JP2011521635A - 新規なハイブリダイゼーションバッファーを用いた染色体異常の検出のための組成物及び方法 - Google Patents

新規なハイブリダイゼーションバッファーを用いた染色体異常の検出のための組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2011521635A
JP2011521635A JP2011511111A JP2011511111A JP2011521635A JP 2011521635 A JP2011521635 A JP 2011521635A JP 2011511111 A JP2011511111 A JP 2011511111A JP 2011511111 A JP2011511111 A JP 2011511111A JP 2011521635 A JP2011521635 A JP 2011521635A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hybridization
probe
hybridization composition
cancer
polar aprotic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2011511111A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2011521635A5 (ja
JP5592357B2 (ja
Inventor
スティーン， ハウゲ マチーセン，
ケネス， エイチ． ペーターセン，
ティム， スヴェンストルプ ポールセン，
Original Assignee
ダコ・デンマーク・エー／エス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=58714504&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2011521635(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ダコ・デンマーク・エー／エス filed Critical ダコ・デンマーク・エー／エス
Publication of JP2011521635A publication Critical patent/JP2011521635A/ja
Publication of JP2011521635A5 publication Critical patent/JP2011521635A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5592357B2 publication Critical patent/JP5592357B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本発明は、染色体異常に関連する核酸配列の検出のための組成物と方法を提供する。本発明は、例えばハイブリダイゼーションにおけるホルムアミドの使用を排除し、又はそれへの依存を低減しうる。本発明で使用される組成物は、少なくとも一の核酸配列と二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物を含む。

