MX2014002741A - Sustratos de enzimas de acido nucleico. - Google Patents
Sustratos de enzimas de acido nucleico.Info
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Abstract
La invención se relaciona a sustratos de ácido nucleico para enzimas de ácido nucleico catalíticas y métodos utilizando los sustratos.
Description
SUSTRATOS DE ENZIMAS DE ÁCIDO NUCLEICO
CAMPO DE L INVENCIÓN
La invención - se relaciona · generalmente al campo de enzimas de ácido nucleico. Más específicamente, la. invención se · relaciona a sustratos para enzimas , de ácidó nucleico . y métodos utilizando los sustratos. ·,
ANTECEDENTES DE IA INVENCION
Una amplia variedad de moléculas de ácido nucleico con actividad enzimática o catalítica se han descubierto en los últimos 20 años. Las e zimas de ÁRN ("ribozimas") aparecen en la naturaleza pero pueden .prepararse por ingeniería para específicamente reconocer y modificar un sustrato ARN objetivo. Las técnicas de evolución in vitro han facilitado el descubrimiento y desarrollo de muchos más ácidos nucleicos catalíticos, incluyendo ácidos desoxirribonucleicos frecuentemente referidos como "desoxiribozimas"', "Enzimas de ADN" o wADNzimas'' Las ADNzimas evolucionadas in vitro y/o ribozimas se ha descubierto tienen la capacidad para catalizar un amplio intervalo de reaccionés incluyendo escisión de ácidos nucleicos, ligación de ácidos nucleicos, metilación de pokfirina, y formación dé enlaces carboiio-carbono, enlaces ést;ér. o enlaces amida.
En particular, ADNzimas y ribozimás se han caracterizado ya que específicamente escinden secuencias distintas de ácido nucleico después de hibridar por medio de apareamiento de bases Watson Crick. Las..ADNzimas son capaces de escindir ya sea mol culas de ARN o ADN. Las ribozimás también son capaces de escindir tarito secuencias objetivos de ARN como de ADN. Las ADNzimas *10-23" y "8-17" son capaces dé escindir sustratos de ácido nucleico en enlaces fosfodiéster de ARN específicos para crear productos de reacción que tienen grupos fosfato 2', 3* -cíclico y grupos 5' -hidroxilo. Los ejemplos dé desoxiribozimas (ADNzimas)., que pueden ligar fosfato 2', 3'-cifclicó y productos .3' -hidroxilo' incluyen las ligasas "7Z81" y ¾>7Z48'.
Más reciehtementé, Enzimas de ácido nucleico Multi-componente (MNAzimas) se ha descrito tiene la capacidad de auto ensamblar dé dos o más componentes oligonucleótido (también referidos én la presente como partzimas") en la presencia de ün facilitador de ensamble MNAzima (por ejemplo una molécula objetivo a ser detectada) . . ·
La naturaleza Versátil dé los ácidos nucleicos catalíticos ha facilitado su Uso n : muchas diferentes aplicaciones, üñ elemento clave para el uso exitoso de los ácidos, nucleicos catalíticos es su capacidad para . modificar un . sustrato apropiado.- En general, el . sustrato es
sustancialmente complementario a los brazos de hibridación del. ácido nucleico catalítico y contiene una secuencia especifica o porción de secuencia en el sitio de acción catalítica. Lá naturaleza de la interacción entre un ácido nucleico catalítico dado y sus sustrato es determinante de que tan eficientemente la enzima acopla y/o cataliticamenite modifica su sustrato, y de este, modo es. una consideración fundamental en el. diseño de algún sistema que utiliza ácidos nucleicos catalíticos.
Los ácidos nucleicos catalíticos tienen aplicaciones de diagnóstico in vitro en la detección de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas. . Estas aplicaciones frecuentemente implican la amplificación de ya . sea él objetivo o la señal para generar .señal suficiente para la detención fuerte del analito de interés.
Los métodos que emplean ácidos nucleicos catalíticos requieren sustratos que se modifican con una tasa suficiente de actividad catalítica para permitir . la discriminación efectiva sobre el ruido de fondó* Pueden requerirse diferentes métodos del uso de temperaturas de reacción diferentes y así hay una necesidad de sustratos que sean eficientemente modificados (por ejemplo escindidos) a temperaturas requeridas. Los métodos tales como aquellos qtjie utilizan MlíAzimas: y AÜNzimas permiten análisis multiplexa¾o
de muchos objetivos simultáneamente en una reacción' sencilla, pero la habilidad para multiplexar y distinguir entre los objetivos múltiples depende de la existencia de un intervalo idóneo de sustratos, úsualmente al menos uno por objetivo. El número de sustratos conocidos en la técnica que sé modifican (por ejemplo escindidos) con alta eficiencia es actualmente insuficiente para multiplexación de masa;
Los sustratos de AD zima y MNAzima previamente conocidos en la técnica se derivaron por la selección de múltiples sustratos posibles para empíricamente determinar aquello que se escindieron más específicamente. Frecuentemente, esta selección se realizó usando números grandes de ADNzimas como objetivo para escindir teóricamente los sitios de escisión posibles dentro del mAR de longitud completa. Esta selección úsualmente se realizó bajo condiciones fisiológicas (temperatura y fuerza iónica, composición y pH de soluciones amortiguadoras). Este sesgo hacia encontrar secuencias de mARN eficientemente éscindidas en condiciones fisiológicas existe, ya que tales . estudios se. · enfocaron en usos terapéuticos d ÁDNzimás como inhibidores de Expresión ARN en vivo. Tales estudios proporcionan un intervalo de protocolos laboriosos para la medición empírica de un número grande de sustratos putativos para encontrar los pocos que se escinden eficientemente (ver por ejemplo Cairns et al., 1999 Nat
Biotech 17: 80^486) . Éstos estudios resultaron.en un conjunto limitado de pautas de 'diseño para la selección de sustratos eficientemente escindidos, y en muchos casos las pautas se enfocaron en el diseño .de la ADNzima más que el sustrato como la. ADNzima pueden fácilmente ajustarse, y el mARN no. Una pauta común generada de estos estudios es la secuencia exacta de l porción riboriucleótido R-Y en el ¡sitio de escisión del sustrato es importante con eficiencia dé escisión estando en él siguiente orden: Gü = AU > GC »> AC.
. La eficiencia de la- escisión de un mARN de. longitud completa bajo condiciones in vitro no es una medición absoluta dé la eficiencia de escisión en un éntorno celular ya que el últim incluye proteínas ribonucléarés y otros factores de confusión que no pueden ser fácilmente imitados in.vitro.
Las pautas de diseño generadas en el pasado tienen algo de uso én la selección de sitios dentro ; de una molécula de mARN grande que puede . ser eficientemente escindida p r ADNzimas y MNAzimás bajo condiciones fisiológicas, pero tiene habilidad limitada para predecir cuales sustratos .se escindirá con eficiencia suficiente para, utilidad en aplicaciones de diagnóstico in vitro. Las aplicaciones de diagnóstico in vitrp pueden requerir condiciones muy diferentes de las condiciones fisiológicas, generalmente
seleccionadas y utilizadas para establecer las pautas de diseño de sustrato limitado que existen en la técnica.
. Ha la necesidad de un conjunto de pautas, o porciones de secuencia, de secuencias de sustrato que predican con mayor certidumbre si un sustrato será suficientemente escindido por una MAzima o ADNzima en condiciones idóneas para aplicaciones diagnóstico in .vitro. También hay la necesidad de sustratos de . ácido nucleico catalíticos con propiedades que faciliten la. función de ácido nucleico, catalítico mejorada.. Estas propiedades pueden incluir, por ejemplo, una habilidad para facilitar la función mejorada de-: ácido nucleico catalítico sobré' un intervalo de condiciones y/o uha capacidad para extender el número de objetivos que pueden simultáneamente detectarse en una reacción multiplex.
·· · ··; .. .' . ·'"
SUMARIO DB IA INVENCIÓM
Mientras que muchos han intentado establecer una porción de secuencia o conjunto de pautas de diseño que consistentemente producen secuencias de sustrato eficientes, a la fecha no. se ha identificado secuencia efectiva o conjunto de pautas. La presente invención proporciona upa serie de principios que ha facilitado el desarrollo. de nuevos sustratos eficientemente escindidos: Así la presente invención proporciona .sustratos de enzimá de ácido nucleico
catalíticos con propiedades que mejoran la función de ácido nucleico catalítico por lo tanto, atendiendo una necesidad existente eri la técnica.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un sustrato de polinucleótido aislado para una enzima ácido nucleico catalítico, dicho sustrato de . polinucleótido que comprende una secuencia Ni-N2-N3-N«-N -N6-N-N8-r T Y-N9- io-Nii-N2-N13-N.14- 15 en dónde:
.. rR es un ribonücl ótido de purina;
rY: es un ribonücléótido de pirimidina;
cada uno de N1-N15 son nucleótidos;
seis más dé N5-N13 son nucleótidos dé citosina; y
menos de tres de N9-N15 son nucleótidos de guanina.
