後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２
０Ｕ、宝酒造社製）を加えさらに３７℃、３０分間反応
させた。
５’末端のリン酸化 前記得られたプローブＡおよびＢの５’末端を以下の方
法でリン酸化した。すなわち、前記プローブ（５０ｐｍ
ｏｌ）、ＡＴＰ（１．５ｎｍｏｌ）、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（２０Ｕ、宝酒造社製）、ＭｇＣｌ2 （１
０ｍＭ）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール、５ｍＭ）、グ
リセロール（５％）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐ
Ｈ９．５）を含む反応溶液５０μｌ中で、３７℃、３０
分間反応させた後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（２
０Ｕ、宝酒造社製）を加えさらに３７℃、３０分間反応
させた。
【００５４】（３）ＬＣＲ反応 ＬＣＲは、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＬＣＲキット（Ｌ
ＣＲＫｉｔ）を使用して、以下の条件で行った。反応溶
液は２０μｌであり、その組成は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）、ＫＣｌ（２０ｍＭ）、Ｍｇ
Ｃｌ2 （１０ｍＭ）、ＮＰ−４０（界面活性剤、STRATA
GENE製、０．１％）、ＡＴＰ（０．１ｍＭ）、ＤＴＴ
（１ｍＭ）、サケ精子ＤＮＡ（５００ｎｇ）、ＰｆｕＤ
ＮＡリガーゼ（４Ｕ）からなる。この反応用液に、以下
の試料番号に従い前記プローブＡまたはＢ（５ｐｍｏ
ｌ）またはターゲット（０．５ｐｍｏｌ）を加えた。
ＣＲＫｉｔ）を使用して、以下の条件で行った。反応溶
液は２０μｌであり、その組成は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（２０ｍＭ，ｐＨ７．５）、ＫＣｌ（２０ｍＭ）、Ｍｇ
Ｃｌ2 （１０ｍＭ）、ＮＰ−４０（界面活性剤、STRATA
GENE製、０．１％）、ＡＴＰ（０．１ｍＭ）、ＤＴＴ
（１ｍＭ）、サケ精子ＤＮＡ（５００ｎｇ）、ＰｆｕＤ
ＮＡリガーゼ（４Ｕ）からなる。この反応用液に、以下
の試料番号に従い前記プローブＡまたはＢ（５ｐｍｏ
ｌ）またはターゲット（０．５ｐｍｏｌ）を加えた。
【００５５】 試料番号１ １ ２ ３ ４ ５ ６ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− プローブＡ あり あり あり あり なし なし プローブＢ あり あり なし なし あり あり ターゲット あり なし あり なし あり なし −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 反応サイクルは、サーマルサイクラー（パーキンエルマ
ー社製、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００）
を使用して、最初９２℃で４分、６０℃で３分で、その
後９２℃で１分、６０℃で１分のサイクルを２５回繰返
した。
ー社製、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００）
を使用して、最初９２℃で４分、６０℃で３分で、その
後９２℃で１分、６０℃で１分のサイクルを２５回繰返
した。
【００５６】（４）前記の反応混合物を、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；ポリアクリルアミド
均一ゲル、濃度７．５％を使用）で分離し、各生成物を
調べた。
アミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ；ポリアクリルアミド
均一ゲル、濃度７．５％を使用）で分離し、各生成物を
調べた。
【００５７】図１には、前記の条件による反応物の泳動
パターン（試料番号１〜６）とともに、プローブＡ（５
ｐｍｏｌ）のみ、プローブＢ（５ｐｍｏｌ）のみ、さら
にターゲット（１ｐｍｏｌ）のみをそれぞれ泳動したパ
ターン７、８、９が示されている。
パターン（試料番号１〜６）とともに、プローブＡ（５
ｐｍｏｌ）のみ、プローブＢ（５ｐｍｏｌ）のみ、さら
にターゲット（１ｐｍｏｌ）のみをそれぞれ泳動したパ
ターン７、８、９が示されている。
【００５８】ここでバンドＰは試料１〜８に含まれてお
り、プローブＡまたはＢであり、試料番号９のバンドＴ