Description

本発明は、一般にインビボ、インビトロ、及びインサイツでの染色体異常の検出のための組成物及び方法に関する。本発明は更に特定のヌクレオチド配列（正常な配列及び染色体異常及び／又は感染症に関連するものを含む）の検出のための分子プローブを含有する組成物及びハイブリダイゼーションに使用するため、特にインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に使用するための二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量で少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物に関する。
一実施態様では、本発明は、例えば細胞診、組織診断、及び分子生物学の分野において使用するための分子プローブ、及びそのような分子プローブを含むキットに関する。他の実施態様では、本発明は、そのような分子プローブを使用する染色体異常又は感染症の検出方法、そのような分子プローブを使用する遺伝子欠陥又は疾患状態の診断方法、及びそのような分子プローブを使用する予後の提供方法に関する。
先天性欠陥及び後天性疾患の双方の多くの病理状態には、染色体異常、例えば増幅、異数性、潜在的切断点、挿入、逆位、欠失、複製、再編成、及び転位置が伴う。更に、病原性感染症は一般に感染した生物中に感染細菌、ウイルス、又は真菌の核酸配列の存在を生じる。
ゲノムＤＮＡ、染色体、染色体断片、又は遺伝子のインビボ、インビトロ、又はインサイツ分析を通して先天性欠陥, 後天性疾患、又は感染性病原に関連するヌクレオチド配列の存在又は不存在を樹立することは、臨床医が適切な診断に到達するのを助けうる。例えば、脆弱Ｘ精神遅滞−１（ＦＭＲ１）遺伝子中のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ（未翻訳領域）の伸長ＣＧＧトリヌクレオチドリピートの伸長により臨床医が脆弱Ｘ症候群を診断することが可能になる。この伸長は遺伝子の転写発現抑制を生じる。しかしながら、他のメカニズム、例えばＦＭＲ１の欠失及び変異がまた脆弱Ｘ症候群を生じさせるかも知れない。疾患に至る遺伝子産物ＦＭＲＰの不存在又は減少量の結果は、伸長により引き起こされた発現抑制及び遺伝子欠失の双方について同じである。数的異常によって生じさせられる症状の例は、トリソミー２１（ダウン症の個体は２ではなく３コピーの染色体２１を有している）としても知られているダウン症候群である。ターナー症候群は、個体がただ一つの性染色体Ｘをもって生まれたモノソミーの例である。他の例は、染色体４の短腕の部分的欠失によって引き起こされるウォルフ・ヒルシュホーン症候群、及び末端１１ｑ欠失疾患とも呼ばれるヤコブセン症候群を含む。シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型のようなある症候群は、染色体１７上の例えば末梢ミエリンタンパク質２２（ＰＭＰ２２）をコードする遺伝子の複製によって引き起こされうる。ロバートソン転座のような他の症候群では、染色体全体がセントロメアの他のものに結合している。ロバートソン転座は染色体１３、１４、１５、２１及び２２でのみ生じ得、ロバートソン転座のヘテロ接合性キャリアーの子孫は例えば不均衡なトリソミー２１を受け継ぎ、ダウン症候群を生じさせるかもしれない。
ゲノムＤＮＡ、染色体、染色体断片、又は遺伝子のインビボ、インビトロ、又はインサイツ分析を通して先天性欠陥、後天性疾患、又は感染性病原に関連するヌクレオチド配列の存在又は不存在を樹立することは、疾患状態が診断されている治療の適切な過程を選択する場合に臨床医にはまた貴重でありうる。例えば、ＨＥＲ２遺伝子が増幅された乳癌患者は、ＨＥＲ２タンパク質を認識するモノクローナル抗体のハーセプチンＴＭ（トラスツズマブ）での治療から恩恵を受けうる。他の例では、臨床医は、ＥＧＦＲ遺伝子が増幅している結腸直腸癌患者にアービタックス（登録商標）（セツキシマブ）又はベクチビックスＴＭ（パニツムマブ）（上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）を特異的に認識する治療用モノクローナル抗体）を処方する選択をしうる。
ゲノムＤＮＡ、染色体、染色体断片、又は遺伝子のインビボ、インビトロ、又はインサイツ分析を通して先天性欠陥、後天性疾患、又は感染性病原に関連するヌクレオチド配列の存在又は不存在を樹立することは、臨床医が予後を提供するのをまた助けうる。よって、ＴＯＰ２Ａ遺伝子が増幅され、又は欠失されている乳癌患者は、それがない患者よりも悪い予後を有している。
ヌクレオチド配列の存在又は不存在の検出は、反対のストランドの塩基間（Ａ＋Ｔ又はＧ＋Ｃ）における水素結合によるヌクレオチド二重螺旋構造の安定化、又はハイブリダイゼーションによる配列の認識を一般に必要とする。ハイブリダイゼーションの基本的な例では核酸断片又は配列が相補的な核酸断片又は配列に結合する。ハイブリダイゼーションによる検出は、一般に、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のような核酸標的に結合し、又は「ハイブリダイズする」ように設計された核酸プローブの使用を含む。
分子生物学の分野では染色体異常を検出するためによく知られた技術が存在している。かしながら、染色体異常の広範なまた常套的な検出を可能にする速やかで簡便で、安価でユーザーフレンドリーな試験法はこれまで利用できなかった。
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの効率と精度は、３つの因子の少なくとも一つに主に依存する：ａ）変性（つまり、例えば二つの核酸ストランドの分離）条件、ｂ）再生（つまり、例えば二つの核酸ストランドの再アニーリング）条件、及びｃ）ハイブリダイゼーション後洗浄条件。
伝統的なハイブリダイゼーション実験、例えばＩＳＨアッセイは、二本鎖核酸鎖を変性させるためにホルムアミド含有バッファーを使用する。ホルムアミドは、ゆるくかつ均一に結合した水和物分子を置換することによって、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのアナログの螺旋状態に不安定化作用を有する溶媒である。更に、ホルムアミドは、塩基のワトソン・クリック結合部位の「ホルムアミド化」により塩基のワトソン・クリック結合部位の「ホルムアミド化」によりＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのアナログのコイル状態を安定化させる。
変性工程には、核酸鎖の二つの相補的ストランドの再アニーリングが続き、これは、これまで、ハイブリダイゼーションを使用するアッセイの最も時間を費やす側面である。例えば、伝統的な蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プロトコルでは、再アニーリングには１４−２４時間かかり、７２時間まででさえかかりうる。伝統的なハイブリダイゼーション時間の例は図１及び２に示す。
核酸塩基のワトソン・クリック結合部位と干渉し、それによって相補的核酸塩基間の水素結合を乱すホルムアミドのようなカオトロピック剤（他のカオトロピック剤はグアニジウム水素及びウレアを含む）の使用は、変性工程に必要なように、相補鎖の融解温度（Ｔｍ）を低下させる唯一の方法であると今まで信じられていた。しかしながら、カオトロピック剤の使用はＴｍを低下させるが、これらの薬剤は、カオトロピック剤を含まない水溶液でのハイブリダイゼーションと比較して、ハイブリダイゼーション時間を有意に延長するようである。
ホルムアミドは長い処理時間を越える欠点を有している。ホルムアミドは毒性があり、危険な物質であり、使用及び廃棄に対して厳しい規制を受ける。更に、高濃度のホルムアミドの使用は、細胞、核、及び／又は染色体構造の形態的破壊を招くようである。
ここに記載の水性組成物は、例えば、より速いハイブリダイゼーション時間、より低いハイブリダイゼーション温度、及びより毒性の少ないハイブリダイゼーション組成物のような、先行技術に対する幾つかの潜在的な利点を有する条件下での核酸配列の検出を可能にする。
本発明は、染色体異常に関連する核酸配列の検出のための組成物及び方法を提供する。本発明の組成物及び方法は、任意のハイブリダイゼーション技術、及び例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、及びその合成及び天然のアナログのような塩基対を使用して、ハイブリダイズ又は結合する任意の分子系に適用可能である。本発明の組成物及び方法は、染色体異常に関連する核酸配列の高度に感受性で技術的に容易で、フレキシブルで、信頼性があり、及び／又は迅速な検出を可能にする。一実施態様では、本発明は、ハイブリダイゼーション反応の温度を、先行技術の方法を使用して利用できるよりも更に大なる度合いまで変化させることにより、ハイブリダイゼーション時間を調節できる能力を提供する。本発明のハイブリダイゼーション組成物及び方法は、生物学的試料の形態を保存し、非毒性のハイブリダイゼーション組成物及び手順を提供し、低蒸発ハイブリダイゼーション技術を提供し、非特異的結合に対する必要性を低減及び／又は除去し、及び／又は例えば生物学的試料中の反復配列をブロックし、除去し、又はその結合を不可能等にする必要なく異種性プローブの使用を許容する。
一実施態様では、本発明は、染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する第一分子プローブを含有する組成物、及び二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物を提供する。別の実施態様では、本発明は、かかる組成物を含みキットを提供する。更に他の実施態様では、本発明は、染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する第一分子プローブを含有する第一組成物と、第二組成物を含み、該第二組成物が、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物であるキットを提供する。
ここに提供される組成物及びキットは、ＰＣＲ、インサイツＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロット、フローサイトメトリー、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、化学発光、免疫組織化学、仮想核型、遺伝子アッセイ、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、アレイ比較的ゲノムハイブリダイゼーション（アレイＣＧＨ））、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子ＩＤ、タイリングアレイ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びインサイツハイブリダイゼーション、例えばＦＩＳＨ、ＳＩＳＨ、ＣＩＳＨを使用する例えばゲノムＤＮＡ、染色体、染色体断片、及び遺伝子のような核酸のインビボ、インビトロ、及び／又はインサイツ分析に有用である。一実施態様では、組成物及びキットは、正常な症状又は疾患（例えば、先天性疾患、癌、又は感染）に関連する異数性、潜在的切断点、挿入、逆位、欠失、複製、遺伝子増幅、再編成、及び転位置のような染色体異常のための核酸のインビボ、インビトロ、及び／又はインサイツ分析に有用である。ここに提供される組成物及びキットはまた例えばｍＲＮＡ及びその相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のようなＲＮＡ発現レベルの変化の検出に有用である。本発明の組成物及びキットは、骨髄スメア、血液スメア、パラフィン包埋組織調製物、酵素的に解離された組織試料、骨髄、羊膜細胞、サイトスピン調製物、インプリント等のようなインビトロ、インビボ、又はインサイツ試料（例えば哺乳動物試料、例えばヒト試料を含む）に使用されうる。
他の使用は、ＦＲＥＴ及び他のクエンチング技術を使用する；例えばインサイツＤａｋｏ ＧｅｎＰｏｉｎｔＴＭ増幅検出システム又はＴｙｒａｍｉｄｅシグナル増幅（ＴＳＡ）システム（Ｋ０６２０、Ｄａｋｏ）を使用する、ストレプトアビジンコンジュゲートでのビオチン標識の検出；又は例えば金及び銀のよな金属での直接標識を使用する溶液ベースのハイブリダイゼーションアッセイを含む。
一実施態様では、本発明は、染色体ＤＮＡ中の標的を検出する方法において、
− 染色体ＤＮＡ中の標的にハイブリダイズする少なくとも一の分子プローブを提供し、
− 染色体ＤＮＡを提供し、
− 二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有し、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないハイブリダイゼーション組成物を提供し、
− 分子プローブ、染色体ＤＮＡ及びハイブリダイゼーション組成物を標的に分子プローブをハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ、
− 標的を検出する
ことを含む方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、核酸配列中における染色体異常の存在を決定する方法において、
− 少なくとも一の分子プローブを提供し、
− 核酸配列を提供し、
− 二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有し、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないハイブリダイゼーション組成物を提供し、
− 分子プローブ及び核酸配列及びハイブリダイゼーション組成物を、分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ、
− 少なくとも一の分子プローブを検出し、
− 染色体異常の存在を決定する
ことを含む方法を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は、核酸配列中における染色体異常の存在を決定する方法において、
− 核酸配列を提供し、
− 少なくとも一の分子プローブと二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有するハイブリダイゼーション組成物を提供し、
− ハイブリダイゼーション組成物を上記核酸に、分子プローブと核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用し、
− 少なくとも一の分子プローブを検出し、
− 染色体異常の存在を決定する
ことを含み、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、核酸配列中の染色体異常の存在を決定する方法において、
− 核酸配列を提供し、
− 請求項１から５０の何れか一に記載の組成物を前記核酸配列に、分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用し、
− 染色体異常が核酸中に存在するかどうかを決定する
ことを含む方法を提供する。
更なる実施態様では、本発明は、染色体異常に関連する先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断する方法において、患者からの組織試料を提供し、ここで、組織試料は核酸を含み、染色体異常が核酸配列中に存在するかどうかを決定し、及び染色体異常が組織試料中に存在する場合に先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断することを含む方法を提供する。試料は哺乳動物試料でありうる。一実施態様では、試料はヒト試料である。
本発明のハイブリダイゼーション組成物及び方法は、ホルムアミドの使用を排除し、又はそれへの依存性を低減しうる。例えば、本発明の方法及び組成物は、ホルムアミドを使用しないでハイブリダイゼーションに対するエネルギー障壁を低下させうる。より低いエネルギー障壁は、ハイブリダイゼーションに必要な時間及び／又は温度を減少させうる。例えば、本発明は、室温を含む低い温度でのハイブリダイゼーションを可能にし得、又はより高い温度での速やかなハイブリダイゼーションを可能にしうる。よって、ある態様では、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイにおける主要な時間を要する工程を克服する。
本発明の一態様は、ハイブリダイゼーションにおける使用のための組成物又は溶液である。本発明に使用される組成物は、少なくとも一の核酸配列と二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含む水性組成物を含む。二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるために有効な量は、ハイブリダイゼーションを可能にする量である。例えば、極性非プロトン溶媒がハイブリダイゼーションをなすのに効果的かどうかを試験する一方法は、極性非プロトン溶媒が、例えば実施例１におけるように、ここに記載のハイブリダイゼーション方法及び組成物に使用される場合、検出可能なシグナル及び／又は増幅された核酸産物を生じるかどうかを決定することである。
極性非プロトン溶媒の有効量の非限定的例は、例えば約１％から約９５％（ｖ／ｖ）を含む。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は５％から６０％（ｖ／ｖ）である。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は１０％から６０％（ｖ／ｖ）である。更に他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は３０％から５０％（ｖ／ｖ）である。１％から５％、５％から１０％、１０％、１０％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、又は５０％から６０％（ｖ／ｖ）の濃度もまた適している。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒は０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するであろう。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、又は２０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するであろう。
本発明の別の態様によれば、極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物は減少した毒性を有している。例えば、伝統的なハイブリダイゼーション溶液よりも毒性の少ない組成物は、組成物がホルムアミドを含まない条件、又は組成物が１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満のホルムアミドを含む条件の組成物を含みうる。毒性の少ない組成物は、組成物がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない条件、又は組成物が１０％、５％、２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満のＤＭＳＯを含む条件の組成物を含みうる。
本発明の一態様では、本発明での使用のために適した極性非プロトン溶媒は、そのハンセン溶解度パラメータに基づき選択されうる。例えば、適切な極性非プロトン溶媒は、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の水素結合溶解度パラメータを有しうる。
本発明の一態様によれば、本発明において使用される適切な極性非プロトン溶媒は環状化合物である。環状化合物は環状塩基構造を有する。例にはここに開示された環状化合物を含む。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は以下の式１−４から選択されうる：
Figure 2011521635
ここで、ＸはＯであり、Ｒ１はアルキルジイルである。
本発明の他の態様によれば、本発明において使用される適切な極性非プロトン溶媒は以下の式５から選択されうる：
Figure 2011521635
ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され；
Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され；
Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり；
Ｒはアルキルジイルであり；
ＹはＯ又はＳ又はＣである。
式５に記載の適切な極性非プロトン溶媒の例を以下の式６−９に提供する：
Figure 2011521635
本発明の更に他の実施態様によれば、極性非プロトン溶媒はラクトン、スルホン, ニトリル, サルファイト,又はカーボネート官能性を有する。かかる化合物は、その比較的高い比誘電率、高い双極子モーメント及び水への溶解度によって区別される。
本発明の他の態様によれば、ラクトン官能性を有する極性非プロトン溶媒はγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）であり、スルホン官能性を有する極性非プロトン溶媒はスルホラン（ＳＬ）であり、ニトリル官能性を有する極性非プロトン溶媒はアセトニトリル（ＡＮ）であり、サルファイト官能性を有する極性非プロトン溶媒はグリコールサルファイト／エチレンサルファイト（ＧＳ）であり、カーボネート官能性を有する極性非プロトン溶媒はエチレンカーボネート（ＥＣ）、プロピレンカーボネート（ＰＣ）、又はエチレンチオカーボネート（ＥＴＣ）である。
図１は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織片（組織検体）での一次標識ＦＩＳＨプローブを用いた単一遺伝子座検出の典型的な時間経過を示す。バーは、伝統的な溶液（上）を使用して実施されたハイブリダイゼーションと、本発明の組成物（下）を使用して実施されたハイブリダイゼーションに対する典型的な時間経過を表す。各時間経過中の左側の最初のバーは脱パラフィン工程を表し；二番目のバーは加熱前処理工程を表し；三番目のバーは消化工程を表し；四番目のバーは変性及びハイブリダイゼーション工程を表し；五番目のバーはストリンジェンシー洗浄工程を表し；六番目のバーはマウント工程を表す。 図２は、細胞検体での一次標識ＦＩＳＨプローブを用いた単一遺伝子座検出の典型的な時間経過を示す。バーは、伝統的な溶液（上）を使用して実施されたハイブリダイゼーションと、本発明の組成物（下）を使用して実施されたハイブリダイゼーションに対する典型的な時間経過を表す。各時間経過中の左側の最初のバーは固定工程を表し；二番目のバーは変性及びハイブリダイゼーション工程を表し；三番目のバーはストリンジェンシー洗浄工程を表し；四番目のバーはマウント工程を表す。
Ｉ．定義
本発明の文脈において、次の用語は次の通りに理解されなければならない：
「生物学的試料」は、一又は複数の細胞又は細胞断片の任意のインビボ、インビトロ、又はインサイツ試料として理解されなければならない。これは、例えば単細胞又は多細胞生物、組織片、細胞試料、染色体スプレッド、精製核酸配列、例えば生物学ベースのシステム又は化学合成、マイクロアレイ、又は核酸チップの他の形態によって作製された人工的に作製された核酸配列でありうる。一実施態様では、試料は哺乳動物試料、例えば ヒト、マウス、ネコ、ラット、又はイヌ試料である。
「核酸」、「核酸鎖」、及び「核酸配列」は、天然に生じるヌクレオチドから形成された骨格を有するオリゴマー又はポリマー及び／又は非標準核酸塩基及び／又は非標準骨格を含む核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸（ＬＮＡ））、又は核酸の任意の誘導体化形態を含む、塩基対形成を使用して結合又はハイブリダイズする任意のものを意味する。
ここで使用される場合、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」なる用語は、限定するものではないが、例えば全てが出典明示によりここに援用される米国特許第５５３９０８２号、第５５２７６７５号、第５６２３０４９号、第５７１４３３１号、第５７１８２６２号、第５７３６３３６号、第５７７３５７１号、第５７６６８５５号、第５７８６４６１号、第５８３７４５９号、第５８９１６２５号、第５９７２６１０号、第５９８６０５３号、第６１０７４７０号、第６２０１１０３号、第６２２８９８２号及び第６３５７１６３号、国際公開第９６／０４０００号又はそこで引用されている文献の任意のものにおいてペプチド核酸として言及され又は請求項に記載されたオリゴマー又はポリマーセグメントの任意のものを含むペンダント核酸塩基と共にポリアミド骨格を有する合成ポリマー（天然に生じるもの及び修飾されたもの）を意味する。例えばＰＮＡ上のプリン又はピリミジン塩基のようなペンダント核酸塩基は、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３又はそこに引用された文献の任意のものに教示されているリンカーの一つのようなリンカーを介して骨格に連結されうる。一実施態様では、ＰＮＡはＮ−（２−アミノエチル）−グリシン）骨格を有している。ＰＮＡは、ＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３又はそこに引用された文献の任意のものに教示されているようにして合成され（場合によっては標識され）うる。ＰＮＡは、ＰＮＡ骨格が変わらないので、ＤＮＡ及びＲＮＡと堅固にかつ高い配列特異性をもってハイブリダイズする。よって、短いＰＮＡプローブは長いＤＮＡ又はＲＮＡプローブに匹敵する特異性を示しうる。ＰＮＡプローブはまた相補ＤＮＡ又はＲＮＡへの結合において大なる特異性を示しうる。
ここで使用される場合、「ロックド核酸」又は「ＬＮＡ」なる用語は、少なくとも一又は複数のＬＮＡサブユニットを含むオリゴマー又はポリマーを意味する。ここで使用される場合、「ＬＮＡサブユニット」なる用語は、リボースの２’−酸素を４’−炭素と結合させるメチレン架橋を含むリボヌクレオチドを意味する。一般に、Kurreck, Eur. J. Biochem., 270:1628-44 (2003)を参照のこと。
核酸及び核酸アナログの例はまた二本鎖及び一本鎖デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、そのα−アノマー型、その合成及び天然アナログ等々を含むヌクレオチドモノマーのポリマーを含む。核酸鎖は全体がデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、その合成又は天然アナログ、又はその混合物から構成されうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はここに定義される他の核酸を本発明の方法及び組成物において使用することができる。
「極性非プロトン溶媒」は、雰囲気温度又はその近傍、例えば約２０℃で、少なくとも５％（体積）の水溶性、約２デバイ単位以上の双極子モーメントを有し、略中性のｐＨ、つまりｐＨ５から９の範囲、又は６から８の範囲で有意な水素交換を受けない有機溶媒を意味する。極性非プロトン溶媒は以下に検討される ハンセン溶解度パラメータに従って定義されるものを含む。
「アルキルジイル」は、親のアルカン、アルケン、又はアルキンの二つの異なった炭素原子から一つの水素原子を除去することによって誘導された二つの一価ラジカル中心を有する飽和又は不飽和、分枝、直鎖又は環状炭化水素基を意味する。
「水溶液」は、例え少量の水でさえ、水を含む溶液として理解されなければならない。例えば、１％の水を含む溶液は水溶液として理解されなければならない。
「ハイブリダイゼーション」は、別の定義がなされない限り、ハイブリダイゼーション手順の変性及び再アニーリング工程を双方とも含むものと理解されなければならない。
「ハイブリダイゼーション組成物」は、例えば核酸配列にプローブを結合させるためにハイブリダイゼーション手順を実施するための本発明の水溶液を意味する。ハイブリダイゼーション組成物は、例えば少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、少なくとも一つの核酸配列、及びハイブリダイゼーション溶液を含みうる。ハイブリダイゼーション組成物は、酵素又は例えば生物学的試料中の核酸を増幅させるためのデオクシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）のような他の成分を含まない。
「ハイブリダイゼーション溶液」は、本発明のハイブリダイゼーション組成物において使用される水溶液を意味する。ハイブリダイゼーション溶液は以下に詳細に検討され、例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩、洗浄剤、及びブロッキング剤を含みうる。
「ＰＣＲ組成物」は、核酸配列を増幅させるためにハイブリダイゼーション手順を実施するための本発明の水溶液を意味する。ＰＣＲ組成物は、例えば少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、核酸を増幅させるための少なくとも一種の酵素、核酸オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ｄＮＴＰｓの混合物、及びＰＣＲ溶液溶液を含みうる。
「ＰＣＲ溶液」は本発明のＰＣＲ組成物において使用される水溶液を意味する。ＰＣＲ溶液は例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩及び洗浄剤を含みうる。
例えば染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する分子プローブの文脈において使用される「検出する」なる用語は、分子プローブが、ヌクレオチド配列の少なくとも一部又はかかる配列に近接するヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それによって使用者が配列の存在又は不存在を決定することが可能になることを意味する。
染色体異常のためのマーカーのような、「マーカー」なる用語は、一又は複数の他のマーカーの使用を伴うか伴わないで、染色体異常の存在又は不存在を検出するために使用することができる染色体異常に関連する任意の配列である。
「ハンセン溶解度パラメータ」及び「ＨＳＰ」は次の凝集エネルギー（溶解度）パラメータを意味する：（１）原子間力から誘導された非極性相互作用を測定する分散溶解度パラメータ（δＤ、「Ｄパラメータ」）；（２）永久双極子−永久双極子相互作用を測定する極性溶解度パラメータ（δＰ、「Ｐパラメータ」）；及び（３）電子交換を測定する水素結合溶解度パラメータ（δＨ、「Ｈパラメータ」）。ハンセン溶解度パラメータは更に以下に定義する。
「反復配列」は、哺乳動物ゲノムの成分を急速に再アニールする（およそ２５％）及び／又は中間的に再アニールする（およそ３０％）ことを意味するものと理解されなければならない。急速に再アニールする成分は、通常はタンデムで見出される（例えばサテライトＤＮＡ）小さい（数ヌクレオチド長）高度に反復性の配列を含む一方、中間的に再アニールする成分は散在反復ＤＮＡを含む。散在反復配列はＳＩＮＥｓ（短い散在反復配列）又はＬＩＮＥｓ（長い散在反復配列）の何れかとして分類され、その双方が霊長類においてレトロトランスポゾンとして分類される。ＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓは、限定しないが、Ａｌｕ−リピート、Ｋｐｎ−リピート、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピート及びヘキサヌクレオチドリピートを含む。ＡｌｕリピートはヒトＳＩＮＥｓの大部分を構成し、ヘッドトゥーテール二量体として配された二つの類似配列からなるおよそ２８０から３００ｂｐのコンセンサス配列によって特徴付けられる。ＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓに加えて、リピート配列は染色体の末端の染色体テロメア及び染色体セントロメアにもまた存在し、これは、染色体の中心領域にのみ存在する別のリピート配列を含む。しかしながら、ゲノム全体にわたって無作為に分散しているＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓとは異なり、テロメア及びセントロメアリピート配列は染色体のある領域内に局在化している。
「非毒性」及び「減少した毒性」は、ホルムアミドの毒性標識に関して、"Directive 1999/45/EC of the European Parliament and of the Council of 31 May 1999 concerning the approximation of the laws, regulations及びadministrative provisions of the Member States relating to the classification, packaging, and labelling of dangerous preparations" (ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf) (「Directive」)に従って定義される。Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅに従えば、毒性は次の分類順を使用して定義される：Ｔ＋「非常に毒性」；Ｔ「毒性」、Ｃ「腐食性」、Ｘｎ「有害」、Ｘｉ「刺激性」。リスクフレーズ（「Ｒフレーズ」）は分類された毒性のリスクを記述する。ホルムアミドはＴ（毒性）及びＲ６１（胎児に害を及ぼしうる）としてリストされている。次の化学物質の全てがホルムアミドよりも毒性が少ないものとして分類されている：アセトニトリル（Ｘｎ、Ｒ１１、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３６）；スルホラン（Ｘｎ、Ｒ２２）；γ−ブチロラクトン（Ｘｎ、Ｒ２２、Ｒ３２）；及びエチレンカーボネート（Ｘｉ、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８）。本出願の出願時には、エチレントリチオカーボネート及びグリコールサルファイトは現在は分類されていない。
「分子プローブ」は「核酸」プローブ又は「核酸アナログ」プローブを意味する。ここで使用される場合、「プローブ」なる用語は、核酸鎖として理解されるべきであり、これは、全体が特定のヌクレオチド配列を検出するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、その合成又は天然アナログ、又はその混合物から構成されうる。また、プローブ中の塩基は、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合によって結合されうる。特定の変異を検出する分子プローブは、その変異の標的配列に結合するものである。「結合する」という用語は「ハイブリダイズする」と同義である。二つの分子がハイブリダイズする場合、それらは一又は複数のタイプの化学結合を介して、相補塩基対形成を介して、又は水素結合形成を介して２分子の組合せを形成する。「標的配列」なる用語は決定されることが求められている核酸塩基配列を意味する。
「染色体異常」又は染色体異常性は、正常な染色体配列からの変動、例えば染色体数の変化（異数性）、遺伝子コピー数の変化（増幅、欠失、複製、異数性）、潜在的切断点、挿入、逆位、再編成、又は転座である。
ＩＩ．組成物
本発明は、ハイブリダイゼーションにおいて使用するための分子プローブを含有する組成物と（二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する）水性組成物を提供する。一般に、かかる組成物はここに記載の任意の分子プローブ及び任意の水性組成物を含みうる。
Ａ．分子プローブ
本発明において使用するために適した分子プローブは、例えば、出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２００５／０２６６４５９号に記載されている。一般に、分子プローブは典型的には例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、及びＬＮＡを含む二本鎖又は一本鎖核酸である。プローブは、標的を検出するための任意の適切な長さでありうる。一般に、プローブは、プローブが全体で約３０ｋｂから約２Ｍｂに及ぶように様々なサイズ（例えばそれぞれ約５０ｂｐから約５００ｂｐ）の小さな断片から構成される。例えば、プローブは、１−１００、１−１０、７−１５、１０−２００、１０−２０、１０−３０、１０−５０、２０−４０、３０−５０、４０−６０、５０−７０、５０−１００、５０−１５０、６０−８０、７０−９０、又は８０−１００ｋｂ長でありうる。プローブは、該プローブに結合する核酸分子又は他の分子を検出し、定量し、同定し、又は分析するために使用できる。
一般に、プローブは、化学合成により、又はクローニングにより特異的ＤＮＡ配列を増幅させ、ベクター中にＤＮＡを挿入し、ベクターを適切な宿主細胞中で増幅させることにより、調製することができる。一般的に使用されるベクターは細菌プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、ＰＩ転用人工染色体（ＰＡＣｓ）、又は酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）を含む。ついで、増幅されたＤＮＡは抽出され、プローブとしての使用のために精製される。プローブを調製し及び／又は合成するための方法は、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に開示されているように、当該分野で知られている。
本発明の方法及び組成物に使用されるプローブは、一実施態様では、独特の断片並びに反復断片の双方を含む。核酸アナログプローブ、例えばＰＮＡプローブは、一般に、約１０から１５の核酸塩基を含む短いよく十分に定まったプローブである。ＰＮＡプローブは通常はそれぞれ１０から２５の核酸塩基単位を有する幾つかの個々のプローブから構成される。
一実施態様では、本発明は、単一の分子プローブを提供する。別の実施態様では、本発明は一対の分子プローブを提供する。他の実施態様では、本発明は、２、３、４、５、１０、又はそれ以上のプローブ又は対のプローブを提供する。一実施態様では、出典明示によりここに援用される米国特許第６７３０４７４号に教示されるように、区別されバランスがとれたプローブ対が使用される。区別されバランスがとれたプローブ対の各々は、例えば転座に関与する異なった染色体に、又は潜在的切断点のフランキング領域にハイブリダイズしうる。別の実施態様では、二つのセットのハイブリダイゼーションプローブを用いることができ、その一又は複数は、ここに出典明示により援用される米国特許第７１０５２９４号におけるようなＰＮＡプローブを含む。一実施態様では、少なくとも二つのセットのハイブリダイゼーションプローブが使用され、少なくとも一つのセットは染色体中の潜在的な異常に関連した特異的核酸配列にハイブリダイズ可能であり、少なくとも別のセットは、染色体中の他の又は同じ潜在的異常に関連した特異的核酸配列にハイブリダイズ可能である。
核酸試料にハイブリダイズさせるために使用できる幾つかのタイプのプローブがある(一般には、Szeles, Acta Microbiol. Immunol. Hungarica, 49:69-80 (2002)を参照のこと)。これらプローブはゲノムDNA又はcDNA、全染色体彩色、染色体リピート、及び全ゲノムの短配列を含む。ゲノムプローブの場合、哺乳動物ゲノム中の頻繁に反復される配列は、比較的僅かの進化的保存しか有していない。よって、全核又はゲノムＤＮＡを種特異的プローブとして使用することができる。染色体彩色は、単一の染色体タイプから誘導されたＤＮＡ配列の収集物であり、分裂中期及び静止期の核中のその特定の染色体を同定できる。異なった染色体タイプはまたプローブハイブリダイゼーションの標的とされうる独特の反復配列を有する (Cremer 等, Hum. Genet., 74:346-52 (1986)を参照)。独特の単一コピー配列を標的とする大きな挿入プローブは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することができるプローブタイプの別の例である。これらのプローブは、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、ＰＩ転用人工染色体（ＰＡＣｓ）、又は酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）においてでありうる。これらの大きなプローブでは、ハイブリダイゼーション効率はプローブサイズに逆比例する。にもかかわらず、２ｋｂほどの小さいプローブが使用されている（Ｉｄを参照）。
一般に、プローブのタイプが、プローブが検出できる特徴のタイプを決定する。染色体全体（全染色体彩色）に沿ってハイブリダイズするプローブは、ある種の染色体の数を計算し、転座を示し、又はクロマチンの 染色体外断片を同定するために使用される。同様のプローブを、欠失、増幅、逆位、複製、及び異数性のような異常を検出するために使用することもできる。他の例では、遺伝子座特異的プローブ混合物を用いて特異的染色体を検出し計数することができる。二以上の異なった着色の遺伝子座特異的プローブは、例えばスプリット-シグナルインサイツハイブリダイゼーションを介して転座を検出するために使用でき、反復配列特異的セントロメアプローブ混合物を特異的染色体を検出し計数するために使用できる。
一般に、密接に関連した配列を区別する能力は、プローブ長が増加するにつれて熱安定性の差が野生型と変異複合体間で減少するので、ハイブリダイゼーションプローブの長さに逆比例する。１０ｂｐ長より大きいプローブが、一般に、関心ある独特の生物又は臨床状態を正しく同定するのに必要な配列多様性を得るのに必要とされる。例えば、ＡＢＬ遺伝子のような特定のＤＮＡ配列は、１５ｋｂ長であるプローブを使用して信頼的に染色されうる。他方、非常に短いオリゴマー（＜１０塩基対）における単一の塩基（点突然変異）のような微妙な配列差は、非標的配列と比較した相補的核酸標的配列へのハイブリダイゼーションの識別を可能にするのに十分であり得る。
一実施態様では、インサイツハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一セットは、米国特許第７１０５２９４号に記載されているように、一又は複数のＰＮＡプローブを含みうる。ＰＮＡは、ペンダントプリン及びピリミジン塩基を持つペプチド（Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン）骨格を有する合成ポリマーである。ＰＮＡ骨格は未変化であるため、ＤＮＡ及びＲＮＡとは異なり、ＰＮＡ／ＤＮＡ及びＰＮＡ／ＲＮＡ相互作用は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡ相互作用よりも強い。従って、ＰＮＡプローブは、同様の特異性を保持しながら、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブよりも短くてもよい。ＰＮＡ／ＤＮＡ（又はＰＮＡ／ＲＮＡ）塩基ミスマッチがＤＮＡ／ＤＮＡ（又はＲＮＡ／ＲＮＡ）二本鎖における同様のミスマッチよりもより不安定化するので、ＰＮＡプローブまた相補ＤＮＡ又はＲＮＡへの結合において大なる特異性を示す。加えて、ＰＮＡｓはプロテアーゼ及びヌクレアーゼによる酵素的分解に対して比較的耐性である。
あるいは、又は加えて、上で検討された技術の何れかにおけるハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一セットは、出典明示によりここに援用されるＷＯ９９／１４２２６に記載されているように、一又は複数のロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを含みうる。ＬＮＡｓは、２’及び４’炭素間に更なる架橋結合を含み、堅牢な３’−エンドコンフォメーション及びその結果としてのハイブリダイゼーションのためのヌクレオチド骨格の事前の組織化を生じる。ＬＮＡ／ＤＮＡ及びＬＮＡ／ＲＮＡ相互作用は、高融解温度によって示されるように、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ相互作用より強い。よって、ハイブリダイゼーションに対して必要とされるエネルギーを減少させる本発明の方法及び組成物は、ＬＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションに対して特に有用である。
一実施態様では、プローブは検出可能な標識（プローブ−標的ハイブリッドの検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子）を含みうる。ここで使用される場合、検出可能な標識は、オリゴマー又はポリマーに直接的に又は間接的に結合されうる部分を意味し、よって、オリゴマー又はポリマーを機器又は方法によって検出可能にする。酵素及び化学プロセスを含む当業者に知られた任意の標識方法を、本発明の方法及び組成物に使用されるプローブを標識するのに使用することができる。
一実施態様では、検出可能な標識はプローブに直接結合されうる。別の実施態様では、検出可能な標識はプローブに間接的に、例えばリンカーを使用することによって結合されうる。他の実施態様では、プローブは標識されない。
検出可能な標識は、例えば蛍光色素、発色団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハオウテン、量子ドット、ビーズ、アミノヘキシル、ピレン、及び化学発光化合物、例えばアクリジンオレンジでありうる。本発明の方法において使用することができる蛍光色素は、限定しないが、ＩＲ染料、Ｄｙｏｍｉｃｓ染料、フィコエリトリン、カスケードブルー、オレゴングリーン４８８、パシフィックブルー、ローダミングリーン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、シアニン染料（つまり、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）（ジエチル−アミノ）クマリン、フルオレセイン（つまり、ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン、リサミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡ、ＴＲＩＴＣ、及びＡｌｅｘａ染料を含む。本発明で使用されうるハプテンは、限定しないが、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ローダミン、ブロモデオキシウリジン、アセチルアミノフルーレン、水銀トリニトロフェノール、エストラジオール、及びビオチンを含む。本発明において使用することができる酵素は、限定しないが、ダイズペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及び西洋わさびペルオキシダーゼを含む。一実施態様では、標識は放射性標識、例えば３１Ｐ、３３Ｐ、又は３２Ｓである。別の実施態様では、プローブは、ハプテン、例えばジゴキシゲニン又はビオチンで標識されうる。プローブはまた重金属粒子で、又は発色性又は蛍光発色性基質を有する酵素で標識されうる。プローブはまた当業者に知られている任意の他の標識で標識されうる。
一を越えるプローブが存在する場合、各プローブは別個の標識で標識されうる。例えば、一実施態様では、米国特許第６７３０４７４号に記載されているように、ＦＩＳＨが実施され、ハイブリダイゼーション混合物が、別個のバランスがとれた対のプローブのセットを含んでいる場合、プローブは比較できる強度の別の標識で標識されうる。
発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）を使用する実施態様では、ハイブリダイゼーション混合物は、一又は複数の一般的な有機色素原での検出に対して構成された少なくとも一のセットのプローブを含み得、Powell RD等, "Metallographic in situ hybridization" Hum. Pathol., 38:1145-59 (2007)に記載されたように、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）に対しては、ハイブリダイゼーション混合物は、銀粒子での検出に対して構成された少なくとも一セットのプローブを含みうる。
一実施態様では、プローブ-核酸配列ハイブリッドの形成は、可視化試薬、例えば抗体（モノクローナルであり得、またそれ自体が標識を含みうる）、酵素のための蛍光発生又は色素発生基質、又は当業者に知られた任意の他の適切な可視化試薬の添加で検出される。
ある実施態様では、プローブは、正常なコントロール試料と比較した試料の染色パターンの変化を検出することにより染色体構造中の変化を検出するために使用されうる。分子プローブを用いて検出することができる染色体異常の非網羅的例は、異数性、遺伝子増幅、欠失、例えば遺伝子欠失、遺伝子融合、転座、複製、挿入、又は逆位を含む。ここで使用される場合、異数性は、正常な正倍数体状態からの任意のずれ又は染色体の正常な二倍体数よりも少なく又は多く有する状態を意味する。ここで使用される場合、増幅は特定のＤＮＡ断片のコピー数の増加を意味する。かかるDNA断片は、例えば遺伝子又は染色体全体を意味する。ここで使用される場合、欠失は、ある核酸配列が染色体から除去されている遺伝子事象を意味する。ここで使用される場合、遺伝子融合は２つの遺伝子のＤＮＡを偶発的に結合させることを意味する。遺伝子融合は転座又は逆位によって生じ得、他の遺伝子のシス調節エレメント（例えばエンハンサー又はプロモーター）の近位のため一つの遺伝子の転写の誤制御又はハイブリッドタンパク質を生じうる。ここで使用される場合、転座は、一つの染色体の核酸配列の一部がその染色体から取り除かれ、異なった染色体に結合させられる遺伝子事象を意味する。ここで使用される場合、複製は、染色体又は染色体セグメントにおけるヌクレオチド配列の反復を意味する。複製は、複製配列に対して線形的に近位するヌクレオチド配列の反復を生じうる。ここで使用される場合、挿入は、染色体中の二つの点の間に核酸配列が導入される遺伝子事象を意味する。ここで使用される場合、逆位は、染色体中の核酸配列配向が逆にされた遺伝子事象である。ここで使用される場合、染色体切断点は染色体が二つの片に壊れる染色体中の位置を意味する。