En una modalidad del primer aspecto, el sustrato de polinucleótido comprende ó consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 25-27, 29-30, 33, 72-90, o 172-175.'' ' ·*
En una modalidad del primer aspecto, siete o más, u ocho o más de N5-N13 son nucleótidos de citosina.
En una modalidad del primer aspecto, siete o más de N5-N13 son nucleótidos de citosina y el sustrato de polinucleótido comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 73, 76-80, 82--83, 85-90, o 172-17.5.
En una modalidad del .primer aspecto, ocho; de N5-N13 son
nucleótidos dé citosina. y el sustrato de polinucleótido comprende o consiste dé una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 76, 77, 80, 83 o 87.
En una modalidad del primer aspecto, siete o más, u ocho o más de 4- 13 son nucleótidos de. citosina.
En una modalidad del primer aspecto, siete © más de 4- 13 son nucleótidos de citosina y el sustrato de polinucleótido comprende una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 27, 29, 73, 76-83, 85-90, o 172-175.
En una modalidad del primer aspecto, ocho de N4-N13 son nucleótidos de citosina y el . sustrato de polinucleótido comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiéra
de SEQ ID NOs: 76, 77, 79-80, 82-83, 87/88 o 90.
En una modalidad del primer aspecto, seis o más, siete o más, u ocho o más de N4-N12 son nucleótidos. de citosina.
En una modalidad del primer aspecto, siete o más de N4-N12 son nucleótidos de citosina y el sustrato de polinucleótido comprende o consiste de. una secuencia definida por cualquiéra de SEQ ID NOs: 27, 29, 73, 76, 77, 79-83, 85-88, .90 o 172-
.. En una modalidad del primer aspecto, ocho de N4-N12 son nucleótidos dé citosina y el sustrato de polinucleótido comprende ó consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 76, 77, 80, 83*, 87, o 88÷
En una modalidad del primer aspecto, seis o. más, siete o más, u ocho o más de N5-N12 son- nucleó idos de citosina..
En una modalidad del primer aspecto, siete o más de N5-Ni2 son nucleótidos . de citosina y el sustrato de polinucíeótido comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ÍD NOs: 29, 73, 76, 77, 80, 83, 85-88 o 172-175.
En una modalidad del primer, aspecto, ocho de N5-Ni¿ son nucleótidos de citosina y el sustrato de polinucíeótido comprende o consisté de uña secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 76; 77, 80, 83, o 87.
En una modalidad del primer aspecto, cualquiera uno o más de Ni, N2, Ns y/o N9.es un ' nucleótido de citosina.
En una modalidad del primer aspecto, N8 y » son nucleótidos de citosina, y el sustrato de polinucíeótido comprende o consisté de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 25^26, 29-30, 72-90, o 172-175.
En una modalidad del primer .aspecto, dos, uno .0 ninguno de N9-N15 son nucleótidos de guanina.
En una modalidad del primer aspecto, uno o ninguno de N9-Nis son nucleótidos. de guanina y el sustrato de polinucíeótido comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: .25-27, 29-30, 33, 72-80, 82-90, o 172-175.
: En una modalidad del primer aspecto* ninguno de N9-N15 son nucleótidos dé guanina y el sustrato de polinucíeótido
comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 25, .26, 30, 33, 72, 75, 77-80, 84-85, o .89.
En una modalidad del primer aspecto, más d diez, mas que once, más que doce, o más de trece de Ni-Nu son nucleótidos de pirimidina. . .
En. una modalidad del primer aspecto, once, doce, - o más que doce de. 1- 15 son nucleótidos de pirimidina y el sustrato de polinucleótido comprende, o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 25-27, 29, 33, 73-90 o
En una modalidad del primer aspecto, trece o catorce fie
Ni- is son nucleótidos de pirimidina y el. sustrato de polinucleótido comprende b consiste de una secuencia définida por cualquiera de SEQ ID NOs: 75, 7y^80 82-85 ó 88-89.
En una modalidad del primer aspecto, más de. ocho, más de nueve, más de diez, u once de i-rN^ son nucleótidos de citosina.
En una modalidad del primer aspecto* diez u once de NI-NM son nucleótidos de. citosina y el sustrato de polinucleótido
comprende o consi te de una secuencia definida por cualquiera dé SEQ ID NOs: 33, 76-80, 82-83, 85, 87, 88, o 89.
En una modalidad del primer aspécto, once de N1-N14 spn nucleótidos de citosina y el sustrato de polinucleótido comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera
. En una modalidad,, del primer aspecto, el sustrato de polinucleótido además comprende una etiqueta detectable para detectar el sustrato de polinucleótido.
En una modalidad del primer aspecto, el sustrato de polinucleótido además comprende una porción detectable y uíia porción extintora, en donde un efecto detectable proporcionado por la porción detectable se incrementa o disminuye bajo modificación del . sustrato de polinucleótido por dicha enzima de ácido nucleico catalítico. .
En una modalidad del primer aspecto, el ribonucleótido .de purina comprende guanina.
En una modalidad del primer aspecto, el ribonucleótido de pirimidina comprende uracilo.
En una modalidad del primer aspecto, una porción del sustrato de polinucleótido que enlaza a dicha enzima de ácido nucleico catalítico tiene una temperatur de fusión (Tm) de entre 50°C y 90°C, entre 50°C y 65eC entre 50°C y 60°C, entre 52°C y 58eC, entre 66eC y 76eC entre 68eC y 76°C, entre 64eC y 706C, entré 70°C y 76°C, entre 70°C 75% entre 72°C y 76°C; 52°C, 58°C, 64°C, 66*C, 68*0, 7Ó°C, 72°C, ' o 76°C. ''.
En una modalidad del primer aspecto, la enzima d ácido nucleico catalítico: e$:
(i) una enzima de ácido, nucleico multi-componente (MNAzima) y dicha porción enlaza 4. al menos . un brazo de sustrato de dicha MNAzima'; o
(ii) una ADNzima. .
En una modalidad del primer aspecto, el sustrato de polinucleótido es capaz de modificación catalítica por uña MNAzima.
En una modalidad del primer aspecto, el sustrato de polinucleótido es - capaz de una modificación catalítica por urja ADNzima*
En una modalidad . del primer aspecto, el sustrato de polinucleótido comprende una etiqueta detectable para detección por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón de supérficie,. espectroscopia de masas, RMN, resonancia de giró de electrón, espectroscopia de fluorescencia de polimerización, dicroismo circular, inmunoensayo, cromatografía; radiometría, electroquímica, fotometría, gammagrafia, métodos electrónicos, ÜY, espectroscopia infrarroja o d luz visible, métodos erizimáticos, o cualquier combinación de .los mismos.
En una modalidad del primer aspécto, el sustrato de polinucleótido .comprende una etiqueta detectadle para detección por espéctroscopia de fluorescencia.
En . una modalidad : del primer aspecto, el sustrato de
polinucleótido comprende una etiqueta detectable . para detección por espectroscopia de Transferencia de . Energía de Resonancia de Fluorescencia (FRET).. - En un segundo aspecto, la presénte invención proporciona un .. sustrato de polinucleótido aislado para una enzima de ácido nucleico catalítico, dicho susfcráto de polinucleótido que comprende ó consiste de una secuencia definida por SEQ ID NO: 28.
En una modalidad del segundo aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es una MNAzima que. comprende un par de partzimas de oligonucleótido, dicho par que comprende o
15 y 8, SEQ ID NOs: 93 y 94, o SEQ JD
En una modalidad del segundo aspecto, la enzima dé ácido nucleico catalítico es una ADNzima que comprende o consiste dé una secuencia definida por SEQ ID NO: 138.
En un tercer aspecto, la present invención proporciona un método para detectar la presencia de al menos un objetivo que comprende:
(a) proporcionar dos o más partzimas de oligonucleótido, donde al menos una primera., partzima de oligonucleótido y. uria segunda partzima de oligonucleótido en la presencia de dicho objetivo para realizar, al "menos uria primera enzima de. ácido nucleico multi-componente
catalíticamente activa (MNAzima) ;
<(b) proporcionar el sustrato de polinucleótido aislado del primero y segundo aspecto, en donde dich sustrato de polinucleótido es capaz de ser modificado por dicha primera MNAzima, en donde, dicha modificación <ie dicho sustrato de polinucleótido por dicha MNAzima proporciona un efecto detectábl ;
(c) contactar dichas dos. o más partzimas oligonucleótido con una muestra que. putativamente contiene dicho objetivo bajo condiciones que permiten:
(1) el auto . ensamble de al menos dicha primera MNAzima, y
(2) - la actividad catalítica de dicha al. menos primera MNAzima; y
(d) detectar dicho efecto de ectable. ¦·.'