はターゲットによる。
り、プローブＡまたはＢであり、試料番号９のバンドＴ
はターゲットによる。
【００５９】明らかに試料番号１のみが多くの高分子量
のバンドの生成を示しており、このためには、前記プロ
ーブＡと、Ｂと、さらにターゲットとが共に存在する必
要があることを示している。
のバンドの生成を示しており、このためには、前記プロ
ーブＡと、Ｂと、さらにターゲットとが共に存在する必
要があることを示している。
【００６０】また、分子量の分布から明らかなように、
本反応条件下では少なくとも６個のプローブからなる増
幅生成物の存在が確認できる。
本反応条件下では少なくとも６個のプローブからなる増
幅生成物の存在が確認できる。
【００６１】
【発明の効果】本発明の遺伝子増幅検出法は、ＬＣＲと
同程度の、高い感度、高い特異性、単一塩基の変異検出
能力を持ちながら、増幅産物が標的核酸に強く固定され
るという特長をもつ。
同程度の、高い感度、高い特異性、単一塩基の変異検出
能力を持ちながら、増幅産物が標的核酸に強く固定され
るという特長をもつ。
【００６２】従って、固相上に固定された標的核酸の検
出において、従来にはない優れた検出を可能とする。ま
た液相中の標的核酸に対する新規な標識、修飾、検出法
などとして利用可能である。
出において、従来にはない優れた検出を可能とする。ま
た液相中の標的核酸に対する新規な標識、修飾、検出法
などとして利用可能である。
【００６３】
配列番号：１ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGCCTGCAGG TCGACTCTAG TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 60 TTTTTTTTTT CGGCCAGTGC CAAGCTTGCA 90 配列番号：２ 配列の長さ：９０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TGCAAGCTTG GCACTGGCCG TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 60 TTTTTTTTTT CTAGAGTCGA CCTGCAGGCA 90 配列番号：３ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 TTTTTCTAGA GTCGACCTGC AGGCATGCAA GCTTGGCACT GGCCGTTTTT 50
【図１】実施例における生成物の電気泳動パターンを示
す図である。Ｔはターゲット、ＰはプローブＡまたは
Ｂ、２ＰはプローブＡとＢが１つずつ計２個ハイブリッ
ド形成したもの、３ＰはプローブＡとＢが計３個ハイブ
リッド形成したもの、１Ｌから６ＬはプローブＡとＢが
リガーゼにより環状化し、鎖状に連繋したものでプロー
ブの数はそれぞれ１〜６個のものを表す。
す図である。Ｔはターゲット、ＰはプローブＡまたは
Ｂ、２ＰはプローブＡとＢが１つずつ計２個ハイブリッ
ド形成したもの、３ＰはプローブＡとＢが計３個ハイブ
リッド形成したもの、１Ｌから６ＬはプローブＡとＢが
リガーゼにより環状化し、鎖状に連繋したものでプロー
ブの数はそれぞれ１〜６個のものを表す。
【図２】本発明の原理の概略を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 G01N 33/53 - 33/566 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 被検体たる１本鎖ポリヌクレオチド中
の、連続する塩基配列Ａ１およびＡ２からなる塩基配列
Ａ１Ａ２を増幅する方法において、 (1) 前記塩基配列Ａ１に相補的な塩基配列Ｂ１からなる
ポリヌクレオチドと、 前記塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列Ｂ２からなるポリ
ヌクレオチドとを連結部を介して連結してなるプローブ
Ｂと、前記ポリオリゴヌクレオチド中の塩基配列Ａ１Ａ
２とハイブリッド形成するステップと、 (2) 前記プローブＢの前記塩基配列Ｂ１の５’末端と、
前記塩基配列Ｂ２の３’末端とを、リガーゼにより結合
するステップと、 (3) 前記ハイブリッド形成した２本鎖を熱変性するステ
ップと、 (4) 前記熱変性したポリヌクレオチド複合物と、 前記塩基配列Ａ１からなるポリヌクレオチドと、 前記塩基配列Ａ２からなるポリヌクレオチドとを連結部
を介して連結してなるプローブＡとハイブリッド形成す
るステップと、 (5) 前記プローブＡの前記塩基配列Ａ１の３’末端と、
前記塩基配列Ａ２の５’末端とをリガーゼにより結合す