ある実施態様では、分子プローブは、遺伝子の各側の例えば約５０００００ｂｐの領域に隣接しうる。約５０００００ｂｐフランキング領域を含むＴＹＭＳマーカーに対するプローブの例は、ＣＴＤ−２３０４Ｈ２２；ＲＰ１１−８４１Ｃ６；ＲＰ１１−４６４Ｌ８；ＲＰ１１−６３１Ｍ２１；ＣＴＤ−２５７３Ｍ２３；ＣＴＤ−３１６２Ｇ８Ｇ８；ＣＴＤ−３２３２Ｆ７；ＲＰ１１−１７０Ｊ２；ＲＰ１１−２５２Ｇ７；ＲＰ１１−６９９Ｐ２４；ＲＰ１１−８０５Ｂ２４；ＣＴＤ−３２３７Ｆ７；ＲＰ１１−２３０Ｐ１７；ＣＴＤ−２３５９Ｈ１８；ＲＰ１１−１１２０Ｈ１０；ＣＴＤ−２５０９Ｆ１；ＲＰ１１−４３１Ｃ１５；ＲＰ１１−３６１Ｏ６；ＲＰ１１−１０６６Ｃ１６；ＣＴＤ−２３５９Ｈ１８；ＲＰ１１−１０６６Ｇ１４；ＲＰ１１−１０３４Ｐ１４；ＲＰ１１−１０３４Ｐ２２；ＣＴＤ−３１１４Ｐ１２；ＲＰ１１−７８７Ａ１２；ＲＰ１１−７８７Ｃ１２；ＣＴＤ−３１４９Ｊ１２；ＲＰ１１−１９５Ｐ１２；ＣＴＤ−２５９５Ｐ２０；ＣＴＤ−２１６８Ｅ８；ＲＰ１１−６２１Ｇ７；ＣＴＤ−３０２３Ｍ８；ＲＰ１１−７４８Ｂ１９；ＣＴＤ−２０６４Ｐ１９；ＲＰ１１−４６１Ｋ１６；ＲＰ１１−６３０Ｆ５；ＣＴＤ−３０２１Ｅ１１；ＣＴＤ−３０２８Ｉ７；ＲＰ１１−１０２１Ｋ１７；ＲＰ１１−７２９Ｇ１５；ＲＰ１１−１０４Ｉ５；ＲＰ１１−５９５Ｄ１３；ＲＰ１１−４３６Ｏ７；ＣＴＤ−２６４６Ｆ１０；ＲＰ１１−１０４Ａ１５；ＣＴＤ−２０２４Ｆ１２；ＣＴＤ−２１６９Ｍ２４；ＲＰ１１−１４０Ｄ２２；ＲＰ１１−８４８Ａ７；ＣＴＤ−２０６０Ｄ６；ＣＴＤ−２２９８Ｋ５；ＣＴＤ−３０２２Ｊ６；ＲＰ１１−２９Ｐ２２；ＲＰ１１−７９０Ｏ１０；ＲＰ１１−８９Ｐ６；ＲＰ１１−９１Ｉ８；ＲＰ１１−６９４Ｎ４；ＲＰ１１−７５２Ｉ１１；ＲＰ１１−３２４Ｇ２；ＣＴＡ−１８６Ｄ６；ＲＰ１１−８８Ｃ１０；ＲＰ１１−６０８Ｎ７；ＲＰ１１−７３２Ｌ１４；ＲＰ１１−３２４Ｇ２；ＲＰ１１−７０５Ｏ１；ＲＰ１１−８３９Ｏ２３；ＲＰ１１−６８３Ｊ１１；ＲＰ１１−８１５Ｌ４；ＲＰ１１−７２０Ｌ２；ＲＰ１１−１７９Ｋ３；ＲＰ１１−７７８Ｐ８；ＲＰ１１−８２３Ｆ８；ＲＰ１１−７９１Ｍ５；ＲＰ１１−６７２Ｌ１０；ＲＰ１１−８２７Ｍ１９；ＲＰ１１−１９Ｊ１２；ＲＰ１１−６０７Ｃ２；ＲＰ１１−２６７Ｃ１９；ＣＴＤ−３２１４Ｎ２４；ＲＰ１１−１０３５Ｅ２；ＣＴＤ−２００４Ｆ１８；ＣＴＤ−３１５５Ｌ２０；ＣＴＤ−２２８１Ａ２２；ＣＴＤ−３２３１Ｌ２３；ＣＴＤ−２０１４Ｐ１８；ＲＰ１１−１１５０Ｃ１８；ＲＰ１１−１７０Ｊ１；ＣＴＣ−７９０Ｉ９；ＲＰ１１−７６Ｈ２４；ＲＰ１１−４８Ｉ２１；ＣＴＣ−７７５Ａ１０；ＣＴＤ−２０３４Ｏ１８；ＲＰ１１−４３１Ｃ１１；ＲＰ１１−５０Ｃ２；ＣＴＤ−２２０８Ｇ７；ＣＴＤ−２３４５Ｇ８；ＲＰ１１−７９７Ｃ９；ＲＰ１１−１３３Ｄ９；ＲＰ１１−６５５Ｄ４；ＲＰ１１−１４Ｐ２０；ＲＰ１１−１０３Ｂ２３；ＲＰ１１−８０６Ｌ２；ＲＰ１１−１４５Ｂ１９；ＣＴＤ−２５９３Ｊ１２；ＣＴＤ−３２１５Ｉ７；ＲＰ１１−３８１Ｄ１０；ＲＰ１１−７６９Ｏ８；ＲＰ１１−９５Ｈ４；ＲＰ１１−５５２Ｅ８；ＲＰ１１−９１４Ｐ２３；ＲＰ１１−９０４Ｆ１；ＲＰ１１−１６４Ｃ１４；ＣＴＤ−３０４０Ａ２０；ＲＰ１１−１１５２Ｅ８；ＣＴＤ−３０６５Ｄ２４；ＣＴＤ−３２４３Ｂ１７；ＣＴＤ−３２４３Ｄ１８；ＣＴＤ−３２４３Ｄ１９；ＣＴＤ−３１１３Ｈ２；ＲＰ１１−１１２０Ｅ２０；ＣＴＤ−３０４６Ｉ１６；ＲＰ１１−６３５Ｊ２０；ＲＰ１１−１１４Ｍ２０；ＲＰ１１−１０１８Ｍ４；ＣＴＡ−３４４Ｎ３；ＲＰ１１−１３７Ｋ７；ＲＰ１１−６８９Ｃ９；ＲＰ１１−１００５Ｂ１８；ＲＰ１１−１２６Ｍ２０；ＣＴＤ−２１３４Ｉ３；ＲＰ１１−７０１Ｆ４；ＣＴＤ−３２３６Ｊ２３；ＣＴＤ−３０４７Ｌ１９；ＣＴＤ−３２４０Ｇ１６；ＣＴＤ−３１４８Ｎ６；ＲＰ１１−２２Ｊ２４；ＲＰ１１−１０９４Ｄ２；ＣＴＤ−２１８２Ｋ１９；ＲＰ１１−１０７Ａ１３；ＲＰ１１−１３４Ｐ２２；ＲＰ１１−６３６Ｐ１５；ＲＰ１１−７８Ｆ１７；ＣＴＤ−２２２１Ｐ２２；ＣＴＤ−２０１１Ｍ１４；ＲＰ１１−６２６Ｂ１１；及びＲＰ１１−２７Ｋ２４である。
他の実施態様では、プローブは遺伝子をコードするか又は遺伝子をコードしない染色体領域内に結合しうる。例えば、プローブは、チミジル酸シンターゼ（ＴＹＭＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）、メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、及び５−メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（メチオニンシンターゼ、ＭＴＲ）を含む５−ＦＵ経路に関連する染色体領域に結合しうる。
一実施態様では、分子プローブは、先天性遺伝子疾患、例えば脆弱Ｘ症候群を検出する。検出されうる他の先天性遺伝子疾患は、例えばダウン症候群、ターナー症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン症候群、ヤコブセン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病１Ａ型、及びロバートソン転座を含む。
一実施態様では、分子プローブは癌状態、例えば固形腫瘍、例えば膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌又は子宮癌を検出する。一実施態様では、分子プローブは、造血器腫瘍、例えば急性 リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病, リンパ腫、多発性骨髄腫、又は非ホジキンリンパ腫を検出する。一実施態様では、分子プローブは、Ｂ細胞悪性腫瘍又はＴ細胞悪性腫瘍を検出する。
他の実施態様では、分子プローブは感染性病原、例えば細菌、ウイルス、又は真菌を検出する。例えば、病原は、例えばエプスタイン・バーウイルス、ヒトパピローマウイルス、又は単純ヘルペスウイルスでありうる。他の例では、病原は、例えば大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、ピロリ菌、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ブラストミセス・デルマチチジス、コクシジオイデス種、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、又は単純ヘルペスウイルスでありうる。
一実施態様では、分子プローブは、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１２、ＢＣＲ（２２ｑ１１）、ＣＣＮＤ１、サイクリンＤ１（１１ｑ２３）、Ｅ２Ａ（１９ｐ１３）、ＥＧＦＲ（７ｐ１１．２）、ＥＴＶ６（ＴＥＬ）（１２ｐ１３）、ＦＩＰ１Ｌ１、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）（１７ｑ２１．１）、ＩＧＨ（１４ｑ３２）、ＩＧＫ（２ｐ１１）、ＩＧＬ（２２ｑ１１）、ＭＡＬＴ１、ＭＬＬ（ＡＬＬ−１、ＨＴＲＸ１、ＨＲＸ）（１１ｑ２３）、ＭＹＣ（ｃ−Ｍｙｃ）（８ｑ２４）、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＩＬ、ＴＣＦ３（Ｅ２Ａ、ＩＴＦ１）、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＲＡＤ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ，テロメア、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３（ＨＯＸ１１Ｌ２、ＲＮＸ）、又はＴＯＰ２Ａの異常（例えば再編成、増幅、又は欠失を含む）を検出する。例えば、プローブは、ＥＴＶ６及びＡＭＬ１（ＲＵＮＸ１及びＣＢＦＡ２としても知られている）の融合によって特徴付けられる小児癌における一般的な遺伝子再編成を検出するために使用することができる。
（例えば造血器腫瘍の文脈を含む）一実施態様では、分子プローブは転座、例えばｔ（１；１４）（ｑ３４；ｑ１１）、ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）、ｔ（２；５）、ｔ（２；１８）（ｑ１２；ｑ２１）、ｔ（２；８）、ｔ（４；１１）、ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）、ｔ（６；１１）（ｑ２７；ｑ２３）、ｔ（７；２２）（ｐ２２；ｑ１２）、ｔ（８；１４）、ｔ（８；２２）、ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ｔ（１０；１４）（ｑ２４；ｑ１１）、ｔ（１１；１４）、ｔ（１１；１４）（ｐ１３；ｑ１１）、ｔ（１１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）、ｔ（１４；１８）（ｑ２３；ｑ２１）、ｔ（１４；１８）、ｔ（１８；２２）（ｑ２１；ｑ１１）、及びｔ（２１；２２）（ｑ２２；ｑ１２）から選択される転座を検出する。他の実施態様では、分子プローブは、欠失、例えばＴＡＬ１の欠失を検出する。更に他の実施態様では、分子プローブは、遺伝子増幅、例えばＥＧＦＲ、ＭＹＣ、ＴＯＰ２Ａ、又はＨＥＲ２の増幅を検出する。かかる場合、プローブは参照プローブと対をなしうる。例えば、ＥＧＦＲを検出するプローブは、ＣＥＮ−７を検出するプローブと対をなし得、ＭＹＣを検出するプローブは、ＣＥＮ−８を検出するプローブと対をなし得、ＨＥＲ２を検出するプローブは、ＣＥＮ−１７を検出するプローブと対をなし得る。
非血液学的疾患を検出するための本発明の組成物及び方法において使用されうるプローブに対する例示的な標的は、例えばＢＡＳＥ、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＤＣＤ、Ｅ２Ｆ３、ｎ−ＭＹＣ／ＭＹＣＮ、ＣＯＸ−２／ＰＴＧＳ２、ＬＲＩＧ１、ＥＲａ、ｈＴＥＲＴ、ＭＬＮ６４／ＳＴＡＲＤ３、ＰＧＲ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＯＰ１、ＴＵＢＢ１、ＡＩＢ１、ＤＬＣ−１、ＥＤＤ、Ｐｉｐ４ｋ２ｂ／５ｋ、Ｓｉｌ、ＴＢＸ２、ｃ−Ｋｉｔ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｓ／ＴＹＭＳ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、Ｐ１５、Ｐ１６、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＭＴＯＲ、ＴＩＭＰ１、ＥＳＲ１、ＰＴＥＮ、ＭＤＭ２／ＣＤＫ４、ＭＥＴ、Ｃ−ＭＥＴ、ＥＲＢ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＥＴ、ＦＧＦＲ３、ＡＢＣＢ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＢＲＣＡ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＥＲＣＣ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＮＴ１、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＭ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＵＲＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＡＵＲＫＣ、ＭＡＰＴ／ｔａｕ、ＴＴＢＫ１、ＴＵＢＢ、ＶＥＧＦＲ、ＣＣＮＤ３、ＣＤＫ６、ＣＤＫ２、ＣＤＣ２、ＨＤＡＣ、ＥＳＲ２、ＳＣＵＢＥ２、ＢＩＲＣ５、ＦＡＳＮ、ＤＨＦＲ、ＴＰ／ＥＣＧＦ１、ＴＹＭＰ、ＤＰＹＤ、ＴＫ１、ＨＭＧＩＣ、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＧ２、ＭＶＰ、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＳＬＣ２９Ａ１、ＳＬＣ２８Ａ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＵＢＢ４、ＴＵＢＡ、ＭＡＰ４、ＭＡＰ７、ＳＴＭＮ１、ＫＩＦ５Ｂ、ＨＳＰＡ５、ＰＳＭＤ１４、ＦＰＧＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ、ＧＣＬＣ、ＧＧＴ２、ＭＴ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＸＰＡ、ＸＰＤ、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＡＰＥＸ１、ＭＧＭＴ、ＧＬＯ１、ＲＢ１、ＧＭＬ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＡＳ２、ＩＴＧＢ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＣＬ１、ＢＡＸ、ＢＩＲＣ４、ＴＮＦＲＳＦ６、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＨＳＰＢ１、ＭＡＬＡＴ１（α）ｔ（１１；１９）（ｑ１１；ｑ１３．４）、ＭＨＬＢ１ ｔ（１１；１９）（ｑ１１；ｑ１３．４）、ＣＯＬ１Ａ１ ｔ（１７；２２）（ｑ２２；ｑ１３）、ＰＤＧＦＢ ｔ（１７；２２）（ｑ２２；ｑ１３）、ＦＫＨＲ ｔ（２；１３）及びｔ（１；１３）、ＥＴＶ６ ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ＮＴＲＫ３ ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ＴＬＳ／ＦＵＳ ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１）、ＣＨＯＰ ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１）、ＥＷＳ ｔ（１２；２２）（ｑ１３；ｑ１２）、ＥＷＳ／ＦＬＩ１ ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）、及びＦＬＩ１ ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）を含む。
血液学的疾患を検出するための本発明の組成物及び方法において使用されうるプローブに対する例示的な標的は、例えば慢性骨髄増殖性疾患の標的、例えばＡＢＬ ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ＰＲＤＭ１６ ｄｅｌ（１ｐ３６．３２）、ｄｅｌ（２１ｑ２２．１２）、ＲＵＮＸ１／ＡＭＬ１ ｄｅｌ（１ｐ３６．３２）、ｄｅｌ（２１ｑ２２．１２）、ＣＥＰ８、ＰＤＧＦＲＢ、ＮＵＰ９８、ＦＧＦＲ１、及びＡＳＳを検出するためのプローブ；急性骨髄性白血病の標的、例えばＥＴＯ ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ＡＭＬ１ ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ＣＢＦβ ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）又はｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）、ＭＹＨ１１ ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）又はｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）、ＡＦ９ ｔ（９；１１）、ＰＭＬ ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）、ＰＬＺＦ ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）、ＮｕＭＡ ｔ（１１；１７）（ｑ１３；ｑ２１）、ＮＰＭ ｔ（５；１７）（ｑ２３；ｑ１２）、ＲＡＲα ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）ｔ（１１；１７）（ｑ１３；ｑ２１）ｔ（５；１７）（ｑ２３；ｑ２１）、ＥＶＩ１ ｔ（３；ｖ）（ｑ２６；ｖ）、ＧＲ６ ｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）、ＲＰＮ１ ｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）、ＤＥＫ ｔ（６；９）、ＣＡＮ ｔ（６；９）、ＭＬＦ１ ｔ（３；５）（…；ｑ２３）、ＦＵＳ ｔ（１６；２１）、ＥＲＧ ｔ（１６；２１）、ＮＵＰ９８ ｔ（７；１１）、ＨＯＸ９Ａ ｔ（７；１１）、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３ ｔ（８；１６）（ｐ１１；ｐ１３）、ＣＢＰ ｔ（８；１６）（ｐ１１；ｐ１３）、ｐ３００ ｔ（８；２２）（ｐ１１；ｑ１３）、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ−１／ＮＣｏＡ−２ ｉｎｖ（８）（ｐ１１ｑ１３）、及びＭＫＬ１を検出するためのプローブ；前駆体Ｂ及びＴ細胞腫瘍の標的、例えばＰＢＸ１ ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３．３）＋ｖａｒ．、ＡＢＬ ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ＡＦ４／ＡＦＦ１ ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）、ＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１ ｔ（１２；２１）（ｐ１３；ｑ２２）、ＩＬ３ ｔ（５；１４）（ｑ３１；ｑ３２）、ＨＬＦ ｔ（１７；１９）、ＩＫＺＦ１ｄｅｌ（７）（ｐ１２．２）、ＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂｄｅｌ（９）（ｐ２１．３）、ＴＡＬ１ １ｐ３２異常、ＬＭＯ２ ｔ（１１；１４）（ｐ１３；ｑ１１）＋ｖａｒ．、ＬＭＯ１ ｔ（１１；１４）（ｐ１５；ｑ１１）、ＨＯＸ１１ ｔ（１０；１４）（ｑ２４；ｑ１１）＋ｖａｒ．、ＴＡＬ２ ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３２）、及びＴＡＮ１ ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３４）を検出するためのプローブ；成熟Ｂ細胞腫瘍の標的、例えばＣＥＰ１２、ＡＴＭ、Ｄ１３Ｓ２５、Ｄ１３Ｓ３１９、ＴＰ５３、Ｐ５３、ＴＮＦＡＩＰ３ｄｅｌ（６）（ｑ２３．３−ｑ２４．１）、ＣＤＫ６ ＢＣＬ１ ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）＋ｖａｒ．、ＩＲＦ４ ｔ（６；１４）（ｐ２５；ｑ３２）、Ｃ−ＭＡＦ ｔ（１４；１６）（ｑ３２；ｑ２３）、ＦＧＦＲ３ ｔ（４；１４）（ｐ１６；ｑ３２）、及びＭＵＭ２／３ ｔ（１；１４）（ｑ２１；ｑ３２）を検出するためのプローブ；及び成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞腫瘍の標的、例えばＮＰＭ ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）、ＡＳＳ、ＲＢ１、及びＡＴＭを検出するためのプローブを含む。
セントロメアを検出するための本発明の組成物及び方法において使用されうるプローブに対する例示的な標的は、例えばＣＥＰ１、ＣＥＰ２、ＣＥＰ３、ＣＥＰ４、ＣＥＰ５、ＣＥＰ６、ＣＥＰ７、ＣＥＰ８、ＣＥＰ９、ＣＥＰ１０、ＣＥＰ１１、ＣＥＰ１２、ＣＥＰ１３、ＣＥＰ１４、ＣＥＰ１５、ＣＥＰ１６、ＣＥＰ１７、ＣＥＰ１８、ＣＥＰ１９、ＣＥＰ２０、ＣＥＰ２１、ＣＥＰ２２、ＣＥＰ２３、ＣＥＰ Ｘ、及びＣＥＰ Ｙを含む。
本発明の組成物及び方法において使用されうるプローブに対する例示的な標的はまた例えばＣＥＰ１８（１８ｐ１１．１−ｑ１１．１）、ＣＥＰＸ（Ｘｐ１１．１−ｑ１１．１）、ＣＥＰ Ｙ（Ｙｐ１１．１−ｑ１１．１）、ＬＳＩ１３（１３ｑ１４）、ＬＳＩ２１（２１ｑ２２．１３−ｑ２２．２）、ＣＥＰ３（３ｐ１１．１−ｑ１１．１）、ＣＥＰ７（７ｐ１１．１−ｑ１１．１）、ＬＳＩ（ｐ１６ ９ｐ２１）、ＣＥＰ１７（１７ｐ１１．１−ｑ１１．１）、ＣＥＰ１（Ｄ１Ｚ５）１ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ１ １ｑ１２、ＣＥＰ２（Ｄ２Ｚ１）２ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ３（Ｄ３Ｚ１）３ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ４ ４ｐ１１−ｑ１１、ＣＥＰ６（Ｄ６Ｚ１）６ｐ１１．１−ｑ１１、ＣＥＰ６（Ｄ６Ｚ１）６ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ７（Ｄ７Ｚ１）７ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ８（Ｄ８Ｚ２）８ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ９ ９ｐ１１−ｑ１１、ＣＥＰ１０ １０ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ１１（Ｄ１１Ｚ１）１１ｐ１１．１１−ｑ１１．１１、ＣＥＰ１１（Ｄ１１Ｚ１）１１ｐ１１．１１−ｑ１１、ＣＥＰ１２（Ｄ１２Ｚ３）１２ｐ１１．１−ｑ１１、ＬＳＩ１３（１３ｑ１４）、ＬＳＩ１３（ＲＢ１）、ＣＥＰ１５（Ｄ１５Ｚ１）１５ｐ１１．２、ＣＥＰ１５（Ｄ１５Ｚ４）１５ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ１６（Ｄ１６Ｚ３）１６ｑ１１．２、ＣＥＰ１７（Ｄ１７Ｚ１）１７ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ１８（Ｄ１８Ｚ１）１８ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ２０（Ｄ２０Ｚ１）２０ｐ１１．１−ｑ１１．１、ＬＳＩ２１、ＬＳＩ２２（ＢＣＲ）、ＣＥＰ Ｘ（ＤＸＺ１）Ｘｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ Ｘ（ＤＸＺ１）／Ｙ（ＤＹＺ１）＊Ｘｐ１１．１−ｑ１１．１Ｙｑ１２、ＣＥＰ Ｘ（ＤＸＺ１）／Ｙ（ＤＹＺ３）Ｘｐ１１．１−ｑ１１．１Ｙｐ１１．１−ｑ１１．１、ＣＥＰ Ｙ（ＤＹＺ１）Ｙｑ１２、ＣＥＰ Ｙ（ＤＹＺ１）、ＣＥＰ Ｙ（ＤＹＺ３）Ｙｐ１１．１−ｑ１１．１、ＬＳＩ １ｐ３６／ＬＳＩ １ｑ２５及びＬＳＩ １９ｑ１３／１９ｐ１３、ＬＳＩ ４ｑ１２、ＬＳＩ ９ｑ３４、ＬＳＩ１３（ＲＢ１）１３ｑ１４、ＬＳＩ１３（ＲＢ１）、ＬＳＩ（１３ｑ３４）、ＬＳＩ１３（１３ｑ１４）、ＬＳＩ２１、ＬＳＩ２２（ＢＣＲ）、ＬＳＩ ＡＬＫ、ＬＳＩ ＡＭＬ１／ＥＴＯ、ＬＳＩアンドロゲンレセプター遺伝子（Ｘｑ１２）、ＬＳＩ ＡＰＩ２／ＭＡＬＴ１ ｔ（１１；１８）（ｑ２１；ｑ２１）、ＬＳＩ ＡＴＭ（１１ｑ２２．３）、ＬＳＩ ＡＴＭ／ＣＥＰ１１、ＬＳＩ ＢＣＬ２、ＬＳＩ ＢＣＲ／ＡＢＬ＋９ｑ３４、ＬＳＩ ＢＣＲ／ＡＢＬ、ＬＳＩ ＣＢＦＢ、ＬＳＩ ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３）、ＬＳＩ ＣＨＯＰ（１２ｑ１３）、ＬＳＩ ＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３−ｑ３４）／Ｄ５Ｓ２３，Ｄ５Ｓ７２１、ＬＳＩ Ｃ−ＭＹＣ（８ｑ２４．１２−ｑ２４．１３）、ＬＳＩサイクリンＤ１（１１ｑ１３）／ＣＥＰ１１、ＬＳＩ Ｄ１３Ｓ２５（１３ｑ１４．３）、ＬＳＩ Ｄ１３Ｓ３１９（１３ｑ１４．３）、ＬＳＩ Ｄ１３Ｓ３１９（１３ｑ１４．３）／ＬＳＩ１３ｑ３４、ＬＳＩ Ｄ２０Ｓ１０８（２０ｑ１２）、ＬＳＩ Ｄ５Ｓ２３／Ｄ５Ｓ７２１、ＣＥＰ９、ＣＥＰ１５、ＬＳＩ Ｄ７Ｓ４８６（７ｑ３１）／ＣＥＰ７、ＬＳＩ Ｄ７Ｓ５２２（７ｑ３１）／ＣＥＰ７、ＬＳＩ ＥＧＦＲ／ＣＥＰ７、ＬＳＩ ＥＧＲ１（５ｑ３１）／Ｄ５Ｓ２３、Ｄ５Ｓ７２１、ＬＳＩ ＥＴＶ６（ＴＥＬ）（１２ｐ１３）、ＬＳＩ ＥＷＳＲ１（２２ｑ１２）、ＬＳＩ ＦＫＨＲ（１３ｑ１４）、ＬＳＩ ＦＵＳ（１６ｐ１１）、ＬＳＩ ＩＧＨ、ＬＳＩ ＩＧＨ／ＢＣＬ２、ＬＳＩ ＩＧＨ／ＣＣＮＤ１、ＬＳＩ ＩＧＨ／ＦＧＦＲ３、ＬＳＩ ＩＧＨ／ＭＡＦ、ＬＳＩ ＩＧＨ／ＭＡＬＴ１ ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）、ＬＳＩ ＩＧＨ／ＭＹＣ、ＣＥＰ８、ＬＳＩＭＡＬＴ１（１８ｑ２１）、ＬＳＩＭＬＬ、ＬＳＩＭＹＢ（６ｑ２３）、ＬＳＩＭＹＣ、ＬＳＩ Ｎ−ＭＹＣ（２ｐ２４．１）、ＬＳＩ Ｎ−ＭＹＣ（２ｐ２４）／ＣＥＰ２Ｓ、ＬＳＩ ｐ１６（９ｐ２１）／ＣＥＰ９、ＬＳＩ ｐ５３（１７ｐ１３．１）、ＬＳＩ ｐ５３／ＬＳＩ ＡＴＭ及びＬＳＩ Ｄ１３Ｓ３１９／ＬＳＩ１３ｑ３４／ＣＥＰ１２、ＬＳＩ ＰＭＬ／ＲＡＲＡ、ＬＳＩ ＰＴＥＮ（１０ｑ２３）／ＣＥＰ１０、ＬＳＩ ＲＡＲＡ、ＬＳＩ ＳＹＴ（１８ｑ１１．２）、ＬＳＩ ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＬＳＩ ＴＣＦ３／ＰＢＸ１、ＬＳＩ ＴＣＲα／ｄｅｌｔａ、ＬＳＩ ＴＯＰ２Ａ、ＬＳＩ ＴＰ５３／ＣＥＰ１７、ＬＳＩ ＺＮＦ２１７（２０ｑ１３．２）、ＬＳＩ ｐ５８（１ｐ３６）ＬＳＩ １ｑ２５、ＬＳＩ Ｄ５Ｓ２３、Ｄ５Ｓ７２１、ＬＳＩ ＥＧＲ１／ＬＳＩ Ｄ５Ｓ２３、Ｄ５Ｓ７２１、ＬＳＩ Ｎ２５／ＡＲＳＡ、ＬＳＩ ＴＵＰＬＥ１／ＬＳＩ ＡＲＳＡ、ＬＳＩ ＴＵＰＬＥ１（ＨＩＲＡ）／ＴｅｌＶｙｓｉｏｎ２２ｑ Ｓ、ＬＳＩ ＫＡＬ／ＣＥＰ Ｘ、ＬＳＩ ＬＩＳ１／ＬＳＩ ＲＡＲＡ、ＬＳＩ Ｄ１５Ｓ１０／ＣＥＰ１５（Ｄ１５Ｚ１）／ＰＭＬ、ＬＳＩ Ｄ１５Ｓ１１／ＣＥＰ１５（Ｄ１５Ｚ１）、ＬＳＩ ＧＡＢＲＢ３／ＣＥＰ１５（Ｄ１５Ｚ１）、ＬＳＩ ＳＮＲＰＮ／ＣＥＰ１５（Ｄ１５Ｚ１）／ＬＳＩ ＰＭＬ、ＬＳＩ ＳＭＳ Ｒｅｇｉｏｎ／ＬＳＩ ＲＡＲＡ、ＬＳＩ ＮＳＤ１（５ｑ３５）、ＬＳＩ ＳＲＹ／ＣＥＰ Ｘ、ＬＳＩ ＳＲＹ、ＬＳＩ ＳＴＳ／ＬＳＩ ＣＥＰ Ｘ、ＬＳＩ ＥＬＮｅ／ＬＳＩ Ｄ７Ｓ４８６、Ｄ７Ｓ５２２、ＬＳＩ ＷＨＳ／ＣＥＰ４、ＣＥＢ１０８／Ｔ７ １ｐ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２０５２（Ｕ３２３８９）２ｐ、３ＰＴＥＬ２５（Ｄ３Ｓ４５５９）３ｐ、４ｐ０２２（Ｄ４Ｓ３３５９、６２４４５９９）４ｐ、Ｃ８４ｃ１１／Ｔ７ ５ｐ、６ＰＴＥＬ４８ ６ｐ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２１８５（Ｇ３１３４１）７ｐ、ＡＦＭ１９７ＸＧ５（Ｄ８Ｓ５０４、１９９１５３）８ｐ、３０５Ｊ７−Ｔ７ ９ｐ、１０ｐ００６（Ｚ９６１３９）１０ｐ、ＶＩＪ２（Ｄ１１Ｓ２０７１、Ｕ１２８９６）１１ｐ、ＶＩＪ３（ｓＡＶＨ２７，Ｕ５７８６５）１２ｐ、ＳＴＳＧ６０８８３１ ＳＴＳＧ６０８９３８ １６ｐ、２８２Ｍ１６／ＳＰ６ １７ｐ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２１０２（Ｄ１８Ｓ５５２）１８ｐ、１２９Ｆ１６／ＳＰ６ １９ｐ、２０ｐ１８（Ｄ２０Ｓ１１５７）２０ｐ、ＤＸＹＳ１２９，ＤＸＹＳ１５３Ｘｐ／Ｙｐ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２１２３ １ＱＴＥＬ１０（Ｄ１Ｓ３７３８、９０４３９１２）１ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２１１２（Ｄ２Ｓ４４７）２ＱＴＥＬ４７ ２ｑ、３ＱＴＥＬ０５（Ｄ３Ｓ４５６０）３ｑ、ＡＦＭ Ａ２２４ＸＨ１（Ｄ４Ｓ２９３０）４ｑ、ＧＳ３５ｏ８／Ｔ７ ５ＱＴＥＬ７０２（Ｄ５Ｓ２９０７）５ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２１５８ ６ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２１８５（ＳＴＳ２０００Ｈ、Ｇ３１３４１）７ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２０５３ ８ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２２４１（Ｄ９Ｓ３２５）９ｑ、１０ＱＴＥＬ２４（Ｄ１０Ｓ２４９０、６２４４６３１）１０ｑ、Ｄ１１Ｓ１０３７ １１ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２１９６ １２ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２００２（Ｄ１３Ｓ３２７）１３ｑ、Ｄ１４Ｓ１４２０ １４ｑ、ＷＩ−５２１４（Ｄ１５Ｓ３９６）（Ｇ０４８０１）１５ｑ、１６ｑ０１３（Ｚ９６３１９）１６ｑ、Ｄ１７Ｓ９２８ Ｚ２３６４６ １７ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２０５０ １８ＱＴＥＬ１１ ＳＴＳＧ１９３ ＡＦＭ２５４ＶＤ５ ＣＵ１８−０１０Ｌ／ＣＵ１８−０１０Ｒ ＳＴＳ−Ｆ０４１９５ ＴＩＧＲ−Ａ００８Ｐ３７ ＳＴＳＧ５２９６３ １８ｑ、Ｄ１９Ｓ２３８Ｅ１９ｑ、２０ＱＴＥＬ１４ ２０ｑ、ＶＩＪ２ｙＲＭ２０２９ ２１ｑ、ＭＳ６０７（Ｘ５８０４４）ＡＣＲ２２ｑ、及びＳＹＢＬ１に対するＥＳＴ Ｃｄｙ１６ｃ０７−コスミドＣ８．２（Ｚ４３２０６）Ｘｑ／Ｙｑ内のマップを含む。
本発明の組成物及び方法において使用されうる例示的プローブは、また例えばＨＩＶサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＥ、Ｆ、ＡＧ、Ｇ及びＯのＰＯＬ遺伝子のＩＮ領域内に結合するプローブ；ＰＲ遺伝子内及びＨＩＶ−１のＰＯＬ遺伝子のＲＴ領域内に結合するプローブ；及びトラコーマクラミジアの潜在的プラスミドを検出するためのプローブ；淋菌のＯｐａ遺伝子を検出するためのプローブ；染色体１−１２及び１６−２０のｐ及びｑサブテロメア、末端動原体染色体１３、１４、１５、２１、及び２２のｑサブテロメア、及びＸｐ／Ｙｐ及びＸｑ／Ｙｑ偽常染色体領域サブテロメアに結合するプローブ；ＨＬＡ−Ａのエキソン２又は３に結合するプローブ；ＨＬＡ−Ｂのエキソン２又は３に結合するプローブ；ＨＬＡ−Ｃのエキソン２又は３に結合するプローブ；ＨＬＡ−ＤＲＢ１のエキソン２に結合するプローブ；ＨＬＡ−ＤＰＢ１のエキソン２に結合するプローブ；及びＨＬＡ−ＤＱＢ１のエキソン２に結合するプローブを含む。
Ｂ．水性組成物
（１）溶媒選択
本発明に使用される適切な極性非プロトン溶媒は、そのハンセン溶解度パラメータに基づいて選択することができる。ある溶媒に対してＨＳＰを実験的に決定し及び／又は計算するための方法は当該分野で知られており、ＨＳＰは１２００を越える化学物質に対して報告されている。
例えば、Ｄパラメータは、屈折率に基づいて合理的な精度で計算することができ、又は臨界温度及びモル体積を樹立した後、類似のサイズ、形状、及び組成の既知の溶媒と比較したチャートから誘導することができる。Ｐパラメータは、式１を使用して既知の双極子モーメント（例えばMcClellan A.L., Tables of Experimental Dipole Moments (W.H. Freeman 1963)を参照）から推定することができる：
式１： δＰ＝３７．４(双極子モーメント)／Ｖ１／２
ここで、Ｖはモル体積である。Ｈパラメータを計算するための式はない。その代わりに、Ｈパラメータは通常グループ寄与に基づいて決定される。
ＨＳＰ特徴付けは、球の中心の実験的に決定された適切な参照溶媒のＨＳＰを用いて、簡便には球標示を使用して可視化される。球半径（Ｒ）は、「良好な」相互作用が起こるのを尚可能にする参照溶媒のＨＳＰからの最大の許容可能な変動を示す。良好な溶媒は球の内部にあり悪いものは外である。その各ＨＳＰ値に基づく２つの溶媒間の距離 Raは、式２を使用して決定することができる：
式２： (Ｒａ)２＝４(δＤ１−δＤ２)２＋(δＰ１−δＰ２)２(δＨ１−δＨ２)２
ここで、添え字１は参照試料を示し、添え字２は試験化学物質を示し、全ての値はＭＰａ１／２である。良好な溶解度は、Ｒａが溶解度球の実験的に決定された半径Ｒｏよりも少ないことを必要とする。２つの溶媒間の相対的なエネルギー差、つまりＲＥＤ数は、式３に示すように、Ｒｏに対するＲａの比をとることによって計算することができる。
式３： ＲＥＤ＝Ｒａ／Ｒｏ
１．０未満のＲＥＤ数は高親和性を示し；１．０に等しいか近いＲＥＤ数は境界条件を示し；漸次高くなるＲＥＤ数は漸次低くなる親和性を示している。
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＤパラメータは、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２である。このような相対的に高いＤパラメータは一般に環状構造及び／又は硫黄又はハロゲンを持つ構造の溶媒に関連する。直鎖状化合物は本発明で使用されるための最も適した溶媒にはなり得ないが、そのＰ及びＨパラメータが以下に検討する範囲内にあれば考慮されうる。Ｄパラメータは式２において４倍されているので、限界はＲｏの半分である。また、約２１又はそれ以上のＤ値はしばしば固体の特徴であることに留意されなければならない。
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＰパラメータは１３から２３ＭＰａ１／２である。そのような指数的に高いＰパラメータは、一般に、高い双極子モーメント及びおそらくは相対的に低いモル体積を有する溶媒に関連する。例えば、６０ｃｃ／モルに近いＶでは、双極子モーメントは４．５と３．１の間である。９０ｃｃ／モルに近いＶでは、双極子モーメントは５．６と３．９の間でなければならない。
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＨパラメータは３から１３ＭＰａ１／２である。一般に、アルコール基を有する極性非プロトン溶媒は、かかる溶媒のＨパラメータが余りに高いので、本発明の組成物及び方法においては有用ではない。
極性非プロトン溶媒のモル体積は、それが３つのハンセン溶解度パラメータ全ての評価に入るので、また関係している。モル体積が小さくなるにつれて、液体は急速に蒸発する傾向にある。モル体積が大きくなるにつれ、液体が上述のＤ及びＰパラメータの範囲の固体領域に入る傾向がある。よって、本発明の極性非プロトン溶媒は、ＨＳＰ空間における液体／固体境界にむしろ近い。
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒は、ラクトン、スルホン、ニトリル、サルファイト、及び／又はカーボネート官能性を有する。かかる化合物は、その相対的に高い比誘電率、高い双極子モーメント、及び水への溶解度によって区別される。ラクトン官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）であり、スルホン官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はスルホラン（ＳＬ；テトラメチレンスルフィド−ジオキシド）であり、ニトリル官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はアセトニトリル（ＡＮ）であり、サルファイト官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はグリコールサルファイト／エチレンサルファイト（ＧＳ）であり、カーボネート官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はエチレンカーボネート（ＥＣ）、プロピレンカーボネート（ＰＣ）、又はエチレントリチオカーボネート（ＥＴＣ）である。これらの例示的な溶媒の構造を以下に提供し、そのハンセン溶解度パラメータ、ＲＥＤ数、及びモル体積を表１にまとめる。
Figure 2011521635
Figure 2011521635
本発明で使用されうる他の適切な極性非プロトン溶媒は環状化合物、例えばε−カプロラクトン及びＮ−メチルピロリドンである。また、置換ピロリジノン及び５−又は６−員環の窒素を含む関連構造、及び二つのニトリル基、又は一つの臭素及び一つのニトリル基を持つ環状構造がまた本発明の使用に適している場合がある。他の適切な極性非プロトン溶媒は環ウレタン基（ＮＨＣＯＯ−）を含みうる。しかしながら、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンは本発明のハイブリダイゼーション組成物において使用される場合シグナルを生じないので、必ずしも全てのかかる化合物が適切な訳ではない。当業者はここに記載の本発明の組成物及び方法に有用な化合物をスクリーニングしてもよい。本発明における使用に適していよう例示的な化学物質を以下の表２及び３に記載する。
Figure 2011521635
Figure 2011521635
表２はそのハンセン溶解度パラメータに基づき本発明の組成物及び方法において使用される潜在的な化学物質の例示的なリストを記載する。勿論、他の化合物もこれらの要件を満たしうる。これらの化学物質の幾らかは先行技術においてハイブリダイゼーション及び／又はＰＣＲ溶液中に使用されている（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はハイブリダイゼーション及びＰＣＲ溶液に使用されており、スルホラン（ＳＬ）はＰＣＲ溶液に使用されている）が、殆どは使用されていない。しかしながら、先行技術には、これらの化合物が、本願に開示したように、ハイブリダイゼーション時間及び／又は温度を低減させるために有利に使用することができることは認識されてはいなかった。
Figure 2011521635
表２及び３に列挙される化学物質の必ずしも全てが本発明の組成物及び方法での使用に適しているものではない。例えば、そのハンセン溶解度パラメータ（ＨＳＰｓ）が上に記載の範囲に入っているので、ＤＭＳＯが表２に列挙されているが、本発明の組成物及び方法において、ＤＭＳＯはハイブリダイゼーション時間及び／又は温度を減少させるように機能しない。よって、ある実施態様では、水性組成物は極性非プロトン溶媒としてＤＭＳＯを含んでいない。しかしながら、提供された実施例の一つにおける化合物の試験を含むここで提供されるガイドを使用して適切な化合物をスクリーニングすることは当業者の技量の範囲である。例えば、ある実施態様では、適切な極性非プロトン溶媒は、上に記載された範囲のＨＳＰｓと上記の式１−９に示された構造を有している。
（２）組成物、バッファー、及び溶液
（ａ）ハイブリダイゼーション溶液
伝統的なハイブリダイゼーション溶液は当該分野で知られている。かかる溶液は、例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩、洗浄剤、及びブロッキング剤を含みうる。
例えば、緩衝剤は、ＳＳＣ、ＨＥＰＥＳ、ＳＳＰＥ、ＰＩＰＥＳ、ＴＭＡＣ、ＴＲＩＳ、ＳＥＴ、リン酸カリウム、クエン酸、ピロリン酸ナトリウム等を含みうる。緩衝剤は０．５ｘから５０ｘの濃度で存在しうる。典型的には、緩衝剤は２ｘから１０ｘの濃度で存在する。
促進剤は、ポリマー、例えばＦＩＣＯＬＬ、ＰＶＰ、ヘパリン、デキストラン硫酸、タンパク質、例えばＢＳＡ、グリコール、例えばエチレングリコール、グリセロール、１，３プロパンジオールグリセロール、プロピレングリコール、又はジエチレングリコール、その組合せ、例えばデンハート溶液及びＢＬＯＴＴＯ、及び有機溶媒、例えばホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ等を含みうる。促進剤は、１％から８０％又は０．１ｘから１０ｘの濃度で存在しうる。典型的には、ホルムアミドは２５％から７５％の濃度で存在する一方、ＤＭＳＯ、デキストラン硫酸、及びグリコールは５％から１０％の濃度で存在する。
キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等を含みうる。キレート剤は０．１ｍＭから１０ｍＭの濃度で存在しうる。典型的には、キレート剤は０．５ｍＭから５ｍＭの濃度で存在する。
塩は塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム等を含みうる。塩は１ｍＭから７５０ｍＭの濃度で存在しうる。典型的には、塩は１０ｍＭから５００ｍＭの濃度で存在する。
洗浄剤は、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、トリトン、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸等を含みうる。洗浄剤は０．０１％から１０％の濃度で存在しうる。典型的には、洗浄剤は０．１％から１％の濃度で存在する。
核酸ブロッキング剤は、酵母ｔＲＮＡ、ホモポリマーＤＮＡ、変性サケ精液ＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、全ヒトＤＮＡ、ＣＯＴ１ ＤＮＡ等を含みうる。ブロッキング核酸は、０．０５ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在しうる。
伝統的なハイブリダイゼーション溶液に関する文献には様々な変形例が存在している。例えば、伝統的なハイブリダイゼーション溶液は５ｘ又は６ｘのＳＳＣ、０．０１ＭのＥＤＴＡ、５×デンハート液、０．５％のＳＤＳ、及び１００ｍｇ／ｍＬの剪断変性サケ精液ＤＮＡを含みうる。他の伝統的なハイブリダイゼーション溶液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、及び０．２ｍＭのＥＤＴＡを含みうる。ＲＮＡ検出のための生物学的検体でのＦＩＳＨの典型的な．ハイブリダイゼーション溶液は、例えば２ｘＳＳＣ、１０％のデキストラン硫酸、２ｍＭのバナジル−リボヌクレオシド複合体、５０％ホルムアミド、０．０２％のＲＮＡｓｅ不含有ＢＳＡ、及び１ｍｇ／ｍＬの大腸菌ｔＲＮＡを含みうる。ＤＮＡ検出のための生物学的検体でのＦＩＳＨの典型的なハイブリダイゼーション溶液は、例えば２ｘＳＳＣ、１０％のデキストラン硫酸、５０％のホルムアミド、及び例えば０．３ｍｇ／ｍＬのサケ精液ＤＮＡ又は０．１ｍｇ／ｍＬのＣＯＴ１ ＤＮＡを含みうる。他の典型的なハイブリダイゼーション溶液は、４０％ホルムアミド、１０％のデキストラン硫酸、３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、ブロッキングＰＮＡ又はＣＯＴ−１ ＤＮＡを含み得、ある場合には０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ（ＴＨＤ）を含みうる。
本発明の組成物は、上述の伝統的なハイブリダイゼーション溶液の成分の何れかを少なくとも一種の極性非プロトン溶媒と組み合わせて含有するハイブリダイゼーション溶液を含みうる。伝統的な成分は伝統的なハイブリダイゼーション溶液において使用されるものと同じ濃度で存在し得、又はより高いかもしくはより低い濃度で存在し得、あるいは完全に省かれてもよい。
例えば、本発明の組成物がＮａＣｌ及び／又はリン酸バッファーを含む場合、それらは、０−１２００ｍＭのＮａＣｌ及び／又は０−２００ｍＭのリン酸バッファーの濃度で存在しうる。ある実施態様では、塩の濃度は、例えば３００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのリン酸バッファー、又は６００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのリン酸バッファーでありうる。
本発明の組成物がデキストラン硫酸、グリコール、又はＤＭＳＯのような促進剤を含む場合、デキストラン硫酸は５％から４０％の濃度で存在し得、グリコールは０．１％から１０％の濃度で存在し得、ＤＭＳＯは０．１％から１０％でありうる。ある実施態様では、デキストラン硫酸の濃度は１０％又は２０％であり得、エチレングリコール、１，３プロパンジオール、又はグリセロールの濃度は１％から１０％でありうる。ある実施態様では、ＤＭＳＯの濃度は１％でありうる。ある実施態様では、水性組成物は促進剤としてＤＭＳＯを含まない。ある実施態様では、水性組成物は促進剤としてホルムアミドを含まず、又はホルムアミドを含むが、但し、１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満である。
本発明の組成物がクエン酸を含む場合、濃度は１ｍＭから５０ｍＭの範囲であり得、ｐＨは５．０から８．０の範囲であり得る。ある実施態様では、クエン酸の濃度は１０ｍＭ及びｐＨは６．２でありうる。
本発明の組成物は、例えば細胞膜への非特異的結合を減少させる薬剤、例えばサケ精液又は少量の全ヒトＤＮＡを含み得、又は例えばそれらは標的への例えば反復配列の結合をブロックするためのブロッキング剤、例えば多量の全ヒトＤＮＡ又はリピートリッチ化ＤＮＡ又は特異的ブロッキング剤、例えばＰＮＡ又はＬＮＡ断片及び配列を含みうる。これらの薬剤は０．０１−１００μｇ／μＬ又は０．０１−１００μＭの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、これらの薬剤は０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ、又は０．１μｇ／μＬの非ヒトＤＮＡ、例えばニシン精液、サケ精液、又はウシ胸腺ＤＮＡ、又は５μＭのブロッキングＰＮＡであろう。
本発明の一態様はハイブリダイゼーションに使用される組成物又は溶液である。本発明において使用される組成物は、核酸配列及び二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含む水性組成物を含む。二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量がハイブリダイゼーションを可能にする量である。例えば、極性非プロトン溶媒の量がハイブリダイゼーションを可能にするのに有効かどうかを試験する一方法は、実施例１のようにここに記載のハイブリダイゼーション方法及び組成物に使用される場合、極性非プロトン溶媒が検出可能なシグナル及び／又は増幅された核酸産物を生じるかどうかを決定することである。
極性非プロトン溶媒の有効量の非限定的な例は、例えば約１％から約９５％（ｖ／ｖ）を含む。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は５％から６０％（ｖ／ｖ）である。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は１０％から６０％（ｖ／ｖ）である。更に他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は３０％から５０％（ｖ／ｖ）である。１％から５％、５％から１０％、１０％、１０％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、又は５０％から６０％（ｖ／ｖ）の濃度がまた適切である。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒は０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、又は２０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。
一又は複数の核酸プローブが本発明の組成物に存在する場合、上に記載したように、プローブは直接的に検出可能な化合物（例えば酵素、発色団、蛍光色素、及びハプテン）で間接的に標識されうる。ＤＮＡプローブは０．１から１００ｎｇ／μＬの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、プローブは１から１０ｎｇ／μＬの濃度で存在しうる。ＰＮＡプローブは０．５から５０００ｎＭの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、プローブは５から１０００ｎＭの濃度で存在しうる。
一実施態様では、本発明の組成物は、４０％の極性非プロトン溶媒（ｖ／ｖ）（例えばエチレンカーボネート、「ＥＣ」）、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、及び１−１０ｎｇ／μＬプローブの混合物を含有する。本発明の他の例示的な組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、及び０．１μｇ／μｌの全ヒトＤＮＡの混合物を含有する。更に他の例示的な組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ｐＨ６．２、及び０．１μｇ／μＬの非ヒトＤＮＡ（例えばニシン精子、サケ精液、又はウシ胸腺）又は０．５％ホルムアミド又は１％のグリコール（例えばエチレングリコール、１，３プロパンジオール、又はグリセロール）を含む。
（ｂ）極性非プロトン溶媒
異なった極性非プロトン溶媒は本発明の組成物に異なった性質を付与しうる。例えば、極性非プロトン溶媒の選択は、ある種の極性非プロトン溶媒は経時的に分解しうるので、組成物の安定性に寄与しうる。例えば、極性非プロトン溶媒のエチレンカーボネートは比較的安定な分子であるエチレングリコールと、水と相互作用して炭酸を形成しうる二酸化炭素に分解し、本発明の組成物の酸性を変える。理論に拘束されるものではないが、エチレンカーボネートの分解時のｐＨ変化は本発明の組成物をハイブリダイゼーションに対して効果的ではないものにすると思われる。しかしながら、安定性は、典型的には約ｐＨ７．４で使用される伝統的なリン酸バッファーの代わりにｐＨ６．２のバッファーとしてクエン酸を添加し、及び／又は例えば０．１％から１０％、又は０．５％から５％、例えば１％、２％、３％等の濃度でエチレングリコールを添加することにより、組成物のｐＨを減少させることによって改善することができる。例えば、１０ｍＭのクエン酸バッファーでは、本発明の組成物はおよそ８ヶ月の間、２−８℃で安定している。安定性はまた組成物を低い温度（例えば−２０℃）に保存すると、改善されうる。
また、ある種の極性非プロトン溶媒は、ある条件下で本発明の組成物を多相系に分離せしめうる。多相系が得られる条件は、異なった極性非プロトン溶媒に対して異なりうる。しかしながら、一般に、極性非プロトン溶媒の濃度が増加すると、相の数が増加する。例えば、低濃度のエチレンカーボネート（つまり、２０％未満）を含む組成物は一相として存在しうるが、より高濃度のエチレンカーボネートを含有する組成物は二、又は三相にさえ分離しうる。例えば、１５％のエチレンカーボネートを半有する組成物は室温で単一相として存在するが、４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物は室温で粘性のある下相（全容量のおよそ２５％）と粘性の少ない上相（全容量のおよそ７５％）からなる。
他方、ある種の極性非プロトン溶媒は低濃度においてさえ二相で存在しうる。例えば、スルホラン、γ−ブチロラクトン、エチレントリチオカーボネート、グリコールサルファイト、及びプロピレンカーボネートは、室温で１０、１５、２０、又は２５％（２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸バッファー）の濃度で二相として存在する。
本発明の組成物の温度を調節することにより相の数を変更することもまたできうる。一般に、温度が上昇すると、相の数は減少する。例えば、２−８℃では、４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物は三相系に分離しうる。
