ES2613481T3 - Composiciones de hibridación y métodos - Google Patents

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Abstract

Composicion de hibridacion que comprende al menos una sonda de hibridacion in situ, aproximadamente el 1%-95% (v/v) de al menos un disolvente aprotico polar que tiene estructura base ciclica en una cantidad eficaz para desnaturalizar secuencias de nucleotidos de doble hebra y una disolucion de hibridacion que comprende al menos un componente adicional seleccionado del grupo que consiste en: agentes tamponantes, sales, agentes acelerantes, agentes quelantes, detergentes y agentes de bloqueo, en la que el disolvente aprotico polar se selecciona del grupo que consiste en:**Fórmula**

Description

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“Disolvente aprótico polar” se refiere a un disolvente orgánico que tiene un momento dipolar de aproximadamente 2 unidades debye o más, una solubilidad en agua de al menos aproximadamente el 5% (volumen) a o cerca de la temperatura ambiental, es decir, aproximadamente 20ºC, y que no experimenta un intercambio significativo de hidrógeno a pH aproximadamente neutro, es decir, en el intervalo de 5 a 9, o en el intervalo 6 a 8. Los disolventes apróticos polares incluyen los definidos según los parámetros de solubilidad de Hansen comentados a continuación.
“Alquildiilo” se refiere a un radical hidrocarbonado saturado o insaturado, ramificado, de cadena lineal o cíclico que tiene dos centros radicálicos monovalentes derivados mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de cada uno de dos átomos de carbono diferentes de un alcano, alqueno o alquino original.
“Disolución acuosa” ha de entenderse como una disolución que contiene agua, incluso pequeñas cantidades de agua. Por ejemplo, una disolución que contiene el 1% de agua ha de entenderse como una disolución acuosa.
“Hibridación” ha de entenderse como incorporar tanto las etapas de desnaturalización como de reapareamiento del procedimiento de hibridación a menos que se especifique de otro modo.
“Composición de hibridación” se refiere a una disolución acuosa de la invención para realizar un procedimiento de hibridación, por ejemplo, para unir una sonda a una secuencia de ácido nucleico. Las composiciones de hibridación pueden comprender, por ejemplo, al menos un disolvente aprótico polar, al menos una secuencia de ácido nucleico, y una disolución de hibridación. Las composiciones de hibridación no comprenden enzimas u otros componentes, tales como desoxinucleósidos trifosfato (dNTP), para amplificar ácidos nucleicos en una muestra biológica.
“Disolución de hibridación” se refiere a una disolución acuosa para su uso en una composición de hibridación de la invención. Se comentan las disoluciones de hibridación en detalle a continuación y pueden comprender, por ejemplo, agentes tamponantes, agentes acelerantes, agentes quelantes, sales, detergentes y agentes de bloqueo.
“Composición de PCR” se refiere a una disolución acuosa de la invención para realizar un procedimiento de hibridación para amplificar una secuencia de ácido nucleico. Las composiciones de PCR pueden comprender, por ejemplo, al menos un disolvente aprótico polar, al menos una enzima para amplificar ácidos nucleicos, un conjunto de cebadores oligonucleotídicos de ácido nucleico, una mezcla de dNTP y una disolución de PCR.
“Disolución de PCR” se refiere a una disolución acuosa para su uso en una composición de PCR de la invención. Las disoluciones de PCR pueden comprender por ejemplo, agentes tamponantes, agentes acelerantes, agentes quelantes, sales y detergentes.
“Parámetros de solubilidad de Hansen” y “HSP” se refieren a los siguientes parámetros de energía de cohesión (solubilidad): (1) el parámetro de solubilidad en dispersión (δD, “parámetro D”), que mide interacciones apolares derivadas de las fuerzas atómicas; (2) el parámetro de solubilidad en medio polar (δP, “parámetro P”), que mide interacciones de dipolo permanente-dipolo permanente; y (3) el parámetro de solubilidad por enlaces de hidrógeno (δH, “parámetro H”), que mide el intercambio de electrones. Los parámetros de solubilidad de Hansen se definen adicionalmente a continuación.
