JP2010538658A - 前立腺癌バイオマーカー - Google Patents

Abstract

癌の診断および／または予後に、そして癌、例えば前立腺癌における治療決定をするために少なくとも有用なバイオマーカーが開示される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願第６０／９７２，６９４号（２００７年９月１４日出願）および第６１／０５４，９２５号（２００８年５月２１日出願）（これらの記載内容はともに、参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。

癌の診断および／または予後に、そして癌、例えば前立腺癌における治療決定をするために少なくとも有用なバイオマーカーが開示される。

（政府支援の承認）
本発明は、アメリカ国立衛生研究所からの助成金番号ＰＯ１ ＣＡ56666に準じた米合衆国政府の支援で実行された；米国政府は本発明において一定の権利を有する。

腫瘍遺伝学者は、例えば「ケアの標準」として特徴づけられる化学療法薬の異なる組合せ、ならびに特定の癌に関する表示値を保有しないが、その癌における効力についての証拠が存在する多数の薬剤を含めて、彼等に利用可能な多数の治療選択肢を有する。良好な治療結果のための最良の機会は、患者が最適な利用可能な癌治療（単数または複数）を即座に受けるということ、ならびにこのような治療（単数または複数）が診断後できるだけ素早く開始されるということを必要とする。他方で、いくつかの癌治療は、生活の質に有意の悪影響を及ぼす；したがって、癌患者は潜在的に有害なおよび／または非有効な治療（単数または複数）を不必要に受けない、ということが同様に重要である。

前立腺癌は、該当する適例を提供する。２００８年、前立腺癌単独は、男性におけるすべての癌の２５％を占め、男性におけるすべての癌死の１０％を示す（Jemal et al., CA Cancer J. Clin. 58: 71-96, 2008）、と概算されている。前立腺癌は、典型的には、直腸診（「ＤＲＥ」）および／または前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）スクリーニングにより診断される。ＤＲＥに関する異常知見および／または血清ＰＳＡレベル上昇（例えば、＞４ ｎｇ／ｍｌ）は、前立腺癌の存在を示し得る。ＰＳＡまたはＤＲＥ試験が異常である場合、経直腸的超音波を用いて前立腺をマッピングし、任意の疑わしい領域を示す。前立腺の種々の区分の生検を用いて、前立腺癌が存在するか否かを確定する。

年齢に伴って増大する出現率ならびに血清ＰＳＡ試験の日常的利用可能性は、診断を受ける加齢男性の数を劇的に増大させた。ほとんどの男性において、当該疾患は徐々に進行するが、しかし有意数が転移性疾患に進行し、そのうちアンドロゲン非依存性になる。癌がまだ前立腺に限局されている時に診断がなされれば、予後は良好である；しかし前立腺癌のほぼ３分の１が、腫瘍が局所的に広がった後に診断され、１０症例のうちの１症例では、疾患は診断時に遠位の転移を有する。進行性前立腺癌を有する男性に関する５年生存率は、３３．６％に過ぎない。適切な治療の選択は、通常は、患者の年齢ならびに前立腺癌の段階により左右される。この決定は、所定の患者の臨床段階および生物学的潜在性を術前に確定するための利用可能な正確な方法の欠如により、複雑にされる。

重要な臨床的問題点は、局在性前立腺癌を有するこのような患者を如何に積極果敢に治療するかである。通常の治療選択肢は、前立腺癌の段階に依っている。低グリーソン数を有し、その腫瘍が前立腺以外に広がらない１０年またはそれ未満の平均余命を有する男性は、しばしば治療されない。より攻撃的な癌のための治療選択肢としては、根治的前立腺切除術および／または放射線療法が挙げられる。アンドロゲン枯渇療法（例えばゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（例えばロイプロリド、ゴセレリン等）および／または両側性睾丸摘出術）も、単独で、あるいは外科手術または放射線と組合せて用いられる。しかしながら、これらの予後指標は、個々の患者に関する臨床結果を正確に予測しない。それゆえ、より精確な分子マーカーを同定するのを手助けするために、再発の恐れが高い腫瘍を決定する分子的異常の重要な理解が必要とされる。

多数の腫瘍型と違って、前立腺癌進行においては、特定パターンの癌遺伝子発現は一貫して同定されてはいないが、しかし個々の症例で重要であると思われる多数の候補遺伝子および経路が同定されている（Tomlins et al., Annu. Rev. Pathol. 1: 243-71, 2006）。いくつかのグループは、原発性癌腫の遺伝子発現を正常前立腺と比較することにより、前立腺癌進行を検査しようとしてきた。前立腺癌において観察される技術の差、ならびに真の生物学的不均質性のため、これらの研究は、数千の候補遺伝子を報告しているが、しかし適度な合意を共有しただけであった。それにもかかわらず、２〜３の遺伝子、例えばヘプシン（ＨＰＮ）（Rhodes et al., Cancer Res. 62: 4427-33, 2002）、アルファ−メチルアシル−ＣｏＡラセマーゼ（ＡＭＡＣＲ）（Rubin et al.,JAMA 287: 1662-70, 2002）、およびＺｅｓｔｅ相同体２（ＥＺＨ２）エンハンサー（Varambally et al., Nature 419: 624-9, 2002）が明らかになっており、これらは、前立腺発癌に及ぼす有望な役割を有する。極く最近、アンドロゲン調節性膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）と赤芽球形質転換特異的（ＥＴＳ）ＤＮＡ転写因子ファミリーとの融合を同定するために、生命情報科学アプローチおよび遺伝子発現方法が用いられた（Tomlins et al., Science 310: 644-8, 2005）。この融合は、一般に前立腺癌において出現し、より攻撃的な腫瘍において広く認められることが示されている（Attard et al., Oncogene 27: 253-63, 2008；Demichelis et al., Oncogene 26: 4596-9, 2007；Nam et al., Br. J. Cancer 97: 1690-5, 2007）。多数の研究が、その遺伝子発現により分離可能な異なるクラスの腫瘍を示しており（Rhodes et al., Cancer Res. 62: 4427-33, 2002；Glinsky et al., J. Clin. Invest. 113: 913-23, 2004；Lapointe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 811-6, 2004；Singh et al., Cancer Cell 1: 203-9, 2002；Yu et al., J. Clin. Oncol. 22: 2790-9, 2004）、これは、既知の臨床的不均質性に関連づけ得る。原発性前立腺癌に対して転移性前立腺癌における遺伝子調節不全を探求する多数の遺伝子発現研究が実施されてきた（Varambally et al., Nature 419: 624-9, 2002；Lapointe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 811-6, 2004；LaTulippe et al., Cancer Res. 62: 4499-506, 2002）。

種々の提唱されたパネルの臨床的有用性に影響を及ぼす別の因子は、妥当化のための大半の試料利用可能性がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織としてのみ存在する、という事実である。これと対照的に、今日までに実行されたｃＤＮＡマイクロアレイ試験の多くは、典型的には、急速凍結組織を使用している（Bibikova et al., Genomics 89: 666-72, 2007；van’t Veer et al., Nature 415: 530-6, 2002）。ＦＦＰＥ組織における遺伝子発現を実施し、分析する能力は、すでに利用可能な臨床情報、例えば組織学的等級および臨床段階を遺伝子特異的シグネチャーと相関させることにより、研究を大いに加速する。

治療を必要としない前立腺癌がある一方、ほとんど常に致命的であるものもあると考えると、さらに、疾患治療がいくらよく見ても不快であり得ることを考えると、予期される疾患経過、例えば癌再発の見込み、患者の長期生存率等を介護者に予測させ、したがって最も適切な治療選択肢を選択させる方法が強く求められている。

前立腺癌に罹患した被験者における当該疾患を特徴づける表８に列挙された1つまたは複数の遺伝子の発現変更（例えば、増大または低減）により少なくとも一部は特徴づけされる、前立腺癌再発の遺伝子シグネチャーが、本明細書中で開示される。例えば、表８に列挙されたwingless型ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー成員５（ＷＮＴ５Ａ）、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）および増殖停止特異的遺伝子１（ＧＡＳ１）および／またはその他の遺伝子の遺伝子発現は、前立腺癌結果、例えば前立腺切除を有する（またはその候補である）患者における疾患再発または非再発を予報するために用いられ得る。特定の例において、ＷＮＴ５ＡおよびＴＫ１の過剰発現ならびにＧＡＳ１の下方調節は、前立腺癌が再発するであろう見込み増大を、したがって不十分な予後を示す。開示された遺伝子シグネチャーは、例えば癌再発に関して前立腺癌患者をスクリーニングするために有用であり、これは、前立腺癌における予後を、ならびに治療決定を行うのを手助けし得る。この発見を具体化する方法および組成物（キットを含めて）が記載される。

図１Ａ〜Ｄは、再発または非再発前立腺癌を有する患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（「ＦＦＰＥ」）組織試料からのＲＮＡ回収に関するいくつかのパネルを含む。（Ａ）組織回収からＲＮＡ定量化までの例示的方法ステップを一般的に略述する流れ図を示す。（Ｂ）ＲＮＡ単離のためのＦＦＰＥブロックからの組織コア（直径１．０ｍｍ、長さ２〜５ｍｍ）を同定し、手動で回収する（ビーチャー・パンチを用いての）ためのスキームを示す。（Ｃ）ヘマトキシリンおよびエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）で染色された代表的組織切片であり、癌性細胞が病理学者により同定され、組織コアが単離した場合を模式的に示す。（Ｄ）実施例１に記載される発現分析のために用いられるＲＮＡ品質の査定方法を示す。アジレント・バイオアナライザ（商標）電気泳動ＲＮＡ検定をすべての試料に関して実行し、トレースはＲＮＡ完全性の代用物として許容可能であると確定された。実時間ＰＣＲをすべての試料中のＲＰＬ１３ａハウスキーピング遺伝子に関して実行し、解離曲線は１つのＲＮＡ種のみの存在を示したが、これは、さらなる分析のために適したＲＮＡ品質も示した。系対照として、ＤＡＳＬ（商標）検定を、新たに単離されたＲＮＡ試料に関する癌ＤＡＰ分析のために実行した。 図２Ａ〜Ｃは、再発または非再発前立腺癌を有する患者からのＦＦＰＥ組織試料から単離されたＲＮＡのＤＡＳＬ（商標）遺伝子発現解析に関するいくつかのパネルを含む。（Ａ）すべての評価可能な遺伝子（３６７）およびすべての試料（２４例の前立腺試験および４例の対照乳房検体、すなわちＣＴＲＬ１−ＭＣＦ７、ＣＴＲＬ２−乳房／ＭＣＦ７、ＣＴＲＬ３−乳房１およびＣＴＲＬ４−乳房２）に関するランク不変正規化を用いたクラスター分析。対照乳癌試料（新たに単離されたＲＮＡ）は前立腺癌試料とは別個に群れを成した。相関（１−ｒ）値は軸上に表示されている。（Ｂ）陰性対照試料プロットは、関係のないプローブとの高試験試料結合を示す＞３００というシグナルを有する有意数のＲＮＡ試料を示す。（Ｃ）低背景結合を有する試料に関してのみのクラスター分析（検出のためのｐ値＜０．０５）。 図３Ａ〜Ｃは、９例の試料に関する再発（ｎ＝４）および非再発（ｎ＝５）群間の（Ａ）ＷＮＴ５Ａ、（Ｂ）ＴＫ１および（Ｃ）ＧＡＳ１の示差的発現を示す一連の棒グラフである。再発および非再発群間の平均シグナル強度は：ＷＮＴ５Ａに関しては２８６１．２９および３３８．３５；ＴＫ１に関しては２１５６．１７および７５２．２５；ＧＡＳ１に関しては１３０．５２および２３８７．１３である。 図４は、ＷＮＴ５Ａ、ＧＡＳ１およびＴＫ１を含み、２７試料の全組に適合したロジスティック回帰モデルの性能を示すＲＯＣ曲線である。曲線下面積は０．８４６であって、これは、当該モデルがデータと非常によく合致することを示す。１００無作為選択試験症例を用いて、ＡＵＣ概算値を改良するために、ブートストラップ再サンプリングを用いた。垂直軸（Ｙ軸）は真陽性率（感受性）、すなわち、再発の場合の再発試料のスコアリングを示し；水平軸（Ｘ軸）は、偽陽性率（１−特異性）、すなわち、再発の場合の非再発試料のスコアリングを示す。

（配列表）
添付の配列表に列挙された核酸およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で定義されているように、ヌクレオチド塩基に関する標準文字略号、ならびにアミノ酸に関しては３文字コードを用いて示される。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、しかし相補鎖は表示された鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。本明細書中で参照される配列データベース寄託番号はすべて、本出願の出願日に利用可能であったような寄託番号により同定された配列のバージョンを指すと理解される。添付の配列表中の各配列を、以下で説明する：
配列番号１：ヒトＧＡＳ１核酸（ｃＤＮＡ）配列（ＣＤＳ＝残基４１１〜１４４８）（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＭ_002048.1（ＧＩ：4503918）参照）；
配列番号２：ヒトＧＡＳ１アミノ酸配列（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＰ_002039.1（ＧＩ：4503919）参照）；
配列番号３：ヒトＷＮＴ５Ａをコードする核酸配列（ＣＤＳ＝残基３１９〜１４６１）（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＭ_003392.3（ＧＩ：40806204）参照）；
配列番号４：ヒトＷＮＴ５Ａアミノ酸配列（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＰ_003383.2（ＧＩ：40806205）参照）；
配列番号５：ヒトＴＫ１核酸（ｃＤＮＡ）配列（ＣＤＳ＝残基８５〜９１５）（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＭ_003258.3（ＧＩ：155969679）参照）；
配列番号６：ヒトＴＫ１アミノ酸配列（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＰ_003249.2（ＧＩ：155969680）参照）；
配列番号７および８：それぞれ、少なくともＲＰＬ１３ａのｑＲＴ−ＰＣＲ検定のために有用な順方向および逆方向プライマー（ＯＭＩＭ寄託番号113703；ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＭ_000977（ＧＩ：15431296）（ｍＲＮＡ変異体１）およびＮＭ_033251（ＧＩ：15431294）（ｍＲＮＡ変異体２））；
配列番号９〜１７：例示的Illuminaプローブ配列；
配列番号１８〜２１：例示的ＷＮＴ５Ａプライマー配列；
配列番号２２〜２３：例示的ＴＫ１プライマー配列；
配列番号２４〜２５：例示的ＧＡＳ１プライマー配列。

Ｉ．用語
別記しない限り、技術用語は、慣用的用法に従って用いられる。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V（出版：Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)）；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology（出版：Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)）;ならびにRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference（出版：VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)）に見出され得る。

種々の開示された実施形態の再検討を促すために、特定用語の以下の説明を提示する：

核酸分子の増幅：核酸分子、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１核酸分子のコピー数を増大させるために用いられる方法を指す。その結果生じる生成物は、単位複製配列または増幅産物と呼ばれ得る。核酸分子の増幅方法は当該技術分野で知られており、例としては、ＭＤＡ、ＰＣＲ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＯＰ−ＰＣＲ、ＲＣＡ、Ｔ７／プリマーゼ依存性増幅、ＳＤＡ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＬＡＭＰなどが挙げられる。

癌：悪性新生物、例えば分化の喪失、増殖率増大、周囲組織の浸潤を伴う特徴的脱分化を受けた、且つ転移し得るもの。

相補的：例えばワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン塩基対を形成することにより鎖が互いと結合する（ハイブリダイズする）時、２つの分子が安定二重鎖または三重鎖を形成するのに十分な数の相補的ヌクレオチドを共有する場合、核酸は別の核酸と「相補的」であるといわれる。安定結合は、核酸分子（例えば、核酸プローブまたはプライマー）が、必要条件下で標的核酸配列（例えば、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１標的核酸配列）と検出可能的に結合されたままである場合に生じる。

相補性とは、一核酸分子（例えば、核酸プローブまたはプライマー）塩基対中の塩基が、第二の核酸分子（例えば、標的核酸配列）中の塩基と塩基対合する程度である。相補性は、百分率、すなわち、２つの分子間、または２つの分子の特定領域またはドメイン内に塩基対を形成するヌクレオチドの割合により記載されるのが便利である。例えば、核酸プローブまたはプライマーの１５連続ヌクレオチド領域のうちの１０ヌクレオチドが標的核酸分子と塩基対を形成する場合、プローブまたはプライマーのその領域は、標的核酸分子と６６．６７％の相補性を有するといわれる。

本発明の開示において、「十分な相補性」とは、十分数の塩基対が一核酸分子またはその領域（例えば、プローブまたはプライマーの領域）と標的核酸配列（例えば、ＷＮＴ５ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１核酸配列）との間に存在して、検出可能な結合を達成する、ということを意味する。結合状態の確立に関与する定性的および定量的考察の徹底的処理は、Beltz et al Methods Enzymol. 100: 266-285, 1983により、ならびにSambrook et al.(ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989により提供される。