組成物中のデキストラン硫酸及び／又は塩の濃度を調節することにより相の数を変更することもまたできうる。一般に言えば、デキストラン硫酸濃度（伝統的な濃度が１０％である）及び／又は塩濃度の低下は相の数を減少させうる。しかしながら、組成物中の特定の極性非プロトン溶媒及びその濃度に応じて、単一相をたとえ高濃度の塩及びデキストラン硫酸ででも製造できる。例えば、低量のＥＣ（例えば１５％、１０％、５％）を含有する組成物は、デキストラン硫酸及び塩濃度を増加させることにより、一相系を尚維持しながら、良好に作用しうる。特定の実施態様では、ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ、ＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのリン酸バッファーを含有する組成物は、たとえ−２０℃でさえ一相として存在する。他の実施態様では、組成物は−２０℃で液体である。
ある極性非プロトン溶媒は、ある相又は他の相に強いシグナルを生じうる。例えば、４０％のグリコールサルファイトは下相に強いシグナルを生じ、上相にシグナルを生じない。同様に、あるタイプのプローブはある相又は他の相に強いシグナルを生じうる。例えば、ＰＮＡプローブは上相より下相に強いシグナルを示す傾向がある。
従って、本発明の多相系は、試料の異なった側面を簡便に検査するために使用することができる。例えば、二相系を使用して、ＤＮＡプローブで標識された試料からＰＮＡプローブで標識された試料を分離することができよう。他には、単離された相が単一相系として使用できるようなある種のハイブリダイゼーションの利点を示す特定の相の単離が含まれる。プローブ及び／又は試料は特定の相の単離の前、又は後に加えることができる。
ハイブリダイゼーションは、本発明の一相組成物を用いて、本発明の多相組成物の個々の相を用いて、又は本発明の多相組成物中の相の何れか一又は複数の混合物で実施されうる。例えば、一相系では、ある容量の試料がハイブリダイゼーションにおいて使用するために抽出されうる。多相系では、ハイブリダイゼーションに使用するために関心のある相（例えば上、下、又は中間相）からある容量の試料を抽出することができる。あるいは、多相系中の相を、ハイブリダイゼーションでの使用に対して混合試料のある容量を抽出する前に混合することができる。しかしながら、多相系は、組成物に応じて、強く不均等な局所的バックグラウンド染色を生じうる。低量のホルムアミドの添加は一相系におけるバックグラウンドを低減させる一方、高濃度（例えば４０％）の極性非プロトン溶媒を含む多相系には殆ど効果がない。また、ホルムアミドの濃度が増加するにつれて、より高濃度のプローブ及び／又はより長いハイブリダイゼーション時間が強いシグナル強度を維持するために必要とされる。
（ｃ）特定の応用に対する最適化
本発明の組成物は、特定の応用に対して結果を最適化するために変更しうる。例えば、極性非プロトン溶媒、塩、促進剤、ブロッキング剤、及び水素イオン（つまりｐＨ）の濃度を、特定の応用に対する結果を改善するために変更しうる。
例えば、極性非プロトン溶媒の濃度を、シグナル強度及びバックグラウンド染色を改善するために変更しうる。一般に、極性非プロトン溶媒の濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加し、バックグラウンド染色が減少する。例えば、１５％のＥＣを含有する組成物は、５％のＥＣを含有する組成物より強いシグナルと少ないバックグラウンドを示す傾向がある。しかしながら、シグナル強度は、塩及び／又はデキストラン硫酸の濃度が増加させられる場合、低濃度の極性非プロトン溶媒（例えば０％から２０％）を有する組成物に対して改善されうる。例えば、塩濃度が伝統的な塩濃度（つまり、およそ１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸バッファー）のおよそ８から１６倍上昇させられると、５％から１０％のＥＣで強いシグナルが観察されうる。同様に、低濃度の極性非プロトン溶媒が使用されると、高濃度のデキストラン硫酸が良好なシグナル及びバックグラウンド強度を維持するために一般に必要とされる。
従って、塩及びデキストラン硫酸の濃度を、シグナル強度及びバックグラウンド染色を改善するためにまた変更しうる。一般に、塩及びデキストラン硫酸の濃度が増加すると、シグナル強度が増加し、バックグラウンドが減少する。例えば、伝統的な濃度（つまり３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー）のおよそ２から４倍の塩濃度は、強いシグナルと低いバックグラウンドを生じる。しかしながら、驚いたことに、ハイブリダイゼーションは、たとえ塩が完全に存在しない場合にでも本発明の組成物を使用して生じる。シグナル強度は、促進剤及び／又は極性非プロトン溶媒の濃度を増加させることによって非塩条件下で改善することができる。
同様に、シグナル強度は、デキストラン硫酸濃度が０％から２０％まで増加すると増加する。しかしながら、良好なシグナルは０％のデキストラン硫酸濃度においてさえ観察されうる。シグナル強度は、極性非プロトン溶媒及び／又は塩濃度を増加させることによって低デキストラン硫酸条件下で改善することができる。
また、本発明の組成物において使用されるプローブのタイプを、結果を改善するために変更しうる。例えば、本発明のある態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡプローブの組合せが、本発明の組成物におけるＤＮＡ／ＰＮＡプローブの組合せより少ないバックグラウンドを示し得、又はその逆もしかりである。他方、ＰＮＡプローブは、低塩及び／又は低極性非プロトン溶媒濃度下でＤＮＡプローブよりも強いシグナルを示す傾向がある。実際、ＰＮＡプローブは極性非プロトン溶媒が存在しない場合にもシグナルを示す一方、ＤＮＡプローブは、極性非プロトン溶媒がないと弱いシグナルを示すかシグナルを示さない。
ＩＩ．キット
本発明はまた本発明の組成物を含むキットを提供する。よっって、キットは、一又は複数の 分子プローブ(上に詳細に記載)及び水性組成物 (上に詳細に記載)を含みうる。一実施態様では、プローブは直ぐには可視化されず（例えばフルオロフォア又は発色団で標識されていないため）、キットは、可視化試薬、例えば抗体（モノクローナルであってよく、検出可能な標識で標識されていてもよい）、蛍光発生又は発色性酵素基質、ストレプトアビジンコンジュゲート、又は当業者に知られている任意の他の適切な可視化試薬を更に含む。
一実施態様では、キットは、染色体異常を検出するために使用されうる他の試薬及び／又は組成物を更に含む。一実施態様では、キットはプロテアーゼ、例えばペプシン又は又はプロテイナーゼＫを更に含みうる。一実施態様では、キットは、一又は複数の前処理溶液、プロテアーゼ、ストリンジェントな洗浄バッファー、蛍光マウント培地、洗浄バッファー、シグナル増幅溶液、及びカバーガラスシーラントを更に含みうる。例えば、一実施態様では、細胞診ＦＩＳＨキットは、一又は複数の洗浄バッファー、ストリンジェントなバッファー、蛍光マウント培地、及びカバーガラスシーラントを更に含みうる。一実施態様では、組織診断ＦＩＳＨキットは、一又は複数の前処理溶液、ペプシン、洗浄バッファー、ストリンジェントなバッファー、蛍光マウント培地、及びカバーガラスシーラントを更に含みうる。一実施態様では、ＣＩＳＨキットは、ペルオキシダーゼブロック、ＣＩＳＨ抗体ミックス、レッド基質バッファー、ブルー基質バッファー、レッド色素原、及びブルー色素原を更に含みうる。別の実施態様では、キットは指示書を更に含みうる。
ＩＩＩ．応用、方法及び用途
本発明は、染色体異常の検出、疾患の診断、治療処置の進行のモニタリング、治療を完了した患者の疾患再発に対するモニタリングのために上述の組成物及びキットを使用する方法を更に提供する。一般に、かかる方法は下記のハイブリダイゼーション条件の一又は複数を使用する。
例えば、本発明は本発明の組成物を使用して染色体異常を検出する方法を提供する。検出は、診断、適切な治療の選択、及び／又は疾患再発についての患者のモニタリングに関連しうる。一実施態様では、本発明は染色体異常が核酸配列中に存在するかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、
− 染色体異常を検出する分子プローブを提供し、
− 核酸配列を提供し、
− １％（ｖ／ｖ）から９５％（ｖ／ｖ）の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物を提供し、
− 分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、分子プローブ及び核酸配列及び水性組成物を組合せ、
− 分子プローブが核酸配列にハイブリダイズしたかどうかを決定し、
それによって、染色体異常が核酸中に存在するかどうかを決定することを含む。
他の実施態様では、本発明は染色体異常が核酸配列中に存在するかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、
− 核酸配列を提供し、
− 分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、染色体異常を検出する分子プローブと1% (v/v)から95% (v/v)の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物を上記核酸に適用し、
− 分子プローブが核酸配列にハイブリダイズしたかどうかを決定し、
それによって、染色体異常が核酸中に存在するかどうかを決定することを含む。
他の実施態様では、本発明は染色体異常が核酸配列中に存在するかどうかを決定する方法を提供し、該方法は、
− 核酸配列を提供し
− 分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、少なくとも一種の極性非プロトン溶媒と染色体異常を検出する分子プローブを含有する水性組成物を上記核酸に適用し、
− 分子プローブが核酸配列にハイブリダイズしたかどうかを決定し、
それによって、染色体異常が核酸中に存在するかどうかを決定することを含む。
本発明は、染色体異常に関連した先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断する方法であって、
− 患者からの組織試料を提供し、ここで、組織試料は核酸配列を含み、
− 本発明の方法に従って、染色体異常が核酸配列中に存在するかどうかを決定し、
− 染色体異常が組織試料中に存在する場合に先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断することを含む方法を提供する。
一実施態様では、本発明の方法は特定の治療から患者が恩恵を受けるかどうかを決定するために使用されうる。例えば、ＨＥＲ２が増幅されている乳癌患者はハーセプチンＴＭ（トラスツズマブ）での治療から恩恵を受け得、ＥＧＦＲが過剰発現している結腸直腸癌患者はアービタックス（登録商標）（セツキシマブ）又はベクチビックスＴＭ（パニツムマブ）での治療から恩恵を受けうる。
一実施態様では、本発明の方法は疾患進行又は寛解をモニターするために使用されうる。別の実施態様では、本発明の方法は患者の予後を評価するために使用されうる。例えば、本発明の方法は、患者の予後を評価するために、臨床病理学的データと併せて使用されうる。一実施態様では、該方法はＨＥＲ２遺伝子増幅の存在を決定するために使用され、またステージＩＩのリンパ節陽性乳癌患者に予後を提供するためにその情報を使用することができる。ＴＯＰ２Ａ欠失又は増幅の存在はまた乳癌患者の予後を評価するために使用されうる。
Ａ．分析試料
本発明の方法及び組成物は、細胞診、組織診断、又は分子生物学の分野における全てのタイプのハイブリダイゼーション用途において完全に又は部分的に使用されうる。一実施態様によれば、本発明の方法における第一又は第二の核酸配列が生物学的試料中に存在する。かかる試料の例は、組織試料、細胞調製物、細胞断片調製物、及び単離された又はリッチ化された細胞成分調製物を含む。試料は、様々な組織、例えば乳房、結腸直腸、前立腺、肺、頭頸部、胃、膵臓、食道、肝臓、及び膀胱、又は他の関連する組織及びその腫瘍、任意の細胞懸濁液、血液試料、細針生検、腹水、痰、腹膜洗浄液、尿、糞便、細胞掻爬、細胞スミア、サイトプシン又は細胞プレップ細胞から由来しうる。
試料は標準的なプロトコルを使用して単離され、プロセシングされうる。細胞断片調製物は、例えば細胞ホモジナイズ、凍結融解処理又は細胞溶解により得ることができる。単離された試料は、試料を得る目的に応じてまた部位に常套的な手段に応じて、多くの異なった方法で処理されうる。しばしば、試料は後での試料分析のために組織を保存するために様々な試薬を用いて処理され、あるいは、試料は直接分析されうる。試料を保存するために広く使用されている方法の例は、ホルマリン固定とそれに続くパラフィン包埋及び凍結保存である。
細胞診は生物学的試料からの個々の細胞及び／又は染色体スプレッドの検査を含む。試料の細胞診は、細胞の検体を得ることで始まり、これは、典型的には、頸部検体の場合におけるように、擦過し、拭き取り、又は領域をブラシでこすることにより、又は胸部腔、 膀胱、又は脊柱から得られるもののように、体液を集めることにより、又は内部の腫瘍の場合のように、穿刺吸引又は細針生検により、なすことができる。一般的な手作業での細胞調製では、試料は液体懸濁材料に移され、液体中の細胞がついで直接又は遠心分離ベースのプロセシング工程によってガラス顕微鏡スライド上へ検査のために移される。典型的な自動化された細胞調製では、フィルターアセンブリが液体懸濁液に配され、フィルターアセンブリが細胞を分散させると共にフィルター上の細胞を捕捉する。ついで、フィルターを除去し、顕微鏡スライドに接触させて位置させる。ついで、細胞を、以下で検討する技術の何れかによる分析前に顕微鏡スライドに固定する。
分裂中期スプレッドでは、細胞培養物を、一般に、コルセミド、又は他の適切な紡錘極破壊剤で処理して、分裂中期における細胞サイクルを停止させる。ついで、細胞を固定し、顕微鏡スライド上に染みつけ、ホルムアルデヒドで処理し、洗浄し、エタノールで脱水する。ついで、プローブを加え、以下に検討する技術の何れかによって試料を分析する。
細胞試料を使用する伝統的なハイブリダイゼーション実験では、検体を含むスライドをホルムアルデヒドバッファー中に浸漬し、洗浄し、ついでエタノールで脱水する。ついで、プローブを加え、検体をカバーガラスで覆う。スライドを検体中の任意の核酸を変性させるのに十分な温度でインキュベートした後（例えば８２℃で５分）、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度でインキュベートする（例えば４５℃で一晩）。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを取り除き、検体に高ストリンジェントな洗浄（例えば６５℃で１０分）と続く一連の低ストリンジェントな洗浄（例えば室温で２×３分）を施す。ついで、試料を脱水し、分析のためにマウントする。
組織診断は組織の薄いスライス中の細胞の検査を含む。組織検査のための組織試料を調製するには、組織片を適切な固定液、典型的にはアルデヒド、例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドで固定し、ついで、融解パラフィンロウに包埋する。ついで、組織試料を含むロウブロックをミクロトームで切断し、典型的には２から１０ミクロン厚の組織を含む薄いパラフィンスライスを得る。ついで、検体スライスを顕微鏡スライドに適用し、空気乾燥させ、加熱して、検体をガラススライドに付着させる。ついで、残留パラフィンを適切な溶媒、典型的にはキシレン、トルエン又は他のもので溶解させる。ついで、これらのいわゆる脱パラフィン化溶媒を、以下に検討される技術の何れかによる試料の分析の前に、洗浄-脱水タイプの試薬を用いて除去する。別法では、スライスを凍結検体から調製し、１０％ホルマリン又は他の適切な固定液に簡単に固定し、ついで試料の分析前に脱水試薬を注入する。
組織試料を使用する伝統的なハイブリダイゼーション実験では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織検体を２−６μｍの切片に切断しスライド上に集める。パラフィンを溶かし（例えば６０℃で３０−６０分）、ついでキシレン（又はキシレン代替物）で、例えば２×５分洗浄することによって除去（脱パラフィン化）する。試料を再水和させ、洗浄し、ついで前処理する（例えば９５−１００℃で１０分）。スライドを洗浄し、ついでペプシン又は他の適切な透過剤で、例えば３７℃で３−１５分、処理する。スライドを洗浄し（例えば２×３分）、脱水し、プローブを適用する。検体をカバーガラスで覆い、スライドを検体中の任意の核酸を変性させるのに十分な温度でインキュベートした後（例えば８２℃で５分）、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度でインキュベートする（例えば４５℃で一晩）。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを取り除き、検体に高ストリンジェントな洗浄（例えば６５℃で１０分）と続く一連の低ストリンジェントな洗浄（例えば室温で２×３分）を施す。ついで、試料を脱水し、分析のためにマウントする。
Ｂ．ハイブリダイゼーション技術
本発明の組成物及び方法は、細胞及び組織試料に対して当該分野で知られている全てのタイプの核酸ハイブリダイゼーション技術において完全に又は部分的に使用することができる。かかる技術は、例えばインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；多色ＦＩＳＨ，Ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ等を含む）、発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、染色体彩色、及びアレイインサイツを含む。
一般に、ＣＧＨ、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのようなハイブリダイゼーション技術は、細胞の染色体中の遺伝子又は遺伝子断片に変動するストリンジェンシーでハイブリダイズする大きな主に特定されない核酸プローブを用いる。かかるプローブは、コズミッククローン、ＹＡＣクローン、又は他のクローン化ＤＮＡ断片から誘導されうる。大きなプローブの使用はインサイツハイブリダイゼーション技術を非常に高感度なものにする。しかしながら、伝統的なハイブリダイゼーションアッセイにおける大きなゲノムプローブの使用の成功は、ゲノム中に存在している例え名反復配列から誘導された望まれないバックグラウンド染色をブロックすることに依存している。かかるブロッキング工程は時間を費やし高価である。ここで検討されるように、本発明の方法及び組成物は、有利なことに、かかるブロッキング工程の必要性を減少させ及び／又は排除する。しかしながら、一実施態様では、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に開示されているように、当該分野で知られている方法によって反復配列を抑制することもできる。
結合したプローブは、細胞及び組織試料中において直接的に又は蛍光色素（例えばＦＩＳＨ）、有機色素原（例えばＣＩＳＨ）、銀粒子（例えばＳＩＳＨ）、又は他の金属粒子（例えば金支援蛍光インサイツハイブリダイゼーション、ＧＯＬＤＦＩＳＨ）で間接的に検出することができる。よって、検出方法に依存して、試験される試料から得られた細胞集団は蛍光顕微鏡又は一般的な明視野光学顕微鏡を介して可視化されうる。
細胞及び組織試料でのハイブリダイゼーションアッセイは、特異的ＤＮＡ配列の数、サイズ、及び／又は位置を決定するための重要なツールである。例えば、ＣＧＨでは、全ゲノムが染色され、異常なコピー数の領域の検出に対して、正常な参照ゲノムと比較される。典型的には、患者組織及び正常なコントロール組織からのＤＮＡが異なった色のプローブで標識される。ＤＮＡのプールが混合され、正常な染色体の分裂中期スプレッドに（又はアレイ−又はマトリックス−ＣＧＨでは、マイクロアレイチップに）加えられる。ついで、異常なコピー数を持つ領域を同定するために色の比が比較される。
ＦＩＳＨは、典型的には、複数のカラー画像処理が必要とされるとき、及び／又はプロトコルがシグナルの定量を求めるときに使用される。該技術は、一般に、細胞試料を調製し、プローブを標識し、標的染色体及びプローブを変性させ、プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、及びシグナルを検出することを必要とする。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、標的にされた配列を蛍光的に染色する結果、その位置、サイズ、又は数を、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は他の適切な機器を使用して決定することができる。全ゲノムから数キロベースの範囲のＤＮＡ配列を、ＦＩＳＨを使用して研究することができる。ＦＩＳＨはまた分裂中期スプレッド及び静止期核について使用することもできる。
ＦＩＳＨは、分裂中期染色体、静止期核、クロマチン線維、及びネイキッドＤＮＡ分子上の反復及び単一コピーＤＮＡのマッピングに対して、また大きな反復ファミリー、典型的にはリボソームＤＮＡ及び主要なタンデムアレイファミリーの局在化を通しての染色体同定及び核型解析に対して成功裏に使用されている。ＦＩＳＨの最も重要な応用の一つは、単一コピーＤＮＡ配列、特にヒト及び他の真核生物モデル種における疾患関連遺伝子の検出、及び感染薬剤の検出にあった。ＦＩＳＨは、例えば出生前診断における染色体異数性、血液学的癌、及び固形腫瘍；遺伝子異常性、例えば癌遺伝子増幅、遺伝子欠失、又は遺伝子融合；染色体構造異常性、例えば転座、複製、挿入、又は逆位；近接遺伝子症候群、例えば微小欠失症候群；様々な治療法の遺伝子効果；体細胞におけるウイルス核酸及び染色体中のウイルス組込み部位等々を検出するために使用することができる。
多色ＦＩＳＨでは、各染色体が別個の色で染色され、異常な染色体が誘導された正常な染色体を決定することが可能になる。かかる技術は、多重ＦＩＳＨ(m-FISH; Speicher等 Nat. Genet., 12:368-75 (1996))、スペクトル核型決定 (SKY; Schrock等, Science, 273:494-97 (1996)), 結合バイナリーレーション標識(combined binary ration labeling)(COBRA; Tanke等, Eur. J. Hum. Genet., 7:2-11 (1999)), 色変化核型決定(Henegariu等, Nat. Genet., 23:263-64 (1999)), 異種間 色バンド形成(Muller等, Hum. Genet., 100:271-78 (1997)), 高分解能多色バンド形成(Chudoba等, Cytogenet. Cell Genet., 84:156-60 (1999)), テロメア多重ＦＩＳＨ(TM-FISH; Henegariu等, Lab. Invest., 81:483-91 (2001)), スプリットシグナルＦＩＳＨ（ｓｓＦＩＳＨ）、及びヒュージョンシグナルＦＩＳＨを含む。ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨは、ＦＩＳＨと同じ用途の多くに使用することができ、例えば病理組織学的用途において、根底にある組織形態の分析を可能にするという更なる利点を有している。
本発明の組成物はまたブロッティング及びプロービング（例えばサザン、ノーザン等）、アレイ、及び伝統的なＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、変異ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、及びインサイツＰＣＲを含む増幅技術を含むハイブリダイゼーションを含む分子生物学技術の全てのタイプにおいて完全に又は部分的に使用することができる。インサイツＰＣＲは、スライド上の細胞、例えば上述の細胞診及び組織診断試料の内部で起こるポリメラーゼ連鎖反応である。典型的には、試料を顕微鏡スライドに接着させた後、細胞を再水和させ、透過させ、ついで ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、及びプライマーを含むＰＣＲ試薬の適切な混合物と組み合わせる。ＰＣＲは、例えばＧｅｎｅＡｍｐインサイツＰＣＲシステム１０００（Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA）のような専用の機器で実施することができ、増幅された産物は、標識プローブを使用し又は増幅中に標識ｄＮＴＰｓを導入することにより検出されうる。本発明の組成物は、増幅サイクルを実施するために必要とされる変性及びハイブリダイゼーション温度及び／又は時間を減少させることにより、伝統的なインサイツＰＣＲ解析の効果を改善する。
Ｃ．ハイブリダイゼーション条件
本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション方法は、殆どは二本鎖の形態である標的核酸配列を含む試料に組成物を適用することを含みうる。通常、標的配列とハイブリダイズするプローブへのアクセスを確保するために、試料及び組成物を加熱して標的核酸を変性させる。変性中、極性非プロトン溶媒は配列と相互作用し、標的の変性と標的に対するプローブの再アニーリングを容易にする。本発明において特定された極性非プロトン溶媒は、このプロセスをかなり速くし、ホルムアミドと比較してハイブリダイゼーション条件の厳しさ及び毒性を低減する。
本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーションは、伝統的な溶液で実施されるハイブリダイゼーションと同じアッセイ法を使用して実施することができる。しかしながら、本発明の組成物は、より短いハイブリダイゼーション時間を可能にする。例えば、加熱前処理、消化、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄、及びマウント工程は、容積、温度、試薬及びインキュベーション時間について伝統的な溶液に対してと同じ条件を使用することができる。当該分野で知られている伝統的なハイブリダイゼーションプロトコルには多大な変形例が存在する。例えば、あるプロトコルは、次のハイブリダイゼーション工程の前に、プローブの存在なしで、潜在的な二本鎖ヌクレオチドの別個の変性工程を特定する。本発明の組成物は、当該分野で知られている伝統的なハイブリダイゼーションプロトコルの任意のものにおいて使用することができる。
別法では、本発明の組成物を使用するアッセイは、例えばハイブリダイゼーション時間を減少させ、変性及び／又はハイブリダイゼーション温度を増加又は減少させ、及び／又はハイブリダイゼーション体積を増加又は減少させることによって、伝統的な方法から変化せしめられ得、最適化されうる。
例えば、ある実施態様では、本発明の組成物は、変性温度が６０から１００℃であり、ハイブリダイゼーション温度が２０から６０℃である場合に、強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性温度が６０から７０℃、７０から８０℃、８０から９０℃又は９０から１００℃であり、ハイブリダイゼーション温度が２０から３０℃、３０から４０℃、４０から５０℃、又は５０から６０℃のときに強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性温度が７２、８２、又は９２℃であり、ハイブリダイゼーション温度が４０、４５、又は５０℃であるとき、強いシグナルを生じる。
他の実施態様では、本発明の組成物は、変性時間が０から１０分で、ハイブリダイゼーション時間が０分から２４時間のとき強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性時間が０から５分で、ハイブリダイゼーション時間が０分から８時間のとき、強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性時間が０、１、２、３、４、又は５分で、ハイブリダイゼーション時間が０分、５分、１５分、３０分、６０分、１８０分、又は２４０分であるときに強いシグナルを生じる。例えばＲＮＡ検出のような、ある場合には、変性工程が必要とされないことは当業者には理解されるであろう。
従って、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーションは、８時間未満で実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、６時間未満で実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、４時間以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、３時間以内に実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、２時間以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、１時間以内に実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、３０分以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは１５分以内に生じうる。ハイブリダイゼーションは１０分以内又は５分未満でさえ生じうる。図１及び２は、伝統的な溶液を使用するハイブリダイゼーションと比較して、本発明の組成物を使用して、組織及び細胞試料それぞれについて実施したハイブリダイゼーションの典型的な時間経過を例証している。
ハイブリダイゼーション時間が変化すると、プローブの濃度はまた強いシグナルを生じさせ及び／又はバックグラウンドを減少させるために変更されうる。例えば、ハイブリダイゼーション時間が減少すると、シグナル強度を改善するためにプローブの量が増加させられうる。他方、ハイブリダイゼーション時間が減少すると、バックグラウンド染色を改善するためにプローブの量が減少させられうる。
本発明の組成物は、驚いたことに、標的ＤＮＡに対する例えば反復配列の結合をブロックすることによってシグナル及びバックグラウンド強度を改善することにより、ハイブリダイゼーション中のブロッキング工程の必要性を除去する。よって、ブロッキング剤として全ヒトＤＮＡ、ブロッキング−ＰＮＡ、ＣＯＴ−１ ＤＮＡ、又は任意の起源由来のＤＮＡを使用する必要性はない。しかしながら、バックグラウンドレベルを、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション反応に、少量の全ヒトＤＮＡ又は非ヒト由来ＤＮＡ（例えばサケ精液ＤＮＡ）のような、例えば細胞膜への非特異的結合を減少させる薬剤を添加することによって、更に低減させることができる。
本発明の水性組成物は、組成物に含められる核酸配列の濃度をかなり低減させる可能性を更にもたらす。一般に、プローブの濃度は、伝統的な濃度と比較して２から８倍、減少されうる。例えば、ＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ及びＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブが本発明の組成物において使用される場合、その濃度は、伝統的なハイブリダイゼーション溶液中におけるその濃度と比較して、それぞれ１／４及び１／２減少されうる。この特徴は、ブロッキング−ＰＮＡ又はＣＯＴ１のようにＤＮＡブロッキングの必要性がない点と共に、伝統的な組成物系において使用される伝統的な１０μＬ体積と比較して自動化機器システムにおいて増大されたプローブ体積を可能にし、これが、以下に更に詳細に検討されるように、蒸発による損失を低減させる。
プローブ濃度の減少はまたバックグラウンドを減少させる。しかしながら、プローブ濃度の減少はハイブリダイゼーション時間に逆に相関する、つまり、濃度が低くなると、必要とされるハイブリダイゼーション時間が長くなる。にもかかわらず、極端に低濃度のプローブが本発明の水性組成物と共に使用されたときでさえ、ハイブリダイゼーション時間は伝統的な溶液の場合よりも尚短い。
本発明の組成物はしばしば伝統的なハイブリダイゼーション溶液よりも良好なシグナル・ノイズ比を可能にする。例えば、ある種のプローブでは、本発明の組成物での一時間のハイブリダイゼーションは、伝統的な溶液での一晩のハイブリダイゼーションと同様のバックグラウンドとより強いシグナルを生じる。バックグラウンドはプローブが添加されない場合は見られない。
伝統的なアッセイ法は、システムがマニュアルか、半自動か、又は自動化されているかどうかに応じて、本発明の組成物を使用するときに、また変更され、最適化されうる。例えば、半自動又は自動化システムは、本発明の組成物で得られた短いハイブリダイゼーション時間から恩恵を受けるであろう。短いハイブリダイゼーション時間は、伝統的な溶液がかかるシステムで使用される場合に遭遇する困難性を低減しうる。例えば、半自動及び自動化システムでの一つの問題は、かかるシステムが小さな試料体積（例えば１０−１５０ｍＬ）、上昇した温度、及び拡張されたハイブリダイゼーション時間（例えば１４時間）を必要とするので、試料の有意な蒸発がハイブリダイゼーション中に起こりうる。よって、伝統的なハイブリダイゼーション溶液中における成分の割合はかなり不変である。しかしながら、本発明の組成物はより速やかなハイブリダイゼーションを可能にするので、蒸発が減少させられ、半自動及び自動化システムにおいて使用されるハイブリダイゼーション組成物における成分割合の柔軟性を増大させる。
例えば、二つの自動化機器を使用して、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーションを実施した。４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物をＰＣＴ出願ＤＫ２００８／０００４３０に開示された装置に使用されており、１５％のエチレンカーボネートを含有する組成物がＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００（Ａｌｏｋａ ＣＯ． ＬＴＤ、Ｊａｐａｎ）で使用されている。本発明の組成物がＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００で使用される場合、該機器は、伝統的な毒性のあるホルムアミドミックスの代わりに水を用いて迅速なＦＩＳＨハイブリダイゼーションを実施することができ、よって安全性を改善し、蒸発を減少させる。米国特許出願公開第２００５／０２８１７１１号に記載されているように、水で湿らされたストリップがＡｌｏｋａ機器の反応ユニット（ハイブリダイゼーションチャンバー）の内方部の蓋に付設される場合は、蒸発はまた更に減少させられる。
自動化された画像解析に伴う他の問題は、必要とされる画像の数、必要とされる保存場所の莫大な量、及び画像を撮るのに必要とされる時間である。本発明の組成物は、伝統的な溶液と比較して非常に強いシグナルを生じせしめることによって課題に対処している。本発明の組成物によって生じせしめられる非常に強いシグナルのため、画像処理を、伝統的な溶液に必要なものよりも低い倍率でなすことができ、尚も検出し、例えばアルゴリズムによって解析できる。焦点面は低い倍率では広くなるので、本発明の組成物は連続試料切片を採取する必要性を低減又は解消する。その結果、本発明の組成物は連続切片が少ないか又は含まず、各画像が大きな面積をカバーするので、全体の画像処理が更に速い。加えて、分析のための全体の時間は、全画像ファイルが小さいので、より速い。
よって、本発明の組成物及び方法は、伝統的なハイブリダイゼーション溶液及び方法に関連する問題の多くを解決する。
本開示は、開示に従う組成物の好ましい実施態様を構成する以下の非限定的実施例を参照してより明確に理解されうる。実施例における以外、又は別の定義がない限り、明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、反応条件等等の量を表す全ての数は、全ての場合に「約」なる用語によって修飾されているものと理解されなければならない。従って、別の定義をしていない限り、次の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、ここで得ることが求められている所望の性質に応じて変動しうる近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する意図ではないが、各数値パラメータは有効桁数及び通常の丸めアプローチに鑑みて解釈されなければならない。
広い範囲を定める数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に記載した数値はできる限り正確に報告している。しかしながら、全ての数値は、その各試験測定に見出される標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差を本来的に含んでいる。以下の実施例は本発明を例証するもので、本発明を限定するものと決して考えてはいけない。
以下、本発明の特定の実施態様を詳細に参照する。本発明をこれら実施態様との関連で説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定まる本発明に含められうる代替物、変形例、及び均等物をカバーすることが意図される。
次の実施例で使用される試薬は、Ｄａｋｏの組織診ＦＩＳＨアクセサリーキット（Ｋ５５９９）及び細胞診ＦＩＳＨアクセサリーキット（Ｋ５４９９）（Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark）からのものである。キットは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織片献体に対するＦＩＳＨ手順を完了させるのに必要なプローブを除く全ての重要な試薬を含んでいる。全ての試料は製造者の記述に従って調製した。Ｄａｋｏハイブリダイザー（S2450, Dako）を消化、変性、及び及びハイブリダイゼーション工程に使用した。
ＦＩＳＨスライドの評価は、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド単一フィルター及びＦＩＴＣ／テキサスレッド二重フィルターを備えたＬｅｉｃａ ＤＭ６０００Ｂ蛍光顕微鏡を使用して、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、及び１００ｘオイル対物下で、ハイブリダイゼーションから一週間以内に実施した。
ＣＩＳＨスライドの評価は、オリンパスＢＸ５１光学顕微鏡を使用して、４ｘ、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、及び６０ｘの対物下で実施した。
以下の実施例において、「デキストラン硫酸」は分子量Ｍｗ＞５０００００のデキストラン硫酸のナトリウム塩（Ｄ８９０６，Ｓｉｇｍａ）を意味する。極性非プロトン溶媒の全ての濃度はｖ／ｖパーセントとして与えられる。ホスフェートバッファーは、ＮａＨ２ＰＯ４，２Ｈ２Ｏ（リン酸ナトリウム二塩基二水和物）及びＮａ２ＨＰＯ４，Ｈ２Ｏ（リン酸ナトリウム一塩基一水和物）を含むリン酸緩衝溶液を意味する。シトレートバッファーは、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７，２Ｈ２Ｏ；１．０６４４８，Ｍｅｒｃｋ）及びクエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７，Ｈ２Ｏ；１．００２４４，Ｍｅｒｃｋ）を含むクエン酸緩衝溶液を意味する。
一般的組織診断ＦＩＳＨ／ＣＩＳＨ手順（実施例１−２０）
ヒト（扁桃腺、乳癌、腎臓及び結腸）由来の切断されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）複数組織アレイ片を有するスライドを、６０℃で３０−６０分べークし、キシレン浴で脱パラフィンし、エタノール浴で再水和させ、ついで、洗浄バッファーに移した。ついで、試料を前処理溶液中で最小９５℃で１０分間前処理し、２×３分洗浄した。ついで、試料を３７℃でペプシンＲＴＵを用いて３分間、消化させ、２×３分洗浄し、一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。ついで、試料を、個々の実験で記載されたようにして１０μＬのＦＩＳＨプローブと共にインキュベートした。ついで、試料を６５℃で１０分ストリンジェントな洗浄によって洗浄した後、２×３分洗浄し、ついで一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドを１５μＬのアンチフェードマウント培地にマウントした。染色が完了したところで、染色スライドのシグナル強度、形態、及びバックグラウンドを評価するために訓練を受けた観察者がスコア付けを実施した。
一般的な細胞診ＦＩＳＨ手順（実施例２１−２２）
分裂中期調製物のスライドを、３．７％のホルムアルデヒドに２分間固定し、２×５分洗浄し、一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。ついで、試料を、個々の実験で記載されたようにして１０μＬのＦＩＳＨプローブと共にインキュベートした。ついで、試料を６５℃で１０分ストリンジェントな洗浄によって洗浄した後、２×３分洗浄し、ついで一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドを１５μＬのアンチフェードマウント培地にマウントした。染色が完了したところで、染色スライドのシグナル強度及びバックグラウンドを評価するために訓練を受けた観察者が、組織片のスコア付けガイドラインに記載されたようにしてスコア付けを実施した。
組織切片のスコア付けガイドライン
シグナル強度は０−３のスケールで評価され、０はシグナルなし、３は強いシグナルとした。細胞／組織構造は０−３スケールで評価し、０は構造なしで核境界なしを意味し、３はインタクトな構造と明確な核境界とした。０と３の間には、観察者がシグナル強度、組織構造、及びバックグラウンドを評価できる０．５離れた更なるグレードがある。
シグナル強度を等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０ シグナルは見られない。
１ シグナル強度は弱い。
２ シグナル強度は中程度である。
３ シグナル強度は強い。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
組織及び核構造を等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０ 組織構造及び核境界は完全に破壊されている。
１ 組織構造及び／又は核境界は乏しい。このグレードは、幾つかの領域が空の核である状況を含む。
２ 組織構造及び／又は核境界が見られるが、核境界は不明瞭である。このグレードは数個の核が空である状況を含む。
３ 組織構造及び核境界は無傷で明瞭である。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
バックグラウンドを等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０ 見られるバックグラウンドは少しないしはない。
１ 幾つかのバックグラウンド。
２ 中程度のバックグラウンド。
３ 高いバックグラウンド。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
実施例１
この実施例は、本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度及び細胞形態を変性温度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％デキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、４０％のホルムアミド（１５５１５−０２６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ（Kirsten Vang Nielsen等, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Chapter 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)を参照）、１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１１４３Ｅ２０，サイズ１９２ｋｂ）。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％デキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート（０３５１９，Ｆｌｕｋａ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１１４３Ｅ２０，サイズ１９２ｋｂ）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを示したように５分間変性し、４５℃で６０分間ハイブリダイズした。
Figure 2011521635
実施例２
この実施例は、本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンド染色をハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のホルムアミド，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で１４時間、４時間、２時間、６０分、３０分、１５分、０分、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例３
この実施例は、異なった極性非プロトン溶媒を有する本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のホルムアミド，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート（ＥＣ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のプロピレンカーボネート（ＰＣ）（５４００１３，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のスルホラン（ＳＬ）（Ｔ２２２０９，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｖ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のアセトニトリル（ＡＮ）（Ｃ０２ＣＩＩＸ，Ｌａｂ−Ｓｃａｎ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＶＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）（Ｂ１０３６０８，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例４
この実施例は、異なった濃度の極性非プロトン溶媒を有する本発明の組成物で処理した試料からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１０−６０％のエチレンカーボネート（標示通り），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＩＧＫ−定常ＤＮＡ遺伝子プローブ（（ＣＴＤ−３０５０Ｅ１５，ＲＰ１１−１０８３Ｅ８；サイズ２２７ｋｂ）及び７．５ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ標識ＩＧＫ−可変遺伝子ＤＮＡプローブ（ＣＴＤ−２５７５Ｍ２１，ＲＰ１１−１２２Ｂ６，ＲＰ１１−３１６Ｇ９；サイズ３５０及び４２９ｋｂ）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例５
この実施例は、ＰＮＡブロッキングを伴う及び伴わない組成物で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンド強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例６
この実施例は本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度をプローブ濃度及びハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，及び１０、７．５、５又は２．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（標記の通り）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で３時間、２時間及び１時間、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例７
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、塩、ホスフェート、及びバッファー濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，（［ＮａＣｌ］，［リン酸バッファー］，［ＴＲＩＳバッファー］結果に示した通り），４０％のエチレンカーボネート，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例８
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度をデキストラン硫酸濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：０、１、２、５、又は１０％のデキストラン硫酸（標記の通り），３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＳＩＬ−ＴＡＬ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１−２７８Ｏ１３；サイズ６７ｋｂ）及び６ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ ＳＩＬ−ＴＡＬ１（ＩＣＲＦｃ１１２−１１２Ｃ１７９４，ＲＰ１１−１８４Ｊ２３，ＲＰ１１−８Ｊ９，ＣＴＤ−２００７Ｂ１８，１３３Ｂ９；サイズ５６０ｋｂ）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
Figure 2011521635
実施例９