“Secuencias repetitivas” ha de entenderse como que se refiere al rápido reapareamiento (aproximadamente el 25%) y/o reapareamiento intermedio (aproximadamente 30%) de componentes de genomas de mamíferos. Los componentes de rápido reapareamiento contienen secuencias altamente repetitivas pequeñas (de unos pocos nucleótidos de largo) que se encuentran habitualmente en tándem (por ejemplo, ADN satélite), mientras que los componentes de reapareamiento intermedio contienen ADN repetitivo disperso. Las secuencias repetidas dispersas se clasifican como o bien SINE (secuencias repetidas dispersas cortas) o LINE (secuencias repetidas dispersas largas), que se clasifican ambas como retrotransposones en primates. Las SINE y LINE incluyen, pero no se limitan a, repeticiones de Alu, repeticiones de Kpn, repeticiones de dinucleótido, repeticiones de trinucleótido, repeticiones de tetranucleótido, repeticiones de pentanucleótido y repeticiones de hexanucleótido. Las repeticiones de Alu componen la mayoría de SINE humanas y se caracterizan por una secuencia consenso de aproximadamente 280 a 300 pb que consisten en dos secuencias similares dispuestas como dímero de cabeza a cola. Además de SINE y LINE, también existen secuencias repetidas en telómeros de cromosomas en los extremos terminales de cromosomas y centrómeros de cromosoma, que contienen distintas secuencias repetidas que sólo existen en la región central de un cromosoma. Sin embargo, a diferencia de las SINE y LINE, que se dispersan aleatoriamente en la totalidad del genoma completo, las secuencias repetidas de telómero y centrómero se localizan en una determinada región del cromosoma.
“No tóxico” y “toxicidad reducida” se definen con respecto al etiquetado de toxicidad de formamida según “Directive 1999/45/EC of the European Parliament and of the Council of 31 May 1999 concerning the approximation of the laws, regulations and administrative provisions of the Member States relating to the classification, packaging, and labelling of dangerous preparations” (ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf) (“Directiva”). Según la Directiva, la toxicidad se define usando el siguiente orden de clasificación: T+ “muy tóxico”; T “tóxico”, C “corrosivo”, Xn “dañino”, .Xi “irritante”. Las frases de riesgo (“frases R”) describen los riesgos de la toxicidad clasificada. La formamida se enumera como T (tóxico) y R61 (puede provocar daños al feto). Todos los productos químicos siguientes se clasifican como menos tóxicos que la formamida: acetonitrilo (Xn, R11, R20, R21, R22, R36); sulfolano (Xn, R22); γ
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butirolactona (Xn, R22, R32); y carbonato de etileno (Xi, R36, R37, R38). En el momento de presentar esta solicitud, no están etiquetados actualmente el tritiocarbonato de etileno y sulfito de glicol.
B. Selección de disolvente Los disolventes apróticos polares para su uso en la invención (“disolventes apróticos polares de la invención”) son
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, ,,y .
Los disolventes apróticos polares incluyendo, entre otros, los disolventes apróticos polares de la invención, pueden seleccionarse basándose en sus parámetros de solubilidad de Hansen. Se conocen en la técnica métodos para determinar experimentalmente y/o calcular HSP para un disolvente, y se han notificado HSP para más de 1200 productos químicos.
Por ejemplo, el parámetro D puede calcularse con una exactitud razonable basándose en el índice de refracción, o puede derivarse de tablas mediante comparación con disolventes conocidos de tamaño, forma y composición similares después del establecimiento de una temperatura crítica y un volumen molar. El parámetro P puede estimarse a partir de momentos dipolares conocidos (véase, por ejemplo, McClellan A.L., Tables of Experimental Dipole Moments (W.H. Freeman 1963)) usando la ecuación 1:
Ecuación 1: δP = 37,4(momento dipolar)/V1/2
en la que V es el volumen molar. No existen ecuaciones para calcular el parámetro H. En su lugar, habitualmente se determina el parámetro H basándose en contribuciones de grupos.