接触：ある作用物質を別の作用物質の極近位に運んで、それにより当該作用物質を相互作用させること。例えば、抗体（または他の特異的結合剤）は、生物学的試料を含有する顕微鏡スライドまたはその他の表面に適用され、それにより、抗体に特異的である試料中のタンパク質（あるいはタンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質核酸相互作用）の検出を可能にし得る。別の例では、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー（または他の核酸結合剤）は、生物学的試料から得られる核酸分子とともにインキュベートされ（そしていくつかの例では、核酸分子の増幅を可能にする条件下で）、それにより、プローブまたはプライマーとの十分な相補性を有する試料中の核酸分子（または核酸−核酸相互作用）の検出を可能にし得る。

検出する：作用物質（例えば、核酸分子またはタンパク質）あるいは相互作用（例えば、２つのタンパク質間の、タンパク質および核酸間の、または２つの核酸分子間の結合、）が存在するか否かを確定すること。いくつかの例では、これはさらに定量化を含み得る。特定の例では、標識からの発光シグナルが検出される。巨視的数の分子が同時に観察され得るよう、検出は大量であり得る。検出は、顕微鏡を用いた単一分子からのシグナルの同定、ならびに背景ノイズを低減するための全反射のような技法も含み得る。

例えば、特定のタンパク質（例えば、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）に特異的な抗体の使用は、前立腺癌組織を含有する試料のような試料におけるタンパク質またはタンパク質-タンパク質相互作用の検出を可能にする。別の例では、特定の遺伝子（例えば、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）に特異的なプローブまたはプライマーの使用は、前立腺癌組織を含有する試料のような試料中の所望の核酸分子の検出を可能にする。

診断：例えば1つまたは複数の診断手順の結果から医学的症状または疾患を同定するプロセス。特定の例では、診断は、被験者の予後を確定すること、例えば付加的治療の非存在下で疾患（例えば前立腺癌）を有する被験者のありそうな結果（例えば、平均余命）を確定すること、例えば前立腺切除後のヒト被験者における前立腺癌のありそうな再発を予測することを包含する。

［核酸配列の］示差的発現：核酸配列は、その発現産物（例えば、転写物（例えばｍＲＮＡ）および／またはタンパク質）のうちの1つまたは複数の量が、別の組織（または細胞）型と比較した場合に、ある組織（または細胞）型においてより高いかまたはより低い場合、示差的に発現される。例えば、再発前立腺癌組織（または細胞）中でその転写物またはタンパク質がより高く発現され、そして非再発前立腺癌組織（または細胞）中でより低く発現される遺伝子、例えばＷＮＴ５Ａおよび／またはＴＫ１は、示差的に発現される。別の例では、非再発前立腺癌組織（または細胞）中でその転写物またはタンパク質がより高く発現され、そして再発前立腺癌組織（または細胞）中でより低く発現される遺伝子、例えばＧＡＳ１は、示差的に発現される。

遺伝子：ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）配列。ポリペプチドは、全長コード配列により、あるいは全長または断片の所望の活性または機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、コード配列の任意の部分により、コードされ得る。当該用語は、構造遺伝子のコード部分、ならびに遺伝子が全長ｍＲＮＡに対応するよう５’または３’のいずれかの末端上の約１ｋｂまたはそれより長い距離の間で５’および３’末端の両方のコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’またはその下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。ゲノム中に存在する（またはそれから単離される）ような遺伝子は、「イントロン」と呼ばれる非コード配列により中断されるコード領域（「エキソン」）を含有する。イントロンは、プロセシングされたＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）転写物中には存在しない。

遺伝子発現：ゲノム中にコードされた遺伝情報を変換し、核酸配列（例えばｍＲＮＡ）をポリペプチドに介入する多段階プロセス。遺伝子のゲノム配列は「転写されて」、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、転写物とも呼ばれる）を産生する。ｍＲＮＡは、「転写されて」、対応するタンパク質を産生する。遺伝子発現は、当該プロセスの多数の段階で調節され得る。遺伝子発現の増大または低減は、任意の遺伝子発現産物（すなわち、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）の、それぞれ、増大または低減により検出され得る。遺伝子発現の増大または低減は、ゲノム変化の結果、例えば被験者遺伝子配列を含めたゲノムの領域の、それぞれ、増幅または欠失でもあり得る。

標識：例えば分光測光法、フローサイトメトリーまたは顕微鏡検査により検出し得る作用物質。例えば1つまたは複数の標識は抗体に結合され、それにより標的タンパク質（例えば、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）の検出を可能にし得る。さらに、1つまたは複数の標識は核酸分子に結合され、それにより標的核酸分子（例えば、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１ ＤＮＡまたはＲＮＡ）の検出を可能にし得る。例示的標識としては、放射性同位体、蛍光団、発色団、リガンド、化学発光物質、酵素およびその組合せが挙げられる。

正常細胞または組織： 非腫瘍、非悪性細胞および組織。

特異的結合（またはこのような語句の明白な派生、例えば特異的に結合する、〜に特異的な、など）：１つの結合相手（例えば、遺伝子特異的プローブまたはタンパク質特異的抗体）ともう１つの結合相手（例えば、遺伝子特異的プローブまたはタンパク質特異的抗体の標的）の間の特別な相互関係。このような相互作用は、結合相手間の（あるいはしばしば、各結合相手の特定領域または部分間の）１つ、または典型的には複数の非共有結合により媒介される。非特異的結合部位と対照的に、特異的結合部位は飽和可能である。したがって、特異的結合を特徴づけるための１つの例示的方法は、特異的結合曲線によるものである。特異的結合曲線は、例えば、第一結合相手濃度の一関数としての、固定量の他方の結合相手に結合される一方の結合相手（第一結合相手）の量を示す。第一結合相手濃度はこれらの条件下で増大するので、結合される第一結合相手の量は飽和する。非特異的結合部位に別様に対照して、互いとの直接的会合（例えば、プローブ−ｍＲＮＡまたは抗体−タンパク質相互作用）に関与する特異的結合相手は、過剰量のいずれかの特異的結合相手によりこのような会合から競合的に除去され得る（または移転させられる）。このような競合検定（または置換検定）は、当該技術分野で非常によく知られている。

被験者：
任意の多細胞脊椎動物、例えばヒトおよび非ヒト哺乳類（例えば、獣医学的被験者）を含む。いくつかの例では、被験者は、癌を有するか、あるいは癌、例えば前立腺癌を有することが疑われる者である。

別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、開示された発明が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。単数用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、明らかに別記しない限り、複数の指示物を含む。同様に、「または」という単語は、明らかに別記しない限り、「および」を含むよう意図される。「〜から成る（comprising）」は、「〜を含む（including）」を意味する；それゆえ、「ＡまたはＢから成る」は、「Ａを含む」かまたは「Ｂを含む」かまたは「ＡおよびＢを含む」。

開示された本発明の実施形態の実行および／または試験のための適切な方法および材料は、以下に記載される。このような方法および材料は、単に例示であって、限定するものではない。本明細書中に記載されるものと類似のまたは等価のその他の方法および材料も、用いられ得る。例えば、開示された発明が関連する当該技術分野でよく知られた慣用的方法は、種々の一般的な、そしてより具体的な参考文献、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001；Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (and Supplements to 2000)；Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4^th ed., Wiley & Sons, 1999；Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1990；およびHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, 1999に記載されている。

本明細書中で参照されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号に関連した配列はすべて、参照により本明細書中で援用される（例えば、２００８年９月１５日に存在する配列は、参照により本明細書中で援用される）。
ＩＩ．前立腺癌バイオマーカー

その発現が、当該疾患に罹患した被験者における前立腺癌を特徴づける遺伝子（例えば、表８参照）が、本明細書中で開示される。この発見を具体化する方法および組成物が記載される。
Ａ．使用方法

本開示は、再発対非再発前立腺癌において示差的に発現される多数の遺伝子を同定する。治療（例えば、前立腺切除）後の前立腺癌の再発は、より攻撃的な癌、患者に関するより悪い予後、疾患進行の見込み増大、治療の失敗（または不適切な治療）、および／または代替的（または付加的）治療の必要性を（少なくとも）示す。したがって、本発明の発見は、特に、前立腺癌組織を特徴づけるための、前立腺癌患者の診断または予後のための、前立腺癌患者における治療結果を予測するための、そして前立腺癌患者のための治療様式を指図する（例えば有用な治療様式を選択する）ための種々の方法を可能にする。

開示される方法は、前立腺癌を有する任意の被験者から得られる生物学的試料を用いて実施され得る。典型的被験者は、ヒト男性である；しかしながら、癌を発症し得る前立腺を有する任意の哺乳類は、開示される方法に有用な生物学的試料の供給源として役立ち得る。開示される方法に有用な例示的生物学的試料としては、組織試料（例えば、前立腺生検および／または前立腺切除組織）または前立腺細胞試料（例えば、前立腺マッサージにより、尿中で、または微細針吸引液中で収集され得る）が挙げられる。試料は、新鮮であるか、または収集後加工処理され得る（例えば、目的達成のため）。いくつかの例では、加工処理された試料は固定され（例えばホルマリン固定され）、および／または蝋−（例えばパラフィン−）包埋され得る。封入細胞および組織調製物のための固定液は当該技術分野でよく知られており、例としては、９５％アルコール性ブワン固定液；９５％アルコール固定液；Ｂ５固定液、ブワン固定液、ホルマリン固定液、カルノフスキー固定液（グルタルアルデヒド）、ハートマン固定液、ホランド固定液、オルト溶液（重クロム酸塩固定液）およびツェンカー固定液が挙げられるが、これらに限定されない（例えばCarson, Histotechology: A Self-Instructional Text, Chicago: ASCP Press, 1997参照）。特定の方法実施形態は、ＦＦＰＥ前立腺癌組織試料を包含する。いくつかの例では、試料（またはその分画）は、固体支持体上に存在する。開示される方法で有用な固体支持体は、生物学的試料に耐えることのみを必要とし、そして任意に、しかし有益には、試料中の構成成分（例えば、タンパク質および／または核酸配列）の便利な検出を可能にする。例示的支持体としては、顕微鏡スライド（例えば、ガラス製顕微鏡スライドまたはプラスチック製顕微鏡スライド）、カバースリップ（例えば、ガラス製カバースリップまたはプラスチック製カバースリップ）、組織培養皿、多ウエルプレート、膜（例えば、ニトロセルロースまたはフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップが挙げられる。

例示的方法は、表８に開示された遺伝子のうちの1つまたは複数の発現レベルを、被験者からの前立腺組織標本中で確定することを包含する。開示される方法において有用な遺伝子（単数または複数）は、表８中の任意の個々の遺伝子（例えばＧＡＳ１、ＷＮＴ５ＡまたはＴＫ１）、あるいは表８中の２つまたはそれより多くの遺伝子の任意の組合せ（例えば、表８中の遺伝子のうちの任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５または３３すべて、あるいは表８中の遺伝子のうちの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０または少なくとも２５）を包含する（またはそれらからなる）。特定の実施形態では、表８中のものから選択される遺伝子の組合せとしては、ＧＡＳ１、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１、ＧＡＳ１とＷＮＴ５Ａ、ＧＡＳ１とＴＫ１、ＷＮＴ５ＡとＴＫ１、またはＧＡＳ１、ＷＮＴ５ＡとＴＫ１が挙げられる。さらに特定の実施形態では、開示される方法に有用な遺伝子は、任意の組合せでのＧＡＳ１、ＷＮＴ５ＡおよびＴＫ１のうちの２つまたはそれより多くからなる（例えば、ＧＡＳ１とＷＮＴ５Ａ、ＧＡＳ１とＴＫ１、ＷＮＴ５ＡとＴＫ１、またはＧＡＳ１、ＷＮＴ５ＡとＴＫ１）。他の方法実施形態における当該遺伝子は、ＧＡＳ１、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１、Ｅ２Ｆ５またはＭＳＨ２、あるいはその任意の組合せを含む（またはそれらからなる）。

例示的方法では、標準値または対照試料と比較した場合、ＷＮＴ５Ａおよび／またはＴＫ１の発現は増大され、および／またはＧＡＳ１の発現は低減される。他の方法では、表８中の別の遺伝子（すなわち、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１以外の遺伝子、例えばＥ２Ｆ５および／またはＭＳＨ２）の発現は、増大される。いくつかのこのような方法において、ＷＮＴ５Ａおよび／またはＴＫ１（および／または表８中の別の遺伝子、例えばＥ２Ｆ５および／またはＭＳＨ２）の相対的に増大された発現、および／またはＧＡＳ１の相対的に低減された発現は、例えば、被験者における前立腺癌進行のより高い見込み、前立腺癌が手術（前立腺切除）後に再発するという見込みの増大、試料が収集される患者に関する不十分な予後、および／または外科的処置（例えば、前立腺切除）が失敗するというより高い見込み、そして前立腺癌のための非外科手術的または代替的処置の必要性増大を示す。

いくつかの方法では、1つまたは複数の当該遺伝子（例えば、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１）の発現が、標準値または対照試料と比較して測定される。標準値としては、正常前立腺における1つまたは複数の当該遺伝子の平均発現（例えば前立腺癌試料における遺伝子の発現値と類似の方法で算定される）、前立腺癌が術後に再発しなかったことが知られている患者または患者集団から得られる前立腺試料における1つまたは複数の当該遺伝子の平均発現、あるいは前立腺癌が術後に再発したことが知られている患者または患者集団から得られる前立腺試料中の1つまたは複数の当該遺伝子の平均発現が挙げられるが、これらに限定されない。対照試料としては、例えば、正常前立腺組織または細胞、前立腺癌が術後に再発しなかったことが知られている患者または患者集団から収集される前立腺組織または細胞、前立腺癌が術後に再発したことが知られている患者または患者集団から収集される前立腺組織または細胞、被験者または無前立腺疾患個体から収集されるリンパ球、および／または被験者または無前立腺疾患個体の頬スワブにより収集される細胞が挙げられ得る。

他の方法では、当該遺伝子（単数または複数）の発現は、各試料中のハウスキーピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ＳＤＨＡ（スクシネートデヒドロゲナーゼ）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＨＢＳ１Ｌ（ＨＢＳ１様タンパク質）、β−アクチンおよびＡＨＳＰ（アルファヘモグロビン安定化タンパク質）のうちの1つまたは複数）に関して得られる値に比して、試験試料（すなわち、前立腺癌患者試料）および対照試料において測定されて、正規化試験および対照値を生じて；次に、試験試料の正規化値が対照試料の正規化値と比較されて、当該遺伝子（単数または複数）の相対的発現（例えば、発現増大または低減）を得る。

遺伝子発現における増大または低減は、例えば試験試料中の特定遺伝子発現産物（例えば転写物（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質）の発現が、適用可能な対照（例えば標準値または対照試料）の、それぞれ、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、または少なくとも約２００％高いかまたは低い、ということを意味し得る。代替的には、相対的発現（すなわち、増大または低減）は、倍数による差に関してであり得る；例えば、試験試料中の特定遺伝子発現産物（例えば転写物（例えばｍＲＮＡ）またはタンパク質）の発現は、適用可能な対照（例えば標準値または対照試料）の、それぞれ、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍高いかまたは低い。

免疫組織化学により確定されるようなタンパク質発現が遺伝子発現の測定として用いられるいくつかの方法実施形態では、タンパク質発現のスコアリングは半定量的であり得る；例えば、タンパク質発現レベルは、０、１、２または３（例えば、いくつかの場合、各レベルでのプラス（またはマイナス）値、例えば１＋、２＋、３＋）として記録され、０は検出可能なタンパク質発現が実質的になく、そして３（３＋）は最高検出タンパク質発現である。このような方法では、対応する遺伝子発現における増大または低減は、適用可能な対照（例えば、標準値または対照試料）と比較した場合のスコアの差として測定される；すなわち、対照に関するスコア０と比較した場合の試験試料における３＋のスコアは試験試料における遺伝子発現増大を表し、そして対照に関する３＋のスコアと比較した場合の試験試料における０というスコアは試験試料における遺伝子発現低減を表わす。

例示的方法は、前立腺癌再発の見込みを予測する。再発は、前立腺癌が初期（またはその後の）治療（単数または複数）後に再発したことを意味する。代表的初期治療としては、放射線治療、化学療法、抗ホルモン治療、および／または外科手術（例えば前立腺切除術）が挙げられる。典型的には、初期前立腺癌治療後、血中ＰＳＡレベルは安定且つ低レベルに低減し、いくつかの場合には、最終的にほとんど検出可能でなくなる。いくつかの例では、前立腺癌の再発は、ＰＳＡレベルを上げる（例えば、２．０〜２．５ｎｇ／ｍＬ以上）ことにより、および／または血液、前立腺生検または吸引液中の、リンパ節における（例えば骨盤または他の場所における）、あるいは転移部位（例えば、排尿の制御を手助けする筋肉、直腸、骨盤の壁、骨または他の器官）での前立腺癌細胞の同定により、示される。血清ＰＳＡレベルは、以下のように特徴づけられ得る（以下の範囲の多少の変動は当該技術分野では普通である）：

その他の例示的方法は、前立腺癌進行の見込みを予測する。前立腺癌進行は、前立腺癌の1つまたは複数の指標（例えば血清ＰＳＡレベル）が、疾患が治療とは無関係に進んでいることを示す、ということを意味する。いくつかの例では、前立腺癌進行は、ＰＳＡレベルを上げる（例えば、２．０〜２．５ｎｇ／ｍＬ以上）ことにより、および／または血液、前立腺生検または吸引液中の、リンパ節における（例えば骨盤または他の場所における）、あるいは転移部位（例えば、排尿の制御を手助けする筋肉、直腸、骨盤の壁、骨または他の器官）での前立腺癌細胞（またはその数の増大）の同定により、示される。