En una modalidad del tercer aspecto, el objetivo es un facilitador de ensamble MNAzima.
En una modalidad del tercer aspecto, el objetivo es un ácido nucleico.
En una modalidad del tercer aspecto, el objetivo es Un ácido nucleico que híbrida a uno o más brazos sensores de dicha MNAzima por cómplementariedad de par de báse
En una modalidad del tercer aspecto, el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de ADN i ADN metiladó, ADN
···· '· ·· _;··,. 15 .· ··· · ·.;.
alquilado, ARN, ARN metilado, microARN, siARN, shARN, tARN, mARN, snoARN, stARN, smARN, pre- y pri-microARN, otros ARNs no codificantes, ARN ribosomal, derivados d los mismos, amplicones, o cualquier combinación de ios mismos .
5 En una modalidad del tercer aspecto, el ácido nucleico se amplifica. .
En una modalidad del tercer aspecto, la amplificación comprende uno o. más de: reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) , • 10 amplificación iiSjOtérmica mediada de rizo (LAMP) , amplificación por circulo rodante (RCA) , amplificación mediada de transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto sostenida (3SR) , amplificación basada én secuéncia de ácido nucleico (NASBA) , o reacción , de cadena polimerasa de 15 transcripción inversa (RT-PCR) .
En una modalidad .del tercer aspecto, el sustrato de polinucleótido hibrida. con brazos de sustrato d dicha M Azima a una temperatura de entre 5D°C. y 90eCÍ; entre S0°C y .· 65eC, entre 50eC y 60eC, entre 52eC y 58°C, entre 66°G y 20 76eC, entre 68°C y 76°C, entre 64eC y 70°C, entre 70eC y 76°C, entre 70eC y 75°C, entre 72°C y 76*0, 52°C, 58°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70eC, 72eC, o 76eC.
En una modalidad del tercer aspecto, el método además comprende proporcionar:
(a> Dos o más partzimas de oligonucleótido adicionales capaces de auto ensamblar en la presencia de un objetivo diferente para formar, una segunda MNAzima catalíticamente activa; y
(b) Al menos un sustrato de polinucléótido adicional; en donde dicho sustrato de polinucléótido adicional és capaz de ser modificado por dicha segunda MNAzima en la presencia de dicho objetivo diferente..
En una modalidad del tercer aspecto, el sustrato de polinucléótido adicional ' no es capaz de ser modificado p r dicha primera MNAzima.
En una modalidad del tercer aspecto, la detección en la parte . (d) comprende el uso de espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasmón de. superficie, espectroscopia de masas, RMN,. resonancia de giro de electrón, espectroscopia de fluorescencia de polimerización, dicroismo circular, inmúnoensayo, cromatografía, . radiometría, electroquímico, fotometría, gammagrafiá, . métodos electrónicos, ÜV, . espectroscopia infrarroja o dé luz visible, métodos enzimáticos, o cualquier combinación de los mismos..; . .. En una modalidad del tercer aspecto, la detección en la parte (d) comprende el uso de espectroscopia de fluorescencia.
En una modalidad del tercer aspecto, la detección en la
parte (d) comprende la detección dé. un efecto detectable FET..
En una modalidad del tercer aspecto, el núcleo catalítico dé dicha MNAzima comprende ADN o un análogo del mismo.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso del sustrato dé polinucleótido aislado del primero o segundo aspecto como un sustrato para una enzima de ácido nucleico catalítico.
En una modalidad del cuarto aspecto, la enzima, de ácido nucleico catalítico es. una enzima de ácido nucleico multi-componente (MNAzima) ,
dicha MNAzima comprende al menos: dos o más partzimas de oligonucleótidó en donde al menos, una primera partzima de oligonucleótidó y una segunda partzima de oligonucleótidó de auto-ensamble en la presencia de un facilitador de ensamble MNAzima para formar üna enzima de ácido nucleico multi-componente catalíticamente activa (MNAzima) , én donde cada una dicha dé al menos de la primera y dicha segunda. partzimas oligonucleótidó comprenden una porción dé brazo de sustrato, una porción de núcleo, catalítico, y una porción de brazo sensor;
en donde bajo auto-ensamble, la porción dé brazo sensor de dicha primera' y segunda · partzimás de oligonucleótidó actúan como brazos, sensores de. la MNAzima, la porción de
brazo de sustrato de la primera y segunda pártzimas oligonucleótido actúan como brazos sustrato de la MNAzima, y la porción de núcleo catalítica de la primera y segunda pártzimas oligpnucleótido actúan como un núcleo catalítico de la MNAzima;
y en donde los brazos sensores de la MNAzima interactúan con dicho facilitador de ensamble MNAzima para mantener la primera y segunda pártzimas oligonucleótido en proximidad para asociación de sus respectivas porciones de núcleo catalítico para formar el núcleo catalítico dé l MNAzima, dicho núcleo catalítico capaz de modificar dicho sustrato de polinucleótido, y en donde dichos brazos de sustrato de dicha MNAzima acoplan dicho sustrato de polinucleótido de manera que dicho núcleo catalítico de dicha MNAzima puede modificar dicho sustrato de polinucleótido.
En una modalidad del tercer o cuarto aspecto, la porción del núcleo catalítico de cada partzima de oligonucleótido comprende ADN o un análogo del mismo.
En una modalidad del cuarto aspecto, el facilitador de
ensamble es un objetivo a identificarse, . detectarse o cuantificarse.
En una modalidad del tercer cuarto aspecto, la primera y segunda pártzimas de oligonucleótido comprenden secuencias respectivas definidas por:
SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10; SEQ ÍD NO: 11 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NOí 13 y SEQ ID NO: 14; SÉQ ID NO: 16 y SEQ ID Np: 14; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID* NO: 18; SEQ ID NO: 4? SEQ. ID Np: 41; SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43; SÉQ ÍD NO: 44 y SEQ ID NÓ: 45; SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 48 y SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51; SÉQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 51; SEQ ID NÓ: 38, y SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59; SEQ ID NÓ: .60 y SEQ ID NO: 61; SÉQ ID NO: 62 y SEQ JD NO: 63; SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70; SEQ ID NÓ: 46 y SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: .38 y SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 62 y SÉQ ID NO: 45; SEQ ID NÓ: 46 y SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 71 y SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NOt 99; SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; SÉQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 105; SÉQ ID NO: 106 y SÉQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108 y SEQ ÍD NO: 109; SEQ ID NO: 110 y SÉQ ID NO: 111; SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113; SEQ ID NO: 116 y SEQ ID NO: 117; SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NQ: 119; SEQ ID NO: 120 y SEQ ID NO: 121;.. SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO:.119; SEQ ID NO: 155 y SÉQ ÍD NÓ: 156; SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NO: 15.8; SEQ ID NO: 159 y SEQ ÍD NO: 160; SEQ ID. NO: 168 y SEQ ID NO: 169; SEQ ÍD NO: 179 y SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 181 y SEQ ID
NO: 182; SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 184 o SEQ ID NO: 185 y SEQ ID NO: 186.
En una modalidad del tercer . o cuarto aspecto, dicho sustrato oligónucleótido y dicha- primera y segunda partzimas 5 de oligónucleótido son definidas por una combinación de secuencias como se establece en la Tabla 6, 8; Í0> 13, 16, 20, 22 y/o 24.
En una modalidad del cuarto aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es. una ADNzima, y la ADNzima y sustrato .10 oligónucleótido son definidos por una combinación de secuencias como se establece en la Tabla 15.
En una modalidad del cuarto aspecto, el objetivo es un ácido nucleico que híbrida a uno o más brazos, sensores de dicha MNAzima por complementariedad de par base.
15 En. una modalidad del cuarto aspecto, el su'strato de polinucleótido híbrida' con dicha; enzima de ácido nucleico catalítico a una temperatura de entre 5Ó°C y 90eC, entre 50*C y 65°C, entre 50°C y 60°C, entre 52eC y 58°C, entre 66°C y 76?C, entre 68°C y 76°C, entre 64°C y 70°C, entre 70°C y • 20 76*C, éntre 70eC y 75eC, entre 72eC y 76°C, 52°C, 58°C, 64°C,
66°C, €8°C, 70eC, 72°C^ o 76°C.