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、デキストラン硫酸、塩、ホスフェート、及び極性非プロトン溶媒濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉａ：３４％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉｂ：３４％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉｃ：３４％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩａ：３２％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩｂ：３２％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩｃ：３２％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩａ：３０％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩｂ：３０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩｃ：３０％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶａ：２８％デキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶｂ：２８％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶｃ：２８％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ参照Ｖ：ブロッキングＰＮＡを含むＨＥＲ２ ＰｈａｒｍＤｘプローブミックス（Ｋ５３３１，Ｄａｋｏ）の標準販売バイアル。２０時間の一晩のハイブリダイゼーション。
全組成物は単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、ブロッキングなしでインキュベートしたが、ＦＩＳＨプローブ参照Ｖは、ＰＮＡブロッキングし、２０時間ハイブリダイズした。
Figure 2011521635
実施例１０
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、高塩（４×正常）条件下で極性非プロトン溶媒及びデキストラン硫酸濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：０％のエチレンカーボネート，２９％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：５％のエチレンカーボネート，２７％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：１０％のエチレンカーボネート，２５％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶ（試験せず）：２０％のエチレンカーボネート，２１％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は二つの相を有していた。
Figure 2011521635
実施例１１
この実施例は、本発明の組成物の異なった相で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，８ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び６００ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−１７ ＰＮＡプローブ。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
Figure 2011521635
実施例１２
この実施例は前の実施例と同様であるが、異なったＤＮＡプローブ及びＥＣの代わりにＧＢＬを使用している。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のＧＢＬ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ及び６００ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−１７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
Figure 2011521635
実施例１３
この実施例は、本発明の組成物中の相の数を、極性非プロトン溶媒及びデキストラン硫酸濃度の関数として調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０又は２０％のデキストラン硫酸；３００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのリン酸バッファー；０、５、１０、１５、２０、２５、３０％のＥＣ；１０ｎｇ／μＬのプローブ。
Figure 2011521635
実施例１４
この実施例は、本発明の異なった組成物で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンドをプローブ濃度及びハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度）及び標準濃度のＣＥＮ７ ＦＩＴＣ標識ＰＮＡプローブ（５０ｎＭ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／２）及び標準濃度（５０ｎＭ）のＦＩＴＣ標識ＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び１／２の標準濃度（２５ｎＭ）のＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
組成物Ｉ−ＩＩＩは単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で３時間、２時間及び１時間、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例１５
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度及びバックグラウンドを、ブロッキング剤の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー；２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び標準濃度の１／２の（３００ｎＭ）ＦＩＴＣ標識ＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ。試料は、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション前に、（ａ）なし；（ｂ）０．１μｇ／μＬのＣＯＴ１（１５２７９−０１１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；（ｃ）０．３μｇ／μＬのＣＯＴ１；又は（ｄ）０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡでブロックした。
全ての試料は単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例１６
この実験は、本発明の組成物を使用してバックグラウンド染色を除去する異なった方法を比較する。
全ての組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）、３００ｎＭのＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ（標準濃度の１／２）、及び次のバックグラウンド低減剤の一つを含んでいた：
Ａ）５ｍＭのブロッキング−ＰＮＡ（Kisrsten Vang Nielsen等, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Chapter 10 (Franck Pellestor編）(Nova Science Publishers, Inc. 2006)を参照）
Ｂ）０．１μｇ／μＬのＣＯＴ−１ ＤＮＡ
Ｃ）０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ（ＴＨＤ）（超音波処理未標識ＴＨＤ）
Ｄ）０．１μｇ／μＬの剪断サケ精液ＤＮＡ（ＡＭ９６８０，Ａｍｂｉｏｎ）
Ｅ）０．１μｇ／μＬのウシ胸腺ＤＮＡ（Ｄ８６６１，Ｓｉｇｍａ）
Ｆ）０．１μｇ／μＬのニシン精液ＤＮＡ（Ｄ７２９０，Ｓｉｇｍａ）
Ｇ）０．５％のホルムアミド
Ｈ）２％のホルムアミド
Ｉ）１％のエチレングリコール（１．０９６２１，Ｍｅｒｃｋ）
Ｊ）１％のグリセロール（１．０４０９５，Ｍｅｒｃｋ）
Ｋ）１％の１，３−プロパンジオール（５３３７３４，Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｌ）１％のＨ２Ｏ（コントロール）
全ての試料は単一相として存在していた。プローブを８２℃で５分間、ついでＦＦＰＥ組織片上で４５℃で６０分及び１２０分、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例１７
この実験は、二つの異なった極性非プロトン溶媒を使用する上相及び下相からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレントリチオカーボネート（ＥＴ）（Ｅ２７７５０，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のグリコールサルファイト（ＧＳ）（Ｇ７２０８，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
Figure 2011521635
実施例１８
この実験は一相系を形成する様々な極性非プロトン溶媒の能力を調べる。
全ての組成物は、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、及び１０、１５、２０、又は２５％の次の極性非プロトン溶媒の一つを含んでいた：
スルホラン
γ−ブチロラクトン
エチレントリチオカーボネート
グリコールサルファイト
プロピレンカーボネート
結果： 調べた全ての濃度で極性非プロトン溶媒の全てが使用された組成物において少なくとも２相系をつくり出した。しかしながら、これは、これらの化合物が他の組成物条件下で一相系をつくることができることを排除しない。
実施例１９
この実験は、複数のＦＦＰＥ組織切片に対する発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）解析における本発明の組成物の使用を調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：４．５ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）（ＲＰ１１−６５４Ａ２，ＲＰ１１−２４６Ａ２，ＣＴＰ−２３５５Ｌ２１，ＲＰ１１−１５８Ｇ６，ＲＰ１１−７８０Ｍ２，ＲＰ１１−４８１Ｃ１４；サイズ１０１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：４．５ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）（サイズ１０１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケＤＮＡ精子。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：３００ｎＭの各個々のＦＩＴＣ標識ＰＮＡ ＣＥＮ１７プローブ（標準濃度の１／２）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
全ての試料は、Ｄａｋｏ ＤｕｏＣＩＳＨプロトコル（ＳＫ１０８）及びスプリットプローブの組成物を使用して分析したが、但し、ストリンジェントな洗浄を１０分の代わりに２０分間実施され、ＤｕｏＣＩＳＨレッド色素原工程は使用しなかった。
Figure 2011521635
実施例２０
この実施例は、二つのＤＮＡプローブを持つ本発明の組成物で処理されたＦＦＰＥ組織切片からのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：９ｎｇ／μＬのＩＧＨ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１５１Ｂ１７，ＲＰ１１−１１２Ｈ５，ＲＰ１１−１０１Ｇ２４，ＲＰ１１−１２Ｆ１６，ＲＰ１１−４７Ｐ２３，ＣＴＰ−３０８７Ｃ１８；サイズ６１２ｋｂ）；６．４ｎｇ／μＬのＭＹＣ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（ＣＴＤ−２１０６Ｆ２４，ＣＴＤ−２１５１Ｃ２１，ＣＴＤ−２２６７Ｈ２２；サイズ４１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：９ｎｇ／μＬのＩＧＨ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ；６．４ｎｇのＭＹＣ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ；１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケ精液ＤＮＡ。
Figure 2011521635
実施例２１
この実験は細胞試料での本発明の組成物の使用を調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー；５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／２）及び１／２の標準濃度のＣＥＮ７（２５ｎＭ）。
ＦＩＳＨプローブを、全てブロッキングなしで、分裂中期染色体スプレッド上で８２℃で５分間、ついで４５℃で３０分間、インキュベートした。
Figure 2011521635
典型的にはＲバンド形成を示す伝統的なＩＳＨ溶液と比較して、本発明の組成物では、染色体バンド形成（Ｒバンド形成パターン）は観察されなかった。静止期核及び分裂中期の低い均一な赤いバックグラウンド染色が観察された。
実施例２２
この実施例は、細胞診試料、分裂中期スプレッド上での、ブロッキングを伴い、またブロッキングなしでの、ＤＮＡプローブからのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：６ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤテキサスレッド標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度）（ＣＴＰ−３１６６６Ｋ２０，ＣＴＰ−２３７３Ｎ７；サイズ３０１ｋｂ）及び４．５ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）；１５％ＥＣ、２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：６ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤテキサスレッド標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度）（サイズ３０１ｋｂ）及び４．５ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）；１５％ＥＣ、２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケ精液ＤＮＡ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
Figure 2011521635
再び、染色体バンド（Ｒ−バンドパターン）は本発明の組成物では観察されなかった。加えて、静止期核又は分裂中期染色体のバックグラウンド染色は観察されなかった。
更なる実施態様
実施態様１． （ａ） 染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する第一分子プローブ、
（ｂ）二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、及び
（ｃ）ハイブリダイゼーション溶液
を含有し、ヌクレオチド配列が染色体異常のためのマーカーであり、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない、ハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２． 染色体異常が、異数性、潜在的切断点、挿入、逆位、欠失、複製，遺伝子増幅、再編成、又は転位置である実施態様１に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３． 染色体異常が先天性遺伝子疾患、癌、又は感染症に関連する実施態様１−２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４． 染色体異常が癌に関連する実施態様１−２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様５． 第一分子プローブがＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１２、ＢＣＲ、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＴＶ６、ＦＩＰ１Ｌ１、ＨＥＲ２、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＭＡＬＴ１、ＭＬＬ（ＡＬＬ−１、ＨＴＲＸ１、ＨＲＸ）、ＭＹＣ（ｃ−Ｍｙｃ）、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＩＬ、ＴＣＦ３（Ｅ２Ａ、ＩＴＦ１）、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＲＡＤ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ，テロメア、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３（ＨＯＸ１１Ｌ２、ＲＮＸ）、又はＴＯＰ２Ａを検出する実施態様４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様６． 第一分子プローブが、ＢＡＳＥ、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＤＣＤ、Ｅ２Ｆ３、ｎ−ＭＹＣ／ＭＹＣＮ、ＣＯＸ−２／ＰＴＧＳ２、ＬＲＩＧ１、ＥＲａ、ｈＴＥＲＴ、ＭＬＮ６４／ＳＴＡＲＤ３、ＰＧＲ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＯＰ１、ＴＵＢＢ１、ＡＩＢ１、ＤＬＣ−１、ＥＤＤ、Ｐｉｐ４ｋ２ｂ／５ｋ、Ｓｉｌ、ＴＢＸ２、ｃ−Ｋｉｔ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｓ／ＴＹＭＳ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、Ｐ１５、Ｐ１６、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＭＴＯＲ、ＴＩＭＰ１、ＥＳＲ１、ＰＴＥＮ、ＭＤＭ２／ＣＤＫ４、ＭＥＴ、Ｃ−ＭＥＴ、ＥＲＢ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＥＴ、ＦＧＦＲ３、ＡＢＣＢ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＢＲＣＡ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＥＲＣＣ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＮＴ１、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＭ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＵＲＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＡＵＲＫＣ、ＭＡＰＴ／ｔａｕ、ＴＴＢＫ１、ＴＵＢＢ、ＶＥＧＦＲ、ＣＣＮＤ３、ＣＤＫ６、ＣＤＫ２、ＣＤＣ２、ＨＤＡＣ、ＥＳＲ２、ＳＣＵＢＥ２、ＢＩＲＣ５、ＦＡＳＮ、ＤＨＦＲ、ＴＰ／ＥＣＧＦ１、ＴＹＭＰ、ＤＰＹＤ、ＴＫ１、ＨＭＧＩＣ、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＧ２、ＭＶＰ、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＳＬＣ２９Ａ１、ＳＬＣ２８Ａ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＵＢＢ４、ＴＵＢＡ、ＭＡＰ４、ＭＡＰ７、ＳＴＭＮ１、ＫＩＦ５Ｂ、ＨＳＰＡ５、ＰＳＭＤ１４、ＦＰＧＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ、ＧＣＬＣ、ＧＧＴ２、ＭＴ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＸＰＡ、ＸＰＤ、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＡＰＥＸ１、ＭＧＭＴ、ＧＬＯ１、ＲＢ１、ＧＭＬ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＡＳ２、ＩＴＧＢ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＣＬ１、ＢＡＸ、ＢＩＲＣ４、ＴＮＦＲＳＦ６、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＨＳＰＢ１、ＭＡＬＡＴ１（α）ｔ（１１；１９）（ｑ１１；ｑ１３．４）、ＭＨＬＢ１ ｔ（１１；１９）（ｑ１１；ｑ１３．４）、ＣＯＬ１Ａ１ ｔ（１７；２２）（ｑ２２；ｑ１３）、ＰＤＧＦＢ ｔ（１７；２２）（ｑ２２；ｑ１３）、ＦＫＨＲ ｔ（２；１３）及びｔ（１；１３）、ＥＴＶ６ ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ＮＴＲＫ３ ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ＴＬＳ／ＦＵＳ ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１）、ＣＨＯＰ ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１）、ＥＷＳ ｔ（１２；２２）（ｑ１３；ｑ１２）、ＥＷＳ／ＦＬＩ１ ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）、及びＦＬＩ１ ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）からなる群から選択される非血液学的疾患に対する標的を検出する実施態様１−４の何れかに記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様７． 第一分子プローブが、ＡＢＬ ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ＰＲＤＭ１６ｄｅｌ（１ｐ３６．３２）ｄｅｌ（２１ｑ２２．１２）、ＲＵＮＸ１／ＡＭＬ１ｄｅｌ（１ｐ３６．３２）ｄｅｌ（２１ｑ２２．１２）、ＣＥＰ８、ＰＤＧＦＲＢ、ＮＵＰ９８、ＦＧＦＲ１、ＡＳＳ、ＥＴＯ ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ＡＭＬ１ ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ＣＢＦβｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）ｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）、ＭＹＨ１１ ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）ｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）、ＡＦ９ ｔ（９；１１）、ＰＭＬ ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）、ＰＬＺＦ ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）、ＮｕＭＡ ｔ（１１；１７）（ｑ１３；ｑ２１）、ＮＰＭ ｔ（５；１７）（ｑ２３；ｑ１２）、ＲＡＲα ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）ｔ（１１；１７）（ｑ１３；ｑ２１）ｔ（５；１７）（ｑ２３；ｑ２１）、ＥＶＩ１ ｔ（３；ｖ）（ｑ２６；ｖ）、ＧＲ６ ｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）、ＲＰＮ１ ｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）、ＤＥＫ ｔ（６；９）、ＣＡＮ ｔ（６；９）、ＭＬＦ１ ｔ（３；５）（…；ｑ２３）、ＦＵＳ ｔ（１６；２１）、ＥＲＧ ｔ（１６；２１）、ＮＵＰ９８ ｔ（７；１１）、ＨＯＸ９Ａ ｔ（７；１１）、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３ ｔ（８；１６）（ｐ１１；ｐ１３）、ＣＢＰ ｔ（８；１６）（ｐ１１；ｐ１３）、ｐ３００ ｔ（８；２２）（ｐ１１；ｑ１３）、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ−１／ＮＣｏＡ−２ ｉｎｖ（８）（ｐ１１ｑ１３）、ＭＫＬ１、ＰＢＸ１ ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３．３）＋ｖａｒ．、ＡＢＬ ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ＡＦ４／ＡＦＦ１ ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）、ＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１ ｔ（１２；２１）（ｐ１３；ｑ２２）、ＩＬ３ ｔ（５；１４）（ｑ３１；ｑ３２）、ＨＬＦ ｔ（１７；１９）、ＩＫＺＦ１ｄｅｌ（７）（ｐ１２．２）、ＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂｄｅｌ（９）（ｐ２１．３）、ＴＡＬ１ １ｐ３２異常、ＬＭＯ２ ｔ（１１；１４）（ｐ１３；ｑ１１）＋ｖａｒ．、ＬＭＯ１ ｔ（１１；１４）（ｐ１５；ｑ１１）、ＨＯＸ１１ ｔ（１０；１４）（ｑ２４；ｑ１１）＋ｖａｒ．、ＴＡＬ２ ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３２）、ＴＡＮ１ ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３４）、ＣＥＰ１２、ＡＴＭ、Ｄ１３Ｓ２５、Ｄ１３Ｓ３１９、ＴＰ５３、Ｐ５３、ＴＮＦＡＩＰ３ｄｅｌ（６）（ｑ２３．３−ｑ２４．１）、ＣＤＫ６ ＢＣＬ１ ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）＋ｖａｒ．、ＩＲＦ４ ｔ（６；１４）（ｐ２５；ｑ３２）、Ｃ−ＭＡＦ ｔ（１４；１６）（ｑ３２；ｑ２３）、ＦＧＦＲ３ ｔ（４；１４）（ｐ１６；ｑ３２）、ＭＵＭ２／３ ｔ（１；１４）（ｑ２１；ｑ３２）、ＮＰＭ ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）、ＡＳＳ、ＲＢ１、及びＡＴＭからなる群から選択される血液学的疾患に対する標的を検出する実施態様１−４の何れかに記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様８． 第一分子プローブが、ＣＥＰ１、ＣＥＰ２、ＣＥＰ３、ＣＥＰ４、ＣＥＰ５、ＣＥＰ６、ＣＥＰ７、ＣＥＰ８、ＣＥＰ９、ＣＥＰ１０、ＣＥＰ１１、ＣＥＰ１２、ＣＥＰ１３、ＣＥＰ１４、ＣＥＰ１５、ＣＥＰ１６、ＣＥＰ１７、ＣＥＰ１８、ＣＥＰ１９、ＣＥＰ２０、ＣＥＰ２１、ＣＥＰ２２、ＣＥＰ２３、ＣＥＰ Ｘ、及びＣＥＰ Ｙからなる群から選択されるセントロメアを検出する実施態様１−４の何れかに記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様９． 癌が、副腎皮質癌、膀胱癌、脳癌、熱傷癌、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌，結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腎臓（腎）癌、白血病、肝臓癌、肺癌、胃癌、神経膠腫、血液学的癌、頭頸部癌、メラノーマ、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、卵巣細胞、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、肉腫、皮膚癌（非メラノーマ）、精巣癌、甲状腺癌、又は子宮癌である実施態様４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１０． 癌が乳癌であり、第一分子プローブがＨＥＲ２を検出する実施態様９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１１． 癌が結腸直腸癌であり、第一分子プローブがＥＧＦ２を検出する実施態様９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１２． 癌が造血器腫瘍である実施態様４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１３． 第一分子プローブが、ｔ（１；１４）（ｑ３４；ｑ１１）、ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）、ｔ（２；５）、ｔ（２；１８）（ｑ１２；ｑ２１）、ｔ（２；８）、ｔ（４；１１）、ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）、ｔ（６；１１）（ｑ２７；ｑ２３）、ｔ（７；２２）（ｐ２２；ｑ１２）、ｔ（８；１４）、ｔ（８；２２）、ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ｔ（１０；１４）（ｑ２４；ｑ１１）、ｔ（１１；１４）、ｔ（１１；１４）（ｐ１３；ｑ１１）、ｔ（１１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）、ｔ（１４；１８）（ｑ２３；ｑ２１）、ｔ（１４；１８）、ｔ（１８；２２）（ｑ２１；ｑ１１）、及びｔ（２１；２２）（ｑ２２；ｑ１２）から選択される染色体異常を検出する実施態様１２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１４． 第二分子プローブを更に含む実施態様１から１３の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１５． 第二分子プローブが参照配列を検出する実施態様１４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１６． 参照配列がセントロメア配列である実施態様１５に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１７． 分子プローブが実施態様８に記載の通りである実施態様１６に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１８． 第一分子プローブ及び第二分子プローブが、一又は複数の潜在的切断点に隣接するか又はその内部の配列を検出する実施態様１４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１９． 第三分子プローブを更に含有する実施態様１４から１８の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２０． 第一分子プローブがＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、又はＬＮＡプローブである実施態様１から１９の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２１． 第二分子プローブがＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、又はＬＮＡプローブである実施態様１４から２０の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２２． 第三分子プローブがＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、又はＬＮＡプローブである実施態様１９から２１の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２３． 分子プローブが標識を更に含む請求項１から２２の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２４． 標識が発色団、フルオロフォア、ビオチン、ＤＩＧ、抗体−ハｐテン、染料又は酵素である実施態様２３に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２５． ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が１％（ｖ／ｖ）から９５％（ｖ／ｖ）の範囲である実施態様１から２４の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２６． ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が５％（ｖ／ｖ）から１０％（ｖ／ｖ）の範囲である実施態様１から２５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２７． ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が１０％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）の範囲である実施態様１から２５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２８． ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が２０％（ｖ／ｖ）から３０％（ｖ／ｖ）の範囲である実施態様１から２５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２９． 極性非プロトン溶媒が非毒性である実施態様１から２８の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３０． 但し、ハイブリダイゼーション組成物がホルムアミドを含んでいない実施態様１から２９の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３１． 但し、ハイブリダイゼーション組成物が１０％未満のホルムアミドを含む実施態様１から３０の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３２． 極性非プロトン溶媒が、ラクトン、スルホン、サルファイト、ニトリル及び／又はカーボネート官能性を有している実施態様１から３１の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３３． 極性非プロトン溶媒が、１７．７ＭＰａ１／２から２２．０ＭＰａ１／２の範囲の分散溶解度パラメータ、１３ＭＰａ１／２から２３ＭＰａ１／２の範囲の極性溶解度パラメータ、及び３ＭＰａ１／２から１３ＭＰａ１／２の範囲の水素結合溶解度パラメータを有する実施態様１から３２の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３４． 極性非プロトン溶媒が環状塩基構造を有する実施態様１から３３の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３５． 極性非プロトン溶媒が
Figure 2011521635
（ここで、ＸがＯであり、Ｒ１がアルキルジイルである）、及び
Figure 2011521635
（ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり、
Ｒはアルキルジイルであり、
ＹはＯ又はＳ又はＣである）
から選択される実施態様１から３４の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。実施態様３６． 極性非プロトン溶媒が、アセトアニリド、アセトニトリル、Ｎ−アセチルピロリドン、４−アミノピリジン、ベンズアミド、ベンズイミダゾール、１，２，３−ベンゾトリアゾール、ブタジエンジオキシド、２，３−ブチレンカーボネート、γ−ブチロラクトン、カプロラクトン（イプシロン）、クロロ無水マレイン酸、２−クロロシクロヘキサノン、クロロエチレンカーボネート、クロロニトロメタン、無水シトラコン酸、クロトンラクトン、５−シアノ−２−チオウラシル、シクロプロピルニトリル、硫酸ジメチル、ジメチルスルホン、１，３−ジメチル−５−テトラゾール、１，５−ジメチルテトラゾール、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、イプシロン−カプロラクタム、エタンスルホニルクロリド、エチルエチルホスフィネート、Ｎ−エチルテトラゾール、エチレンカーボネート、エチレントリチオカーボネート、エチレングリコールサルフェート、エチレングリコールサルファイト、フルフラール、２−フロニトリル、２−イミダゾール、イサチン、イソキサゾール、マロノニトリル、４−メトキシベンゾニトリル、１−メトキシ−２−ニトロベンゼン、メチルαブロモテトロネート、１−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、３−メチルイソキサゾール、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、メチルフェニルスルホン、Ｎ−メチルピロリジノン、メチルスルホラン、メチル−４−トルエンスルホネート、３−ニトロアニリン、ニトロベンズイミダゾール、２−ニトロフラン、１−ニトロソ−２−ピロリジノン、２−ニトロチオフェン、２−オキサゾリジノン、９，１０−フェナントレンキノン、Ｎ−フェニルシドノン、無水フタル酸、ピコリノニトリル（２−シアノピリジン）、１，３−プロパンスルトン、β−プロピオラクトン、プロピレンカーボネート、４Ｈ−ピラン−４−チオン、４Ｈ−ピラン−４−オン（γ−ピロン），ピリダジン、２−ピロリドン、サッカリン、スクシノニトリル、スルファニルアミド、スルホラン、２，２，６，６−テトラクロロシクロヘキサノン、テトラヒドロチアピランオキシド、テトラメチレンスルホン（スルホラン）、チアゾール、２−チオウラシル、３，３，３−トリクロロプロペン、１，１，２−トリクロロプロペン、１，２，３−トリクロロプロペン、トリメチレンスルフィド−ジオキシド、及びトリメチレンサルファイトからなる群から選択される実施態様１から３５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３７． 極性非プロトン溶媒が、
Figure 2011521635
からなる群から選択される実施態様１から３５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３８． 極性非プロトン溶媒が、
Figure 2011521635
からなる群から選択される実施態様１から３５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３９． 緩衝剤、塩、促進剤、キレート剤、洗浄剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも一種の更なる成分を更に含む実施態様１から３８の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４０． 促進剤がデキストラン硫酸であり、塩が塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムである実施態様３９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４１． デキストラン硫酸が、５％から４０％の濃度で存在し、塩化ナトリウムが０ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はリン酸ナトリウムが０ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する実施態様４０に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４２． デキストラン硫酸が１０％から３０％の濃度で存在し、塩化ナトリウムが３００ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はリン酸ナトリウムが５ｍＭから２０ｍＭの濃度で存在する実施態様４１に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４３． 促進剤が、ホルムアミド、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールからなる群から選択され、緩衝剤がクエン酸バッファーである実施態様３９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４４． ホルムアミドが０．１−５％の濃度で存在し、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールが０．１％から１０％の濃度で存在し、クエン酸バッファーが１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する実施態様４３に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４５． ブロッキング剤が、全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡからなる群から選択される実施態様３９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４６． 全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡが０．０１から１０μｇ／ｍＬの濃度で存在する実施態様４５に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４７． ４０％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、１０％デキストラン硫酸、３００ｍＭの塩化ナトリウム、及び５ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する実施態様１から４６の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４８． １５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び０．１μｇ／ｍｌの全ヒトＤＮＡを含有する実施態様１から４６の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４９． １５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸バッファーｐＨ６．２、及び０．１μｇ／μＬのニシン精液ＤＮＡ、又はサケ精液ＤＮＡ、又はウシ胸腺ＤＮＡ、又は０．５％のホルムアミド、又は１％のエチレングリコール、又は１％の１，３プロパンジオール、又は１％のグリセロールを含有する実施態様１から４６の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様５０． 水性組成物が室温で一を越える相を含む実施態様１から４９の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様５１． 実施態様１から４１の何れか一に記載の組成物を含むキット。
実施態様５２．（ａ）染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する第一分子プローブ、及び
（ｂ）二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有するハイブリダイゼーション組成物
を含み、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないキット。
実施態様５３． 可視化試薬を更に含む実施態様５１及び５２の何れかに記載のキット。
実施態様５４． キットが細胞診に使用するために設計された実施態様５１及び５２の何れかに記載のキット。
実施態様５５． キットが組織診断に使用するために設計された実施態様５１及び５２の何れかに記載のキット。
実施態様５６． 極性非プロトン溶媒が実施態様２５−３８の何れかに記載された通りである実施態様５２に記載のキット。
実施態様５７． キットがＦＩＳＨ又はＣＩＳＨ実験において使用されるために設計された実施態様５１から５６の何れか一に記載のキット。
実施態様５８． 染色体ＤＮＡ中における標的を検出する方法において、
− 染色体ＤＮＡ中の標的にハイブリダイズする少なくとも一の分子プローブを提供し、
− 染色体ＤＮＡを提供し、
− 二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有し、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないハイブリダイゼーション組成物を提供し、
− 分子プローブ、染色体ＤＮＡ及びハイブリダイゼーション組成物を、標的に分子プローブをハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ、及び
− 標的を検出する
ことを含む方法。
実施態様５９． 核酸配列中の染色体異常の存在を決定する方法において、
− 少なくとも一の分子プローブを提供し、
− 核酸配列を提供し、
− 二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有し、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないハイブリダイゼーション組成物を提供し、
− 分子プローブ及び核酸配列及びハイブリダイゼーション組成物を、分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ、及び
− 少なくとも一の分子プローブを検出し、
− 染色体異常の存在を決定する
ことを含む方法。
実施態様６０． 核酸配列中の染色体異常の存在を決定する方法において、
− 核酸配列を提供し、
− 少なくとも一の分子プローブと二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有するハイブリダイゼーション組成物を提供し、
− ハイブリダイゼーション組成物を上記核酸に、分子プローブと核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用し、
− 少なくとも一の分子プローブを検出し、
− 染色体異常の存在を決定する
ことを含み、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない方法。
実施態様６１． 極性非プロトン溶媒が実施態様２５−３８の何れか一に記載の通りである実施態様５８から６０の何れか一に記載の方法。
実施態様６２． 核酸配列中の染色体異常の存在を決定する方法において、
− 核酸配列を提供し、
− 実施態様１から５０の何れか一に記載の組成物を上記核酸に、分子プローブと核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用し、
− 染色体異常が核酸中に存在するかどうかを決定する
ことを含む方法。
実施態様６３． 第一及び第二核酸にハイブリダイズするのに十分な量のエネルギーが提供される実施態様５８から６２の何れか一に記載の方法。
実施態様６４． エネルギーがハイブリダイゼーション組成物及び核酸配列を加熱することにより提供される実施態様６３に記載の方法。
実施態様６５． 加熱工程が、マイクロ波、熱浴、ホットプレート、電熱線、ペルチェ素子、誘導加熱又は加熱ランプの使用により実施される実施態様６４に記載の方法。
実施態様６６． 核酸配列が二本鎖であり、分子プローブが一本鎖であり、核酸配列が二本鎖であり、及び分子プローブが二本鎖であり、核酸配列が一本鎖であり、分子プローブが一本鎖であり、又は核酸配列が一本鎖であり、分子プローブが二本鎖である実施態様５８から６５の何れか一に記載の方法。
実施態様６７． 変性及びハイブリダイゼーション工程が別個に生じる実施態様５８から６６の何れか一に記載の方法。
実施態様６８． ハイブリダイゼーション工程がハイブリダイゼーション組成物、分子プローブ、及び核酸配列を加熱及び冷却する工程を含む実施態様５８から６７の何れか一に記載の方法。
実施態様６９． ハイブリダイゼーション工程が８時間未満を要する実施態様５８から６８の何れか一に記載の方法。
実施態様７０． ハイブリダイゼーション工程が１時間未満を要する実施態様６９に記載の方法。
実施態様７１． 冷却工程が１時間未満を要する実施態様５８から７０の何れか一に記載の方法。
実施態様７２． 冷却工程が３０分未満を要する実施態様７１に記載の方法。
実施態様７３． 核酸配列が生物学的試料中にある実施態様５８から７２の何れか一に記載の方法。
実施態様７４． 生物学的試料が組織試料である実施態様７３に記載の方法。
実施態様７５． 水性組成物が室温で一相を含む実施態様５８から７４の何れか一に記載の方法。
実施態様７６． 水性組成物が室温で複数相を含む実施態様５８から７４の何れか一に記載の方法。
実施態様７７． 水性組成物の相が混合される実施態様７６に記載の方法。
実施態様７８． ブロッキング工程を更に含む実施態様５８から７７の何れか一に記載の方法。
実施態様７９． 染色体異常に関連する先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断する方法において、
− 患者からの組織試料を提供し、ここで、組織試料は核酸を含み、
− 実施態様５８から７８の何れか一に記載の方法に従って、染色体異常が核酸配列中に存在するかどうかを決定し、及び
− 染色体異常が組織試料中に存在する場合に先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断する
ことを含む方法。
実施態様８０． 染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおける、染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する分子プローブを含む組成物及び１％（ｖ／ｖ）から９５％（ｖ／ｖ）の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含むハイブリダイゼーション組成物の使用。
実施態様８１． 実施態様１から５０の何れか一に記載の組成物の、実施態様８０に記載の使用。