前立腺癌進行または前立腺癌再発の見込み増大は、任意の既知の計量により定量され得る。例えば、見込み増大は、少なくとも１０％の発生機会（例えば、少なくとも２５％の機会、少なくとも５０％の発生機会、少なくとも６０％の発生機会、少なくとも７５％の発生機会または８０％以上でさえある発生機会）を意味する。

いくつかの方法実施形態は、前立腺癌予後のために有用である。予後は、疾患の考え得る結果（典型的には治療とは無関係）である。本明細書中に開示される遺伝子シグネチャー（単数または複数）は、前立腺癌再発のかなり前に収集された試料におけるこのような再発を予測する。それゆえ、このような遺伝子シグネチャーは癌の攻撃性の代用であり、再発中の癌はさらに攻撃的である。不良な（またはより不良な）予後は、より攻撃的な癌を有する被験者に関してありそうに思われる。いくつかの方法実施形態では、予後不良は、新生物性疾患の初期診断後の患者の生存は５年未満（例えば、１年未満生存または２年未満生存）である。いくつかの方法実施形態では、良好な予後は、新生物疾患の初期診断後の患者の２年より長い生存（例えば３年より長い生存、５年より長い生存または７年より長い生存）である。

さらに他の方法実施形態は、前立腺癌患者における治療結果を予測し、前立腺癌患者のための治療様式を指図する（例えば、有用な治療様式を選択する）ために有用である。本明細書中の他の箇所で考察されるように、開示される遺伝子の発現は、前立腺癌治療（例えば前立腺切除）が失敗すると思われる（例えば、疾患が再発する）、ということを予測する。それゆえ、開示される遺伝子シグネチャー（単数または複数）は、治療（例えば前立腺切除）の考え得る成功に関して前立腺患者に助言するために介護者により用いられ得る。特定の被験者の病歴の状況で考察すると、患者および介護者は、治療（例えば外科手術、例えば前立腺切除術を実施）するか否か、および／または代替的治療（例えば外部照射放射線療法、近接照射療法、化学療法、または監視的待機）を提供するか否かについての良好に知らされた決定をなし得る。

１．遺伝子発現レベルの確定（例えば、遺伝子発現プロファイリング）
遺伝子発現レベルは、当該技術分野で知られた任意の技法を用いて、開示される方法で確定され得る。例示的技法としては、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ゲノム核酸配列および／または転写物（例えば、ｍＲＮＡ））のハイブリダイゼーション解析に基づいた方法、ポリヌクレオチドのシーケンシングに基づいた方法、タンパク質の検出に基づいた方法（例えば、免疫組織化学およびプロテオミクス・ベースの方法）が挙げられる。

前記のように、遺伝子発現レベルは、ゲノムにおける変更（例えば、遺伝子増幅、遺伝子欠失、あるいはその他の染色体再構成または染色体重複（多染色体性）あるいは1つまたは複数の染色体の損失）により影響を及ぼされ得る。したがって、いくつかの実施形態では、遺伝子発現レベルはこのようなゲノム変更を検出することにより推測されるかまたは確定され得る。当該遺伝子を保有するゲノム配列は、例えば遺伝子特異的ゲノムプローブと細胞核中に広げられた中期のまたは核中に存在するような染色体とのin situハイブリダイゼーションにより定量され得る。遺伝子特異的ゲノムプローブの作製は、当該技術分野でよく知られている（例えば米国特許第５４４７８４１号、第５７５６６９６号、第６８７２８１７号、第６５９６４７９号、第６５００６１２号、第６６０７８７７号、第６３４４３１５号、第６４７５７２０号、第６１３２９６１号、第７１１５７０９号、第６２８０９２９号、第５４９１２２４号、第５６６３３１９号、第５７７６６８８号、第５６６３３１９号、第５７７６６８８号、第６２７７５６９号、第６５６９６２６号、米国特許出願第１１／８４９，０６０号およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０７／７７４４４号参照）。いくつかの例示的方法では、遺伝子増幅または欠失の定量化は、遺伝子特異的ゲノムプローブに関する結合部位の数を対照ゲノムプローブ（例えば、当該遺伝子が位置する染色体の動原体に特異的なゲノムプローブ）と比較することにより、促進され得る。いくつかの例では、遺伝子増幅または欠失は、遺伝子特異的ゲノムプローブ対対照（例えば動原体）プローブの比により確定され得る。例えば、２より大きい（例えば、３より大きい、４より大きい、５より大きい、あるいは１０またはそれ以上の）比は、遺伝子特異的プローブが結合する遺伝子（または染色体領域）の増幅を示す。別の例では、１未満の比は、遺伝子特異的プローブが結合する遺伝子（または染色体領域）の欠失を示す。特定の方法実施形態では、遺伝子増幅または欠失は、遺伝子の発現産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）における、それぞれ、対応する増大または低減により成し遂げられるのが有益であり得る；しかしながら、一旦相関関係が確立されると、連続同時検出は必要でない（そして不必要な資源および時間を浪費し得る）。

遺伝子発現レベルは、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の定量化によっても確定され得る。試料中のｍＲＮＡ発現の定量化のために当該技術分野で知られている一般的に用いられる方法としては、ノーザンブロッティングおよびin situハイブリダイゼーション（例えば、Parker and Barnes, Meth. Mol. Biol., 106: 247-283, 1999）；ＲＮＡアーゼ保護検定（例えば、Hod, Biotechniques, 13: 852-854, 1992）；ならびにＰＣＲベースの方法、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Weis et al., Trends in Genetics, 8: 263-264, 1992）および実時間定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれる））が挙げられるが、これらに限定されない。代替的には、特定の二重鎖、例えばＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。シーケンシングベースの遺伝子発現解析のための代表的方法としては、網羅的遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）、ならびに大規模並列処理特徴配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析が挙げられる。

ｍＲＮＡレベルの確定を包含するいくつかの方法実施形態は、標的試料、例えば前立腺癌組織試料から単離されるＲＮＡ（例えば、総ＲＮＡ）を利用する。ＲＮＡ（例えば、総ＲＮＡ）単離のための一般的方法は当該技術分野でよく知られており、分子生物学の標準テキスト、例えばAusubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、本明細書中の実施例に、そして例えばRupp and Locker (Lab. Invest., 56: A67, 1987)およびDeAndres et al. (Bio Techniques, 18: 42044, 1995)により開示されている。特定の例では、ＲＮＡ単離は、メーカーの使用説明書に従って、製造業者、例えばQiagenから入手される精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを用いて実施され得る。他の市販ＲＮＡ単離キットとしては、MASTERPURE（商標）完全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（EPICENTRE（商標） Biotechnologies）およびパラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ambion, Inc.）が挙げられる。

MassARRAY（商標）遺伝子発現プロファイリング方法（Sequenom, Inc.）では、総ＲＮＡの逆転写から得られるｃＤＮＡは、単一塩基を除いてすべての位置における標的化ｃＤＮＡ領域を整合し、内部標準として役立つ合成ＤＮＡ分子（競合体）でスパイクされる。ｃＤＮＡ／競合体混合物は、標準ＰＣＲにより増幅され、後ＰＣＲエビアルカリ性ホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理に付され、これが残存ヌクレオチドの脱リン酸化を生じる。アルカリ性ホスファターゼの不活性化後、競合体およびｃＤＮＡからのＰＣＲ産物はプライマー伸長に付され、これが、競合体−およびｃＤＮＡ−由来ＰＣＲ産物に関する別個の大量シグナルを生じる。精製後、これらの生成物は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光分析による分析に必要な構成成分を前負荷されるチップアレイ上に分配される。反応に存在するｃＤＮＡは次に、発生された質量スペクトルにおけるピーク領域の比を分析することにより、定量される。さらなる詳細に関しては、例えばDing and Cantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 3059-3064, 2003を参照されたい。

ＰＣＲを包含するｍＲＮＡ発現を確定するための他の方法としては、例えば、示差的表示（Liang and Pardee, Science, 257: 967-971, 1992）；増幅断片長多形性（Kawamoto et al., Genome Res., 12: 1305-1312, 1999）；BEADARRAY（商標）技法（Illumina, San Diego, CA, USA; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease (Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson et al., Anal. Chem., 72: 5618, 2000;および本明細書中の実施例）；ＸＭＡＰ（商標）技法（Luminex Corp., Austin, TX, USA）；ＢＡＤＧＥ検定（Yang et al., Genome Res., 11: 1888-1898, 2001）；ならびに包括的遺伝子発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）解析（Fukumura et al., Nucl. Acids. Res., 31(16):e94, 2003）が挙げられる。

示差的遺伝子発現は、マイクロアレイ技法を用いても確定され得る。これらの方法では、特定結合相手、例えば、当該ＲＮＡに特異的なプローブ（例えばｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）、または当該タンパク質に特異的な抗体は、マイクロチップ基板上でプレート化されるかまたは配置される。マイクロアレイは、マイクロアレイ上の特定の結合相手のうちの1つまたは複数に関して、1つまたは複数の標的（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を含有する試料と接触される。配置された特異的結合相手は、当該試料中のそれらの同族標的と特異的な検出可能な相互作用を形成する（例えばハイブリダイズされるかまたは特異的に結合する）。

網羅的遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）は、各転写物のための個々のハイブリダイゼーションプローブの提供を必要とせずに、多数の遺伝子転写物の同時的且つ定量的解析を可能にする。ＳＡＧＥ法では、転写物を一意に同定するのに十分な情報を含有する短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が生成されるが、但し、タグは各転写物内の一意の位置から得られる。次に、多数の転写物は一緒に連結されて、長い連続分子を形成し、これはシーケンシングされて、多数のタグの同一性を同時的に明示する。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在度を確定し、各タグに対応する遺伝子を同定することにより定量され得る（例えばVelculescu et al., Science, 270:484-487, 1995およびVelculescu et al., Cell, 88: 243-51, 1997参照）。

大規模並列処理特徴配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析は、Brenner等（Nature Biotechnology, 18: 630-634, 2000）により最初に記載された。それは、非ゲルベースのシグネチャー・シーケンシングを、別個の直径５μｍのマイクロビーズ上の多数の鋳型のin vitroクローニングと組合せるシーケンシングアプローチである。ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーは、in vitroクローニングにより構築される。この結果、高密度でのフローセル中の鋳型含有マイクロビーズの平面アレイのアセンブリーが生じる。各マイクロビーズ上のクローン化鋳型の自由末端は、ＤＮＡ断片分離を必要としない蛍光ベースのシグネチャー・シーケンシング法を用いて同時的に分析される。

いくつかの例では、示差的遺伝子発現は、in situハイブリダイゼーション技法、例えば蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または色原体in situハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）を用いて確定される。これらの方法では、特定の結合相手、例えば標的ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、ＧＡＳ１、ＴＫ１またはＷＮＴ５Ａ ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子）に特異的な蛍光体または色原体で標識されるプローブは、試料、例えば支持体（例えば、スライドガラス）上に封入される前立腺癌試料と接触される。特定の結合相手は、試料中のそれらの同族標的と特定の検出可能な相互作用を形成する（例えば、それらとハイブリダイズする）。例えば、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションは、例えばプローブと会合された標識を検出することにより検出され得る。いくつかの例では、顕微鏡検査、例えば蛍光顕微鏡検査が用いられる。

免疫組織化学（ＩＨＣ）は、開示された方法においてタンパク質発現産物を検出するための有用な例示的一技法である。各タンパク質発現マーカーに特異的な抗体（例えば、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体）は、発現を検出するために用いられる。抗体は、放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識、例えばビオチン、あるいは酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて抗体それ自体を直接標識することにより、検出され得る。代替的には、非標識化一次抗体は、一次抗体に特異的な標識化二次抗体（抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を包含する）と協力して用いられる。ＩＨＣプロトコールおよびキットは当該技術分野でよく知られており、市販されている。

プロテオーム解析は、開示された方法においてタンパク質発現産物を検出するために有用な別の例示的技法である。「プロテオーム」という用語は、ある時点で試料（例えば、組織、生物体または細胞培養）中に存在するタンパク質の総量として定義される。プロテオミクスは、特に、試料中のタンパク質発現の全体的変化についての研究を包含する（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。例示的プロテオミクス検定は、（ｉ）例えば２−Ｄゲル電気泳動による試料中の個々のタンパク質の分離；（ｉｉ）例えば、質量分光分析またはＮ末端シーケンシングによるゲルから回収される個々のタンパク質の同定；ならびに（ｉｉｉ）データの解析を包含する。

Ｂ．例示的前立腺癌バイオマーカー
１．増殖停止特異的１（ＧＡＳ１）
ヒト増殖停止特異的１（ＧＡＳ１）遺伝子は、遺伝子地図遺伝子座９ｑ２１．３−ｑ２２．１で第９染色体上に位置し、４５ｋＤａのグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質をコードする。例示的ＧＡＳ１配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）から公的に利用可能である（例えば、寄託番号ＮＰ_００２０３９．２およびＡＡＨ５５７４７．１（タンパク質）およびＢＣ１３２６８２．１およびＮＭ_００８０８６．１（ｃＤＮＡ））。ＧＡＳ１タンパク質（例えば配列番号２参照）は、推定腫瘍サプレッサーである。それは、増殖抑制に一役を果たす（Del Sal et al., Cell, 70: 595-607, 1992）。特に、ＧＡＳ１は、Ｓ期に入ることを遮断し、正常および形質転換細胞の周期循環を阻止する。ＧＡＳ１は、ＧＤＮＦα受容体に関連し、Ｒｅｔシグナル伝達を調節する（Cabrera et al., J. Biol. Chem., 281(20): 14330-9, 2006）。

Del Sal等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1848-1852, 1994）は、ヒトＧＡＳ１ ｃＤＮＡをクローン化した（例えば配列番号１参照）。誘導３４５−アミノ酸タンパク質は、２つの推定膜貫通ドメイン、ＲＧＤコンセンサス認識配列、および１つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含有した。Stebel等（FEBS Lett., 481: 152-8, 2000）は、ＧＡＳ１タンパク質が同時翻訳修飾、例えばシグナルペプチド切断、Ｎ結合型グリコシル化、およびグリコシルホスファチジルイノシトール・アンカー付加を受ける、ということを実証した。

Del Sal等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1848-1852, 1994）は、ヒトＧＡＳ１遺伝子の過剰発現が、肺および膀胱癌細胞株における細胞増殖を遮断するが、しかし骨肉種細胞株ではまたはアデノウイルス５型形質転換細胞株では遮断しない、ということを実証した。Del Sal等（Cell, 70: 595-607, 1992）は、ＳＶ４０形質転換ＮＩＨ ３Ｔ３細胞もネズミＧＡＳ１過剰発現に不応性である、ということを以前に示したが、これは、細胞芽細胞腫および／またはｐ５３遺伝子産物がＧＡＳ１の増殖抑制作用を媒介するのに能動的な役割を有する、ということを示唆する。MartinelliとFan（Genes Dev., 21: 1231-1243, 2007）は、ＧＡＳ１が、マウスおよびニワトリを発生するに際してヘッジホッグ・シグナル伝達（ヘッジホッグが低濃度で作用する領域で特に注目に値する効果）を積極的に調節する、ということを見出した。

Seppala等（J. Clin. Invest., 117: 1575-1584, 2007）は、ＧＡＳ１-／-マウスを生成し、ミクロフォーム全前脳胞症、例えば顔面中央形成不全、顎骨前方切歯融合、および口蓋裂を、重症耳欠陥のほかに観察した；しかしながら、前脳は総じて無傷のままであった。これらの欠陥は、転写源から離れた細胞におけるＳｈｈシグナル伝達の欠損に関連づけられた。

２．ウイングレス型ＭＭＭＴＶ組込み部位ファミリー成員５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）
ヒトＷＮＴ５Ａ遺伝子は、遺伝子地図遺伝子座３ｐ２１−ｐ１４で第３染色体上に位置する。Ｗｎｔ遺伝子は、ショウジョウバエからヒトまでの範囲の種において発現される少なくとも１３の既知の成員を有する癌原遺伝子の一ファミリーに属する。Ｗｎｔは、発生様式、細胞増殖、分化、細胞極性および形態形成運動における役割を含めた多様な生物学的機能を調節する脂質修飾分泌糖タンパク質である（Logan and Nusse, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 20: 781-810, 2004）。Ｗｎｔファミリー遺伝子の転写は、精確な時間的および空間的方式で、発生的に調節されると思われる。

Gavin等（Genes Dev., 4: 2319-2332, 1990）は、マウスにおける、ＷＮＴ５Ａを含めた、Ｗｎｔ遺伝子ファミリーの６つの新規の成員を同定した。Ｗｎｔ遺伝子は、３８〜４３ｋＤの富Ｃｙｓ推定糖タンパク質をコードするが、これらは、分泌増殖因子に典型的な特徴を有する（例えば、相対的間隔が保持される疎水性シグナル配列および２１の保存システイン残基）（例えば配列番号４参照）。