En un quinto aspecto, la presente. invención proporciona un kit que comprende el sustrato de polinucleótido aislado del primero o segundo aspecto.
En una modalidad del quinto aspecto, el kit además comprende una enzima de ácido nucleico catalítico capaz de catalíticamente modificar dicho sustrato de polinucleótido.
En una modalidad del quinto aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es una enzima de ácido nucleico multi-componente (MNAzima)'.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende el sustrato de polinucleótido aislado dél primero o segundo aspecto y una pluralidad de partzimas de oligonucleótido diseñadas para ensamblar una enzima de ácido nucleico multi-componente (MNAzima) capaz d detectar al menos un objetivo, en donde dicha MNAzima es capaz de catalíticamente modificar el sustrato de polinucleótido.
En una modalidad del sexto aspecto, dicho sustrato oligonucleótido y dicha pluralidad de partzimas de oligonucleótido son definidas · por una combinación de secuencias como sé establece en las Tablas 6, 8, .10, 13, 16, 20, 22 y/ó 24.
En un séptimo aspecto, la presenté invención proporciona un ensamble que comprende un enlace.de soporte sólido para un sustrato de polinucleótido del primero o segundó aspecto.
En una modalidad del primero o tercero al : séptimo aspectos, cualquiera uno o más de 1-N15 son desoxiribonucleótidos.
En una modalidad de primero o tercero al séptimo aspectos, cualquiera uno o más. de N1-M15 son ribónucleótidos
En . una modalidad de primero o tercero al séptimo aspectos, todos de .N1-N15 son desoxiribonucleótidos.
En: una modalidad, de primero o tercero al séptimo aspectos, todos de N1-N15 son ribónucleótidos.
En una modalidad de primero o tercero ai séptimo aspectos, Hi'-Nis comprende una mezcla de desoxiribonucleótidos y ribónucleótidos.
En una modalidad- del séptimo aspecto,, el ensamble comprende una pluralidad de diferentes soportes sólidos enlazados a una pluralidad de diferentes sustratos de polinucleótidos.
En una modalidad del primero, segundo, cuarto, o quinto aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es una ADNzima.
En una modalidad del primero, segundo, cuarto, o quinto aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es una ribosoma. ' .
En una modalidad del primero, ségundo, cuarto, o quinto aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es una enzima de ácido nucleico mul i-componente (MNAzima) .
En una modalidad de os aspectos anteriores., la enzima de ácido nucleico catalítico es capaz dé modificar el sustrato
de polinucleótido por ésclsión.
En una modalidad del primero,, segundo, o quinto aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es una MNAzima que comprende la primera y segunda partzimas de oligonucleótido, y dicho sustrato .oligonucleótido y dicha primera y segunda partzimas de oligonucleótido son definidas por , una combinación de secuencias como se establece en las Tablas 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 y/o 24.
En una modalidad del primero, segundo, o quinto aspecto, la enzima de ácido nucleico catalítico es una ADNzima, y la ADNzima y el sustrato oligonucleótido son definidos por una combinación de secuencias como se establece en la Tabla 15.
En una modalidad del primero, segundo, o quinto aspecto, el sustrato de polinucleótido es capaz: de hibridar : a dicha enzima. de ácido nucleico catalítico por apareamiento dé bases complementarias.'/·".."
En una modalidad del cuarto aspecto, el sustrato de polinucleótido híbrida a dicha enzima de ácido nucleico catalítico por apareamiento dé bases complementarias.
En una modalidad del tercer.o y cuarto aspecto, el sustrato de . polinucleótido híbrida a dicha . MNÁzima por apareamiento de bases complementarias. ·· .'·
En una modalidad del primero, segundo, quinto, y sexto aspecto, el sustrato de polinucleótido és capaz dé hibridar.a
dicKa MNAzima por apareamiento de bases complementarias.
En una modalidad de los aspectos anteriores, una porción del sustrato de pblinucleótido aislado enlaza a al menos un brazo de sustrato de dicha MNAzima.
En una modalidad de los aspectos anteriores, el sustrato de polinucle.ótidó es un sustrato universal capaz de ser enlazado y catalíticamente modificado, por más de, un tipo diferente de enzima de ácido nucleico catalítico.
En una modalidad de los aspectos anteriores, el sustrato de polinucleótido es un sustrato universal capaz de ser enlazado y catalíticamente modificado por más. de un tipo diferente de enzima de ácido nucleico mülti-eomponeñte (MNAzima) .' · . " ·
En una modalidad de los aspectos anteriores, al menos una de dichas partzimas de oligonucleótido, facilitador de ensamble o sustrato comprende ADN o un análogo del mismo.
En una modalidad del tercero y sexto aspecto, la modificación es lá escisión del sustrato de polinucleótido por la MNAzima.
Las modalidades preferidas de la présente invención ahora se describirán, a modo de. ejemplo únicamente, con referencia a las figuras acompañantes en donde:
La Vigor* 1 es un diagrama representando un diseño de ejemplificación de un ácido nucleico multi-componente (MNAzima) . A modo de descripción, de ejemplificación, una MNAzima está compuesta de . dos o . más componentes oligonucleótido (partzima A y partzima B) , que auto ensamblan en la presencia de un facilitador de ensamble. Cuando dos partzimas ensamblan en la presencia del facilitador de ensamble, una MNAzima catalíticamente activa se forma la cuál es capaz de modificar (por ejemplo escisión o ligación) un sustrato. Las dos partzimas componentes tienen (i) brazos sensores, que enlazan l facilitador de ensamble, (ii) brazos sustrato, que enlazan al sustrato, y (iii) secuencias parciales de núcleo catalítico. La presencia de una molécula facilitadora de ensamble (por ejemplo Una. secuencia objetivo de ácido nucleico) proporciona la señal de ^entrada" que dirige el ensamble de los componentes de partzima en una tendencia altamente especifica que es susceptible a la modulación. En algunas modalidades, el facilitador de ensamble puede ser, por ejemplo, una secuencia de' ácido nucleico objetivo présente en una. muestra dé prueba. En otras modalidades, el facilitador de ensamble puede ser, p r ejemplo un oligonucleótido sintético incluido en el medio para dirigir el auto-ensamblé de los componentes partzima en la presencia de una señal evento detectáble. La modificación
del sustrato por la MNAzlma ensamblada puede proporcionar un "éfectó detectable" que puede ser detectado y/o cuantificado.
Por ejemplo, cuando el sustrato se etiqueta dual con un fluoróforo (F) y un extintor (Q) , la escisión, dé este *sustrato reportero" por una MNAzima . activa separa él fluoróforo y el , extintor resultando en un incremento concomitante en fluorescencia.
La Figura 2 proporciona un diagrama de flujo que muestra aplicaciones de ejemplificación de métodos para detección de objetivo usando MNAzimas. Las MNAzimas pueden usarse para (1) detección directa; (2) detección de amplicones generadas, por ejemplo, por PCR, SDA, LAMP, RCA, TMA, 3SR ó NASBA ya sea durante, o seguido de, amplificación de objetivo; y (3) iniciando una cascada de amplificación de señal.
La Figura 3 proporciona una representación de MNAzimas de ejemplififcación y un. método para detección de objetivo usando MNAzimas que escinden sustratos anclados, a un soporte. En esta modalidad, . l MNAzima se forma únicamente en la presencia de un facilitador de ensamble <objetivo) . Cuando la MNAzima escinde el sustrato anclado [entre un fluoróforo .y extintor, se genera ui¾a señal. Cómo, se muestra aqui, bajo escisión entre fluoróforo F y extintor Q, hay un incremento resultante en fluorescencia. En general, el método puede designarse de manera que ya sea fluoróforo F o extintor Q
puedan seguir adjuntos al soporté una vez que ocurre la escisión. Panel (i): El soporte mostrado tiene únicamente él soporte mostrado (Sustrato 1) anclado al mismo. Panel (ii) : Púeden haber múltiples tipos de sustrato anclados en diferentes posiciones» Cada sustrato puede ser escindido únicamente por una MNAzima formada en la presencia de una molécula de facilitador de ensamble MNAzima especifico- aqui, Los objetivos 1 y 2 facilitan el. auto-ensamble de MNAzimas 1 y 2 respectivamente. Asi, en este ejemplo. MNAzima 1 únicamente auto-ensambla en la presencia de Objetivo 1 y únicamente escinde Sustrato 1. Similarmente, MNAzima 2 únicamente auto-ensambla en la presencia de Objetivo 2 y únicamente escinde Sustrato 2. La señal puede localizarse posicionando el sustrato en la superficie, de este modo permitiendo la : . detección especifica de diferentes facilitadores de ensamble. El ensayo ejemplar en Panel (ii) requiere dos secuencias distintas de sustrato.