Claims (81)

  1. （ａ）染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する第一分子プローブ、
    （ｂ）二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、及び
    （ｃ）ハイブリダイゼーション溶液
    を含有し、ヌクレオチド配列が染色体異常のためのマーカーであり、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないハイブリダイゼーション組成物。
  2. 染色体異常が、異数性、潜在的切断点、挿入、逆位、欠失、複製，遺伝子増幅、再編成、又は転位置である請求項１に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  3. 染色体異常が先天性遺伝子疾患、癌、又は感染症に関連する請求項１−２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  4. 染色体異常が癌に関連する請求項３に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  5. 第一分子プローブが、ＡＬＫ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ３、ＢＣＬ６、ＢＣＬ１０、ＢＣＬ１２、ＢＣＲ、ＣＣＮＤ１、Ｅ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＴＶ６、ＦＩＰ１Ｌ１、ＨＥＲ２、ＩＧＨ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＭＡＬＴ１、ＭＬＬ（ＡＬＬ−１、ＨＴＲＸ１、ＨＲＸ）、ＭＹＣ（ｃ−Ｍｙｃ）、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＳＩＬ、ＴＣＦ３（Ｅ２Ａ、ＩＴＦ１）、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＲＡＤ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＧ，テロメア、ＴＬＸ１、ＴＬＸ３（ＨＯＸ１１Ｌ２、ＲＮＸ）、又はＴＯＰ２Ａを検出する請求項４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  6. 第一分子プローブが、ＢＡＳＥ、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＤＣＤ、Ｅ２Ｆ３、ｎ−ＭＹＣ／ＭＹＣＮ、ＣＯＸ−２／ＰＴＧＳ２、ＬＲＩＧ１、ＥＲ ａ、ｈＴＥＲＴ、ＭＬＮ６４／ＳＴＡＲＤ３、ＰＧＲ、ＳＮＡＩ１、ＳＲＣ、ＴＯＰ１、ＴＵＢＢ１、ＡＩＢ１、ＤＬＣ−１、ＥＤＤ、Ｐｉｐ４ｋ２ｂ／５ｋ、Ｓｉｌ、ＴＢＸ２、ｃ−Ｋｉｔ、ＶＥＧＦ、ＶＣＡＭ−１、Ｔｉｅ−１、Ｔｓ／ＴＹＭＳ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＡＰ、Ｐ１５、Ｐ１６、ＢＣＬ１、ＢＣＬ２、ＭＴＯＲ、ＴＩＭＰ１、ＥＳＲ１、ＰＴＥＮ、ＭＤＭ２／ＣＤＫ４、ＭＥＴ、Ｃ−ＭＥＴ、ＥＲＢ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＮＥＴ、ＦＧＦＲ３、ＡＢＣＢ１、ＴＭＰＲＳＳ２、ＢＲＣＡ２、ＴＯＰ２Ｂ、ＥＲＣＣ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＥＮＴ１、ＲＲＭ１、ＲＲＭ２、ＲＲＭ２Ｂ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＡＵＲＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＡＵＲＫＣ、ＭＡＰＴ／ｔａｕ、ＴＴＢＫ１、ＴＵＢＢ、ＶＥＧＦＲ、ＣＣＮＤ３、ＣＤＫ６、ＣＤＫ２、ＣＤＣ２、ＨＤＡＣ、ＥＳＲ２、ＳＣＵＢＥ２、ＢＩＲＣ５、ＦＡＳＮ、ＤＨＦＲ、ＴＰ／ＥＣＧＦ１、ＴＹＭＰ、ＤＰＹＤ、ＴＫ１、ＨＭＧＩＣ、ＡＢＣＡ２、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＧ２、ＭＶＰ、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＰ７Ｂ、ＳＬＣ２９Ａ１、ＳＬＣ２８Ａ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＴＵＢＢ４、ＴＵＢＡ、ＭＡＰ４、ＭＡＰ７、ＳＴＭＮ１、ＫＩＦ５Ｂ、ＨＳＰＡ５、ＰＳＭＤ１４、ＦＰＧＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＰＸ、ＧＣＬＣ、ＧＧＴ２、ＭＴ、ＡＫＲ１Ｂ１、ＨＭＧＢ１、ＨＭＧＢ２、ＸＰＡ、ＸＰＤ、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＡＰＥＸ１、ＭＧＭＴ、ＧＬＯ１、ＲＢ１、ＧＭＬ、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＥＲＢＢ２、ＫＲＡＳ２、ＩＴＧＢ１、ＪＵＮ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＴＰ５３、ＴＰ７３、ＢＣＬ２Ｌ１、ＭＣＬ１、ＢＡＸ、ＢＩＲＣ４、ＴＮＦＲＳＦ６、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ８、ＨＳＰＢ１、ＭＡＬＡＴ１（α）ｔ（１１；１９）（ｑ１１；ｑ１３．４）、ＭＨＬＢ１ ｔ（１１；１９）（ｑ１１；ｑ１３．４）、ＣＯＬ１Ａ１ ｔ（１７；２２）（ｑ２２；ｑ１３）、ＰＤＧＦＢ ｔ（１７；２２）（ｑ２２；ｑ１３）、ＦＫＨＲ ｔ（２；１３）及びｔ（１；１３）、ＥＴＶ６ ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ＮＴＲＫ３ ｔ（１２；１５）（ｐ１３；ｑ２５）、ＴＬＳ／ＦＵＳ ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１）、ＣＨＯＰ ｔ（１２；１６）（ｑ１３；ｐ１１）、ＥＷＳ ｔ（１２；２２）（ｑ１３；ｑ１２）、ＥＷＳ／ＦＬＩ１ ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）、及びＦＬＩ１ ｔ（１１；２２）（ｑ２４；ｑ１２）からなる群から選択される非血液学的疾患に対する標的を検出する請求項１から４の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  7. 第一分子プローブが、ＡＢＬ ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ＰＲＤＭ１６ｄｅｌ（１ｐ３６．３２）ｄｅｌ（２１ｑ２２．１２）、ＲＵＮＸ１／ＡＭＬ１ｄｅｌ（１ｐ３６．３２）ｄｅｌ（２１ｑ２２．１２）、ＣＥＰ８、ＰＤＧＦＲＢ、ＮＵＰ９８、ＦＧＦＲ１、ＡＳＳ、ＥＴＯ ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ＡＭＬ１ ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ＣＢＦβｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）ｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）、ＭＹＨ１１ ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）ｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）、ＡＦ９ ｔ（９；１１）、ＰＭＬ ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）、ＰＬＺＦ ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）、ＮｕＭＡ ｔ（１１；１７）（ｑ１３；ｑ２１）、ＮＰＭ ｔ（５；１７）（ｑ２３；ｑ１２）、ＲＡＲα ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）ｔ（１１；１７）（ｑ１３；ｑ２１）ｔ（５；１７）（ｑ２３；ｑ２１）、ＥＶＩ１ ｔ（３；ｖ）（ｑ２６；ｖ）、ＧＲ６ ｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）、ＲＰＮ１ ｔ（３；３）（ｑ２１；ｑ２６）、ＤＥＫ ｔ（６；９）、ＣＡＮ ｔ（６；９）、ＭＬＦ１ ｔ（３；５）（…；ｑ２３）、ＦＵＳ ｔ（１６；２１）、ＥＲＧ ｔ（１６；２１）、ＮＵＰ９８ ｔ（７；１１）、ＨＯＸ９Ａ ｔ（７；１１）、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３ ｔ（８；１６）（ｐ１１；ｐ１３）、ＣＢＰ ｔ（８；１６）（ｐ１１；ｐ１３）、ｐ３００ ｔ（８；２２）（ｐ１１；ｑ１３）、ＴＩＦ２／ＧＲＩＰ−１／ＮＣｏＡ−２ ｉｎｖ（８）（ｐ１１ｑ１３）、ＭＫＬ１、ＰＢＸ１ ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３．３）＋ｖａｒ．、ＡＢＬ ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ＡＦ４／ＡＦＦ１ ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）、ＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１ ｔ（１２；２１）（ｐ１３；ｑ２２）、ＩＬ３ ｔ（５；１４）（ｑ３１；ｑ３２）、ＨＬＦ ｔ（１７；１９）、ＩＫＺＦ１ｄｅｌ（７）（ｐ１２．２）、ＣＤＫＮ２Ａ／ＣＤＫＮ２Ｂｄｅｌ（９）（ｐ２１．３）、ＴＡＬ１ １ｐ３２異常、ＬＭＯ２ ｔ（１１；１４）（ｐ１３；ｑ１１）＋ｖａｒ．、ＬＭＯ１ ｔ（１１；１４）（ｐ１５；ｑ１１）、ＨＯＸ１１ ｔ（１０；１４）（ｑ２４；ｑ１１）＋ｖａｒ．、ＴＡＬ２ ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３２）、ＴＡＮ１ ｔ（７；９）（ｑ３４；ｑ３４）、ＣＥＰ１２、ＡＴＭ、Ｄ１３Ｓ２５、Ｄ１３Ｓ３１９、ＴＰ５３、Ｐ５３、ＴＮＦＡＩＰ３ｄｅｌ（６）（ｑ２３．３−ｑ２４．１）、ＣＤＫ６ ＢＣＬ１ ｔ（１１；１４）（ｑ１３；ｑ３２）＋ｖａｒ．、ＩＲＦ４ ｔ（６；１４）（ｐ２５；ｑ３２）、Ｃ−ＭＡＦ ｔ（１４；１６）（ｑ３２；ｑ２３）、ＦＧＦＲ３ ｔ（４；１４）（ｐ１６；ｑ３２）、ＭＵＭ２／３ ｔ（１；１４）（ｑ２１；ｑ３２）、ＮＰＭ ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）、ＡＳＳ、ＲＢ１、及びＡＴＭからなる群から選択される血液学的疾患に対する標的を検出する請求項１から４の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  8. 第一分子プローブが、ＣＥＰ１、ＣＥＰ２、ＣＥＰ３、ＣＥＰ４、ＣＥＰ５、ＣＥＰ６、ＣＥＰ７、ＣＥＰ８、ＣＥＰ９、ＣＥＰ１０、ＣＥＰ１１、ＣＥＰ１２、ＣＥＰ１３、ＣＥＰ１４、ＣＥＰ１５、ＣＥＰ１６、ＣＥＰ１７、ＣＥＰ１８、ＣＥＰ１９、ＣＥＰ２０、ＣＥＰ２１、ＣＥＰ２２、ＣＥＰ２３、ＣＥＰ Ｘ、及びＣＥＰ Ｙからなる群から選択されるセントロメアを検出する請求項１から４の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  9. 癌が、副腎皮質癌、膀胱癌、脳癌、熱傷癌、乳癌、子宮頚癌、結腸直腸癌，結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、腎臓（腎）癌、白血病、肝臓癌、肺癌、胃癌、神経膠腫、血液学的癌、頭頸部癌、メラノーマ、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、卵巣細胞、膵臓癌、前立腺癌網膜芽細胞腫、肉腫、皮膚癌（非メラノーマ）、精巣癌、甲状腺癌、又は子宮癌である請求項４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  10. 癌が乳癌であり、第一分子プローブがＨＥＲ２を検出する請求項９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  11. 癌が結腸直腸癌であり、第一分子プローブがＥＧＦ２を検出する請求項９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  12. 癌が造血器腫瘍である請求項４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  13. 第一分子プローブが、ｔ（１；１４）（ｑ３４；ｑ１１）、ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）、ｔ（２；５）、ｔ（２；１８）（ｑ１２；ｑ２１）、ｔ（２；８）、ｔ（４；１１）、ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）、ｔ（６；１１）（ｑ２７；ｑ２３）、ｔ（７；２２）（ｐ２２；ｑ１２）、ｔ（８；１４）、ｔ（８；２２）、ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）、ｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）、ｔ（１０；１４）（ｑ２４；ｑ１１）、ｔ（１１；１４）、ｔ（１１；１４）（ｐ１３；ｑ１１）、ｔ（１１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）、ｔ（１４；１８）（ｑ２３；ｑ２１）、ｔ（１４；１８）、ｔ（１８；２２）（ｑ２１；ｑ１１）、及びｔ（２１；２２）（ｑ２２；ｑ１２）から選択される染色体異常を検出する請求項１２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  14. 第二分子プローブを更に含有する請求項１から１３の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  15. 第二分子プローブが参照配列を検出する請求項１４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  16. 参照配列がセントロメア配列である請求項１５に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  17. 分子プローブが請求項８に記載の通りである請求項１６に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  18. 第一分子プローブ及び第二分子プローブが、一又は複数の潜在的切断点に隣接し又はその内部の配列を検出する請求項１４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  19. 第三分子プローブを更に含む請求項１４から１８の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  20. 第一分子プローブがＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、又はＬＮＡプローブである請求項１から１９の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  21. 第二分子プローブがＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、又はＬＮＡプローブである請求項１４から２０の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  22. 第三分子プローブがＤＮＡプローブ、ＰＮＡプローブ、又はＬＮＡプローブである請求項１９から２１の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  23. 分子プローブが標識を更に含む請求項１から２２の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  24. 標識が発色団、フルオロフォア、ビオチン、ＤＩＧ、抗体−ハプテン、染料、又は酵素である請求項２３に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  25. ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が、１％（ｖ／ｖ）から９５％（ｖ／ｖ）の範囲である請求項１から２４の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  26. ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が５％（ｖ／ｖ）から１０％（ｖ／ｖ）の範囲である請求項１から２５の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  27. ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が１０％（ｖ／ｖ）から２０％（ｖ／ｖ）の範囲である請求項１から２５の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  28. ハイブリダイゼーション組成物中の極性非プロトン溶媒の濃度が２０％（ｖ／ｖ）から３０％（ｖ／ｖ）の範囲である請求項１から２５の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  29. 極性非プロトン溶媒が非毒性である請求項１から２８の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  30. 但し、ハイブリダイゼーション組成物がホルムアミドを含まない請求項１から２９の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  31. 但し、ハイブリダイゼーション組成物が１０％未満のホルムアミドを含む請求項１から３０の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  32. 極性非プロトン溶媒が、ラクトン、スルホン、サルファイト、ニトリル及び／又はカーボネート官能性を有する請求項１から３１の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  33. 極性非プロトン溶媒が、１７．７ＭＰａ１／２から２２．０ＭＰａ１／２の範囲の分散溶解度パラメータ、１３ＭＰａ１／２から２３ＭＰａ１／２の範囲の極性溶解度パラメータ及び３ＭＰａ１／２から１３ＭＰａ１／２の範囲の水素結合溶解度パラメータを有する請求項１から３２の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  34. 極性非プロトン溶媒が環状塩基構造を有する請求項１から３３の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  35. 極性非プロトン溶媒が、
    Figure 2011521635
    （ここで、ＸがＯであり、Ｒ１がアルキルジイルである）、及び
    Figure 2011521635
    （ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
    Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
    Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり、
    Ｒはアルキルジイルであり、
    ＹはＯ又はＳ又はＣである）
    から選択される請求項１から３４の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  36. 極性非プロトン溶媒が、アセトアニリド、アセトニトリル、Ｎ−アセチルピロリドン、４−アミノピリジン、ベンズアミド、ベンズイミダゾール、１，２，３−ベンゾトリアゾール、ブタジエンジオキシド、２，３−ブチレンカーボネート、γ−ブチロラクトン、カプロラクトン（イプシロン）、クロロ無水マレイン酸、２−クロロシクロヘキサノン、クロロエチレンカーボネート、クロロニトロメタン、無水シトラコン酸、クロトンラクトン、５−シアノ−２−チオウラシル、シクロプロピルニトリル、硫酸ジメチル、ジメチルスルホン、１，３−ジメチル−５−テトラゾール、１，５−ジメチルテトラゾール、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、イプシロン−カプロラクタム、エタンスルホニルクロリド、エチルエチルホスフィネート、Ｎ−エチルテトラゾール、エチレンカーボネート、エチレントリチオカーボネート、エチレングリコールサルフェート、エチレングリコールサルファイト、フルフラール、２−フロニトリル、２−イミダゾール、イサチン、イソキサゾール、マロノニトリル、４−メトキシベンゾニトリル、１−メトキシ−２−ニトロベンゼン、メチルαブロモテトロネート、１−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、３−メチルイソキサゾール、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、メチルフェニルスルホン、Ｎ−メチルピロリジノン、メチルスルホラン、メチル−４−トルエンスルホネート、３−ニトロアニリン、ニトロベンズイミダゾール、２−ニトロフラン、１−ニトロソ−２−ピロリジノン、２−ニトロチオフェン、２−オキサゾリジノン、９，１０−フェナントレンキノン、Ｎ−フェニルシドノン、無水フタル酸、ピコリノニトリル（２−シアノピリジン）、１，３−プロパンスルトン、β−プロピオラクトン、プロピレンカーボネート、４Ｈ−ピラン−４−チオン、４Ｈ−ピラン−４−オン（γ−ピロン），ピリダジン、２−ピロリドン、サッカリン、スクシノニトリル、スルファニルアミド、スルホラン、２，２，６，６−テトラクロロシクロヘキサノン、テトラヒドロチアピランオキシド、テトラメチレンスルホン（スルホラン）、チアゾール、２−チオウラシル、３，３，３−トリクロロプロペン、１，１，２−トリクロロプロペン、１，２，３−トリクロロプロペン、トリメチレンスルフィド−ジオキシド、及びトリメチレンサルファイトからなる群から選択される請求項１から３５の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  37. 極性非プロトン溶媒が
    Figure 2011521635
    からなる群から選択される請求項１から３５の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  38. 極性非プロトン溶媒が
    Figure 2011521635
    である請求項１から５０の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  39. 緩衝剤、塩、促進剤、キレート剤、洗浄剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも一種の更なる成分を更に含有する請求項１から３８の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  40. 促進剤がデキストラン硫酸及び塩が塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムである請求項３９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  41. デキストラン硫酸が５％から４０％の濃度で存在し、塩化ナトリウムが０ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はリン酸ナトリウムが０ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する請求項４０に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  42. デキストラン硫酸が１０％から３０％の濃度で存在し、塩化ナトリウムが３００ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はリン酸ナトリウムが５ｍＭから２０ｍＭの濃度で存在する請求項４１に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  43. 促進剤が、ホルムアミド、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールからなる群から選択され、緩衝剤がクエン酸バッファーである請求項３９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  44. ホルムアミドが０．１−５％の濃度で存在し、グリセロール，プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールが０．１％から１０％の濃度で存在し、クエン酸バッファーが１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する請求項４３に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  45. ブロッキング剤が、全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡからなる群から選択される請求項３９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  46. 全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡが０．０１から１０μｇ／μＬの濃度で存在する請求項４５に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  47. ４０％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭの塩化ナトリウム、及び５ｍＭのリン酸ナトリウムを含有する請求項１から４６の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  48. １５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び０．１μｇ／μｌの全ヒトＤＮＡを含有する請求項１から４６の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  49. １５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸バッファーｐＨ６．２、及び０．１μｇ／μＬのニシン精液ＤＮＡ、又はサケ精液ＤＮＡ、又はウシ胸腺ＤＮＡ、又は０．５％のホルムアミド、又は１％のエチレングリコール、又は１％の１，３プロパンジオール、又は１％のグリセロールを含有する請求項１から４６の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  50. 水性組成物が室温で一を越える相を含む、請求項１から４９の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
  51. 請求項１から４１の何れか一項に記載の組成物を含むキット。
  52. （ａ）染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する第一分子プローブ、及び
    （ｂ）二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有するハイブリダイゼーション組成物
    を含み、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないキット。
  53. 可視化試薬を更に含む請求項５１又は５２に記載のキット。
  54. 細胞診における使用のために設計されている請求項５１又は５２に記載のキット。
  55. 組織診断における使用のために設計されている請求項５１又は５２に記載のキット。
  56. 極性非プロトン溶媒が請求項２５から３８の何れかに記載の通りである請求項５２に記載のキット。
  57. ＦＩＳＨ又はＣＩＳＨ実験における使用のために設計されている請求項５１から５６の何れか一項に記載のキット。
  58. 染色体ＤＮＡ中における標的を検出する方法において、
    − 染色体ＤＮＡ中の標的にハイブリダイズする少なくとも一の分子プローブを提供し、
    − 染色体ＤＮＡを提供し、
    − 二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有し、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないハイブリダイゼーション組成物を提供し、
    − 分子プローブ、染色体ＤＮＡ及びハイブリダイゼーション組成物を標的に分子プローブをハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ、
    − 標的を検出する
    ことを含む方法。
  59. 核酸配列中の染色体異常の存在を決定する方法において、
    − 少なくとも一の分子プローブを提供し、
    − 核酸配列を提供し、
    − 二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有し、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではないハイブリダイゼーション組成物を提供し、
    − 分子プローブ及び核酸配列及びハイブリダイゼーション組成物を、分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ、
    − 少なくとも一の分子プローブを検出し、
    − 染色体異常の存在を決定する
    ことを含む方法。
  60. 核酸配列中の染色体異常の存在を決定する方法において、
    − 核酸配列を提供し、
    − 少なくとも一の分子プローブと二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに十分な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有するハイブリダイゼーション組成物を提供し、
    − ハイブリダイゼーション組成物を上記核酸に、分子プローブと核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用し、
    − 少なくとも一の分子プローブを検出し、
    − 染色体異常の存在を決定する
    ことを含み、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない方法。
  61. 極性非プロトン溶媒が請求項２５から３８の何れか一項に記載の通りである請求項５８から６０の何れか一項に記載の方法。
  62. 核酸配列中の染色体異常の存在を決定する方法において、
    − 核酸配列を提供し、
    − 請求項１から５０の何れか一に記載の組成物を前記核酸配列に、分子プローブ及び核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用し、
    − 染色体異常が核酸中に存在するかどうかを決定する
    ことを含む方法。
  63. 第一及び第二核酸にハイブリダイズするのに十分な量のエネルギーが提供される請求項５８から６２の何れか一項に記載の方法。
  64. エネルギーがハイブリダイゼーション組成物及び核酸配列を加熱することにより提供される請求項６３に記載の方法。
  65. 加熱工程が、マイクロ波、熱浴、ホットプレート、電熱線、ペルチェ素子、誘導加熱又は加熱ランプの使用によって実施される請求項６４に記載の方法。
  66. 核酸配列が二本鎖で分子プローブが一本鎖であり、核酸配列が二本鎖で分子プローブが二本鎖であり、核酸配列が一本鎖で分子プローブが一本鎖であり、又は核酸配列が一本鎖で分子プローブが二本鎖である請求項５８から６５の何れか一項に記載の方法。
  67. 変性及びハイブリダイゼーション工程が別個に生じる請求項５８から６６の何れか一項に記載の方法。
  68. ハイブリダイズ工程がハイブリダイゼーション組成物、分子プローブ、及び核酸配列を加熱及び冷却する工程を含む請求項５８から６７の何れか一項に記載の方法。
  69. ハイブリダイゼーション工程が８時間未満を要する請求項５８から６８の何れか一項に記載の方法。
  70. ハイブリダイゼーション工程が１時間未満を要する請求項６９に記載の方法。
  71. 冷却工程が１時間未満を要する請求項５８から７０の何れか一項に記載の方法。
  72. 冷却工程が３０分未満を要する請求項７１に記載の方法。
  73. 核酸配列が生物学的試料中にある請求項５８から７２の何れか一項に記載の方法。
  74. 生物学的試料が組織試料である請求項７３に記載の方法。
  75. 水性組成物が室温で一相を含む請求項５８から７４の何れか一項に記載の方法。
  76. 水性組成物が室温で複数相を含む請求項５８から７４の何れか一項に記載の方法。
  77. 水性組成物の相が混合される請求項７６に記載の方法。
  78. ブロッキング工程を更に含む請求項５８から７７の何れか一項に記載の方法。
  79. 染色体異常に関連する先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断する方法において、
    − 患者からの組織試料を提供し、ここで、組織試料は核酸配列を含み、
    − 請求項５８から７８の何れか一項に記載の方法に従って、染色体異常が核酸配列中に存在するかどうかを決定し、
    − 染色体異常が組織試料中に存在する場合に先天性遺伝子疾患、癌、又は感染を診断する
    ことを含む方法。
  80. 染色体異常に関連するヌクレオチド配列を検出する分子プローブを含む組成物と、１％（ｖ／ｖ）から９５％（ｖ／ｖ）の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒染色体を含有するハイブリダイゼーション組成物の、異常に関連するヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおける使用。
  81. 請求項１から５０の何れか一項に記載の組成物の、請求項８０に記載の使用。
JP2011511111A 2008-05-27 2009-05-27 新規なハイブリダイゼーションバッファーを用いた染色体異常の検出のための組成物及び方法 Expired - Fee Related JP5592357B2 (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5608908P 2008-05-27 2008-05-27
DKPA200800727 2008-05-27
DKPA200800727 2008-05-27
US61/056,089 2008-05-27
US15568309P 2009-02-26 2009-02-26
US61/155,683 2009-02-26
DKPA200900278 2009-02-27
DKPA200900278 2009-02-27
PCT/IB2009/006548 WO2009147537A2 (en) 2008-05-27 2009-05-27 Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2011521635A true JP2011521635A (ja) 2011-07-28
JP2011521635A5 JP2011521635A5 (ja) 2014-07-24
JP5592357B2 JP5592357B2 (ja) 2014-09-17