Las caracterizaciones de HSP se visualizan convenientemente usando una representación esférica, con los HSP de un disolvente de referencia adecuado determinado experimentalmente en el centro de la esfera. El radio de la esfera
(R) indica la variación máxima tolerable con respecto a los HSP del disolvente de referencia que todavía permite que tenga lugar una “buena” interacción. Los buenos disolventes están dentro de la esfera y los malos están fuera. La distancia, Ra, entre dos disolventes basándose en sus valores de HSP respectivos puede determinarse usando la ecuación 2:
Ecuación 2: (Ra)2 = 4(δD1 -δD2)2 + (δP1 -δP2)2 (δH1 -δH2)2
en la que el subíndice 1 indica la muestra de referencia, el subíndice 2 indica el producto químico de prueba, y todos MPa1/2
los valores son en . Una buena solubilidad requiere que Ra sea menor que el radio determinado experimentalmente de la esfera de solubilidad Ro. La diferencia de energía relativa entre dos disolventes, es decir, el número RED, puede calcularse tomando la razón de Ra con respecto a Ro, tal como se muestra en la ecuación 3.
Ecuación 3: RED = Ra/Ro
Números RED de menos de 1,0 indican alta afinidad; números RED iguales o próximos a 1,0 indican condiciones límite; y números RED progresivamente mayores indican afinidades progresivamente menores.
En algunas realizaciones y divulgaciones, los parámetros D de los disolventes apróticos polares, incluyendo entre otros los disolventes apróticos polares de la invención, son de entre 17,7 y 22,0 MPa1/2 . Tales parámetros D relativamente altos se asocian generalmente con disolventes que tienen estructuras cíclicas y/o estructuras con azufre o halógenos. No es probable que los compuestos lineales estén entre los disolventes apróticos polares más adecuados para su uso en la invención, pero pueden considerarse si sus parámetros P y H están dentro de los intervalos comentados a continuación. Puesto que el parámetro D se multiplica por 4 en la ecuación 2, los límites son la mitad de Ro. Además, debe observase que valores de D de aproximadamente 21 o mayores son a menudo característicos de un sólido.
En algunas realizaciones y divulgaciones, los parámetros P de los disolventes apróticos polares, incluyendo entre otros los disolventes apróticos polares de la invención, son de entre 13 y 23 MPa1/2 . Tales parámetros P excepcionalmente altos se asocian generalmente con disolventes que tienen un alto momento dipolar y presumiblemente también un volumen molecular relativamente bajo. Por ejemplo, para V cerca de 60 cc/mol, el momento dipolar debe ser de entre 4,5 y 3,1. Para V cerca de 90 cc/mol, el momento dipolar debe ser de entre 5,6 y 3,9.
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apróticos polares de la invención). Tabla 2
Disolvente
D P H
Acetanilida
20,6 13,3 12,4
N-Acetil-pirrrolidona
17,8 13,1 8,3
4-Aminopiridina
20,4 16,1 12,9
Benzamida
21,2 14,7 11,2
Bencimidazol
20,6 14,9 11,0
1,2,3-Benzotriazol
18,7 15,6 12,4
Dióxido de butadieno
18,3 14,4 6,2
Carbonato de 2,3-butileno
18,0 16,8 3,1
Caprolactona (épsilon)
19,7 15,0 7,4
Anhídrido cloromaleico
20,4 17,3 11,5
2-Clorociclohexanona
18,5 13,0 5,1
Cloronitrometano
17,4 13,5 5,5
Anhídrido citracónico
19,2 17,0 11,2
Crotonolactona
19,0 19,8 9,6
Ciclopropilnitrilo
18,6 16,2 5,7
Sulfato de dimetilo
17,7 17,0 9,7
Dimetilsulfona
19,0 19,4 12,3
Dimetilsulfóxido
18,4 16,4 10,2
1,2-Dinitrobenceno
20,6 22,7 5,4
2,4-Dinitrotolueno
20,0 13,1 4,9
Difenilsulfona
21,1 14,4 3,4
1,2-Dinitrobenceno
20,6 22,7 5,4
2,4-Dinitrotolueno
20,0 13,1 4,9
Cloruro de etanosulfonilo