La Figura 4 muestra un ensayo de éjemplificación usando productos de sustrato .catalíticamente modificados como componentes de facilitador de ensamble. MNAzima. En esta estrategia una MNAzima de inicio (Mt) se forma en la presencia de. un objetivo (T) . La MNAzima dé inicio (Mt) escinde un primer sustrato (Si para crear un primer componente facilitador de ensamble (Slf) , que dirige la
formación de una primera NNAzima de cascada (MNAzima Mcl de cascada) . En. este ejemplo la primera MNAzima de cascada (Mcl) comprende . dos partzimas y tres componentes de facilitador de ensamble désignados El, F2 y Slf. Mcl puede escindir un sustrato adicional (S2) de éste modo liberando un componente de facilitador de ensamble adicional (S2f) , que dirige la formación de una segunda MNAzima de cascada (MNAzima Mc2 de cascada). En- ste ejemplo la segunda MNAzima de cascada (Mc2) comprende dos partzimas y tres componentes de facilitador de ensamble designados F3, F4 y S2f. Mc2 puede entonces escindir más del primer sustrato (SI) asi creando más del primer componente de facilitador de ensamble (Slf) . Esto lleva a la formación de primer MNAzima de cascada adicional (Mcl) de esté modo formando un cascada de amplificación. Éste ensayo de amplificación requiere dos secuencias de sustrato distintas.
La ligur* 5 proporciona una gráfica que ilustra valores Ct generados por MNAzima qPCR usando un intervalo de sustratos universales diferentes para la detección del gen TFRC humano. La identidad de los sustratos universales usad s en reacciones se indica en el eje x (donde "2" se refiere a Sub2, M3" se refiere a Sub3 etc.). El mismo primér conjunto y ADN genómico se usaron para todas las reacciones, y. todas las partzimas tuvieron' las mismas regiones objé'tivo-sensor y
dominios catalíticos . Las únicas diferencias entre reacciones fueron los brazos sustrato-sensor de las partzimas y los sustratos universales fluorescentemente etiquetados. Ahi la diferencia en los valórés Ct entré reacciones se correlaciona con eficiencia de escisión de los sustratos universales. Los valores Ct más bajos indican un número más rápido de . ciclos para alcanzar un nivel de umbral de fluorescencia, y por lo tanto indicar sustratos universales más eficientemente escindidos..
La rigor* 6 proporciona gráficas que ilustran las relaciones de señal a ruido resultando de escisión mediada de MNAzima de un intervalo de sustratos universales en un formato isotérmico. El objetivo fue un oligonucleótido sintético. La relación de señal á ruido se calculó de datos de fluorescencia, normalizada recolectados durante las reaccioñes de escisión en un intervalo de temperaturas de reacción. La identidad de los sustratos universales: usados én las reacciones se indica . en el eje x (donde "2" se refiere a Sub2, ~3" se refiere a Sub3 etc.). En la Figura 6 (i) las diferentes columnas dé datos se refieren a los resultados para diferentes temperaturas de reacción (como « se indica en la leyenda 52eC, 54°C, 56°C y 58°C) . La Vigora 6 (i) ilustra la señal para relación de ruido en el eje y. La Figura 6 (ii) i^stra la desviación estándar del promedio de la relación de
··" ' . ·· 30
señal al ruida de todas . las cuatro temperaturas probadas ; y las diferentes series de sustratos se indican mediante sombreado diferente de columnas.
La Figura 7 proporciona gráficas que ilustran gráficas de amplificación lineal generadas por MNAzima qPCR usando un intervalo de diferentes sustratos universales para la detección de un intervalo de genes humanos. Cada combinación de sustratos y objetivos se corri a una temperatura de combinación de pares de bases de a) 52°C o b) 58*C. Los sustratos universales probados con cada gen se indican por símbolos ubicados en la. parte superior izquierda de cada gráfica y fueron (i) Sub3 y Sub6Í con CYP2C.9, (ii) Sub6, Sub72, Sub74 y Sub79, con TP53, (iii) Sub60, Sub61 y- Sub79 con B2M, (iv) Sub49 y Sub75 con HMBS, (v) Sub2, Sub72 y Sub80 con TPRC y (iv) Sub55, Sub80 y Sub88. cóh RPL13a. El mismo conjunto de cebador . y ADN genómico se usaron para todas las reacciones cada uno con diferente gen, y todas l s; partzimás tuvieron los mismos dominios catalíticos y regiones objetivp-sensor acoplados al gen particular. Las únicas diferencias entre . reacciones fueron los brazos sustrato-sensor de las partzimás y los sustratos . universales fluorescentemente etiquetados. Así la deferencia en la forma de la gráfica de amplificación y los valores Ct entre reacciones para el mismo gen se correlaciona con la eficienci de escisión de los
sustratos universales. Las curvas más pronunciadas ; y los valores Ct más tempranos indican un número más rápido de ciclos para alcanzar una- fluorescencia de umbral, y por lo tanto indican sustratos universalés. más eficientemente escindidos.
La Figura 8 proporciona gráficos que ilustran la relación de señal y ruido resultante de la escisión mediada de ADNzima de un intervalo de sustratos universales en un formato isotérmico. La relación de señal a ruido se calculó de datos de fluorescencia normalizados recolectados durante las reacciones de escisión en un intervalo de temperaturas de reacción. La identidad de los sustratos universales usados en las reacciones se indica en el eje x (donde w2" se refiere a Sub2, "3" se refiere a Sub3 etc.). En la Figura 8. (i) las diferentes columnas de datos se refieren a ios resultados para diferentes temperaturas de reacción (como se indica en la leyenda - con la relación de señal a ruido en
el eje y. En la Vigora 8 (ii) las columnas de datos se refieren a la desviación estándar del promedio de. la relación de señal a ruido de todas las seis temperaturas probadas .y las diferentes series de sustratos son indicadas ppr diferente sombreado da columnas.
La Figura 9 proporciona gráficos que ilustran gráficas de amplificación lineal de MNAziraa qPCR realizada en un
intervalo de diferentes sustratos universales (Sub44, SubSS, Sub61, Sub65, Sub72 y Sub74) para investigar l actividad de escisión no especifica con un subconjunto de partzimas (designado con brazos de sensor de sustrato para ser complementario a Sub44f Sub55,. Sub72 y Sub74) para detección del gen RPL13a humano. Cada sustrato universal se probó individualmente con pares de partzima diseñados para enlazar con complementariedad completa a los otros sustrato pata determinar si podia detectarse una señal. Las partzimas complementarias a (i) Sub72, (ii) Sub74, (iiij: Sub55 y (iy) Sub44, se probaron con todos los sustratos. En el Panel (a) la linea de fondo, de la tabla indica el sustrato al cual las partzimas en el experimento exhiben complementariedad completa. Las otras dos filas de ; la tabla .muestran una alineación de las secuencias de ios otros sustratos probados en cada experimento con diferencias entre el. sustrato de fondo y otras secuencias de sustrato indicadas por letras que son grises y están subrayadas. En el Panel (b) se ilustran la gráficas de amplificación lineal.. La . fluorescencia normalizada (eje y) se gráfica contra el número: de ciclo (eje x). Las curvas de- amplificación individual están etiquetadas a la derecha de la . gráfica para indicar qué curva de amplificación se relaciona a cada sustrato. La fluorescencia dé umbral es indicada por una linea horizontal .sólida arriba
del eje x. Una señal de incremento arriba de la fluorescencia dé umbral indica escisión del sustrato universal.
La Vigor* 10 proporciona gráficos: qué ilustran la relación de señal a ruido resultante de escisión, mediada de AD zima de cada sustrato universal individualmente con ADNzimas diseñadas para enlazar con complementariedad completa a los otros sustratos, en un formato isotérmico. La relación de señal normalizada a ruido se calculó de los datos de fluorescencia normalizada recolectados en las temperaturas de reacción de (i) 52°C o (ii) 58°C. La identidad de los sustratos universales usados, en las reacciones se indica en el eje x. Las diferentes columnas de datos se refieren a los resultados de escisión para cada ADNzimá como se indica en la leyenda, con l relación de señal a ruido en él eje y.