Clark等（Genomics, 18: 249-260, 1993）は、ヒトＷｎｔ５Ａ ｃＤＮＡをクローン化した（例えば配列番号３参照）。他の例示的ＷＮＴ５Ａ配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）から公的に利用可能である（例えば、寄託番号ＡＡＨ７４７８３．２およびＡＡＶ６９７５０．１（タンパク質）およびＮＭ_００３３９２．３およびＮＭ_００９５２４．２（ｃＤＮＡ））。He等（Science, 275: 1652-1654, 1997）は、ヒト・フリズルド−５がＷＮＴ５Ａのための受容体である、ということを示した。Ｗｎｔリガンドはフリズルドファミリーの受容体を利用し、シグナル伝達は通常は２つの経路に分けられる：すなわち、β−カテニンを介して作用する「正準経路」と、Ｃａ^２＋およびに平面極性経路を介して作用する「非正準経路」である（Veeman et al., Dev. Cell 5: 367-77, 2003）。ＷＮＴ５Ａタンパク質は、ヒストンメチル化を実行することにより転写に影響を及ぼし、細胞移動を増大し、細胞極性に影響を及ぼし、内皮増殖を誘導し、ある種のメタロプロテイナーゼの発現を増大することが示されている。

３．可溶性チミジンキナーゼ（ＴＫ１）
ヒトＴＫ１遺伝子は、遺伝子地図遺伝子座１７ｑ２５．２−ｑ２５．３で第１７染色体上に位置する。例示的ｃＤＮＡおよびタンパク質配列に関しては、それぞれ、配列番号５および６を参照されたい。他の例示的ＴＫ１配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）から公的に利用可能である（例えば、寄託番号ＮＰ_００３２４９．３およびＮＰ_０３３４１３．１（タンパク質）ならびにＡＢ４５１２６８．１およびＮＭ_０５２８００．１（ｃＤＮＡ））。

チミジンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．２１）は、チミジンのデオキシチミジン一リン酸へのリン酸化を触媒する。Lin等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6528-6532, 1983）は、ＴＫ１遺伝子をクローン化し、その最大サイズを１４ｋｂ、その最小サイズを４〜５ｋｂであると概算した。遺伝子は、多数の非コード挿入物および多数のＡｌｕ配列を含有する。SherleyとKelly（J. Biol. Chem., 263: 375-382, 1988）は、HeLa細胞から酵素を精製し、特性化した。ＴＫ遺伝子の５’フランキング領域で、Sauve等（DNA Sequence, 1: 13-23, 1990）は、トランス作用性因子のための結合部位として作用し得るヌクレオチド配列、ならびに潜在的シス作用性配列の位置を突き止めた。後者は、ヒト増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）遺伝子のプロモーターのものと比較された。ＴＫおよびＰＣＮＡはともに、細胞周期のＧ１／Ｓ境界で最大に発現される。

４．変異体配列
本明細書中で提供される具体的な配列、そして一般に公的に利用可能である配列のほかに、このような配列の変異体が特定被験者において存在し得る、と当業者は理解する。例えば、特定の遺伝子またはタンパク質に関する多形性が存在し得る。さらに、配列は異なる生物体間で変わり得る。特定の例では、変異体配列は、その対応するネイティブ配列の生物学的活性を保持する。例えば、特定被験者に存在する配列（例えば、表８に列挙されたＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１配列、あるいは任意のその他の遺伝子／タンパク質）は、保存的アミノ酸変化（例えば、極高度に保存された置換、高度保存置換または保存置換）、例えば１〜５または１〜１０の保存的アミノ酸置換を有し得る。保存的アミノ酸置換の例を、表１に示す。

いくつかの実施形態では、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１配列は、それぞれネイティブＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１配列の配列変異体、例えば配列番号１〜６で記述される配列と少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９２％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、または少なくとも６０％の配列同一性（または本明細書中で言及されるＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号とのこのような量の配列同一性）を有する核酸またはタンパク質配列であって、この場合、結果的に生じる変異体はＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１生物学的活性を保持する。「配列同一性」は、２つのアミノ酸配列間（または２つの核酸配列間）の類似性を記述するために一般に用いられる語句である。配列同一性は、典型的には、同一性百分率に換算して表される：百分率が高いほど、２つの配列の類似性は大きい。

特定の例では、表８に列挙された遺伝子またはタンパク質の配列変異体は、ネイティブ配列と比較して1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有するか、あるいはネイティブ配列との特定百分率の配列同一性（例えば、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９２％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、または少なくとも６０％の配列同一性）を有する。特定の例では、このような変異体は、ネイティブタンパク質または核酸分子の有意量の生物学的活性を保持する。

比較のために配列を整列させるための、および配列同一性を確定するための方法は、当該技術分野でよく知られている。種々のプログラムおよびアラインメント・アルゴリズムは、以下の：Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS, 5: 151-153, 1989；Corpet et al., Nucleic Acids Research, 16: 10881-10890, 1988；Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences, 8: 155-165, 1992；Pearson et al., Methods in Molecular Biology, 24: 307-331, 1994；Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett., 174: 247-250, 1999に記載されている。Altschul等は、配列−アラインメント方法および相同性算定についての詳細な考察も提示している（J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）。

米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）基本ローカル配列検索ツール（ＢＬＡＳＴ（商標）、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと結びつけて用いるために、国立生物工学情報センター（NCBI, Bethesda, MD）を含めたいくつかの情報源から、ならびにインターネット上で、公的に入手可能である。このプログラムを用いて配列同一性を確定するための方法の説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）に関するヘルプ・セクション下でインターネット上で利用可能である。

約１５アミノ酸より大きいアミノ酸配列の比較のために、デフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス組を使用するＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｐ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」機能が用いられて、パラメーターをデフォルトする（ギャップ開始コスト［デフォルト＝５］；ギャップ継続コスト［デフォルト＝２］；塩基不一致ペナルティ値［デフォルト＝３］；塩基一致スコア値［デフォルト＝１］；出現期待値（Ｅ）［デフォルト＝１０．０］；ワードサイズ［デフォルト＝３］；および候補配列の最大表示数（Ｖ）［デフォルト＝１００］）。短いペプチド（約１５アミノ酸より小さい）を整列する場合、アラインメントは、組成物ベースの統計学を用いて、パラメーターをデフォルトする（予測閾値＝２００００、ワードサイズ＝２、ギャップコスト：存在＝９および拡張＝１）ためのＰＡＭ３０マトリックス組を使用するＢｌａｓｔ２配列機能「短い塩基のほぼ完全一致に関する検索」を用いて実施されるべきである。

Ｃ．組成物
その発現が当該疾患に悩む被験者における前立腺癌を特徴づける遺伝子（例えば表８参照）が、本明細書中で開示される。したがって、生物学的試料中のこのような遺伝子の検出を促す組成物が、ここで可能にされる。
１．キット

開示された方法の実行を促すために有用なキットも意図される。一実施形態では、表８に開示された遺伝子のうちの1つまたは複数（例えば、表８に開示された遺伝子のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも５つ、少なくとも７つまたは少なくとも１０）を検出するためのキットが提供される。具体的一例では、例えば１〜１０（例えば１、２、３、４または５）のハウスキーピング遺伝子またはタンパク質（例えばβ−アクチン、ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＨＢＳ１ＬおよびＡＨＳＰ）と組合せて、少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１核酸またはタンパク質分子を検出するためのキットが提供される。さらに他の具体例では、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１核酸またはタンパク質分子のみを検出するためのキットが提供される。検出手段は、遺伝子および／または遺伝子発現産物、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質を伴うゲノム変更を検出するための手段を包含し得る。特定の例では、表８に列挙された遺伝子またはタンパク質のうちの1つまたは複数を検出するための手段（例えば、少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１を検出するための手段）は、別個の容器またはバイアル中に包装される。いくつかの例では、表８に列挙された遺伝子またはタンパク質のうちの1つまたは複数を検出するための手段（例えば、少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１を検出するための手段）は、アレイ上に存在する（以下で考察）。

例示的キットとしては、開示遺伝子または遺伝子産物のうちの1つまたは複数の検出のための少なくとも１つの手段（少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５つの検出手段）、例えば、少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１の検出を可能にする手段が挙げられる。いくつかの例では、このようなキットはさらに、1つまたは複数（例えば１〜３つ）のハウスキーピング遺伝子またはタンパク質の検出のための少なくとも１つの手段を包含し得る。検出手段としては、開示される遺伝子を含めたゲノム配列に特異的な核酸プローブ、開示遺伝子によりコードされる転写物（例えばｍＲＮＡ）に特異的な核酸プローブ、開示遺伝子の特異的増幅のための一対のプライマー（例えばこのような遺伝子のゲノム配列またはｃＤＮＡ配列）、開示遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体または抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。特定のキット実施形態としては、例えば、ＷＮＴ５Ａ転写物に特異的な核酸プローブ、ＴＫ１転写物に特異的な核酸プローブ、ＧＡＳ１転写物に特異的な核酸プローブ、ＷＮＴ５Ａ転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＴＫ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＧＡＳ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＷＮＴ５Ａタンパク質に特異的な抗体、ＴＫ１タンパク質に特異的な抗体、およびＧＡＳ１タンパク質に特異的な抗体から選択される1つまたは複数（例えば２、３または４つ）の検出手段が挙げられ得る。特定のキット実施形態はさらに、例えば、ハウスキーピング転写物に特異的な核酸プローブ、ハウスキーピング転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、およびハウスキーピングタンパク質に特異的な抗体から選択される1つまたは複数（例えば２または３つ）の検出手段を包含し得る。例示的ハウスキーピング遺伝子／タンパク質としては、ＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＨＢＳ１Ｌ、β−アクチンおよびＡＨＳＰが挙げられる。

いくつかのキット実施形態では、一次検出手段（例えば、核酸プローブ、核酸プライマーまたは抗体）は、例えば、蛍光団、発色団または検出可能な生成物を生成し得る酵素（例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび当該技術分野で一般に知られている他のもの）で直接的に標識され得る。他のキット実施形態は、二次検出手段；例えば二次抗体（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体、ウサギ抗マウス抗体、抗ハプテン抗体）または非抗体ハプテン結合分子（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）を包含する。いくつかのこのような場合、二次検出手段は、検出可能部分で直接的に標識される。他の場合には、二次（またはより高次の）抗体は、ハプテン（例えば、ビオチン、ＤＮＰおよび／またはＦＩＴＣ）と接合され、これは、検出可能的に標識された同族ハプテン結合分子（例えば、ストレプトアビジン（ＳＡ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＳＡアルカリ性ホスファターゼおよび／またはＳＡ ＱＤｏｔ（商標））により検出可能である。いくつかのキット実施形態は、比色試薬（例えば、ＤＡＢおよび／またはＡＥＣ）を、このような比色試薬の発色のために酵素で標識される一次または二次（またはより高次の）検出手段（例えば、抗体）と同時に用いられるよう適切な容器中に含み得る。

いくつかの実施形態では、キットは、陽性または陰性対照試料、例えば、表８に列挙された特定の遺伝子または遺伝子産物を発現するかまたは発現しないことが知られている細胞株または組織を包含する。特定の例では、対照試料はＦＦＰＥである。試料の例としては、正常（例えば、非癌性）細胞または組織、乳癌細胞株または組織、前立腺切除後（例えば前立腺切除後少なくとも５年、または少なくとも１０年）、前立腺癌再発を有していないことが分かっている被験者からの前立腺癌試料、ならびに前立腺切除後に前立腺癌再発を有したことが分かっている被験者からの前立腺癌試料が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、キットは、例えば、開示遺伝子またはその発現産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）を特異的に結合するプローブまたは抗体の使用の手段、あるいは特定のプライマーまたはプローブに関する使用の手段を開示する使用説明書を包含する。使用説明書は、電子形態（例えばコンピューター・ディスケットまたはコンパクトディスク）で書かれ得るし、あるいは視覚的であり得る（例えば、ビデオファイル）。キットは、キットが意図される特定の適用を促すための付加的構成成分も包含し得る。したがって、例えばキットは、特定の開示された方法の実行のためにルーチン的に用いられる緩衝剤およびその他の試薬を包含し得る。このようなキットおよび適切な内容物は、当業者によく知られている。

ある種のキット実施形態は、キャリア手段、例えば箱、袋、小かばん、プラスチック・カートン（例えば、成形プラスチックまたはその他の透明パッケージ）、包装紙（例えば、密封または密封可能なプラスチック製、紙製または金属製包装紙）、あるいはその他の容器を包含し得る。いくつかの例では、キット構成成分は、単一包装単位、例えば箱またはその他の容器中に封入され、これらの包装単位は、キットの1つまたは複数の構成成分が配置され得る区画を有し得る。他の例では、キットは、例えば試験されるべき1つまたは複数の生物学的試料を保持し得る1つまたは複数の容器、例えばバイアル、管等を包含する。

他のキット実施形態は、例えば注射器、綿棒またはゴム手袋を包含し、これらは生物学的試料を取扱い、収集し、および／または加工処理するために有用であり得る。キットは、任意に、ある位置から別の位置に生物学的試料を移動するために有用な用具、例えばスポイト、注射器等も含有し得る。さらに他のキット実施形態は、使用済みのまたはもはや必要とされない品目（例えば、被験者試料）を廃棄するための廃棄手段を包含し得る。このような廃棄手段としては、廃棄物質からの漏出物を含入し得る容器、例えばプラスチック、金属またはその他の不浸透性袋、箱または容器が挙げられるが、これらに限定されない。

２．アレイ
遺伝子（例えば、ゲノム配列および対応する転写物）およびタンパク質の検出のためのマイクロアレイは、当該技術分野でよく知られている。マイクロアレイとしては、多数の（例えば数百のまたは数千でさえある）特異的結合剤（例えば、ｃＤＮＡプローブ、ｍＲＮＡプローブまたは抗体）がその上に固定される固体表面（例えば、スライドガラス）が挙げられる。特異的結合剤は、アレイ上にアドレス呼出可能（例えば、格子）フォーマットで明瞭に配置される。アレイ上のアドレス呼出可能位置の数は、例えば少なくとも３から、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも３３、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００またはそれ以上まで変わり得る。アレイは、配置される特異的結合剤に関する標的（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質（適用可能な場合））を含有すると考えられる生物学的試料と接触される。特異的結合剤は、試料中に存在するそれらの同族標的と相互作用する。すべての固定化結合剤の間の標的の結合パターンは、遺伝子発現のプロフィールを提供する。特定実施形態では、種々のスキャナーおよびソフトウェアプログラムを用いて、「作動」される（例えば、固定化特異的結合剤に結合される）遺伝子のパターンをプロファイルし得る。代表的マイクロアレイは、例えば米国特許第５４１２０８７号、第５４４５９３４号、第５７４４３０５号、第６８９７０７３号、第７２４７４６９号、第７１６６４３１号、第７０６０４３１号、第７０３３７５４号、第６９９８２７４号、第６９４２９６８号、第６８９０７６４号、第６８５８３９４号、第６７７０４４１号、第６６２０５８４号、第６５４４７３２号、第６４２９０２７号、第６３９６９９５号、第６３５５４３１号に記載されている。

タンパク質アレイであれ、核酸アレイであれ、表８に開示された遺伝子（または遺伝子産物）のうちの少なくとも３つを検出するためのアレイが、本明細書中で開示される。特定実施形態では、開示アレイは、開示された遺伝子のうちの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または３３すべてに特異的な結合剤からなる。特定アレイ実施形態は、ＧＡＳ１、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１、Ｅ２Ｆ５およびＭＳＨ２発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質）に特異的な核酸プローブまたは抗体からなる。より特定的なアレイ実施形態は、ＧＡＳ１、ＷＮＴ５ＡおよびＴＫ１発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質）に特異的な核酸プローブまたは抗体からなる。その他のアレイ実施形態は、表８中の３３遺伝子のうちの各１つに関する発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質）に特異的な核酸プローブまたは抗体からなる；したがって、アレイは、以下の遺伝子のすべてに対応するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質に特異的な核酸プローブまたは抗体からなる：ＣＤＣ２５Ｃ、Ｅ２Ｆ５、ＭＭＰ３、ＣＹＰ１Ａ１、ＦＧＦ８、ＷＮＴ５Ａ、ＣＨＥＫ１、ＣＳＦ２、ＣＤＣ２、ＩＬ１Ａ、ＡＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＴＥＲＴ、ＡＬＯＸ１２、ＢＲＣＡ２、ＦＡＮＣＡ、ＧＡＳ１、ＬＭＯ１、ＰＬＧ、ＴＤＧＦ１、ＴＫ１、ＢＬＭ、ＭＳＨ２、ＮＡＴ２、ＤＭＢＴ１、ＦＬＴ３、ＧＦＩ１、ＭＯＳ、ＴＰ７３、ＨＭＭＲおよびＩＮＨＡ。特定例では、アレイはさらに、ハウスキーピング遺伝子または遺伝子産物、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質に特異的な核酸プローブまたは抗体を包含する。