Family

ID=58714504

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011511111A Expired - Fee Related JP5592357B2 (ja) 2008-05-27 2009-05-27 新規なハイブリダイゼーションバッファーを用いた染色体異常の検出のための組成物及び方法
JP2011511105A Expired - Fee Related JP5588970B2 (ja) 2008-05-27 2009-05-27 ハイブリダイゼーション組成物及び方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011511105A Expired - Fee Related JP5588970B2 (ja) 2008-05-27 2009-05-27 ハイブリダイゼーション組成物及び方法

Country Status (9)

Country Link
US (4) US9297035B2 (ja)
EP (8) EP2285979B2 (ja)
JP (2) JP5592357B2 (ja)
CN (3) CN102084004B (ja)
BR (1) BRPI0912046B1 (ja)
CA (2) CA2724638C (ja)
ES (4) ES2595031T5 (ja)
RU (2) RU2618868C2 (ja)
WO (2) WO2009147537A2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012518430A (ja) * 2009-02-26 2012-08-16 ダコ・デンマーク・エー／エス 試料及びプローブの別々の変性によるハイブリダイゼーションの実施のための組成物及び方法
WO2016133218A1 (ja) * 2015-02-20 2016-08-25 国立大学法人名古屋大学 ホスファフルオレセイン化合物若しくはその塩、又はそれを用いた蛍光色素
JP2021531795A (ja) * 2018-07-27 2021-11-25 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 次世代配列決定用途向けのホルムアミド非含有標的濃縮組成物

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2285979B2 (en) 2008-05-27 2020-02-19 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
CA2781907C (en) * 2009-12-02 2019-07-16 Dako Denmark A/S Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation
EP2569624B1 (en) 2010-05-10 2017-03-15 Mayo Foundation for Medical Education and Research Detection of chromosomal abnormalities associated with endometrial cancer
CN105223357A (zh) * 2010-09-16 2016-01-06 Cbs生物科学有限公司 预测肝癌预后的组合物或试剂盒
EP2668296B1 (en) * 2011-01-25 2018-08-15 Almac Diagnostics Limited Colon cancer gene expression signatures and methods of use
CN104846073B (zh) * 2011-09-16 2018-04-13 上海长海医院 前列腺癌的生物学标志物、治疗靶点及其用途
EP2761028A1 (en) * 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
EP2768974B1 (en) 2011-10-21 2017-07-19 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
WO2013101893A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Abbott Molecular Inc. Compositions and methods for detecting viral infection using direct-label fluorescence in situ hybridization
KR101938699B1 (ko) 2012-07-23 2019-01-16 삼성전자주식회사 Ｌｒｉｇ１의 항 ｃ―ｍｅｔ 항체 적용 대상 환자 선별을 위한 용도
KR102160389B1 (ko) 2013-08-05 2020-09-28 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
GB201319180D0 (en) * 2013-10-30 2013-12-11 Mast Group Ltd Nucleic acid probe
US10253353B2 (en) * 2013-12-06 2019-04-09 The Broad Institute, Inc. Enhanced methods of ribonucleic acid hybridization
US9587268B2 (en) * 2014-01-29 2017-03-07 Agilent Technologies Inc. Fast hybridization for next generation sequencing target enrichment
US9994912B2 (en) 2014-07-03 2018-06-12 Abbott Molecular Inc. Materials and methods for assessing progression of prostate cancer
WO2016050681A1 (en) * 2014-09-29 2016-04-07 Ventana Medical Systems, Inc. MULTIPLEX TP53/CEN17/B CELL GENE-PROTEIN CO-DETECTION ASSAY AND UNIQUELY SPECIFIC PROBES FOR 19q12, INSR, ATM, DLEU2, TP53, and 13q12
WO2016126882A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
ES2753274T5 (es) * 2015-08-21 2023-05-26 42 Life Sciences Gmbh & Co Kg Composición y procedimiento de hibridación
EP3350314A4 (en) 2015-09-18 2019-02-06 Twist Bioscience Corporation BANKS OF OLIGONUCLEIC ACID VARIANTS AND SYNTHESIS THEREOF
KR20180058772A (ko) 2015-09-22 2018-06-01 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
CN108779490A (zh) * 2016-01-08 2018-11-09 雅培分子公司 包含硫氰酸胍的杂交缓冲液
CN105755136B (zh) * 2016-04-13 2017-08-25 武汉康录生物技术有限公司 一种人12号染色体着丝粒探针试剂盒及其制备方法和应用
CN107419001A (zh) * 2016-05-23 2017-12-01 益善生物技术股份有限公司 Brca1、pten基因异常检测试剂盒及检测方法
CN107058565A (zh) * 2016-08-31 2017-08-18 郭军 肢端型黑色素瘤的诊断和治疗
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
WO2018093777A1 (en) * 2016-11-15 2018-05-24 The Regents Of The University Of Michigan Centromere analysis
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
CN107227359A (zh) * 2017-06-19 2017-10-03 福建万科药业有限公司 一种亚型Ph‑likeALL的检测试剂盒及其检测方法
CN107312838A (zh) * 2017-06-28 2017-11-03 广西大学 细胞荧光原位杂交方法
GB2583590A (en) 2017-10-20 2020-11-04 Twist Bioscience Corp Heated nanowells for polynucleotide synthesis
CN112639130B (zh) * 2018-05-18 2024-08-09 特韦斯特生物科学公司 用于核酸杂交的多核苷酸、试剂和方法
CN108998531B (zh) * 2018-08-31 2021-10-01 昆明医科大学第一附属医院 肺癌下调长链非编码rna标志物及其应用
EP3874057A4 (en) 2018-11-01 2022-08-17 Advanced Cell Diagnostics, Inc. PROCEDURE FOR DIGITAL IN SITU MULTIPLEXING OF NUCLEIC ACIDS
US10768173B1 (en) 2019-09-06 2020-09-08 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US10704094B1 (en) * 2018-11-14 2020-07-07 Element Biosciences, Inc. Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding
CN111781356A (zh) * 2019-04-04 2020-10-16 清华大学 一种胃癌极早期细胞标志和胃癌前病变早期细胞标志及其在诊断试剂盒中的应用
CN110172511A (zh) * 2019-05-10 2019-08-27 广州安必平医药科技股份有限公司 用于检测her-2基因扩增水平的探针组、试剂盒及其应用
CN110257483B (zh) * 2019-07-10 2022-08-05 厦门通灵生物医药科技有限公司 用于原位杂交的杂交液、其制备方法及检测试剂盒
AU2020356471A1 (en) 2019-09-23 2022-04-21 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for CRTH2
US11287422B2 (en) 2019-09-23 2022-03-29 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
AU2021368759A1 (en) 2020-10-30 2023-06-22 Element Biosciences, Inc. Reagents for massively parallel nucleic acid sequencing
CN112626180A (zh) * 2020-12-30 2021-04-09 北京思尔成生物技术有限公司 一种dna杂交增强液及其制备方法与应用
CN114561449B (zh) * 2022-02-28 2022-10-14 深圳大学 一种免预杂交的Northern blot杂交液及其应用
CN116144780A (zh) * 2023-03-17 2023-05-23 重庆医科大学 一种慢性淋巴细胞白血病的细胞的遗传学检测方法
CN117247995A (zh) * 2023-09-12 2023-12-19 上海新培晶医学检验所有限公司 一种在g-显带的玻片上进行分子荧光原位杂交处理方法
CN117887813B (zh) * 2023-11-28 2024-07-12 首都医科大学附属北京口腔医院 一种杂交缓冲液与应用
CN118454487A (zh) * 2024-05-20 2024-08-09 上海乐纯生物技术股份有限公司 一种亲水改性聚偏氟乙烯过滤膜的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002088A1 (en) * 1989-07-24 1991-02-21 Microprobe Corporation Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids
WO1994002639A1 (en) * 1992-07-17 1994-02-03 Aprogenex, Inc. Enhancement of probe signal in nucleic acid-mediated in-situ hybridization studies