La Figura 11 ilustra gráficas de amplificación exponencial generadas con' amplificación ya sea en 52°C (Panel (i)) o 58eC (Panel (ii) ) para dos reacciones multipléx MNAzimá qPCR Multiplé 1 usando sustratos de serie .1 (Sub2, Sub3, Sub4, Sub6 y Sub7) y MültipleX 2 usando ' sustratos de serie 2 y.3 (Sub55, Sub61, Sub74, Sub7? y Süb80) . Ambos multiplexes midieron los genes humanos TFRC, HPRT, TP53, RPL13á y CYP2C9 en un contendor de reacción sencillo. Paya cada gen diferente, medido en ios dos formatos multipléx los mismos conjuntos dé cebador y ADN genómico se usaron en ara as
temperaturas y para todos los sustratos universales, y todas las partzimas tuvieron los mismos dominios catalíticos y regiones objetivo-sensor apareadas al gen particular. La única diferencia entre las reacciones fue los brazos ele sustrato-sensor dé las partzimas y . los sustratos universales fluorescentemente etiquetados. Los sustratos universales probados con cada gen se indican en . la parte superior izquierda de cada gráfica. Las gráficas .de amplificación para Multiplex 1 (cruces) y Multiplex 2 (circuios) se superpusieron para permitir una comparación directa entre los do multiplexes en dos diferente concentraciones de DNA, 100 ng (gráfica de cruz y circulo a la izquierda) y 391 pg (gráfica de cruz y circulo a la dérecha) . La diferencia en la forma de las gráficas de amplificación se correlacionó con la eficiencia de escisión de los sustratos universales. Las curvas más pronunciadas y los valores Ct .más tempranos indican un númer más rápido de ciclos, para alcanzar una fluorescencia de umbral, y por lo tanto indican sustratos universales más suficientemente escindidos.
DESCRIFCIÓM DETALLADA CE LA INVENCIÓN OEFUIICIOBKS
Ciertos términos se usan' en la présente qu tendrán los significados establecidos como sigue.
Como se us¾ en .la presente; la forma singular "un"¿ "uno" y la" incluyen referencias plurales á menos que el contexto claramente lo indiqué de otro modo. Por ejemplo, el término "un sustrato de polinucleótido" también incluye una pluralidad de sustratos de polinucleótido.
El término ^comprende" se refiere á "incluyendo principalmente, . pero no necesariamente exclusivamente". Además, las variaciones de la palabra "comprender", tal como "comprendiendo" y. "comprende", tiene correspondientemente varios significados.
El uso del. término "alrededor" en la. presente en referencia a un valor numérico recitado incluye el valor numérico recitado y valores numéricos dentro de más 6 menos diez por ciento del valor mencionado.
El uso del término "entre" en l presente cuando se refiere a un intervalo de valores numéricos abarca los valores numéricos' en cada punto final del intervalo. Por ejemplo, un polinucleótido de entre 10 nucleótidos y ¿0 nucleótidos en longitud es inclusivo de un olinucleótido de 10 nucleótidos en longitud y un polinucleótido de 20 nucleótidos en longitud.
Los términos ^polinucleótido" y "ácido nucleico": se usan intercambiablemente: en la presente y se refieren a un polímero sencillo o de doble hebra de bases
desoxirribonucléótido y/o ribonucleótido, y/o análogos, derivados, variantes, fragmentos o combinaciones de ios mismos, incluyendo pero no limitado a ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN motilado, microARN, siARN, shARN, mARN, tARN, snoARN, stARN, s ARN, pre- y pri-microARN, otros ARNs no codificados, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones de los mismos o cualquier combinación de los mismos. A modo de ejemplo no limitante, la fuente de un ácido nucleico puede seleccionarse del grupo qtje consiste de sintético, mamífero, humano, animal, planta, hongo, bacteria, viral, fuentes de arqueas o cualquier combinación de los mismos.
El término *oligonucleótido'' típicamente denota un segmento de ADN o una molécula de ácido nucleico que contiene ADN, o ARN o moiéculá que contiene ARN, o una combinación de los mismos. Asi un oligonucleótido puede comprender o consistir de desoxirribonucléótido y/o bases ribonucleótido, y/o análogos, derivados, variantes» fragmentos ..o combinaciones de los mismos, incluyendo pero no limitado ,: a ADN, ADN metilado, ADN alquilado, ARN, ARN metiladó, microARN, siARN, shARN* mARN, tARN, snoARN, stARN, smARN, pre- y pri-microARN, otros ARNs no codificantes, ÁRN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones de los mismos o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos de
oligonucleótidos. incluyen objetivos de ácido, nucleico; sustratos, por. ejemplo, aquellos que pueden ser modificados por una ADNzima o una MNAzima con escisión, ligasa ü otra actividad enzimática; cebadores tales como aquellos usados para amplificación in vitro por métodos tales como PCR; . y componentes de MAzimas incluyendo, pero no limitado a partzimas, y facilitadores de ensamble.
El término "nucleótido de pirimidina" abarca cualquier nucleótido que comprende una base . de pirimidina incluyendo, pero no limitado a, citocina, timina y uracilo. Un nucleótido de pirimidina puede comprender una molécula de . azúcar ribosa (esto es un ribonucleótido de pirimidina") o una molécula de azúcar desoxirribosa (esto es un "desoxirribónucleótido de pirimidina")..
El término .. "nucleótido de purina" abarca cuálquiér nucleótido que comprende una base purina incluyendo,, pero no limitado a, adenina y guanina. Un nucleótido de purina puede comprender una molécula azúcar ribosa (esto, es un "ribonucleótido de purina") o una molécula, de azúcar
desoxirribosa (esto es un "desoxirribonucleótidó de purina").'·.
Los términos "enzima de ácido nucleico", "ácido nucleico catalítico", ''ácido nucleico con actividad catalítica", y "enzima de ácido nucleico catalítico" se usan ¡en la presente intercambiablemente y . se referirán a ; ADN o molécula que
contiene ADN o complejo o un ARN o. molécula que contiene ARN o . complejo, o una combinación - de los . mismos siendo una molécula de hibrido ADN-ARN o compléjo, que puede enlazar a al menos un sustrato y catalizar una modificación (tal como ligación o escisión) de al menos un sustrato. Los résiduos nucleótido en los : ácidos nucleicos catalíticos puédén incluir las bases A, C .G, T¿ y U, asi como también derivados . y análogos de los mismos. Los términos de arriba incluyen enzimas uni-moleculares de ácidó nucleico que pueden comprender un ADN sencillo o molécula que contiene ADN (también conocida en la técnica como una "enzima de ADN", "desoxirribozima" o ADNzima") o un ARN o. molécula que contiene ARN (también conocida en la técnica como una "enzima de ARN" o "ribozima ) o una combinación de los mismos, siendo una molécula hibrido ADN-ARN que puede reconocer al menos ün sustrato y catalizar una modificación ; (tal como ligación o escisión) del al menos un sustrato. Los términos anteriores incluyen enzimas dé ácido nucleico que comprenden, un ADN o complejo que contiene ADN o un ARN o complejo qué contiene ARN o una combinación de los mismos, siendo un complejo hibrido ADN-ARN que puede reconocer al menos un sustrato y catalizar una modificación (tal como ligación o escisión) de al . menos un sustrato. · Los términos, "enzima de. ácido nucleico", "ácido nucleico catalítico"; nucleico con
actividad catalítica?, y "enzima de ácido nucleico catalítico" incluyen MAzimas dentro de su significado.
Los términos "MNAzima" y "enzima de ácido nucleico multi-componente" como sé usan en la presente tiene el mismo significado y sé refieren a dos o más secuencias de oligonucleótido (por ejemplo partzimas) qüe, únicamente en la presencia de un - facilitador de ensamble de MNAzima (por ejemplo, un objetivo),, forma una enzima activa de ácido nucleico que es capaz de catalíticamente .modificar ün sustrato. Las MNAzimas pueden catalizar un intervalo de reacciones incluyendo escisión de un sustrato, ligación de sustratos y otras modificaciones enzimáticas d un sustrato o sustratos. Una MNAzima dé ejemplificación que comprende partzima A y partzima B que tiene, actividad de escisión se representa én la Figura 1.. Las MNAzimas con endoiiucléasa o actividad de escisión también se conocen como "éscindidorés de MNAzima". Con referencia a la Figura 1, las partzimas Á y B cada una enlazan. a ün facilitador de ensamblé (por ejemplo un ADN objetivo o secuencia de ARN) a través del apareamiento dé · bases Watson-Crick. La MNAzima únicamente se forma cuando los brazos del sensor de partzimas A y B hibridan adyacentes el uno al otro en el facilitador de ensamble. Los brazos de sustrato de la MNAzima acopian al sustrato, la modificación (por ejemplo escisión) la cual es catalizada por el núcleo
catalítico de ia MNAzima, formado por la interacción de los dominios catalíticos dé las partzimas A y B. La escisión de un sustrato reportero quimérico ADN/ARN se ejemplifica en el dibujo. La MNAzima escinde el sustrato entre un fluoróforo y un par de colorante extintor, de este modo generando señal. Los términos "enzima de ácido nucleico multi-comporiente'' y "MNAzima" comprenden estructuras bipartito, compuestas de dos moléculas o estructuras tripartito, compuestas de tres moléculas de ácido, nucleico, u otras estructuras multipartito, por ejemplo aquellas formadas por cuatro o más moléculas de ácido nucleico.