ａ．核酸アレイ
一例では、アレイは、表８に列挙された遺伝子のうちの少なくとも３つ、例えば開示遺伝子のうちの少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または３３すべてとハイブリダイズし得る核酸プローブを包含し、例えば、少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１とハイブリダイズし得る核酸プローブを包含する（例えば、配列番号１、３または５あるいはその相補鎖とハイブリダイズし得る核酸プローブを包含する）。特定例では、アレイは、表８中に列挙された３３遺伝子すべてを認識し得るプローブを包含する。このようなアレイのあるもの（ならびに本明細書中に記載される方法）は、さらに、ハウスキーピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ＳＤＨＡ（スクシネートデヒドロゲナーゼ）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＨＢＳ１Ｌ（ＨＢＳ１様タンパク質）、β−アクチンおよびＡＨＳＰ（アルファヘモグロビン安定化タンパク質）のうちの1つまたは複数））に特異的なオリゴヌクレオチドを包含し得る。

一例では、表８に列挙された遺伝子のうちの少なくとも３つ（例えば少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１）の検出、例えば被験者から（例えば前立腺癌試料から）得られた核酸配列（例えば、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の検出に用いるために、一組のオリゴヌクレオチドプローブが固体支持体の表面に結合される。さらに、内部対照核酸配列が用いられる場合（例えば再発中の前立腺癌を有さなかった被験者から得られた核酸配列、またはハウスキーピング遺伝子核酸配列）、核酸プローブは、この対照核酸分子の存在を検出するために含まれ得る。

アレイに結合されるオリゴヌクレオチドプローブは、例えば高緊縮条件下で、被験者から得られたか、または被験者から増幅された配列と特異的に結合し得る。当該方法とともに用いる作用物質は、表８に列挙された標的遺伝子配列を認識するオリゴヌクレオチドプローブを包含する。このような配列は、既知の遺伝子配列を検査し、表８に列挙された特定遺伝子と特異的にハイブリダイズするが、しかし他の遺伝子配列とは特異的にハイブリダイズしないプローブ配列を選択することにより、確定され得る。

本発明の開示に従う方法および装置は、適切な条件下で、オリゴヌクレオチドプローブが、相補的塩基配列を有する核酸分子と塩基対合二重鎖を形成する、という事実を利用する。二重鎖の安定性は、多数の因子、例えばオリゴヌクレオチドプローブの長さ、塩基組成、ならびにハイブリダイゼーションが実行される溶液の組成に依っている。二重鎖安定性に及ぼす塩基組成の作用は、特定溶液中での、例えば高濃度の第三級または第四級アミンの存在下で、ハイブリダイゼーションを実行することにより、低減され得る。二重鎖の熱安定性は、配列間の配列類似性の程度にも依っている。標的配列とアレイに結合されるオリゴヌクレオチドとの間に形成されると予測される種類の二重鎖の予想温度Ｔｍに近い温度でハイブリダイゼーションを実行することにより、ミスマッチ二重鎖の形成率は実質的に低減され得る。

アレイに用いられる各オリゴヌクレオチドプローブの長さは、標的配列の結合を最適にするよう選択され得る。具体的スクリーニング条件下で特定遺伝子配列とともに用いるための最適長は、経験的に確定され得る。したがって、アレイに含まれているオリゴヌクレオチド配列の組の各々の個々の素子に関する長さは、スクリーニングのために最適化され得る。一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば約２０〜約３５ヌクレオチド長、または約２５〜約４０ヌクレオチド長である。

アレイを形成するオリゴヌクレオチドプローブ配列は、支持体に直接的に連結され得る。代替的には、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチド（標的遺伝子配列と非特異的にハイブリダイズしない）、あるいは固体支持体とのスペーサーまたはリンカーとして役立つその他の分子により、支持体に結合され得る。

ｂ．タンパク質アレイ
別の例では、アレイは、タンパク質配列（またはこのようなタンパク質の断片、あるいはこのようなタンパク質またはタンパク質断片に特異的な抗体）を包含し、これらは、表３に列挙されたタンパク質配列のうちの少なくとも３つ、例えば開示タンパク質のうちの少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５または３３全部を包含し、例えば、少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１と特異的に結合し得る（例えば、それぞれ、配列番号２、４または６と安定的に結合し得る）タンパク質結合剤を包含する。特定例では、アレイは、表８に列挙された３３のタンパク質すべてを認識し得るタンパク質結合剤を包含する。このようなアレイ（ならびに本明細書中に記載される方法）のいくつかは、さらに、ハウスキーピングタンパク質（例えばＧＡＰＤＨ、ＳＤＨＡ、ＨＰＲＴ１、ＨＢＳ１Ｌ、β−アクチンおよびＡＨＳＰのうちの1つまたは複数）に特異的なタンパク質結合剤を包含し得る。

アレイを形成するタンパク質または抗体は、支持体に直接的に連結され得る。代替的には、タンパク質または抗体は、固体支持体とのスペーサーまたはリンカーにより支持体に結合され得る。タンパク質発現における変化は、例えば、タンパク質特異的結合剤（これはいくつかの例では標識される）を用いて検出され得る。ある例では、タンパク質発現における変化を検出することは、被験者の前立腺癌試料から得られるタンパク質試料を、タンパク質特異的結合剤（例えばアレイ上に存在し得る）と接触させること；ならびに結合剤が試料により結合されるか否かを検出し、それにより試料中に存在する標的タンパク質のレベルを測定することを包含する。試料中の標的タンパク質（例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１）のレベルの差は、特定例において、再発前立腺癌を有していなかった被験者からの類似の試料中に見出される同一標的タンパク質のレベルと比較して、被験者が予後不良を有する、ということを示す。
ｃ．アレイ基板

アレイ固体支持体は、有機ポリマーから形成され得る。固体支持体のための適切な材料としては、以下の：ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリビニルピロリジン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオリド、ポリフルオロエチレン−プロピレン、ポリエチレンビニルアルコール、ポリメチルペンテン、ポリクロロトリフルオロエチレン、ポリスルホン、ヒドロキシル化二軸配向ポリプロピレン、アミノ化二軸配向ポリプロピレン、チオール化二軸配向ポリプロピレン、エチレンアクリル酸、エチレンメタクリル酸、ならびにそのコポリマーの配合物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第５，９８５，５６７号）。

概して、固体支持体表面を形成するために用いられ得る材料の適切な特徴としては、以下のものが挙げられる：活性化時に、支持体の表面が生体分子、例えばオリゴヌクレオチドまたはそれに対する抗体を共有的に結合し得るよう、表面活性化に応じ易いこと；生体分子の「in situ」合成に応じ易いこと；オリゴヌクレオチドまたは抗体に占有されない支持体上の領域が非特異的結合に応じ易くないよう、あるいは非特異的結合が生じた場合、このような材料が、オリゴヌクレオチドまたは抗体を除去することなく表面から容易に除去され得るよう、化学的に不活性であること。

一例では、固体支持体表面はポリプロピレンである。ポリプロピレンは、化学的に不活性で且つ疎水性である。非特異的結合は一般的に回避可能であり、検出感度は改良される。ポリプロピレンは、種々の有機酸（例えば蟻酸）、有機作用物質（例えばアセトンまたはエタノール）、塩基（例えば水酸化ナトリウム）、塩（例えば塩化ナトリウム）、酸化剤（例えば過酢酸）、ならびに無機酸（例えば塩酸）に対する良好な化学的耐性を有する。ポリプロピレンは低蛍光背景も提供し、これが、背景干渉を最小限にして、当該シグナルの感度を増大する。

別の例では、表面活性化有機ポリマーが固体支持表面として用いられる。表面活性化有機ポリマーの一例は、高周波プラズマ放電によりアミノ化されるポリプロピレン材料である。このような材料は、核酸分子の結合のために容易に利用され得る。ヌクレオチド分子がポリマーと結合され得るよう、活性化有機ポリマー上のアミン基はヌクレオチド分子と反応性である。他の反応基、例えばカルボキシル化、ヒドロキシル化、チオール化または活性エステル基も用いられ得る。

ｄ．アレイフォーマット
本発明の開示に従って、広範な種々のアレイフォーマットが用いられ得る。一例としては、当該技術分野でディップスティックと一般的に呼ばれるオリゴヌクレオチド帯域の線状アレイが挙げられる。別の適切なフォーマットとしては、別個の細胞の二次元パターン（例えば、６４×６４アレイで４０９６平方）が挙げられる。当業者に理解されているように、他のアレイフォーマット、例えばスロット（長方形）および円形アレイ（これらに限定されない）は、使用するのに同様に適している（例えば米国特許第５，９８１，１８５号）。一例では、アレイは、糸、膜または皮膜である高分子媒質上に形成される。有機高分子媒質の一例は、約１ミル（０．００１インチ）〜約２０ミルのオーダーの厚みを有するポリプロピレン・シートであるが、しかし皮膜の厚みは重要でなく、かなり広範囲に亘って変更され得る。特に、二軸配向ポリプロピレン（ＢＯＰＰ）皮膜が、アレイの調製のために開示される；それらの耐久性のほかに、ＢＯＰＰ皮膜は、低背景蛍光を示す。

本発明の開示のアレイフォーマットは、種々の異なる型のフォーマットに含まれ得る。「フォーマット」は、固体支持体が添付され得る任意のフォーマット、微量滴定プレート、試験管、無機シート、ディップスティック等を包含する。例えば、固体支持体がポリプロピレン糸である場合、1つまたは複数のポリプロピレン糸はプラスチック製ディップスティック型デバイスに添付され得る；ポリプロピレン膜は、スライドガラスに添付され得る。特定フォーマットは、それ自体且つ自然に、重要ではない。必要であるものはすべて、固体支持体またはその上に吸収される任意のバイオポリマーの機能的振る舞いに影響を及ぼすことなく、固体支持体がそれに添付され得るもの、ならびにフォーマット（例えばディップスティックまたはスライド）が、デバイスが導入される任意の材料に対して安定であるもの（例えば、臨床試料およびハイブリダイゼーション溶液）である。

本発明に開示のアレイは、種々のアプローチにより調製され得る。一例では、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質配列は、別々に合成され、次に固体支持体に結合される（例えば米国特許第６，０１３，７８９号参照）。別の例では、配列は、支持体上に直接合成されて、所望のアレイを提供する（例えば、米国特許第５，５５４，５０１号参照）。オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を固体支持体に共有結合するために、そしてオリゴヌクレオチドまたはタンパク質を支持体上に直接合成するための適切な方法は、当業者に知られている；適切な方法の要約は、Matson et al., Anal. Biochem. 217: 306-10, 1994に見出され得る。一例では、オリゴヌクレオチドは、固体支持体上にオリゴヌクレオチドを調製するための慣用的化学技法を用いて、支持体上に合成される（例えばＰＣＴ出願ＷＯ８５／０１０５１およびＷＯ８９／１０９７７または米国特許第５，５５４，５０１号参照）。

適切なアレイは、予定パターンで４つの塩基に関する前駆体を被せることにより、アレイのセル中にオリゴヌクレオチドを合成するために自動化手段を用いて生成され得る。要するに、基板を横断して、平行横列（総計で、送達系におけるチャンネルの数に対応する）で、オリゴヌクレオチドプローブ集団を作製するために、多チャンネル自動化化学送達系が用いられる。第１の方向でのオリゴヌクレオチド合成の完了後、次に、基板は９０°回転されて、第１の組に対してここで直角を成す第２の（２°）組の横列内で合成を進行させる。このプロセスは、その交差が複数の別個のセルを生じる多チャンネルアレイを作製する。

オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドの３’末端により、またはオリゴヌクレオチドの５’末端により、支持体に結合され得る。一例では、オリゴヌクレオチドは、３’末端により固体支持体に結合される。しかしながら、当業者は、固体支持体との結合に適しているのはオリゴヌクレオチドの３’末端の使用か、５’末端の使用かを確定し得る。概して、３’末端および５’末端の領域におけるオリゴヌクレオチドプローブの内部相補性が、支持体への結合を決定する。特定例では、アレイ上のオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ：標的配列ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にする1つまたは複数の標識を包含する。

３．タンパク質特異的結合剤
いくつかの例では、表８に列挙された遺伝子または遺伝子産物のうちの1つまたは複数（例えば、少なくとも３つ）を検出するために用いられる手段は、タンパク質特異的結合剤、例えば抗体またはその断片である。例えば、表８に列挙されたタンパク質、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１（例えば、それぞれ、配列番号２、４または６）に特異的な抗体またはアプタマーは、市販供給元から入手可能であるか、または当該技術分野で一般的な技法を用いて調製され得る。このような特異的結合剤は、本明細書中で提供される予後方法にも用いられ得る。

特異的結合試薬としては、例えば抗体あるいはその機能的断片または組換え誘導体、アプタマー、鏡像アプタマー、あるいは以下の足場のいずれか１つまたは複数を基礎にした工学処理非免疫グロブリン結合タンパク質が挙げられる：フィブロネクチン（例えばADNECTINS（商標）またはモノボディ）、ＣＴＬＡ−４（例えばEVIBODIES（商標））、テンダミスタット（例えばMcConnell and Hoess, J. Mol. Biol., 250: 460-470, 1995）、ネオカルジノスタチン（例えばHeyd et al., Biochem., 42: 5674-83, 2003）、ＣＢＭ４−２（例えばCicortas-Gunnarsson et al., Protein Eng. Des. Sel., 17: 213-21, 2004）、リポカリン（例えばANTICALINS（商標）；Schlehuber and Skerra, Drug Discov. Today, 10: 23-33, 2005）、Ｔ細胞受容体（例えばChlewicki et al., J. Mol. Biol., 346:223-39, 2005）、プロテインＡドメイン（例えばAFFIBODIES（商標）；Engfeldt et al., ChemBioChem, 6: 1043-1050, 2005）、Ｉｍ９（例えばBernath et al., J. Mol. Biol., 345: 1015-26, 2005）、アンキリン反復タンパク質（例えばDARPins；Amstutz et al., J. Biol. Chem., 280: 24715-22, 2005）、テトラトリコペプチド反復タンパク質（例えばCortajarena et al., Protein Eng. Des. Sel., 17: 399-409, 2004）、ジンクフィンガードメイン（例えばBianchi et al., J. Mol. Biol., 247: 154-60,1995）、ｐＶＩＩＩ（例えばPetrenko et al., Protein Eng., 15: 943-50, 2002）、ＧＣＮ４（Sia and Kim, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 9756-61, 2003）、鳥類膵臓ポリペプチド（ＡＰＰ）（例えばChin et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 11: 1501-5, 2001）、ＷＷドメイン（例えばDalby et al., Protein Sci., 9: 2366-76, 2000）、ＳＨ３ドメイン（例えばHiipakka et al., J. Mol. Biol., 293: 1097-106, 1999）、ＳＨ２ドメイン（Malabarba et al., Oncogene, 20: 5186-5194, 2001）、ＰＤＺドメイン（例えばTELOBODIES（商標）；Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17: 170-5, 1999）、ＴＥＭ−１ β−ラクタマーゼ（例えばLegendre et al., Protein Sci., 11: 1506-18, 2002）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（例えばZeytun et al., Nat. Biotechnol., 22: 601, 2004）、チオレドキシン（例えばペプチドアプタマー：Lu et al., Biotechnol., 13: 366-372, 1995）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ（例えばNorman, et al., Science, 285: 591-5, 1999）、ＰＨＤフィンガー（例えばKwan et al., Structure, 11: 803-13,2003）、キモトリプシン阻害薬２（ＣＩ２）（例えばKarlsson et al., Br. J. Cancer, 91: 1488-94,2004）、ウシ膵臓トリプシン阻害薬（ＢＰＴＩ）（例えばRoberts, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 2429-33, 1992）、ならびに多数の他のもの（Binz et al., Nat. Biotechnol.,23(10): 1257-68, 2005による再検討および補足項目を参照）。

特異的結合試薬は、抗体も包含する。「抗体」という用語は、特定抗原と特異的に結合するか、またはそれと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子（またはその組合せ）を指し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子工学処理抗体および別のやり方で修飾された形態の抗体を包含し、例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヘテロ共役抗体（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディ）、一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ポリペプチドとの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチド、抗体の抗原結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片としては、タンパク質分解性抗体断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆａｂ断片、ＦｖおよびｒＩｇＧ］、組換え抗体断片（例えばｓＦｖ断片、ｄｓＦｖ断片、二重特異性ｓＦｖ断片、二重特異性ｄｓＦｖ断片、ダイアボディおよびトリアボディ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、ラクダ抗体（例えば米国特許第６，０１５，６９５号；第６，００５，０７９号；第５，８７４，５４１号；第５，８４０，５２６号；第５，８００，９８８号および第５，７５９，８０８号参照）、ならびに軟骨魚および硬骨魚により産生される抗体およびその単離結合ドメイン（例えば国際特許出願ＷＯ０３０１４１６１参照）が挙げられる。

Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である；Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２つのＦａｂ断片を含む二価断片である；Ｆｄ断片は、ＶＨおよびＣＨＩドメインからなる；Ｆｖ断片は、抗体の一本のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる；ならびにｄＡｂ断片はＶＨドメインからなる（例えばWard et al., Nature 341: 544-546, 1989参照）。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域が対合されて、それらを単一タンパク質鎖となし得る合成リンカーを介して一価分子を形成する（例えばBird et al., Science, 242: 423-426, 1988；Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883, 1988参照）。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖上で、しかし、同一鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いて発現され、それにより当該ドメインをもう一方の鎖の相補的ドメインと強いて対合させて、２つの抗原結合部位を作製する二価二重特異性抗体である（例えばHolliger et al., Pro. Natl Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448, 1993；Poljak et al., Structure, 2: 1121-1123, 1994参照）。キメラ抗体は、１つの抗体からの1つまたは複数の領域および1つまたは複数の他の抗体からの1つまたは複数の領域を含有する抗体である。抗体は、1つまたは複数の結合部位を有し得る。１つより多くの結合部位が存在する場合、結合部位は互いに同一であるか、または異なり得る。例えば、天然免疫グロブリンは２つの同一結合部位を有し、一本鎖抗体またはＦａｂ断片は１つの結合部位を有するが、一方、「二重特異性」または「二機能性」抗体は２つの異なる結合部位を有する。

いくつかの例では、抗体は、試料中の他の分子に関する結合定数より少なくとも１０^３Ｍ^−１大きい、１０^４Ｍ^−１大きいまたは１０^５Ｍ^−１大きい結合定数で、標的タンパク質（例えば、表８に列挙されたタンパク質のうちの１つ、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）と特異的に結合する。いくつかの例では、特異的結合試薬（例えば抗体（例えばモノクローナル抗体）またはその断片）は、１ｎＭまたはそれ未満の平衡定数（Ｋ_ｄ）を有する。例えば、特異的結合剤は、少なくとも約０．１×１０^−８Ｍ、少なくとも約０．３×１０^−８Ｍ、少なくとも約０．５×１０^−８Ｍ、少なくとも約０．７５×１０^−８Ｍ、少なくとも約１．０×１０^−８Ｍ、少なくとも約１．３×１０^−８Ｍ、少なくとも約１．５×１０^−８Ｍまたは少なくとも約２．０×１０^−８Ｍの結合親和性で、標的タンパク質と結合し得る。Ｋｄ値は、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）により、または表面プラズモン共鳴装置、例えばＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００（Biacore, Inc., Piscataway, NJから入手可能）を用いて確定され得る。

抗体（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）の生成方法は、当該技術分野で十分に確立されている（例えばHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory New York, 1988参照）。例えば、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１（例えば、それぞれ配列番号２、４または６）のような表８に列挙されたタンパク質のうちの１つのペプチド断片は、担体分子（またはこのようなエピトープまたは共役ＲＤＰをコードする核酸）と共役され、非ヒト哺乳類（マウスやウサギ）に注射され、その後、追加抗原注射されて、抗体応答を生じる。免疫感作動物から単離された血清は、その中に含入されるポリクローナル抗体に関して単離され得るし、あるいは免疫感作動物からの脾臓は、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の産生のために用いられ得る。いくつかの例では、抗体は使用前に精製される。

一例では、表８に列挙されたタンパク質のうちの１つ、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１（例えば、それぞれ配列番号２、４または６）に対するモノクローナル抗体は、KohlerとMilstein（Nature,256: 495, 1975）の古典的方法またはその派生的方法に従って、ネズミハイブリドーマから調製され得る。要するに、マウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ）は、２〜３ミリグラムの選択ペプチド断片（例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１のエピトープ）またはその担体共役体を、２〜３週間の期間に亘って、反復的に接種される。次にマウスは屠殺され、脾臓の抗体産生細胞が単離される。脾臓細胞は、ポリエチレングリコールにより、マウス骨髄腫細胞と融合され、そして、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上での系の増殖により、余分量の非融合細胞が破壊される。上首尾に融合された細胞は希釈され、希釈アリコートは微量滴定プレートのウエル中に置かれて、培養の増殖が継続される。抗体産生クローンは、元々は、Engvall（Enzymol., 70:419, 1980）により記載されたような免疫検定手法、例えばＥＬＩＳＡにより、およびその派生的方法により、ウエルの上清液中の抗体の検出によって同定される。選択陽性クローンは拡張され、それらのモノクローナル抗体産物が使用のために収穫され得る。

抗体の商業的供給元としては、Santa Cruz Biotechnology, Inc.（Santa Cruz, CA）、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)、およびAbcam（Cambridge, UK）が挙げられる。表２は、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１に対する抗体の商業的供給元の例を示す。

開示される特異的結合剤は、アプタマーも包含する。一例では、アプタマーは、特異的配列依存性形状を有し、高親和性および特異性で標的タンパク質（例えば、表８に列挙されたタンパク質のうちの１つ、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）と結合する一本鎖核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）である。アプタマーは一般的に、１００より少ないヌクレオチド、７５より少ないヌクレオチド、または５０より少ないヌクレオチド（例えば、１０〜９５ヌクレオチド、２５〜８０ヌクレオチド、３０〜７５ヌクレオチド、または２５〜５０ヌクレオチド）を含む。具体的一実施形態では、開示特異的結合試薬は、鏡像アプタマー（SPIEGELMER（商標）とも呼ばれる）である。鏡像アプタマーは、Ｄ−オリゴヌクレオチド（例えばアプタマー）と比較して、酵素的分解に対する高耐性を示す高親和性Ｌ−エナンチオマー核酸（例えばＬ−リボースまたはＬ−２’−デオキシリボース単位）である。アプタマーおよび鏡像アプタマーの標的結合特性は、例えばWlotzka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99(13): 8898-8902, 2002に記載されたようなオリゴヌクレオチドの無作為プールから出発するin vitro選択プロセスにより意図される。アプタマーの生成方法は、当該技術分野で知られている（例えばFitzwater and Polisky (Methods Enzymol., 267: 275-301, 1996)；Murphy et al., Nucl. Acids Res. 31: e110, 2003参照）。

別の例では、アプタマーは、高親和性および特異性で標的タンパク質（例えば、表８に列挙されたタンパク質のうちの１つ、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）と結合するペプチドアプタマーである。ペプチドアプタマーは、タンパク質足場に両端で結合されるペプチドループ（例えば、標的タンパク質と特異的である）を包含する。この二重構造束縛は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体に匹敵するレベル（ナノモル範囲）に大いに増大する。可変ループ長は、典型的には８〜２０アミノ酸（例えば８〜１２アミノ酸）であり、足場は、安定で、可溶性で、小さく且つ非毒性である任意のタンパク質（例えば、チオレドキシン−Ａ、ステフィンＡ三重突然変異体、緑色蛍光タンパク質、エグリンＣおよび細胞性転写因子Ｓｐ１）であり得る。ペプチドアプタマー選択は、異なる系、例えば酵母２ハイブリッド系（例えばＧａｌ４酵母２ハイブリッド系）またはＬｅｘＡ相互作用トラップ系を用いてなされ得る。

特異的結合剤は、任意に、検出可能部分で直接的に標識され得る。有用な検出作用物質としては、蛍光化合物（例えばフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリン、ランタニド蛍光体またはシアニンファミリーの染料（例えばＣｙ−３またはＣｙ−５）等）；生物発光化合物（例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質）；検出可能な反応産物を産生し得る酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはグルコースオキシダーゼ等）、あるいは放射性標識（例えば^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉまたは^１３１Ｉ）が挙げられる。

４．核酸プローブおよびプライマー
いくつかの例では、表８に列挙された遺伝子または遺伝子産物のうちの1つまたは複数（例えば少なくとも３つ）を検出するために用いられる手段は、核酸プローブまたはプライマーである。例えば、表８に列挙された遺伝子に特異的な核酸プローブまたはプライマーは、市販供給元から得られるか、当該技術分野で一般的な技法を用いて調製され得る。このような作用物質は、本明細書中で提供される方法にも用いられ得る。

核酸プローブおよびプライマーは、標的核酸分子（例えばゲノム標的核酸分子）とハイブリダイズし得る核酸分子である。例えば、表８に列挙された遺伝子（例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）に特異的なプローブは、標的とハイブリダイズされる場合、直接または間接的に検出され得る。表８に列挙された遺伝子、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１に特異的なプライマーは、標的とハイブリダイズされる場合、標的遺伝子を増殖し得るし、その結果生じるアンプリコンは直接または間接的に検出され得る。したがって、プローブおよびプライマーは、標的核酸分子の検出を可能にし、いくつかの例では、その定量化を可能にする。

プローブおよびプライマーは、標的核酸分子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ）の相補領域と塩基対を形成し、それにより二重鎖分子を形成することにより、標的核酸配列と「ハイブリダイズ」し得る。特定程度の緊縮性を生じるハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質、ハイブリダイズする核酸配列の組成および長さによって変わる。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度ならびにハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（例えばＮａ^＋濃度）は、ハイブリダイゼーションの緊縮度を確定する。特定の緊縮度を得るためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Plainview, NY (chapters 9 and 11)で考察されている。以下にハイブリダイゼーション条件の例を示すが、これらに限定されない：
極高い緊縮度（少なくとも９０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション： ５×ＳＳＣ、６５℃で１６時間
２回洗浄： ２×ＳＳＣ、各々、室温（ＲＴ）で１５分
２回洗浄： ０．５×ＳＳＣ、各々、６５℃で２０分
高緊縮度（少なくとも８０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション： ５×〜６×ＳＳＣ、６５℃〜７０℃で１６〜２０時間
２回洗浄： ２×ＳＳＣ、各々、ＲＴで５〜２０分
２回洗浄： １×ＳＳＣ、各々、５５℃〜７０℃で３０分
低緊縮度（少なくとも５０％の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション： ６×ＳＳＣ、ＲＴ〜５５℃で１６〜２０時間
２回洗浄： ２×〜３×ＳＳＣ、各々、ＲＴ〜５５℃で２０〜３０分

プローブおよびプライマーの商業的供給元としては、Invitrogen（Santa Cruz, CA）が挙げられる。表３は、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１プライマー対の例を示す。プローブの例は、実施例の節の下記の表６に示す。

標的核酸（例えば、表８に列挙された遺伝子、例えばＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１）に特異的なプローブまたはプライマーの生成方法は、当該技術分野では慣例的手順である（Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Plainview, NY）。例えば、配列番号１、３または５のいずれかに特異的であるプローブおよびプライマー、例えばこのような配列（またはその相補鎖）の少なくとも１２〜５０連続ヌクレオチドに特異的なプローブまたはプライマーが生成され得る。プローブおよびプライマーは、一般的に、少なくとも１２ヌクレオチド長、例えば少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、または少なくとも３０ヌクレオチド、例えば１２〜１００、１２〜５０、１２〜３０または１５〜２５ヌクレオチド長である。一般的には、プローブは、検出可能部分または「標識」を包含する。例えばプローブは、プローブを検出可能にさせる「標識」と、直接または間接的に結合され得る。いくつかの例では、プライマーは、結果的にアンプリコンに組入れられるようになり、それによりアンプリコンの検出を可能にする標識を包含する。

以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、本発明を記載された特定の特徴または実施形態に限定しないよう意図されるべきである。

緊縮制御はＦＦＰＥ組織試料から単離されたＲＮＡから信頼性が高い遺伝子発現シグネチャーを得るために有益である
科学的および医学的に価値のある組織試料（例えば癌患者から収集されたもの）を保管することは、そうでなければ壊れ易い組織の長期安定化を要する。ホルマリン固定およびパラフィン包埋は、このような組織試料を保管するために一般に用いられる一方法である。

保管ＦＦＰＥ組織試料から単離されるＲＮＡは、癌における遺伝子異常のシグネチャーを同定するための常習的供給源である（例えばGianni et al., J. Clin. Oncol., 23(29): 7265-77, 2005；Mina et al., Breast Cancer Res. Treat., 103(2):197-208, 2007）。このような試料から単離されるＲＮＡの品質は、遺伝子発現解析の結果に直接的に影響する。

本実施例は、遺伝子発現解析のためのＲＮＡ品質が高度発現ハウスキーピング遺伝子に関して、ｑＲＴ−ＰＣＲのような代理検定からは、あるいは例えばアジレント・BIOANALYZER（商標）におけるマイクロ流体分離により推論され得ない、ということを実証する。その代わりに、このような解析のためのＲＮＡ試料の適合性を確定するために、より厳密な方法、例えば本実施例で実証されるものが、好ましくは用いられる。

患者試料およびＲＮＡ単離
多重ｍＲＮＡ解析のために、アリゾナ大学前立腺癌バンクから、患者症例のサブセット（ｎ＝２８）を選択した。外科手術（前立腺切除）後少なくとも５年、前立腺癌再発を有するかまたは有さない個体を、解析のために選択した。患者は、異常直腸診（「ＤＲＥ」）または血清ＰＳＡレベル上昇（＞０．４ｎｇ／ｍｌ）を提示し、正常ＤＲＥとその後の陽性６箇所生検を示した。癌再発を、ＰＳＡレベル上昇により確定した。前立腺切除術中に除去された組織から、試料を収集した；次に、病理学技術分野における標準方法を用いて、表面にインクでしるしをつけて、１０％中性緩衝ホルマリン中で一晩固定し、パラフィンブロック中に完全に包埋した。保管組織ブロックの年数は、６〜１３年の範囲であった。

図１Ａ〜Ｃに例示したように、試験ＦＦＰＥコアから全ＲＮＡを単離した。要するに、選択患者からのＦＦＰＥ組織ブロックから、４μｍ組織切片を切り出した。標準（手動）方法を用いて組織切片をヘマトキシリンおよびエオシン（「Ｈ&Ｅ」）で染色して、グリーソン合計スコア、腫瘍容積、位置および病理学的段階を確定した。病理学会認定病理専門医が組織切片を再検討し、前立腺癌の各切片領域で同定した。組織パンチを同定領域で作製して、ＲＮＡ単離のためにコアを収集した。最低９年の追跡調査を有する男性のみを、試験に含めた。０．３ｎｇ／ｍｌより高い血清ＰＳＡ値に戻った場合を、再発と定義した。再発患者１４名および非再発患者１４名を、遺伝子発現試験のために選択した（表４）。

各患者からのＨ＆Ｅ染色スライドを用いて、腫瘍および隣接正常の代表領域を病理学医が選択した。ビーチャー・パンチを用いて、ＦＦＰＥブロックからのコア（直径１．０ｍｍ、長さ２〜５ｍｍ）をＲＮＡ単離のためにＲＮアーゼ無含有エッペンドルフ管中に手動で回収した。コア採取具をキシレン中に浸漬し、患者試料間でブンゼンバーナーを用いて燃焼して、ＲＮＡ持込を防止した。

ＦＦＰＥブロックからの組織コアを、数回混合しながら、室温で５分間、キシレン中で脱パラフィン化し、無水エタノールで２回洗浄した。次に組織をブロットして、５５℃で１０分間乾燥した。各組織ペレットに、１６μｌの１０％ＳＤＳおよび４０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を含有する組織溶解緩衝液１００μｌを付加し、５５℃で一晩インキュベートした。次に、HIGH PURE（商標）ＲＮＡ単離キット（Roche Applied Science; Indianapolis, IN, USA）を用いて、溶解試料から総ＲＮＡを単離した。NanoDrop-1000（NanoDrop Technologies Inc., DE）を用いてＵＶ分光法により、総ＲＮＡを定量した。RIBOGREEN（商標）検定（Molecular Probes, Eugene, OR）で、ＲＮＡの量を確定した。表５に示すように、試料はすべて、４００ｎｇより多い総ＲＮＡを有した。ＲＮＡ単離方法の流れ図を、図１Ａに示す。

対照ＲＮＡ試料を乳癌細胞株ＭＣＦ７または正常乳房組織から新たに単離し、脱パラフィン化ステップなしで前記の方法を用いて定量した。
定量的実時間ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）

定量的実時間ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）をApplied Biosystems（ＡＢＩ）7500ＰＣＲ系（ＳＤＳ ｖ１．４；Applied Biosystems Inc., CA）で実施して、DASL（登録商標）遺伝子発現解析（Illumina Corporation, CA）に関して潜在的に有用であると試料を定量した。メーカーの使用説明書に従って、SYBR（登録商標）Green ＲＴ−ＰＣＲ試薬（Applied Biosystems）を用いて、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１３ａ（ＯＭＩＭ寄託番号１１３７０３；ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）寄託番号ＮＭ_０００９７７（ＧＩ：１５４３１２９６）（ｍＲＮＡ変異体１）およびＮＭ_０３３２５１（ＧＩ：１５４３１２９４）（ｍＲＮＡ変異体２））の発現を測定することにより、ｑＲＴ−ＰＣＲ検定を実行した。順方向プライマーは５’−ＧＴＡＣＧＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＡＴＣＡＡ−３’（配列番号７）であり、逆方向プライマーは５’−ＧＴＴＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＣＧＣＴＴＧ−３’（配列番号８）であって、その結果生じたアプリコンサイズは９０ｂｐであった。

各反応は、２５μＬのSYBR Green ＰＣＲ Master Mix（ABI）、１μＬのｃＤＮＡ鋳型および２５０ｎＭの各順方向および逆方向プライマーを総反応容積５０μＬ中に含有した。MicroAmp光学接着カバー（ABI）で閉じたMicroAmp光学９６ウエル反応プレート（ABI）中で三重反復実験で、すべての検定を実行した。ＰＣＲは、９５℃で１０分間の初期酵素活性化と、その後の、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルとで構成された。最終生成物に到達するために、６０℃〜９５℃の傾斜（ABI）を用いて、解離曲線を作成した。