17,7 14,9 6,8
Furfural
18,6 14,9 5,1
2-Furonitrilo
18,4 15,0 8,2
Isoxazol
18,8 13,4 11,2
Anhídrido maleico
20,2 18,1 12,6
Malononitrilo
17,7 18,4 6,7
4-Metoxibenzonitrilo
19,4 16,7 5,4
1-Metoxi-2-nitrobenceno
19,6 16,3 5,5
1-Metil-imidazol
19,7 15,6 11,2
3-Metil-isoxazol
19,4 14,8 11,8
N-Óxido de N-metil-morfolina
19,0 16,1 10,2
Metil-fenilo-sulfona
20,0 16,9 7,8
Metil-sulfolano
19,4 17,4 5,3
4-Toluenosulfonato de metilo
19,6 15,3 3,8
3-Nitroanilina
21,2 18,7 10,3
2-Nitrotiofeno
19,7 16,2 8,2
9,10-Fenantrenoquinona
20,3 17,1 4,8
Anhídrido ftálico
20,6 20,1 10,1
1,3-Propanosultona
18,4 16,0 9,0
beta-Propiolactona
19,7 18,2 10,3
Sacarina
21,0 13,9 8,8
Succinonitrilo
17,9 16,2 7,9
Sulfanilamida
20,0 19,5 10,7
Sulfolano
20,3 18,2 10,9
2,2,6,6-Tetraclorociclohexanona
19,5 14,0 6,3
Tiazol
20,5 18,8 10,8
3,3,3-Tricloropropeno
17,7 15,5 3,4
1,1,2-Tricloropropeno
17,7 15,7 3,4
1,2,3-Tricloropropeno
17,8 15,7 3,4
La tabla 2 expone una lista a modo de ejemplo de disolventes apróticos polares que no son disolventes apróticos polares de la invención basándose en sus parámetros de solubilidad de Hansen. Otros compuestos, naturalmente, también pueden satisfacer estos requisitos. Algunos de estos productos químicos se han usado en disoluciones en hibridación y/o PCR en la técnica anterior (por ejemplo, se ha usado dimetilsulfóxido (DMSO) en disoluciones de hibridación y PCR, y se ha usado sulfolano (SL) en disoluciones de PCR), pero la mayor parte no. Sin embargo, la técnica anterior no reconocía que estos compuestos puedan usarse ventajosamente para disminuir los tiempos y/o
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las temperaturas de hibridación, tal como se dan a conocer en esta solicitud. Tabla 3
Producto químico (momento dipolar)
RED Punto de fusión, ºC
Carbonato de cloroetileno (4,02)
0,92 -
2-Oxazolidinona (5,07)
0,48 86-89
2-Imidazol
1,49 90-91
1,5-Dimetil-tetrazol (5,3)
∼1,5 70-72
N-Etil-tetrazol (5,46)
∼1,5
Dióxido-sulfuro de trimetileno (4,49)
- -
Sulfuro de trimetileno (3,63)
- -
1,3-Dimetil-5-tetrazol (4,02)
- -
Piridazina (3,97)
1,16 -8
2-Tiouracilo (4,21)
- -
N-Metil-imidazol (6,2)
1,28 -
1-Nitroso-2-pirolidinona
∼1,37 -
Etilfosfinato de etilo (3,51)
- -
5-ciano-2-Tiouracilo (5,19)
- -
4H-Piran-4-tiona (4,08)
1,35 32-34
4H-Piran-4-ona = gamma-pirona (4,08)
1,49 Punto de ebullición (P.E.) 80
2-Nitrofurano (4,41)
1,14 29
Alfa-Bromotetronato de metilo (6,24)
- -
Óxido de tetrahidrotiapirano (4,19)
1,75 60-64
Picolinonitrilo (2-cianopiridina) (5,23)
0,40 26-28 (P.E. 212-215)
Nitrobencimidazol (6,0)
0,52 207-209
Isatina (5,76)
- 193-195
N-fenil-sidnona (6,55)
- -
Sulfato de glicol (etilenglicol) Nota: no es soluble al 40%
- 99ºC
Aunque se enumera el DMSO en la tabla 2 debido a que sus parámetros de solubilidad de Hansen (HSP) se encuentran dentro de los intervalos citados anteriormente, el DMSO no funciona disminuyendo los tiempos y/o las temperaturas de hibridación en las composiciones y los métodos de la invención. Por tanto, la composición de hibridación de la invención no contiene DMSO como disolvente aprótico polar. Sin embargo, está muy dentro de los conocimientos del experto habitual examinar compuestos adecuados usando la orientación proporcionada en el presente documento incluyendo someter a prueba un compuesto en uno de los ejemplos proporcionados. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los disolventes apróticos polares adecuados tendrán HSP dentro de los intervalos citados anteriormente y una estructura mostrada en las fórmulas 1-9 anteriores.