るステップとを、少なくとも含むことを特徴とする塩基
配列増幅方法。 - 【請求項２】 被検体たる１本鎖ポリヌクレオチド中
の、連続する塩基配列Ａ１およびＡ２からなる塩基配列
Ａ１Ａ２を増幅する方法において、 (1) 前記塩基配列Ａ１に相補的な塩基配列Ｂ１からなる
ポリヌクレオチドと、 前記塩基配列Ａ２に相補的な塩基配列Ｂ２からなるポリ
ヌクレオチドとを連結部を介して連結してなるプローブ
Ｂと、前記ポリオリゴヌクレオチド中の塩基配列Ａ１Ａ
２とハイブリッド形成するステップと、 (2) 前記プローブＢの前記塩基配列Ｂ１の５’末端と、
前記塩基配列Ｂ２の３’末端とを、リガーゼにより結合
するステップと、 (3) 前記ハイブリッド形成した２本鎖を熱変性するステ
ップと、 (4) 前記熱変性したポリヌクレオチド複合物と、 前記塩基配列Ａ１からなるポリヌクレオチドと、 前記塩基配列Ａ２からなるポリヌクレオチドとを連結部
を介して連結してなるプローブＡとハイブリッド形成す
るステップと、 (5) 前記プローブＡの前記塩基配列Ａ１の３’末端と、
前記塩基配列Ａ２の５’末端とをリガーゼにより結合す
るステップと、 (6) 前記ハイブリッド形成した２本鎖を熱変性するステ
ップと、 (7) 前記熱変性したポリヌクレオチド複合物と、 前記プローブＢ、又は前記プローブＡとハイブリッド形
成するステップと、 (8) 前記プローブＢの前記塩基配列Ｂ１の５’末端と、
前記塩基配列Ｂ２の３’末端とを、 又は前記プローブＡの前記塩基配列Ａ１の３’末端と、
前記塩基配列Ａ２の５’末端とを、リガーゼにより結合
するステップと、 (9) 前記ステップ(6)〜(8)を繰返すことを特徴とする塩
基配列増幅方法。 - 【請求項３】 前記連結部の一部が、少なくともポリヌ
クレオチドまたはヘキサエチレングリコールであること
を特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の塩基
配列増幅方法。 - 【請求項４】 前記連結部が、少なくとも塩基配列Ａ１
Ａ２の１．２倍〜３倍の核酸塩基を有するポリヌクレオ
チドであることを特長とする請求項１〜３のいずれかに
記載の塩基配列増幅方法。 - 【請求項５】 前記プローブＡの連結部が、前記塩基配
列Ａ１の５’末端と、前記塩基配列Ａ２の３’末端で前
記連結部を介して連結されていること、または前記プロ
ーブＢの連結部が、前記塩基配列Ｂ１の３’末端と、前
記塩基配列Ｂ２の５’末端で前記連結部を介して連結さ
れていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記
載の塩基配列増幅方法。 - 【請求項６】 前記ポリヌクレオチド複合物において、
前記１本鎖被検体ポリヌクレオチドが、前記リガーゼに
よる結合反応により形成したプローブＢの環状構造を介
して該プローブＢと連繋されてなることを特徴とする請
求項１または２のいずれかに記載の塩基配列増幅方法。 - 【請求項７】 前記増幅生産物において、前記１本鎖被
検体ポリヌクレオチドが、前記リガーゼによる結合反応
により形成したプローブＡの環状構造と、前記リガーゼ
による結合反応により形成した環状構造を有する前記プ
ローブＢの該環状構造を介して該プローブＡと連繋され
てなることを特徴とする請求項１または２に記載の塩基
配列増幅方法。 - 【請求項８】 請求項１〜７のいずれかに記載の前記塩
基増幅方法に基づき生成される増幅生産物を検出するこ
とを特徴とする塩基配列検出方法。 - 【請求項９】 前記塩基配列検出方法において、ラベル
化した前記プローブＡまたはラベル化したプローブＢを
用いることを特徴とする請求項８に記載の塩基配列検出
方法。 - 【請求項１０】 前記ラベル化が、放射線同位元素、蛍
光色素、ジゴキシゲニン、またはビオチンによることを
特徴とする請求項９に記載の塩基配列検出方法。
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- 1996-07-12 EP EP96111302A patent/EP0756009A3/en not_active Withdrawn
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|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＮＤ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ，ＶＯＬ．１７３，ＮＯ．１２，Ｐ．９５５−９５８（１９９５） |
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