ABI 7500系ソフトウエアでデルタ−デルタＣＴ法を用いて、各試料中の各転写物の発現レベルの相対的定量化を算定した。正常前立腺ＲＮＡを較正物質として用い、ヒトベータアクチン（ＡＣＴＢ）遺伝子を内因性対照として用いた。周期閾値（ＣＴ）は１９〜２８の範囲であり、DASL（商標）検定による解析のために許容可能であるとみなされた。解離曲線解析は単一ピークも生じるが、これは、良好な品質のＲＮＡを示す。分解を示すより小さな断片の有意の存在は観察されなかった。

ＲＮＡ試料もアジレントBIOANALYZER（商標）で検査して、全体的ＲＮＡ品質を査定した。ＲＮＡNano 6000シリーズ ＩＩ LabChip（Agilent）を用いて、ＲＮＡ品質を確定した。ｑＲＴ−ＰＣＲで予備定量化した全試料が、BIOANALYZER（商標）査定により許容可能な品質であると判定された。

単一対照遺伝子発現または全体的ＲＮＡのこれらの測定は、保管資料の何れにおいても許容不可能なレベルの分解を示さなかった。さらに、ブロックの年数とこれらの解析のためのＲＮＡを抽出する能力との間に相関は認めされなかった。
ｃＤＮＡ合成およびＤＡＳＬ発現解析

２８例の元の前立腺癌試料および４例の対照からの総ＲＮＡを、Illumina DASL（商標）BeadChipプラットホームでの発現解析に付した。このｃＤＮＡ媒介性アニーリング、選択、伸長および結紮検定（ＤＡＳＬ）は、ＦＦＰＥ組織に由来するものを含めてＲＮＡから発現プロフィールを生成するよう意図される（Fan et al., Genome Res. 14: 878-85, 2004）。ＤＡＳＬ検定を、Illuminaからの標準ヒト癌パネル（１０の公的に利用可能な癌遺伝子リストから収集された５０２の独特の癌遺伝子からなる（これらのリスト上のこのような遺伝子の出現頻度、ならびに癌に関連したこれらの遺伝子の文献引用頻度に基づいている））と、ならびにUniversal-16 BeadChipとともに用いた。標準Illuminaプロトコールに従って、検定を実施した（例えばIllumina BeadStation DASL（商標）システムマニュアル；Fan et al., Genome Res. 14: 878-85, 2004およびRavo et al., Lab. Invest. 88: 430-40, 2008参照）。要するに、Illuminaからのヒト癌パネルは、５０２の独特の癌遺伝子ｍＲＮＡに関する選択プローブ群のプールを含み、各ｍＲＮＡは３つの別個のプローブにより３つの位置で標的化される。

各試料に関して、反応のための投入量を２００ｎｇ（４０ｎｇ／ｕｌ濃度で５ｕｌ）に正規化した。これを、メーカーの使用説明書に従って、ビオチニル化無作為九量体、オリゴ−デオキシチミジン１８プライマーおよびIllumina供給試薬を用いて、ｃＤＮＡに転化した。その結果生じたビオチニル化ｃＤＮＡをアニーリングして、オリゴヌクレオチドを検定し、ストレプトアビジン共役常磁性粒子と結合して、ｃＤＮＡ／オリゴ複合体を選択した。オリゴ体ハイブリダイゼーション後、誤ハイブリダイズ化および非ハイブリダイズ化オリゴ体を洗い落とし、一方、結合オリゴ体を伸長させて、結紮し、共有ＰＣＲプライマーでその後増幅されるべき鋳型を生成した。蛍光標識相補鎖を、標準プロトコールに従って、Universal DASL １６×１ビーズチップとハイブリダイズさせた。Universal−１６ビーズチップ・プラットホームは、１６の個々のアレイで構成され、各試料に関して、３回の技術的反復を実施した。ハイブリダイゼーション後、Illuminaビーズアレイ読取機５００系を用いてアレイを走査した。強度データ抽出および処理を、Bead Studio Gene Expression Module（ＧＸ バージョン３）を用いて実施した。

転写物当たり３部位を分析し、例えば示差的遺伝子発現、ランク不変規格化を用いるクラスターリング、ならびにヒートマップに関するデータ解析はすべて、Bead Studio（Illumina）で実行した。ヒートマップは、各遺伝子の非正規化シグナルデータに関する対数（底２）変換ならびに平均シグナル減法を用いた。マップ上に赤色で示した値は、平均に比して過剰発現される；緑色で示す値は、平均に比して過少発現される；黒色で示した値は、平均に比して変化がない。

ＤＡＳＬ検定データ（下記で考察）の正当性を立証するために、以下の遺伝子：ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ（検定ＩＤ：Ｈｓ００２６６７１５_ｓｌ、Ｈｓ００１７７４０６_ｍｌおよびＨｓ００１８０１０３_ｍｌ）に関するＴａｑＭａｎ遺伝子発現検定（ABI）を用いて、メーカーの使用説明書に基づいて、試験試料に関してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。Illuminaプラットホームにおける標的配列に最も近い配列を尋問する検定を選択した（表６）。

結果
癌ＤＡＳＬ検定プール（ＤＡＰ）において検定された５０２の遺伝子のうち、ＲＮＡメッセージは全試料に関するこれらの遺伝子のうちの３６７に関して検出可能であった。３６７の評価可能な遺伝子すべて、ならびに全試料（２４例の再発または非再発前立腺癌試料、ならびに４例の対照乳房検体）に関して、ランク不変規格化を用いて、クラスター解析を実施した。対照乳癌試料（新たに単離されたＲＮＡ）は、前立腺癌試料とは別個に群れを成した（図２Ａ参照）。さらに、乳癌細胞株ＭＣＦ−７は、この細胞株を正常細胞と区別するプロフィールを発現した。これらのデータは、乳癌および前立腺癌に関する（Axelsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 13122-7, 2007；Su et al., Cancer Res. 61: 7388-93, 2001）、ならびにＭＣＦ−７細胞株（Tsai et al., Cancer Res. 67: 3845-52, 2007）および正常検体（Axelsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 13122-7, 2007）に関する予測される関係を確証し、前立腺癌試料のさらなる解析のためにこの検定の適合性を実証した。

意外にも、図２Ａに示したように、前立腺癌再発に関する明白な分子シグネチャーは、全遺伝子に関する全試料における教師なしクラスター解析で確定された。これらの予期せぬ結果に関する説明の１つは、前立腺試料から単離されたＲＮＡは、癌が再発するかしないかという見込みとは関係なく、このような試料を一緒に群れにさせる混合品質のものであったというもの、そして新たに単離された対照ＲＮＡが対照試料に別個の一団を形成させる上品質を有した、というものである。

図２Ｂに示したように、陰性対照試料プロットは、＞３００のシグナルを有する有意数のＲＮＡ試料を示したが、これは、関連性のないプローブとの試験試料の予期せぬ高い結合を示す。したがって、シグネチャーの確定は、特定試料に関して得られた検出の緊縮度によっていた。この結果は、元のＲＮＡ試料がｑＲＴ−ＰＣＲまたはBIOANALYZER（商標）検定により示されたよりも多く分解された場合に起こり得る。

低背景反応性を有する９つの試料のサブセットを選択した。「低」背景を有する試料を、対照の新たに単離されたＲＮＡに匹敵するシグナルを有するものと定義した。この試料サブセットのクラスター解析は、再発および非再発前立腺癌試料の遺伝子発現プロフィール間の明白な区別を示した（図２Ｃ）。

合理的な遺伝子シグネチャーの確定は、特定試料に関して得られた検出の緊縮度に左右される。特に、関連性のないプローブと低結合であると定義された低陰性対照シグナルを有する試料は、最も信頼性が高いことが見出された。前立腺癌患者の本発明のコホートの遺伝子発現プロファイリングのための後者指示方法の結果は、実施例３でさらに詳細に説明する。

本実施例は、ＦＦＰＥ組織から単離されたｍＲＮＡに関する高度多重解析を実行することの実現可能性を実証する。しかしながら、ＦＦＰＥからのＲＮＡ品質は、新鮮な試料に比べてかなり劣化していた。よって、これらの解析のためのＲＮＡ試料の適合性を確定するために用いられる方法（単数または複数）は、さらなる考察を受け入れる。例えば、ＦＦＰＥ組織からのＲＮＡ品質は、高度発現ハウスキーピング遺伝子に関して、ｑＲＴ−ＰＣＲのような代理検定からは、あるいは例えばBIOANALYZER（商標）におけるマイクロ流体分離により推論され得ない。

有益には、無関連プローブ（すなわち、陰性対照プローブ）との試料の背景結合の確定は、ＦＦＰＥ試料を用いる遺伝子発現解析の目的のためのＲＮＡ品質の信頼できる指標として役立ち得る。

前立腺癌段階づけおよび再発
個体の臨床パラメーターを統計分析に付して、再発および非再発試料群間に有意差が存在するか否かを確定した（上記表４参照）。

臨床パラメーター、例えば年齢、追跡調査期間、提示ＰＳＡおよびグリーソンスコアを、スチューデントｔ検定で評価して、非再発および再発被験者間の平均の差を査定した。フィッシャーの正確確率検定を用いて、Ｔスコアの割合の間の差を検出した。統計学的有意を、ｐ＜０．０５で査定した。これらを、Stata 10統計学的ソフトウエア（StataCorp IC, College Station, TX）を用いて実行した。

非再発および再発試料間の連続変数（年齢、追跡調査期間、提示ＰＳＡおよびグリーソンスコア）の中での差は、統計学的に有意でなかった（表７）。しかしながら段階Ｔ２を有する被験者の割合は、再発被験者と比較した場合、非再発被験者では統計学的に有意に高かった（表７）。段階Ｔ３を有する被験者の割合は、再発被験者と比較した場合、非再発被験者では統計学的に有意に低い、ということも観察された（表７）。

本実施例は、腫瘍段階および癌再発を除いて、比較される種々の臨床パラメーターの中で、無痛性前立腺疾患を有する男性と、前立腺切除後に再発を示している進行性疾患を有する男性との間に有意差が認められなかった、ということを示す。非再発群よりも再発群のほうがより多数の患者が段階Ｔ３を有する（表７）が、しかし、同様に非再発群における高次腫瘍段階を有する患者の多数の症例が存在し、非再発症例のうちの２つは最初の外科手術の時点で閉鎖リンパ節転移（Ｔ４ａ）を有するため、これは癌再発の強力な予測因子ではあり得ない（表５）。これは、選択遺伝子が再発のより良好な予測因子であり、腫瘍の等級または段階とは無関係である、ということを示した以前の報告と一致する（Lapointe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 811-6, 2004）。

再発または非再発前立腺癌を有する患者の遺伝子発現プロファイリング
本実施例は、再発および非再発前立腺癌を有する患者において示差的に発現される遺伝子を提供する。このような情報は、患者が不必要に治療されないかおよび／または適切に治療されるよう、個別化治療決定するのを手助けするのに少なくとも有用である。

実施例１に記載したように、９例の試料（再発前立腺癌を有する患者からの４例（ＴＭＡ＃５２−Ｒ；ＴＭＡ＃３６−Ｒ；ＴＭＡ＃３８−Ｒ；ＴＭＡ＃５１−Ｒ）および非再発前立腺癌を有する患者からの５例（ＴＭＡ＃５８−ＮＲ；ＴＭＡ＃５６−ＮＲ；ＴＭＡ＃６３−ＮＲ；ＴＭＡ＃６５−ＮＲ；ＴＭＡ＃２３−ＮＲ））を、許容可能的低レベルの背景シグナル（すなわち無関係（陰性対照）プローブとの低結合性）に基づいて、継続的解析のために選択した。このような試料は、本開示全体を通して、適切な場合、呼称「ＮＲ」（すなわち非再発性）または「Ｒ」（すなわち再発性）とのいくつかの組合せで、少なくとも（または単に）数字（例えば、５２、３６，３８等）でも呼ばれ得る。

陰性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトゲノム中に出現しない２７の無作為配列を標的にする（Illumina Product Guide 2006/7）。これらのプローブの平均シグナルは、系背景を規定した。これらのプローブに関するシグナルの平均偏差は、ノイズを規定した。これは、背景の包括的測定値であり、画像形成系背景、ならびに染料の非特異的結合または交差ハイブリダイゼーションに起因する任意のシグナルを表した。Bead Studioアプリケーションは、遺伝子発現検出限界を確立するためにこれらのプローブのシグナルおよびシグナル標準偏差を用いた。

解析用試料を選択するためにこれらの判定基準を用いた結果、前立腺癌の２つの群の間で有意に（検出ｐ値≦０．００１）示差的に発現されると同定された３３遺伝子シグネチャー（表８）を生じ、再発したものとしなかったものとが明白に分類された。各試料中の３３の遺伝子すべてに関する平均シグナルを、表９に示す。表９に示した検出ｐ値は、試験試料を用いて特定プローブ組に関して検出されたシグナル−ノイズにおける信頼の測定値を表す。検出ｐ値スコアを用いて、結果をフィルタリングして、その後の分析から特定のノイズ試料を除去し得る。本発明の結果に関しては、検出ｐ値フィルタリングを適用しなかった。

非再発試料に関する平均シグナル（遺伝子転写レベルと、したがって遺伝子発現レベルと関係がある）を、再発試料中の同一遺伝子に関する平均シグナルと（またはこの逆）比較することにより、２つの試料間の遺伝子の相対的発現を確定し得る。例えば、表９において、非再発試料２３−ＮＲにおけるＷＮＴ５Ａに関する平均シグナルは２５８２．８４６であり、再発試料３６−Ｒにおける平均シグナルは４７０４．３５７である。したがって、ＷＮＴ５Ａは、再発前立腺癌試料においてより高度に発現される。

非再発試料のいずれかにおけるＷＮＴ５Ａ遺伝子発現を比較することにより、再発試料のいずれかと比較した場合と同様の結果が得られるし、あるいは、非再発試料すべてからの平均シグナルの平均を取ることにより、再発試料のすべての平均シグナルの平均と比較した場合と同様の結果が得られる。このような遺伝子の相対的発現（例えば、再発前立腺癌におけるより高い発現、または再発前立腺癌におけるより低い発現）を確定するために、表９における遺伝子の各々に関して、類似の比較を実施し得る。表１０は、表９で報告した再発および非再発試料からの遺伝子発現シグナルのこのような平均を示す。

個々の再発および非再発試料に関する生データを比較した場合、表１０の平均化発現データは、再発前立腺癌試料においてＷＮＴ５Ａがより高度に発現される、ということを実証している。したがって、ＷＮＴ５Ａ発現増大は、ヒト患者における前立腺癌再発の見込み増大のマーカーの一例として役立ち得る。同様に、表１０のデータは、再発前立腺癌試料において、ＴＫ１がより高度に発現され、ＧＡＳ１は余り発現されない、ということを示す。したがって、ＴＫ１発現増大および／またはＧＡＳ１発現低減も、ヒト患者における前立腺癌再発の見込み増大の例示的マーカー（単数または複数）として役立ち得る。

３例の遺伝子、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１の発現を、より特定的に調べた。図３Ａ〜Ｃは、９つの試料の各々におけるこのような遺伝子の相対的発現を示し、そして、少なくとも、これらの遺伝子の任意の１つまたは任意の組合せの発現により非再発前立腺癌がさらに区別され得る、ということを明瞭に実証する。ＷＮＴ５ＡおよびＴＫ１発現は、非再発症例と比較して再発症例で増大された（ぞれぞれ図３Ａおよび３Ｂ）。これと対照して、ＧＡＳ１発現は、再発症例と比較して、非再発症例で顕著に増大された（図３Ｃ）。

本実施例は、無痛性前立腺癌腫におけるＧＡＳ１の過剰発現を実証する最初のものである。ラット去勢モデルを用いて、ＧＡＳ１は、アポトーシスを受けている腹側前立腺の分泌上皮で上方調節されることが示されている（Bielke et al., Cell. Death Differ. 1997; 4: 114-24）。特定の機序に縛られることなく考えると、非再発症例におけるＧＡＳ１の発現増大は、増殖の抑制を生じるかまたはアポトーシスを増大する。

再発および非再発患者群間の示差的発現を示す９試料のサブセットを、ABI TaqMan検定を用いてｑＲＴ−ＰＣＲ分析に付して、ＤＡＳＬ検定で得られたデータの正当性を立証した。ｑＲＴ−ＰＣＲ検定は、少なくともＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１に関して、ＤＡＳＬ検定発現データを確証した。

ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａを用いた遺伝子発現プロファイリング
より大きな試料組（表４、２８被験者）を用いて、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１に関して認められた示差的発現の有意を査定した。非再発群からの１つの外れ値試料（患者番号６１）は、高背景シグナルを示し、さらにすべての遺伝子に非応答性であった。したがって、２７の試料を分析した。

ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１に関して２７の個々の前立腺試料に関して記録された平均シグナル強度を、非パラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定で解析した。２つのデータ組が別個の分布から得られるという信頼度を測定するマン・ホイットニーＵ検定は、ＷＮＴ５ＡおよびＧＡＳ１に関する再発および非再発試料がｐ＜０．０５のレベルで統計学的に有意である差を示す、ということを示した。ＴＫ１に関する非再発および再発間の示差的発現は、ｐ＜０．０１で有意であった（表１１）。ＴＫ１の発現と再発との間に顕著な相関が認められた。ＴＫ１に関して、非再発試料は低発現レベルで見出され、再発試料はより高い発現レベルで存在するように思われる。ＧＡＳ１およびＷＮＴ５Ａも多少の相関を示すが、しかしＴＫ１よりもＧＡＳ１およびＷＮＴ５Ａに関して、より多くの再発および非再発試料が全発現レベルで見出される。したがって、この試料組に関しては、非再発および再発試料に関する発現レベルの分布は、３つの遺伝子の各々に関して異なった。

従来の試験は、ＷＮＴ５Ａ、ＧＡＳ１およびＴＫ１に関する別個の再発および非再発分布を実証したが、しかしこれらの分布は重複しており、再発を確実に予測するそれらの能力は別々の問題であって、これはロジスティック回帰モデルを用いて査定された。ロジスティック回帰分析を用いて、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１のその発現レベルに基づいた個々の患者に関する再発の確率を予測するモデルを開発した。このようなモデルの予測を評価するために一般に用いられる統計値は、結果から構築される受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＡＵＣ）である。ＡＵＣは、無作為選択再発患者が無作為選択非再発患者より高いロジスティックモデルスコアを有する確率を表す。２つの交差妥当化法を用いて、ＡＵＣを概算した；leave-one-out交差妥当化（ＬＯＯＣＶ）および６倍交差妥当化。両方法は、試料を訓練組（ロジスティックモデルパラメーターを較正するために用いられる）と試験組に分配し、これから、ＡＵＣが確定される。試料が少数であるため、１００例の無作為選択試験症例を用いて、ＡＵＣ概算を改良するために、ブートストラップ再試料採取を用いた。leave-one-out交差妥当化の場合、他の試料のすべてに関して訓練されたモデルに対して各試料を試験し、結果を組合せて、単一ＲＯＣ曲線を構築した。

ロジスティック回帰モデルを２７試料の全組に適合させて、ＲＯＣ曲線を構築して、モデルがデータと如何に良好に適合するかを評価した。３つの遺伝子パネルに関して、０．８４６というＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を達成した（図４）。これは、Laxman等（Cancer Res. 68: 645-9, 2008）により近年同定された遺伝子パネル（ＳＰＩＮＫ１、ＰＣＡ３、ＧＯＬＰＨ２およびＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ）に関する０．７５８というＡＵＣ、ならびにＰＳＡ血清試験に関する０．５０８というＡＵＣと都合よく匹敵する。したがって、いくつかの例では、開示された方法は、少なくとも０．８４６のＡＵＣを有する。

モデル訓練組に含まれない試料に関する再発を予測するモデルの能力を査定した。ブートストラップ法およびleave-one-out交差妥当化の両方を用いた。ブートストラップ法を用いて０．７３４というＡＵＣが見出され、そして０．６９０というＡＵＣがleave-one-out交差妥当化技法を用いて判明した。比較のために、Laxman等（Cancer Res. 68: 645-9, 2008）は、leave-one-out法を用いて、それらの遺伝子パネルに関して０．７３６のＡＵＣを算定した。したがって、いくつかの例では、開示された方法は、少なくとも０．６９０、例えば少なくとも０．７３４、少なくとも０．７５、少なくとも０．８または少なくとも０．８５のＡＵＣを有する。例えば、少なくともＧＡＳ１、ＷＮＴ５ＡおよびＴＫ１発現レベルが前立腺癌組織試料で確定される場合、試料が得られる被験者の予後の確定の感度および特異性は、少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％または少なくとも９８％である。

前立腺癌再発を予測するために低複雑性分子シグネチャーを同定する目的で、広範に利用可能な保管ＦＦＰＥ組織から回収されるｍＲＮＡに基づいて、高多重化バイオマーカー検定を利用して、本明細書中で提供される実施例を実施したが、これは、ルーチンの臨床病理学業務に利用され得る。本明細書中で提供される結果は、例えば前立腺切除術後に再発するかまたは再発しない前立腺癌間を区別するためにその発現（独立してまたは任意の組合せでの）が用いられ得る多数の遺伝子（表８）を提供する。したがって、表８の遺伝子のうちの任意の1つまたは複数（例えば任意の２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）、あるいは任意の組合せは、（少なくとも）患者における前立腺癌再発の見込みを確定するために用いられ得る。この方法により同定される遺伝子シグネチャーの一例は、ＷＮＴ５ＡおよびＴＫ１の過剰発現により、ならびにＧＡＳ１の下方調節により特徴づけられる。この新規の３遺伝子シグネチャーは、追跡調査の少なくとも５年前に取り出された外科的検体中の再発および非再発前立腺癌を区別する。本明細書中の結果は、さらに、前立腺癌再発の見込みを予測するこれら３つの遺伝子の能力がＰＳＡ血清試験より有意に良好である、ということを示す。

発現を検出するためのin situハイブリダイゼーション
本実施例は、in situハイブリダイゼーション、例えばＦＩＳＨまたはＣＩＳＨを用いて遺伝子発現を検出するために用いられ得る例示的方法を提供する。特定の材料および方法が提供されるが、しかし変更は成され得ると当業者は理解する。

前立腺癌組織試料、例えばＦＦＰＥ試料を、試料中に存在する核酸分子の検出を可能にする条件下で顕微鏡スライド上に封入した。例えば、試料中のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを検出し得る。極高または高緊縮条件下で試料中のｃＤＮＡまたはｍＲＮＡとハイブリダイズするために十分な相補性を有する核酸プローブとともに、スライドをインキュベートする。プローブは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ核酸配列（例えばヒト配列）に特異的である別個のプローブを、試料とともに同時的にまたは逐次的にインキュベートするか、あるいは試料の連続切片とともにインキュベートする。例えば、各プローブは、３つのプローブ間の区別を可能にするために異なる蛍光体または色原体を含み得る。プローブとその遺伝子標的とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でプローブを試料と接触させた後、非ハイブリダイズ化プローブを除去し（例えば洗い落とし）、例えば、顕微鏡を用いて残留シグナルを検出する。いくつかの例では、シグナルは定量される。

いくつかの例では、例えば、表８に列挙された1つまたは複数の他の遺伝子、あるいは1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子（例えばβアクチン）の発現を検出するために、さらなるプローブが用いられる。いくつかの例では、ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａの発現は、（同一プローブを用いて）対照試料、例えば乳癌細胞、再発前立腺癌を有したことがない被験者からの前立腺癌細胞、再発前立腺癌を有した被験者からの前立腺癌細胞、あるいは正常（非癌）細胞でも検出される。

ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａに関する結果的に生じたハイブリダイゼーションシグナルを、対照、例えば非再発癌または再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値と比較する。非再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値と比較して、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａの発現が増大され、ＧＡＳ１の発現が低減される場合、これは、癌が再発すると思われるので被験者が予後不良（例えば１または２年未満の生存）を有する、ということを示す。同様に、再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値に比してＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現が同様である場合、これは、癌が再発すると思われるので被験者が予後不良を有する、ということを示す。非再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値に比してＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現が同様である（例えば差が２倍以下）場合、これは、癌が再発しないと思われるので被験者が良好な予後を有する、ということを示す。

発現を検出するための核酸増幅
本実施例は、核酸増幅方法、例えばＰＣＲを用いて、遺伝子発現を検出するために用いられ得る例示的方法を提供する。試料中の標的核酸分子の増幅は、結果的に生じるアンプリコンの検出を可能にし、したがって標的核酸分子の発現の検出を可能にする。特定の材料および方法が提供されるが、しかし変更が成され得ると当業者は理解する。

前立腺癌組織試料、例えばＦＦＰＥ試料または新鮮な組織試料（例えば外科手術検体）から、ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡの抽出方法は当該技術分野では慣例であり、例示的方法は、本開示の他の箇所で提示されている。例えば、市販のキットを用いてＲＮＡを抽出し得る。その結果生じたＲＮＡを、実施例１に記載したように分析して、それが適切な質および量を有するか否かを確定し得る。

その結果生じたＲＮＡは、例えばＲＴ−ＰＣＲ、例えばｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＤＮＡを生成するために用いられ得る。ＰＣＴを実施する方法は、当該技術分野で慣例である。例えばＲＮＡを、標的遺伝子（例えば、ＧＡＳ１、ＷＮＴ５ＡおよびＴＫ１）に特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーとともにインキュベートする。このようなプライマーは、極高または高緊縮条件下でＲＮＡとハイブリダイズするために十分な相補性を有する。ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ核酸配列（例えばヒト配列）に特異的なプライマー対を、別個のＲＮＡ試料とともにインキュベートする（例えば３つの別個のＰＣＲ反応を実施する）か、あるいは複数のプライマー対を、単一試料とともにインキュベートし得る（例えば、プライマー対が示差的に標識されて、各プライマー対から生成されるアンプリコン間の区別を可能にする場合）。例えば、各プライマー対は、アンプリコン間の区別を可能にするために異なる蛍光体を含み得る。アンプリコンは実時間で検出され得るし、あるいは増幅反応後に検出され得る。アンプリコンは、通常は、例えば分光法を用いて、アンプリコンと会合された標識を検出することにより検出され得る。いくつかの例では、シグナルは定量される。

いくつかの例では、例えば、表８に列挙された1つまたは複数の他の遺伝子、あるいは1つまたは複数のハウスキーピング遺伝子（例えばβアクチン）の発現を検出するために、さらなるプライマー対が用いられる。いくつかの例では、ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａの発現は、（同一プローブを用いて）対照試料、例えば乳癌細胞、再発前立腺癌を有したことがない被験者からの前立腺癌細胞、再発前立腺癌を有した被験者からの前立腺癌細胞、あるいは正常（非癌）細胞でも検出される。

ＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａに関する結果的に生じたアンプリコンシグナルを、対照、例えば非再発癌または再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値と比較する。非再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値と比較して、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａの発現が増大され、ＧＡＳ１の発現が低減される場合、これは、癌が再発すると思われるので被験者が予後不良（例えば、１または２年未満生存）を有する、ということを示す。同様に、再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値に比してＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現が同様である場合、これは、癌が再発すると思われるので被験者が予後不良を有する、ということを示す。非再発癌におけるＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現を表す値に比してＧＡＳ１、ＴＫ１およびＷＮＴ５Ａ発現が同様である（例えば差が２倍以下）場合、これは、癌が再発しないと思われるので被験者が良好な予後を有する、ということを示す。

Claims (25)

1. 前立腺癌組織の特徴づけ方法であって、対照標準と、あるいは対照試料における予後遺伝子の発現と比較した場合の、前立腺癌を有する被験者からの前立腺組織試料において、ＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１あるいはその任意の組合せを含む1つまたは複数の予後遺伝子の発現レベルを確定することを包含する方法であり、対照標準または対照試料における予後遺伝子の発現と比較した場合の前立腺組織試料におけるＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１あるいはその任意の組合せの示差的発現が前立腺癌組織を特徴づける方法。
2. 前立腺癌組織を特徴づけすることが、前立腺切除後の疾患再発の見込みを予測すること、あるいは前立腺癌進行の見込みを予測することを包含する請求項１記載の方法。
3. 前記1つまたは複数の予後遺伝子が、表８に列挙される任意の1つまたは複数の他の遺伝子または他の遺伝子の組合せをさらに含む請求項２記載の方法であって、前記他の遺伝子の発現増大が被験者における前立腺癌の再発の見込みがより低いことを示し、そして前記他の遺伝子がＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１でない方法。
4. 前記発現レベルを確定することが、前記1つまたは複数の予後遺伝子の各々の発現産物のレベルを測定することを包含する請求項１、２または３記載の方法。
5. 前記発現産物がｍＲＮＡまたはタンパク質である請求項１、２または３記載の方法。
6. 前記発現レベルを確定することが前記1つまたは複数の予後遺伝子の前記ゲノム配列（単数または複数）における変更（単数または複数）を検出することを包含する請求項１、２または３記載の方法。
7. 前記ゲノム配列における前記変更が少なくとも１つのＷＮＴ５ＡまたはＴＫ１対立遺伝子の増幅、あるいは少なくとも１つのＧＡＳ１対立遺伝子の欠失である請求項６記載の方法。
8. 前記1つまたは複数の予後遺伝子がＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１またはＧＡＳ１あるいはその任意の組合せからなる請求項１または２記載の方法。
9. 前記予後遺伝子がＧＡＳ１を含む請求項１または２記載の方法。
10. 前記1つまたは複数の予後遺伝子がＷＮＴ５Ａ、ＴＫ１およびＧＡＳ１からなる請求項５記載の方法。
11. 前記前立腺組織試料が固定され、蝋包埋された前立腺組織試料である請求項１または２記載の方法。
12. 前記前立腺試料が前立腺癌診断後に、且つ、被験者における前立腺切除前に収集される請求項２記載の方法。
13. 前記前立腺組織試料が前立腺切除中に除去された組織から収集される請求項２記載の方法。
14. 疾患再発が前記前立腺切除の５年以内に起きる請求項２記載の方法。
15. 前立腺癌進行の見込みを予測するためのキットであって、生物学的試料において、ＷＮＴ５Ａゲノム配列、ＷＮＴ５Ａ転写物またはＷＮＴ５Ａタンパク質を検出するための手段、生物学的試料において、ＴＫ１ゲノム配列、ＴＫ１転写物またはＴＫ１タンパク質を検出するための手段、あるいは生物学的試料において、ＧＡＳ１ゲノム配列、ＧＡＳ１転写物またはＧＡＳ１タンパク質を検出するための手段、あるいは前記のいずれかの任意の組合せを包含するキット。
16. 生物学的試料において、ＷＮＴ５Ａ転写物またはタンパク質を検出するための手段、生物学的試料において、ＴＫ１転写物またはタンパク質を検出するための手段、ならびに生物学的試料において、ＧＡＳ１転写物またはタンパク質を検出するための手段を包含する請求項１５記載のキット。
17. ＷＮＴ５Ａ転写物に特異的な核酸プローブ、ＴＫ１転写物に特異的な核酸プローブ、ならびにＧＡＳ１転写物に特異的な核酸プローブを包含する請求項１５記載のキット。
18. ＷＮＴ５Ａ転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＴＫ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ならびにＧＡＳ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマーを包含する請求項１５記載のキット。
19. ＷＮＴ５Ａタンパク質に特異的な抗体、ＴＫ１タンパク質に特異的な抗体、ならびにＧＡＳ１タンパク質に特異的な抗体を包含する請求項１５記載のキット。
20. 以下の：
    ＷＮＴ５Ａ転写物に特異的な核酸プローブ、ＴＫ１転写物に特異的な核酸プローブ、ＧＡＳ１転写物に特異的な核酸プローブ、ＷＮＴ５Ａ転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＴＫ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＧＡＳ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＷＮＴ５Ａタンパク質に特異的な抗体、ＴＫ１タンパク質に特異的な抗体、ならびにＧＡＳ１タンパク質に特異的な抗体
    からなる群から選択される少なくとも２つの検出手段を包含する請求項１５記載のキット。
21. 以下の：
    ＷＮＴ５Ａ転写物に特異的な核酸プローブ、ＴＫ１転写物に特異的な核酸プローブ、ＧＡＳ１転写物に特異的な核酸プローブ、ＷＮＴ５Ａ転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＴＫ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＧＡＳ１転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ＷＮＴ５Ａタンパク質に特異的な抗体、ＴＫ１タンパク質に特異的な抗体、ならびにＧＡＳ１タンパク質に特異的な抗体
    からなる群から選択される少なくとも３つの検出手段を包含する請求項２０記載のキット。
22. 以下の：
    ハウスキーピング遺伝子転写物に特異的な核酸プローブ、ハウスキーピング遺伝子転写物の特異的増幅のための一対のプライマー、ならびにハウスキーピングタンパク質に特異的な抗体
    からなる群から選択される検出手段をさらに包含する請求項２０または２１記載のキット。
23. 以下の遺伝子の各々からの転写物に特異的な核酸プローブからなるアレイ：ＣＤＣ２５Ｃ、Ｅ２Ｆ５、ＭＭＰ３、ＣＹＰ１Ａ１、ＦＧＦ８、ＷＮＴ５Ａ、ＣＨＥＫ１、ＣＳＦ２、ＣＤＣ２、ＩＬ１Ａ、ＡＬＫ、ＭＹＢＬ２、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＴＥＲＴ、ＡＬＯＸ１２、ＢＲＣＡ２、ＦＡＮＣＡ、ＧＡＳ１、ＬＭＯ１、ＰＬＧ、ＴＤＧＦ１、ＴＫ１、ＢＬＭ、ＭＳＨ２、ＮＡＴ２、ＤＭＢＴ１、ＦＬＴ３、ＧＦ１１、ＭＯＳ、ＴＰ７３、ＨＭＭＲおよびＩＮＨＡ。
24. ＷＮＴ５Ａ転写物、ＴＫ１転写物およびＧＡＳ１転写物に特異的な核酸プローブからなるアレイ。
25. ＷＮＴ５Ａ転写物、ＴＫ１転写物およびＧＡＳ１転写物ならびにハウスキーピング転写物に特異的な核酸プローブからなるアレイ。

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