C. Composiciones, tampones y disoluciones
(1) Disoluciones de hibridación
Se conocen en la técnica disoluciones de hibridación tradicionales. Tales disoluciones pueden comprender, por ejemplo, agentes tamponantes, agentes acelerantes, agentes quelantes, sales, detergentes y agentes de bloqueo.
Por ejemplo, los agentes tamponantes pueden incluir SSC, HEPES, SSPE, PIPES, TMAC, TRIS, SET, ácido cítrico, un tampón fosfato, tal como por ejemplo fosfato de potasio o pirofosfato de sodio,, etc. Los agentes tamponantes pueden estar presentes a concentraciones de desde 0,5x hasta 50x. Normalmente, los agentes tamponantes están presentes a concentraciones de desde 2x hasta 10x.
Los agentes acelerantes pueden incluir polímeros tales como FICOLL, PVP, heparina, sulfato de dextrano, proteínas tales como BSA, glicoles tales como etilenglicol, glicerol, 1,3-propanodiol, propilenglicol o dietilenglicol, combinaciones de los mismos tales como disolución de Dernhardt y BLOTTO, y disolventes orgánicos tales como formamida, dimetilformamida, DMSO, etc. El agente acelerante puede estar presente a concentraciones de desde el 1% hasta el 80% o de 0,1x a 10x. Normalmente, está presente formamida a concentraciones de desde el 25% hasta el 75%, mientras que están presentes DMSO, sulfato de dextrano y glicol a concentraciones de desde el 5% hasta el 10%.
Los agentes quelantes pueden incluir EDTA, EGTA, etc. Los agentes quelantes pueden estar presentes a concentraciones de desde 0,1 mM hasta 10 mM. Normalmente, los agentes quelantes están presentes a concentraciones de desde 0,5 mM hasta 5 mM.
Las sales pueden incluir cloruro de sodio, fosfato de sodio, fosfato de magnesio, etc. Las sales pueden estar presentes a concentraciones de desde 1 mM hasta 750 mM. Normalmente, las sales están presentes a
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tienden a mostrar señales más intensas y menos fondo que las composiciones que comprenden EC al 5%. Sin embargo, puede mejorarse la intensidad de señal para composiciones que tienen bajas concentraciones de disolvente aprótico polar (por ejemplo, del 0% al 20%) si se aumentan las concentraciones de sal y/o sulfato de dextrano. Por ejemplo, pueden observarse señales intensas con EC a del 5% al 10% cuando la concentración de sal se eleva aproximadamente de 8 a 16 veces las concentraciones de sal tradicionales (es decir, aproximadamente NaCl 1200 mM, tampón fosfato 20 mM). Asimismo, a medida que se usan menores concentraciones de disolvente aprótico polar, generalmente se requieren mayores concentraciones de sulfato de dextrano para mantener buena intensidad de señal y fondo.
Por consiguiente, las concentraciones de sal y sulfato de dextrano también pueden variarse para mejorar la intensidad de señal y la tinción de fondo. Generalmente, a medida que aumentan las concentraciones de sal y sulfato de dextrano, aumenta la intensidad de señal y disminuye el fondo. Por ejemplo, concentraciones de sal que son aproximadamente de dos a cuatro veces las concentraciones tradicionales (es decir, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM) producen señales más intensas y bajo fondo. Sin embargo, sorprendentemente se produce hibridación usando las composiciones de la invención incluso en ausencia completa de sal. Pueden mejorarse las intensidades de señal en condiciones sin sal aumentando las concentraciones de agente acelerante y/o disolvente aprótico polar.
Asimismo, la intensidad de señal aumenta a medida que aumenta la concentración de sulfato de dextrano desde el 0% hasta el 20%. Sin embargo, pueden observarse buenas señales incluso a concentraciones de sulfato del 0%. Puede mejorarse la intensidad de señal en condiciones de baja concentración de sulfato de dextrano aumentando las concentraciones de disolvente aprótico polar y/o sal.