Se entenderá que los términos ^MNAzima" y ^enzima de ácido nucleico multi-componente" como se usa en la presente abarcan todas las MNAzimas conocidas y MNAzimas modificadas incluyendo aquellas descritas en cualquiera de una o más de publicación PCT dé las patentes, números WÓ/2007/041774, WO/2008/040095, WO2008/122Ó84, y publicación de la patente de E.ü.A. números 2007-0231810, 2010-0136536, y 2011-0143338 (los contenidos de cada uno de estos documentos se incorporan en la presente como referencia en su totalidad) . Los ejemplos nó. limitantes de MNAzimas y MNAzimas modificádas abarcados por los términos MNAz'lma" y "enzima de ácido nucleico multi-componente" incluyen MNAzimas con escisión actividad catalítica (como se ejemplifica en la presente), MNAzimas no
ensambladas o parcialmente ensambladas que comprenden uno o más inhibidores de ensamble, MNAzimas que comprenden uno o más aptámeros { apta-MNAzimas") , Las MNAzimas que comprenden uno o más brazos dé sensor truncado. y opcionalmente uno ? más oligonucleótidós estabilizadores, las MNAzimas que comprenden uno o más inhibidores de actividad, proenzimas inactivas de ácido nucleico multi-componente (MNAi)¿. y MNAzimas con actividad catalítica de ligasa ("ligasas MNAzima ) , cada una de las cuales se describe a detalle en una o más de WO/2007/041774> WO/2008/040095, WO2008/122084, E.U.A. 2007-0231810, E.U.A. 2010-0136536, y/o E.U.A. 2011-0143338.
Como se usa en la presente, los : términos ^partzima", componente del par^zima", "partzima del componente", *componente de óligonücleótido", "óligonücleótido del componente" y partzima de oligonucieótidó" se refieren a un ADN que contiene Q ARN que contiene o ADN-ARN-que contiene oligonucleótido, dos o más de los cuales, únicamente, en la presencia de un facilitador de ensamble MNÁzima como se definen en la presenté, pueden juntos formar uña -^MNAzima," En ciertas modalidades' preferidas, uno o. más componentes de partzimas, y preferiblemente al menos dos, pueden comprender tres regiones o dominios: un dominio "catalítico", que forma parte del núcléo catalítico que cataliza una modificación; un dominio de "brazo sensor", que puede asociarse, con. y/o
enlazar a un facilitador de ensamble; y un dominio "brazo de sustrato", que puede asociarse con y/o enlazar a un sustrato. Las ilustraciones de estas regiones o dominios se muestran en la Figura 1. Las partzimas pueden comprender al menos un componente adicional 'incluyendo pero . no limitando a un aptámero, referidQ en la presente como, una "apta-partzima.. " Una partzima puede comprender componentes múltiples, incluyendo pero no limitado a, un componente partzima con un brazo sensor truncado y un componente de brazo estabilizador que estabiliza la estructura MNAzima por interacción con ya sea un facilitador.de ensamble o un .sustrato..
Los términos "molécula de facilitador de ensamble'', "facilitador de ensamble", "molécula de facilitador de ensamblé de MNAzima", y "facilitador de ensambl MNAzima" como sé usa en la presente se refieren a entidades que pueden facilitar el auto ensamble de componente de partzimas para formar una MNAzima catalíticamente activa por interacción con os brazos sensores de la MNAzima. Como se usa en la presente, los facilitadores de ensamble pueden facilitar el ensamble de MNAzimas que tienen escisión, ligasa u otras actividades énzimáticas. En modalidades, preferidas un facilitador de ensamble se requiere para él auto ensamble de una MNAzima. Un facilitador de ensamble puede . estar comprendido de una molécula, o puede estar, comprendido de dos
o más ^componentes de facilitador de ensamble" que pueden emparejar con, o enlazar a, los brazos sensores de una o más ^partzimas" oligonucleótido. El facilitador de ensamble puede ser un objetivo. El objetivó puede ser un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de. ApN, ApN metilado, ADN alquilado, AR , ARN metílado, microARN, siARN, shARN, tARN, mARN, snoARN, stARN, smARN, pre- y pri-micrcARN, otros ARNs no codificantes, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones, o cualquier combinación de los mismos. El ácido nucleico puede amplificarse. La amplificación puede comprender uno o más de: reacción de cadena polimerasa (PCR) , amplificación de desplazamiento de hebra, , amplificación isotérmica mediada de rizo, amplificación por circulo rodante, amplificación, mediada dé transcripción, replicación de secuencia auto-sostenida, reacción de cadena ligasa, amplificación basada en secuencia dé ácido nucleico, o reacción de cadena polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) . :
Un Axcomponente facilitador de ensamble" es una molécula que puede usarse para controlar el ensamble de MNAzimas activas o facilita la transición de componentes de MNAzima inactiva a MNAzimas activa.
El término. objetivo" como se usa en la presente incluye cualquier entidad natural o sintética, constituyente o
análito que se espera se detecte, identifique o. cuantifique por un método que úse una enzima de ácido nucleico particular tal como una MNAzima(s), con o sin una. etapa y/o cascada de amplificación adicional. Los objetivos por lo tanto abarcan el intervalo más amplio de . entidades detectables, constituyentes o ¿hálitos para los cuales lps métodos de detección sensible, identificación y/o cuantificación son deseables.. Algunos objetivos de ejemplificación incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico, proteina,; polipéptido, péptido, glicoproteinas, lipidos, lipoproteinas, organismos enteros, células, virus, bacterias, arqueas, levadura, hongos, anticuerpos, metabolitos, patógenos, toxinas, contaminantes, venenos, moléculas pequeñas, polímeros iones metálicos, sales metálicas, priones o cualquiera de los derivados, porciones o combinaciones de los mismos. Otros objetivos también sé contemplan para su uso e la. presente. Se entenderá que el objetivo puede también ser un facilitador de ensamble o componente facilitador de ensamble.
Un "efecto detectable" es un efecto que puede detectarse o cuantificarse como una indicación de que ha ocurrido la modificación de sustrato/s. La magnitud del efecto puede ser indicativa de la cantidad de una entrada . tal como, un facilitador de ensamble (por ejemplo un objetivo). Los efectos detectables pueden, ser detectados por una variedad de
métodos, incluyendo ' espectroscopia de fluoresce cia, resonancia de plasmón de superficie, espectroscopia de masas, RMN, resonancia de giro de electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroísmo circular, inmunoénsayo, cromatografía, radiometría, fotometría, gammagrafía, métodos electrónicos; OV, espectroscopia inf a roja o luz . visible, métodos enzimáticos o cualquier combinación de. loá mismos.
Los términos "sustrato de polinucleótido" y ^sustrato" como se usa en la presente incluyen cualquier, polímero sencillo- o de doble hebra de bases de desoxirrlbonucleótido o ribonucleótido, o análogos, derivados variantes, fragmentos o combinaciones de los mismos, incluyendo pero no limitado a ADN, ADN metilado, AD alquilado, , ARN, ARN metilado, microARN, siARN, shARN, mAR , tARN, snoARN,. stARN, smAR , pre- y pri-microARN, otros ARÑs no codificantes, ARiN ribosomál, derivados dé los mismos, amplicones de los mismos o cualquier combinación de los mismos (incluyendo: polímeros mezclados de bases desoxirrlbonucleótido y ribonucleótido) , que son capaces de ser reconocidos, accionados bajo o modificados por una enzima incluyendo una enzima de ácido nucleico catalítico., ün sustrato de polinucleótido" o "sustrato" puede ser modificado por varias actividades enzimáticas incluyendo pero no limitado a escisión o
46 . - ...
ligación. La modificación de un ^sustrato de pólinucleótido" o "sustrato" puede proporcionar un "efecto detectable para rniinitorear la actividad catalitica de na enzima.