Family Cites Families (191)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3151405A (en) 1960-12-15 1964-10-06 Ludwig Herbert Ladies' slipper having a plastic bead construction
US4652517A (en) 1984-06-11 1987-03-24 Diagnostic Research Limited Partnership Methods for the in vitro detection and identification of unknown pathogens or genetic entities
US5132207A (en) 1984-07-05 1992-07-21 Gen-Probe Incorporated Accelerated nucleic acid reassociation method
US4888278A (en) 1985-10-22 1989-12-19 University Of Massachusetts Medical Center In-situ hybridization to detect nucleic acid sequences in morphologically intact cells
US6344315B1 (en) 1986-01-16 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Chromosome-specific staining to detect genetic rearrangements associated with chromosome 3 and/or chromosome 17
US6475720B1 (en) 1986-01-16 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Chromosome-specific staining to detect genetic rearrangements associated with chromosome 3 and/or chromosome 17
EP0261955A3 (en) 1986-09-26 1989-06-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for immobilization of dna
US4886741A (en) * 1987-12-09 1989-12-12 Microprobe Corporation Use of volume exclusion agents for the enhancement of in situ hybridization
US4996359A (en) * 1988-03-14 1991-02-26 Arco Chemical Technology, Inc. Process for the preparation of aromatic bis dialkyl ureas
US5869237A (en) 1988-11-15 1999-02-09 Yale University Amplification karyotyping
US6203977B1 (en) 1988-11-15 2001-03-20 Yale University Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization
US5650148A (en) 1988-12-15 1997-07-22 The Regents Of The University Of California Method of grafting genetically modified cells to treat defects, disease or damage of the central nervous system
US5925525A (en) * 1989-06-07 1999-07-20 Affymetrix, Inc. Method of identifying nucleotide differences
US5633129A (en) * 1989-07-13 1997-05-27 Massachusetts Institute Of Technology Electrophoretic detection and separation of mutant DNA using replaceable polymer matrices
US5106730A (en) * 1989-07-24 1992-04-21 Microprobe Corporation Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids
ATE174914T1 (de) 1990-08-30 1999-01-15 Tropix Inc Chemolumineszente 3-(substituierte adamant-2'- ylidene)1,2-dioxetane
GB9024005D0 (en) * 1990-11-05 1990-12-19 British Bio Technology Process for amplifying nucleic acid
WO1992007959A1 (en) 1990-11-05 1992-05-14 Biowhittaker Inc. Homogeneous membrane lytic immunoassay method utilizing contact sensitive liposome formulations
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) * 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) * 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US6228982B1 (en) 1992-05-22 2001-05-08 Benget Norden Double-stranded peptide nucleic acids
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
US5641625A (en) 1992-05-22 1997-06-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids
US5766855A (en) 1991-05-24 1998-06-16 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
GB9211979D0 (en) * 1992-06-05 1992-07-15 Buchard Ole Uses of nucleic acid analogues
EP0662153A1 (en) 1992-07-17 1995-07-12 Aprogenex, Inc. Free radical scavengers useful for reducing autofluorescence in fixed cells
AU5355594A (en) 1992-10-09 1994-05-09 Oncor, Inc. Methods for the detection of chromosome structural abnormalities by (in situ) hybridization to fixed tissue
US5432065A (en) 1993-03-30 1995-07-11 United States Biochemical Corporation Cycle sequencing with non-thermostable DNA polymerases
US5382285A (en) * 1993-04-06 1995-01-17 Regents Of The University Of California Biofoam
US5527675A (en) 1993-08-20 1996-06-18 Millipore Corporation Method for degradation and sequencing of polymers which sequentially eliminate terminal residues
DE4331012A1 (de) * 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
GB2284209A (en) * 1993-11-25 1995-05-31 Ole Buchardt Nucleic acid analogue-induced transcription of RNA from a double-stranded DNA template
US5582985A (en) 1994-08-05 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Detection of mycobacteria
US5705333A (en) 1994-08-05 1998-01-06 The Regents Of The University Of California Peptide-based nucleic acid mimics(PENAMS)
PT778844E (pt) 1994-09-02 2003-04-30 Novartis Ag Complexos funcionais de metais de terpiridina processos para a sua preparacao e conjugados oligonucleotideos com complexos de metais de terpiridina
US5718915A (en) 1994-10-31 1998-02-17 Burstein Laboratories, Inc. Antiviral liposome having coupled target-binding moiety and hydrolytic enzyme
US20010011131A1 (en) 1997-07-28 2001-08-02 Luyten Frank P. DNA molecules encoding cartilage-derived morphogenetic proteins
US5750340A (en) * 1995-04-07 1998-05-12 University Of New Mexico In situ hybridization solution and process
DE19516399A1 (de) 1995-05-04 1996-11-07 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von Polymeren mit wiederkehrenden Succinyleinheiten
CA2237392A1 (en) 1995-11-13 1997-05-22 University Of Rochester Production of somatic mosaicism in mammals using a recombinatorial substrate
US5962227A (en) 1996-07-26 1999-10-05 The Regents Of The University Of California DNA-based diagnostic test for detecting myxobolus, the cause of salmonid whirling disease
US6582921B2 (en) 1996-07-29 2003-06-24 Nanosphere, Inc. Nanoparticles having oligonucleotides attached thereto and uses thereof
US6361940B1 (en) 1996-09-24 2002-03-26 Qiagen Genomics, Inc. Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity
ES2201323T3 (es) 1996-10-04 2004-03-16 Dako A/S Nuevas sondas para la deteccion de micobacterias.
US6329197B2 (en) * 1996-10-09 2001-12-11 Synaptic Pharmaceutical Corporation DNA encoding galanin GALR3 receptors and uses thereof
US5858671A (en) 1996-11-01 1999-01-12 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
EP0970101A2 (en) 1997-03-20 2000-01-12 University Of Washington Solvent for biopolymer synthesis, solvent microdroplets and methods of use
US6716625B1 (en) 1997-04-16 2004-04-06 Claude Selitrennikoff Histidine kinases of Aspergillus and other fungal species, related compositions, and methods of use
US6534273B2 (en) 1997-05-02 2003-03-18 Gen-Probe Incorporated Two-step hybridization and capture of a polynucleotide
EP0878552A1 (en) 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
US6107470A (en) * 1997-05-29 2000-08-22 Nielsen; Peter E. Histidine-containing peptide nucleic acids
CA2242035C (en) * 1997-07-01 2004-11-23 Transgene S.A. Compositions useful for transferring therapeutically active substances into a target cell, and their use in gene therapy
WO1999009390A1 (en) * 1997-08-20 1999-02-25 The University Of Miami A high quality, continuous throughput, tissue fixation-dehydration-fat removal-impregnation method
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
ES2242291T5 (es) 1997-09-12 2016-03-11 Exiqon A/S Análogos de nucleósidos bicíclicos y tricíclicos, nucleótidos y oligonucleótidos
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20020192659A1 (en) 1997-09-17 2002-12-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
DE59802413D1 (de) * 1997-09-24 2002-01-24 Infineon Technologies Ag o-Amino(thio)phenol-carbonsäuren und deren Herstellung
BR9814904A (pt) * 1997-11-26 2000-10-03 Zymogenetics Inc Polinucleotìdeo isolado que codifica um polipeptìdeo, polipeptìdeo isolado, e, anticorpo.
US5972615A (en) * 1998-01-21 1999-10-26 Urocor, Inc. Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate disease
US6043039A (en) 1998-02-17 2000-03-28 Applied Spectral Imaging Method of and composite for in situ fluorescent hybridization
US6405609B1 (en) 1998-02-27 2002-06-18 Ventana Medical Systems, Inc. System and method of aspirating and dispensing reagent
US7396508B1 (en) 2000-07-12 2008-07-08 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US6265168B1 (en) 1998-10-06 2001-07-24 Transgenomic, Inc. Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides
US6287772B1 (en) 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
AU3516899A (en) 1998-05-04 1999-11-23 Dako A/S Method and probes for the detection of chromosome aberrations
US6586176B1 (en) 1998-08-07 2003-07-01 Cellay, Llc Gel microdrops in genetic analysis
ES2279629T3 (es) * 1998-08-24 2007-08-16 Fuso Pharmaceutical Industries Ltd. Nueva colectina.
US20080050393A1 (en) * 1998-12-03 2008-02-28 Tang Y Tom Novel nucleic acids and polypeptides
EP1013772A1 (en) * 1998-12-21 2000-06-28 Transgene S.A. Method for preparing suspension of stable posiplexes
US6331618B1 (en) * 1999-05-13 2001-12-18 Pe Corporation (Ny) Compositions of solvents and high concentrations of nucleic acid analogs
US6300073B1 (en) 1999-10-01 2001-10-09 Clontech Laboratories, Inc. One step RT-PCR methods, enzyme mixes and kits for use in practicing the same
WO2001029265A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 Ventana Medical Systems, Inc. Method of detecting single gene copies in-situ
US8012471B2 (en) 1999-11-19 2011-09-06 Abbott Healthcare Products B.V. Screening and treatment methods using IGS5 enzymes of the metalloprotease family
US20010031468A1 (en) 2000-02-08 2001-10-18 Alex Chenchik Analyte assays employing universal arrays
WO2001066804A2 (en) 2000-03-09 2001-09-13 Protogene Laboratories, Inc. Methods for optimizing hybridization performance of polynucleotide probes and localizing and detecting sequence variations
US6617131B2 (en) 2000-03-21 2003-09-09 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Nucleic acid molecule encoding the potassium channel protein, KCNQ5
US6969587B2 (en) 2000-04-04 2005-11-29 Taylor Paul D Detection of nucleic acid heteroduplex molecules by anion-exchange chromatography
US20040048376A1 (en) 2000-04-10 2004-03-11 Benoit Chabot Methods for modulating splicing and/or alternative splicing, and for identifying alternatively spliced units in genes
AU2001246404A1 (en) 2000-04-14 2001-10-30 Novozymes A/S Polypeptides having haloperoxidase activity
US7482151B2 (en) 2000-05-19 2009-01-27 Aquaria, Inc. Method of using ammonia-oxidizing bacteria
DE60125243T2 (de) 2000-07-03 2007-05-31 Applera Corp., Foster City Polynukleotid-sequenzassay
US6716829B2 (en) 2000-07-27 2004-04-06 Pharmacia Corporation Aldosterone antagonist and cyclooxygenase-2 inhibitor combination therapy to prevent or treat inflammation-related cardiovascular disorders
US6942970B2 (en) 2000-09-14 2005-09-13 Zymed Laboratories, Inc. Identifying subjects suitable for topoisomerase II inhibitor treatment
AU2001294542B8 (en) 2000-09-15 2008-07-03 Ventana Medical Systems, Inc Oligonucleotide sequence formula for labeling oligonucleotide probes and proteins for in-situ analysis
WO2002023156A1 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Biogenex Laboratories Enhancement of in situ hybridization
US20040030093A1 (en) * 2000-09-28 2004-02-12 Yoko Sakurai Metal catalyst for ring-opening polymerization of heterocyclic compound
JP2002112777A (ja) 2000-10-03 2002-04-16 Livestock Improvement Association Of Japan Inc 新規精巣特異的遺伝子
DE10053047A1 (de) 2000-10-13 2002-06-06 Univ Lausanne Epalinges Verwendung von Caveolin-1 oder des Gens desselben zur Behandlung von nichtsteroidabhängigem Karzinom
US7309573B2 (en) 2000-11-21 2007-12-18 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
EP1377679B1 (en) * 2000-12-14 2009-10-28 Gen-Probe Incorporated Method and kit for enhancing the association rates of polynucleotides
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
WO2003014398A2 (en) 2001-01-03 2003-02-20 Transgenomic, Inc. Methods and compositions for mutation detection by liquid chromatography
US6656685B2 (en) 2001-01-29 2003-12-02 Ventana Medical Systems, Inc. Hybridization buffers using low molecular weight dextran sulfate and methods for their use
US6949368B2 (en) 2001-01-30 2005-09-27 The Trustees Of Princeton University Compositions and methods for enhancing polynucleotide amplification reactions
US8252531B2 (en) 2001-04-26 2012-08-28 Nof Corporation Nonspecific hybridization inhibitors, clinical examination reagents and clinical examination method
ES2400448T3 (es) 2001-04-30 2013-04-10 Ventana Medical Systems, Inc. Reactivos y métodos para la hibridación automatizada in situ o para microarray
CN1384203A (zh) 2001-04-30 2002-12-11 香港科技创业股份有限公司 具有高度延伸专一性的dna低温循环延伸反应方法
US7297494B2 (en) 2001-06-25 2007-11-20 Georgia Tech Research Corporation Activatable probes and methods for in vivo gene detection
US7297553B2 (en) 2002-05-28 2007-11-20 Nanosphere, Inc. Method for attachment of silylated molecules to glass surfaces
US20030108903A1 (en) 2001-07-19 2003-06-12 Liman Wang Multiple word DNA computing on surfaces
EP1424392B1 (en) 2001-09-03 2012-10-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited RF-peptide ligands of G-protein coupled receptor
WO2003027328A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to the suppression of detectable probe binding to randomly distributed repeat sequences in genomic nucleic acid
US20040106109A1 (en) 2001-10-02 2004-06-03 Belly Robert T Detection of ras mutations
US7132236B2 (en) 2001-10-25 2006-11-07 Agilent Technologies, Inc. Composition and method for optimized hybridization using modified solutions
US6783940B2 (en) 2001-10-31 2004-08-31 Applera Corporation Method of reducing non-specific amplification in PCR
DE10154291B4 (de) * 2001-11-05 2005-05-19 Hain Lifescience Gmbh Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes
US20060270595A1 (en) 2001-12-18 2006-11-30 Denis Jullien Nucleic acids encoding compositions of THAP-family chemokine binding domains
US7153390B2 (en) 2001-12-31 2006-12-26 Kimberly-Clark Wordwide, Inc. Process for manufacturing a cellulosic paper product exhibiting reduced malodor
ES2377188T3 (es) * 2002-01-18 2012-03-23 Zymogenetics, Inc. Nuevo ligando de citocina ZCYTOR17
US7772383B2 (en) 2002-01-25 2010-08-10 The Trustees Of Princeton University Chemical PCR: Compositions for enhancing polynucleotide amplification reactions
US7456219B2 (en) 2002-03-04 2008-11-25 Merck Hdac Research, Llc Polymorphs of suberoylanilide hydroxamic acid
US20060030541A1 (en) 2002-04-05 2006-02-09 Proskelia Genes involved in osteogenesis, and methods of use
CA2490413C (en) 2002-07-02 2011-08-30 Nanosphere, Inc. Nanoparticle polyanion conjugates and methods of use thereof in detecting analytes
US20040029184A1 (en) 2002-08-09 2004-02-12 Pickcell Laboratories B.V. Method for antigen retrieval and submersion fluid compositions for use therein
TWI228511B (en) * 2002-10-25 2005-03-01 Univ Nat Cheng Kung Genes controlling floral development in orchid
AU2003269379A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-25 Pfizer Products Inc. Suspension method for producing embryoid bodies, and compositions and methods related thereto
US7517697B2 (en) * 2003-02-05 2009-04-14 Applied Biosystems, Llc Compositions and methods for preserving RNA in biological samples
US7601491B2 (en) 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
US20040224343A1 (en) 2003-05-06 2004-11-11 Biochain Inc. Methods and products to enhance interactions among molecules
US7064196B2 (en) 2003-05-20 2006-06-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes encoding carotenoid compounds
US20040241666A1 (en) 2003-05-30 2004-12-02 Amorese Douglas A. Ligand array assays that include an organic fluid wash step and compositions for practicing the same
US20050250094A1 (en) 2003-05-30 2005-11-10 Nanosphere, Inc. Method for detecting analytes based on evanescent illumination and scatter-based detection of nanoparticle probe complexes
US20050064472A1 (en) 2003-07-23 2005-03-24 Affymetrix, Inc. Methods of monitoring gene expression
WO2005033333A2 (en) 2003-10-07 2005-04-14 Dako Denmark A/S Methods and compositions for the diagnosis of cancer
CA2482097C (en) 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
US20050191657A1 (en) * 2003-11-18 2005-09-01 Demorest David M. Stringency modifiers in hybridization assays
ES2614425T3 (es) 2004-01-08 2017-05-31 Dako Denmark A/S Aparato y métodos para el procesamiento de muestras biológicas y un depósito para los mismos
JP2005300998A (ja) 2004-04-13 2005-10-27 Tokyo Ohka Kogyo Co Ltd ポジ型レジスト組成物及びレジストパターン形成方法
KR100798202B1 (ko) 2004-04-15 2008-01-24 에프. 호프만-라 로슈 아게 피리다진온 화합물의 제조방법
EP1745156A2 (en) 2004-05-04 2007-01-24 Dako Denmark A/S Methods for detecting chromosome aberrations
US20060024751A1 (en) 2004-06-03 2006-02-02 Fluidigm Corporation Scale-up methods and systems for performing the same
CN1989245A (zh) * 2004-06-14 2007-06-27 株式会社嘉尔药物 新型半乳凝素8变体蛋白质以及其用途
JP2008506379A (ja) 2004-07-16 2008-03-06 オイ ユリラブ アェルテーデー ２型糖尿病の危険性の検出及び治療のための方法
US7867443B2 (en) 2004-07-23 2011-01-11 Dako Denmark A/S Method and apparatus for automated pre-treatment and processing of biological samples
WO2006073504A2 (en) 2004-08-04 2006-07-13 President And Fellows Of Harvard College Wobble sequencing
DE602005024987D1 (de) 2004-08-24 2011-01-05 Cornell Res Foundation Inc Detektion von nucleinsäureunterschieden mit hilfe von endonucleasespaltungs-/ligaseabgabereaktionen und kapillarelektrophoresen oder mikroarrays
US20060147957A1 (en) * 2004-11-12 2006-07-06 Affymetrix, Inc. Methods for high throughput sample preparation for microarray analysis
RU2007126770A (ru) 2004-12-15 2009-01-27 Бристол-Маерс Сквибб Компани (Us) Кристаллические формы ингибитора фактора ха
EP1836471A2 (en) 2004-12-17 2007-09-26 Ventana Medical Systems, Inc. High temperature tissue conditioning with low volatility solutions and applications
JP2008526204A (ja) * 2004-12-30 2008-07-24 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション φ１５ＤＮＡポリメラーゼ
US20080318226A1 (en) 2005-02-28 2008-12-25 Eisair & Dmanagement Co., Ltd. Signal Amplification Method
PT103257B (pt) 2005-04-05 2007-05-31 Inst Superior Tecnico Método de produção subcrítica de xerogéis e aerogéis monolíticos híbridos de sílica e látex modificado com grupos alcoxissilano
EP1877581B1 (en) * 2005-05-06 2012-03-28 Gen-Probe Incorporated Methods and products for nucleic acid target capture
CA2618060A1 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Xm Satellite Radio Inc. Broadcast signal interface device and method thereof
US8019560B2 (en) 2005-09-28 2011-09-13 Nec Corporation Signal measuring device
WO2007037341A1 (ja) 2005-09-29 2007-04-05 Toto Ltd. 光電流を用いた被検物質の特異的検出方法、それに用いられる電極、測定用セルおよび測定装置
WO2007058326A1 (ja) 2005-11-17 2007-05-24 Japan Science And Technology Agency 特定の塩基配列の標的核酸類を検出する方法、及び検出のための核酸類セット
US20070141583A1 (en) 2005-12-20 2007-06-21 Weiwei Li Methods of rapid chromatin immunoprecipitation
US7807354B2 (en) * 2005-12-28 2010-10-05 Agilent Technologies, Inc. Low volume hybridization
CA2640464A1 (en) * 2006-03-13 2007-09-20 Ikonisys, Inc. Method for combining immunostaining and fish using covalently binding fluorophores
RU2338787C2 (ru) * 2006-03-15 2008-11-20 Институт белка Российской академии наук Обнаружение молекулярных колоний посредством гибридизации на мембранах с флуоресцентными зондами
US7820883B2 (en) 2006-03-15 2010-10-26 Dow Agrosciences Llc Resistance to auxinic herbicides
BRPI0708949B1 (pt) * 2006-03-20 2017-04-04 Novozymes As métodos para degradar ou converter um material celulósico, para produzir uma susbtância, e para produzir um polipeptídeo tendo atividade endoglucanase, e, célula microbiana recombinante
DE602006015364D1 (de) 2006-03-29 2010-08-19 Huawei Tech Co Ltd Verfahren und anwendung von reduzierung einer verkehrsunterbrechung eines endgeräts während einer ps-handover-prozedur der mobilkommunikation
EP1870411B1 (en) 2006-06-21 2016-03-16 Fidia Farmaceutici S.p.A. Process for the preparation and purification of valgancyclovir
WO2008018839A1 (en) 2006-08-09 2008-02-14 National University Of Singapore Method for molecular biology applications
US7846703B2 (en) 2006-10-02 2010-12-07 Takara Bio Inc. Method for enhancing polymerase activity
GB0701253D0 (en) 2007-01-23 2007-02-28 Diagnostics For The Real World Nucleic acid amplification and testing
US8686129B2 (en) 2007-03-20 2014-04-01 Agilent Technologies, Inc. Methods for the separation of biological molecules using sulfolane
ATE490961T1 (de) 2007-04-24 2010-12-15 Hoffmann La Roche Verfahren für hcv-proteasehemmerzwischenprodukt
US8841437B2 (en) 2008-06-20 2014-09-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Precursor miRNA loop-modulated target regulation
AU2008298560A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Ventana Medical Systems, Inc. Prostate cancer biomarkers
EP2235496B1 (en) 2007-12-10 2015-10-14 Dako Denmark A/S A tissue processing apparatus
US9409166B2 (en) 2007-12-10 2016-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Integrated PCR reactor for cell lysis, nucleic acid isolation and purification, and nucleic acid amplication related applications
US9261508B2 (en) 2008-04-25 2016-02-16 Istituto Superiore Di Sanita Antisense RNA for treating cancer and inhibition of metastasis and vectors for antisense sequestration
EP2285979B2 (en) 2008-05-27 2020-02-19 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
ITMI20081002A1 (it) 2008-05-30 2009-11-30 Kardia S R L Dispositivo per il trattamento di occlusioni arteriose degli arti inferiori
EP2303292A4 (en) * 2008-06-09 2013-01-02 New York Medical College COMPOSITIONS WITH CARDIAL STEM CELLS WITH OVEREXPRESSION OF SPECIFIC MICRORNAS AND METHOD FOR THEIR USE IN THE REPAIR OF THE CARED MYOCARDIC
EP2684734B1 (en) 2008-06-12 2017-04-12 Massachusetts Institute Of Technology High energy density redox flow device
US7750208B2 (en) 2008-07-09 2010-07-06 National Taiwan University Anther-specific expression promoter in plant and application thereof
WO2010088517A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and systems for purifying transferring and/or manipulating nucleic acids
US9303287B2 (en) 2009-02-26 2016-04-05 Dako Denmark A/S Compositions and methods for RNA hybridization applications
EP2411532B1 (en) 2009-03-24 2017-04-05 Asuragen, Inc. Pcr methods for characterizing the 5' untranslated region of the fmr1 and fmr2 genes
CA2781907C (en) 2009-12-02 2019-07-16 Dako Denmark A/S Compositions and methods for performing hybridizations with no denaturation
EP2576515B1 (en) 2010-05-28 2014-04-16 Syngenta Participations AG Pyrazolecarboxamide derivatives and their use as microbiocides
BR112012030813A2 (pt) 2010-06-03 2017-06-20 Cellay Inc "métodos e kits para detecção in situ de sequências de nucleotídeo"
EP2686662B1 (en) 2011-02-28 2022-01-19 Agilent Technologies, Inc. Two phase immiscible system for the pretreatment of embedded biological samples
EP2761028A1 (en) 2011-09-30 2014-08-06 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods using formamide
EP2768974B1 (en) 2011-10-21 2017-07-19 Dako Denmark A/S Hybridization compositions and methods
US9651549B2 (en) 2012-07-13 2017-05-16 Genisphere, Llc Lateral flow assays using DNA dendrimers
WO2014070460A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Cellay, Inc. Methods and kits for performing in situ hybridization
GB201303666D0 (en) 2013-03-01 2013-04-17 Goldsborough Andrew S Sample fixation and stabilisation
WO2014138688A1 (en) 2013-03-07 2014-09-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Repetitive reverse transcription partition assay
SG10201805453XA (en) 2013-04-25 2018-08-30 Firefly Bioworks Inc Multiplexed analysis of target nucleic acids
AU2014373792A1 (en) 2013-12-30 2016-07-07 Genomatix Genomic rearrangements associated with prostate cancer and methods of using the same
CN103966321A (zh) 2014-04-24 2014-08-06 哈尔滨工业大学（威海） 一种区域选择性抗生物污染阵列芯片的制备方法
WO2015184144A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Rare molecule signal amplification
CN104032033B (zh) 2014-07-07 2015-09-23 玉峰惠仁生物医药科技（北京）有限公司 用于荧光原位杂交检测粪肠球菌和/或其他肠球菌的肽核酸探针组及其试剂盒、使用方法、用途
WO2016125091A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Alma Mater Studiorum Universita Di Bologna Additive for accelerating hybridization

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991002088A1 (en) * 1989-07-24 1991-02-21 Microprobe Corporation Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids
WO1994002639A1 (en) * 1992-07-17 1994-02-03 Aprogenex, Inc. Enhancement of probe signal in nucleic acid-mediated in-situ hybridization studies

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012518430A (ja) * 2009-02-26 2012-08-16 ダコ・デンマーク・エー／エス 試料及びプローブの別々の変性によるハイブリダイゼーションの実施のための組成物及び方法
WO2016133218A1 (ja) * 2015-02-20 2016-08-25 国立大学法人名古屋大学 ホスファフルオレセイン化合物若しくはその塩、又はそれを用いた蛍光色素
JP2021531795A (ja) * 2018-07-27 2021-11-25 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 次世代配列決定用途向けのホルムアミド非含有標的濃縮組成物
JP7090793B2 (ja) 2018-07-27 2022-06-24 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 次世代配列決定用途向けのホルムアミド非含有標的濃縮組成物

Also Published As

Publication number Publication date
ES2595031T3 (es) 2016-12-27
CN102084004A (zh) 2011-06-01
EP2285982A2 (en) 2011-02-23
US20240124922A1 (en) 2024-04-18
EP3733871A1 (en) 2020-11-04
US11834703B2 (en) 2023-12-05
EP2636757B1 (en) 2016-11-23
ES2610588T3 (es) 2017-04-28
EP3219812B1 (en) 2020-09-02
RU2505609C2 (ru) 2014-01-27
JP5592357B2 (ja) 2014-09-17
US20110229975A1 (en) 2011-09-22
US9297035B2 (en) 2016-03-29
CN107254513B (zh) 2021-04-20
EP3138925B8 (en) 2020-06-17
US20110281263A1 (en) 2011-11-17
EP3138925A1 (en) 2017-03-08
JP2011522531A (ja) 2011-08-04
CA2724638C (en) 2020-02-18
US20220064716A1 (en) 2022-03-03
JP5588970B2 (ja) 2014-09-10
CA2724552C (en) 2018-10-09
RU2010151495A (ru) 2012-07-10
CA2724638A1 (en) 2009-12-03
CN107254513A (zh) 2017-10-17
EP3360973A1 (en) 2018-08-15
BRPI0912046B1 (pt) 2020-11-24
RU2010151493A (ru) 2012-07-10
ES2595031T5 (es) 2020-05-28
CN102046808B (zh) 2017-05-17
CN102046808A (zh) 2011-05-04
EP2636756B1 (en) 2016-07-20
EP2636757A1 (en) 2013-09-11
CA2724552A1 (en) 2009-12-10
ES2613481T3 (es) 2017-05-24
ES2613481T5 (es) 2020-08-11
EP3219812A1 (en) 2017-09-20
EP2285979A1 (en) 2011-02-23
EP2285979B1 (en) 2017-01-11
EP2285982B1 (en) 2018-04-11
EP2636756A1 (en) 2013-09-11
WO2009144581A1 (en) 2009-12-03
BRPI0912046A2 (pt) 2017-06-20
WO2009147537A3 (en) 2010-04-01
ES2668555T3 (es) 2018-05-18
EP3138925B1 (en) 2020-05-13
US11118214B2 (en) 2021-09-14
RU2618868C2 (ru) 2017-05-11
EP2636756B2 (en) 2019-11-20
EP2285979B2 (en) 2020-02-19
CN102084004B (zh) 2016-01-20
WO2009147537A2 (en) 2009-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5592357B2 (ja) 新規なハイブリダイゼーションバッファーを用いた染色体異常の検出のための組成物及び方法
JP6091753B2 (ja) 試料及びプローブの別々の変性によるハイブリダイゼーションの実施のための組成物及び方法
BRPI0912041B1 (pt) Método de hibridização in situ para determinar a presença de uma aberração cromossômico em dna cromossômico,composição de hibridização, uso da mesma e kit

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120525

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20120525

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20131203

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140226

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140305

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140401

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140408

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140430

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140509

A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20140603

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20140701

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20140731

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5592357

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113

S531 Written request for registration of change of domicile

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees
R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350