Además, las sondas tipo usadas en las composiciones de la invención pueden variarse para mejorar los resultados. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención, combinaciones de sondas de ADN/ADN pueden mostrar menos fondo que combinaciones de ADN/sondas de PNA en las composiciones de la invención o viceversa. Por otra parte, las sondas de PNA tienden a mostrar señales más intensas que las sondas de ADN a bajas concentraciones de sal y/o bajas concentraciones de disolvente aprótico polar. De hecho, las sondas de PNA también muestran señales cuando no está presente disolvente aprótico polar, mientras que las sondas de ADN muestran señales débiles o no muestran señales sin disolvente aprótico polar.
D. Aplicaciones, métodos y usos
(1). Muestras analíticas
Los métodos y las composiciones de la invención pueden usarse completa o parcialmente en todos los tipos de aplicaciones de hibridación en los campos de la citología, histología o biología molecular. Según una realización, la primera o la segunda secuencia de ácido nucleico en los métodos de la invención está presente en una muestra biológica. Los ejemplos de tales muestras incluyen, muestras tisulares, preparaciones celulares, preparaciones de fragmentos celulares y preparaciones de componentes celulares enriquecidos o aislados. La muestra puede originarse de diversos tejidos tales como, por ejemplo, mama, pulmón, tejido colorrectal, próstata, pulmón, cabeza y cuello, estómago, páncreas, esófago, hígado y vejiga, u otros tejidos relevantes y neoplasia de los mismos, cualquier suspensión celular, muestra de sangre, aspiración con aguja fina, líquido ascítico, esputo, lavado peritoneal, lavado pulmonar, orina, heces, raspado celular, frotis celular, células citocentrifugadas o citopreparadas.
La muestra puede aislarse y procesarse usando protocolos convencionales. Pueden obtenerse preparaciones de fragmentos celulares, por ejemplo, mediante homogeneización celular, tratamiento por congelación-descongelación
o lisado celular. La muestra aislada puede tratarse de muchos modos diferentes dependiendo del fin de la obtención de la muestra y dependiendo de la rutina en el centro. A menudo la muestra se trata con diversos reactivos para conservar el tejido para el análisis posterior de la muestra, alternativamente la muestra puede analizarse directamente. Ejemplos de métodos ampliamente usados para conservar muestras son fijación con formalina seguido por incrustación en parafina y crioconservación.
Para extensiones en metafase, se tratan generalmente cultivos celulares con colcemida, u otros agentes de perturbación del polo del huso adecuados, para detener el ciclo celular en metafase. Entonces se fijan las células y se aplican en puntos sobre portaobjetos de microscopio, se tratan con formaldehído, se lavan y se deshidratan en etanol. Entonces se añaden sondas y se analizan las muestras mediante cualquiera de las técnicas comentadas a continuación.
La citología implica el examen de células individuales y/o extensiones de cromosomas a partir de una muestra biológica. El examen citológico de una muestra comienza con la obtención de una muestra de células, lo que puede realizarse normalmente mediante raspado, frotamiento con hisopo o cepillado de una zona, como en el caso de muestras de cuello uterino, o recogiendo fluidos corporales, tales como los obtenidos de la cavidad torácica, la vejiga
o la columna vertebral, o mediante aspiración con aguja fina o biopsia con aguja fina, como en el caso de tumores internos. En una preparación citológica manual convencional, la muestra se transfiere a un material de suspensión líquido y las células en el fluido se transfieren entonces directamente o mediante etapas de procesamiento basadas en centrifugación sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio para su observación. En una preparación citológica
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5
10
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El fondo se puntúa con un sistema graduado en una escala de 0-3.
0
Se observa poco o nada de fondo.
1
Algo de fondo.
2
Fondo moderado.
3
Fondo alto.
El sistema de puntuación permite el uso de 0,5 grados.
Ejemplo 1
Este ejemplo compara la intensidad de señal y la morfología celular de muestras tratadas con las composiciones de la invención o disoluciones de hibridación tradicionales en función de la temperatura de desnaturalización.
Composición de la sonda para FISH I: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM, formamida al 40% (15515-026, Invitrogen), PNA de bloqueo 5 µM (véase Kirsten Vang Nielsen et al., PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, capítulo 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)), sonda de ADN del gen CCND1 marcada con Texas Red 10 ng/µl (RP11-1143E20, tamaño de 192 kb).
Composición de la sonda para FISH II: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM, carbonato de etileno al 40% (03519, Fluka), PNA de bloqueo 5 µM, sonda de ADN del gen CCND1 marcada con Texas Red 10 ng/µl (RP11-1143E20, tamaño de 192 kb).
Se mezclaron antes de su uso fases de diferente viscosidad, si estaban presentes. Se desnaturalizaron las sondas para FISH tal como se indica durante 5 min y se hibridaron a 45ºC durante 60 minutos.
Resultados:
Temperatura de desnaturalización
Señal Morfología celular
(I) Formamida
(II) EC Formamida E
72ºC
0 2 Buena Buena
82ºC
0,5 3 Buena Buena
92ºC
0,5 3 No buena No buena
Las señales puntuadas como “3” eran claramente visibles en un objetivo de 20x. Ejemplo 2 Este ejemplo compara la intensidad de señal y la tinción de fondo de muestras tratadas con las composiciones de la
invención o disoluciones de hibridación tradicionales en función del tiempo de hibridación.
Composición de la sonda para FISH I: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM, formamida al 40%, PNA de bloqueo 5 µM, sonda de ADN del gen CCND1 marcada con Texas Red 10 ng/µl. Composición de la sonda para FISH II: sulfato de dextrano al 10%, NaCl 300 mM, tampón fosfato 5 mM, carbonato
de etileno al 40%, PNA de bloqueo 5 µM, sonda de ADN del gen CCND1 marcada con Texas Red 10 ng/µl. Se mezclaron antes de su uso fases de diferente viscosidad, si estaban presentes. Se incubaron las sondas para
FISH a 82ºC durante 5 min y luego a 45ºC durante 14 horas, 4 horas, 2 horas, 60 minutos, 30 minutos, 15 minutos, 0 minutos. Resultados:
Tiempo de hibridación
Señal Tinción de fondo
(I) Formamida
(II) EC Formamida EC
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Todas las composiciones contenían EC al 15%, sulfato de dextrano al 20%, NaCl 600 mM, tampón fosfato 10 mM, sondas de ADN de HER2 2,5 ng/µl (1/4 de la concentración convencional), sonda de PNA de CEN17 300 nM (1/2 de la concentración convencional), y uno de los siguientes agentes de reducción del fondo:
A) PNA de bloqueo 5 µM (véase Kirsten Vang Nielsen et al., PNA Suppression Method Combined with Fluorescence 5 In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, capítulo 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)) B) ADN de COT-1 0,1 µg/µl C) ADN humano total (THD) 0,1 µg/µl (THD no marcado sonicado) D) ADN de esperma de salmón fragmentado 0,1 µg/µl (AM9680, Ambion) 10 E) ADN de timo de ternero 0,1 µg/µl (D8661, Sigma) F) ADN de esperma de arenque 0,1 µg/µl (D7290, Sigma) G) formamida al 0,5% H) formamida al 2% I) etilenglicol al 1% (1.09621, Merck) 15 J) glicerol al 1% (1.04095, Merck) K) 1,3-propanodiol al 1% (533734, Aldrich)
L) H2O al 1% (control) Estaban presentes todas las muestras como monofase. Se incubaron las sondas a 82ºC durante 5 minutos y luego a 45ºC con secciones tisulares FFPE durante 60 y 120 minutos.
20 Resultados:
Bloqueo del fondo
Hibridación/min Fondo Intensidad de señal ADN PNA
PNA de bloqueo
60 +1 3 2,5
PNA de bloqueo
120 +1-1,5 3 2,5
COT-1
60 +0,5 3 2,5
COT-1
120 +0-0,5 3 2,5
THD
60 +0 3 3
THD
120 +0,5 3 2,5
ADN de esperma de salmón
60 +0 3 3
ADN de esperma de salmón
120 +0 3 3
ADN de timo de ternero
60 +0 2,5 3
ADN de timo de ternero
120 +0,5 3 2,5
ADN de esperma de arenque
60 +0 3 3
ADN de esperma de arenque
120 +0,5 2,5 3
Formamida al 0,5%
60 +0 2,5 3
Formamida al 0,5%
120 +0 3 3
Formamida al 2%
60 +0,5 2,5 3
Formamida al 2%
120 +0,5 3 3
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