Un "sustrato reportero" como se usa en la presente, es un sustrato que es particularmente adaptado par facilitar la medición de ya sea la desaparición de un sustrato o la aparición de un producto en conexión con una reacción catalizada. Los sustratos reporteros pueden estar libres en solución o enlazados (ó "atados*'),, por. ejemplo, á upa superficie, o a otra molécula. Un sustrato reportero puede ser etiquetado por cualquiera de una amplia variedad de medios incluyendo, por ejemplo, fluóróforos (con o sin uno o más componentes adicionales, tal cómo extintores), etiquetas radioactivas, biotina (por ejemplo biotiniíáción) o marcadores quimioluminiscentes.
Como se usa er la presente, un "sustrato genérico" o un "sustrato universal" es un sustrato, por ejemplo, un sustrato reportero, que es reconocido por y accionado catalíticamente pór una pluralidad de MAzimas, cada una de los cuales puede reconocer un facilitador de ensamble diferente. El uso de tales sustratos facilita el desarrollo de ensayos separados para detección, identificación, o cuantificacióri de una amplia variedad de facilitadores de ensamble usando MNAzimas estructuralmente relacionadas todas de las cuáles. reconocen
un sustrato universal. Estos sustratos universales pueden ser independientemente etiquetados con una o más etiquetas. En modalidades preferidas, las etiquetas independientemente détectábles se Usan para etiquetar uno o más sustratos universales para . permitir la creación de un sistema conveniente para independientemente o simultáneamente detectar una variedad de facilitadores de ensamble usando MNAzimas. En algunas modalidades, los sustratos escindidos por MNAzimas podrían reconstituirse, y por lo tanto reciclarse, usando una ligasa de MNAzima o ADNzima. En algunas modalidades, el sustrato (s) escindido o ligado por MNAzimas puede además usarse como componente o modulador de MNAzima (s) o ADNzima (s) adicionales.
En algunas modalidades, los sustratos universales"
* . · pueden atarse a un soporte sólido en diferentes posiciones para proporcionar una configuración de sustrato. . En tales modalidades, los sustratos universales atados todos pueden ser etiquetados con el mismo fluoróforo. En ciertos casos, cada, sustrato universal puede ser escindido únicamente por una MNAzima formada en la presencia de una molécula de facilitador de ensamble MNAzima especifica y la señal puede localizarse por el posicionamiento del sustrato en la superficie, de este .modo permitiendo, la detección especifica de diferentes facilitadores de ensamble.
El término "producto" se refiere a- la nueva molécula o moléculas que se producen como resultado de modificación enzimática de un sustrato. Como se lisa en la presente el término "producto de escisión" se refiere a una nueva molécula producida como resultado de actividad de escisión, o endonucleasa por una enzima. El término "producto de ligación" se . refiere a una nueva, molécula producida de acuerdo al resultado de' la ligación de sustratos por una enzima.
Como se usa en la presente, el uso de los términos
"temperatura de fusión" y "Tm" en el contexto de un sustrato de polinucleótido de la presente invención se. entenderá es una referencia a la temperatura de fusión .' (Tm). como se calculó usando la norma Wallace, dondé Tm .= 2°C(A+T) + 4eC(G+C) (ver Wallace et al.,' (1979) Nucí. Acids Res. 6(11) : 3543-3558) , a menos que específicamente se indique de otró modo.
Como se usa en la presente,- el término "basé" se entenderá abarca el ribonucleótido o desoxirribonucleótido entero al cual la base está adjunta.
ABRKVIATORAS
Las siguientes abreviaturas .se usan en la presente y por toda la especificación:
MNAzima: enzima de ácido nucleico multi-componénte, o enzima de ácido nucleico .multipartito;
ADNzima: enzima de ácido desoxirribonucieico;
Ribozima: enzima de ácido ribonucleico;
Partzima: oligonucleótido que contiene enzima parcial
PCR: reacción de cadena polimerasa;
qPCR: PCR cuantitativa en tiempo real;
NF-H2O: nucleasa-agua libre;
LNA: ácido nucleico cerrado;
F: fluoróforo;
Q: extintor;. .
N- A, C, T/ü, . G, o. cualquier análogo del mismo;
N'» cualquier nucléótiido complementario a N, o capaz de emparejar la base con N;
(N)x: cualquier número de N;
(N')x: cualquier número de Nf
W: A o T;
R: ?, G, o AA;
rN: cualquier ribónucleótido;
(rN)x: cualquier número de rN;
rR: A Q G ribónucleótido;
rY: C .Ó ü; ribonucleót,ido
M: A o C;
H: A, C, o T/ü;
D: G, A, o T/ü; :
JOE o 6-JOE: 6-carboxi- ' ,5· -dicloro-2 · , V- dimetoxifluoresceina; .
FAM o 6-FAM: 6-Carbóxifluoresceina.
BHQ1: Black Hole Quencher® 1
BHQ2: Black Hole Quencher® 2
IB: Iowa Black® FQ
IBR: Iowa Black® RQ
shRNA: AR de horquilla corta
siRA: ARN de . interferencia corta
mARN: ARN mensajero
tRNA: ARN de transferencia
snoRNA: ARN nucléolar pequeño
stRNA: ARN temporal pequeño
smARN: ARN modulador pequeño
pre-microRNA: microÁRN precursor
pri-microRNA: microÁRN primario
UV: ultra violeta
Se ha de entender desde el principio, que las figuras y ejemplos proporcionados en la presente son para ejemplificar más que limitar . la presente invención y sus. varias.
modalidades.
Existe una necesidad de sustratos de ácido nucleico catalíticos con propiedades que facilitan la función mejorada de ácido nucleico catalítico. En particular,¦ muchas aplicaciones implicando MNAzimas y ADNzimas sé beneficiarán significativamente de la provisió de nuevas familias de sustrato universal que han incrementado su capacidad para modificación catalítica por diferentes MNAzimas con las mismas o distintas especificidades de objetivo» Por ejemplo, estas familias de sustrato serian ventajosas en el incremento de la eficiencia y/o exactitud de ensayos multipléx implicando MNAzimas. Los sustratos universales adicionales son particularmente útiles en aplicaciones dónde las configuraciones de sustrato se crean atando sustratos a soportes sólidos.
La presente invención proporciona un conjunto de pautas para producir sustratos de oligonucleótido universales con una probabilidad más alta de ser catalíticamente modificados (por ejemplo escindidos) eficientemente sobre un intervalo amplio de temperatura con desempeño mejorado a temperaturas elevadas.. Estas, pautas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera uno o más de: (i) siete o más nucléótidos de citosina en las diez bases rodeando los dos ribonucleótidos centrales; (ii) bases inmediatamente adyacentes a los dos
ribonucleótidos centrales son citosinas (N8 y N9); (iii) contenido pirimidina total del sustrato oligonucleótido s mayor que 64%; (iv) Tm total del sustrato oligonucleótido -és 66°C o mayor, aplicable si la temperatura de reacción para modificación catalítica (por ejemplo escisión) del sustrato oligonucleótido por la enzima de ácido nucleico está arriba de 50°C; y/o (v) un número bajo de nucleótidos de guanina (por ejemplo tres, dos, uno o ninguno), en las 10 bases rodeando los dos ribonucleótidos centrales.
El desarrollo de éstas pautas ha facilitado el desarrollo de sustratos de enzima de ácido nucleico catalítico con características qué' aumentan la función de ácido nucleico catalítico. Se ha identificado qué la modificación catalítica de nucleótido/s dentro de un sustrato como objetivo por una enzima dada de ácido nucleico puede ser mejorada por la presencia de ciertos nucleótidos específicos próximos a aquellos que están catalíticamente modificados..
Por consiguiente, ciertos aspectos, de la . presenté invención se relacionan a sustrato d polinucleótidos para enzimas de ácido nucleico catalíticas. Los sustratos de polinucleótidos pueden comprender una serie de nucleótidos de pirimidina 5' (esto es cadena arriba) y/o 3' (esto es cadena abajo) de nucleotido/s que son catalíticamente modificados por una enzima de, ácido nucleico, que tiene como objetivo él
sustrato. Los .. hucléótidos de pirimidina . pue,den ser nucleótidos de citósina.
Otros aspectos de la presente invención se relacionan al uso de sustratos de polinucleótido descritos en la presente como sustratos para enzimas de ácido nucleico (por ejemplo una ADNzima, ribozima o una MAzima) . En ciertas modalidades, los sustratos se usan como sustratos para MNAzimas. En ciertas modalidades/ los sustratos se usan como sustratos para ADNzimas.
Los aspectos adicionales de la presente invención se relacionan a métodos para detectar una molécula objetivo.. Los métodos comprenden modificar un sustrato de polinucleótido descrito en la presente para proporcionar un efecto detectable. En ciertas modalidades, los métodos comprendén modificar el sustrato de polinucleótido usando una MNAzima que es capaz de detectar un objetivo.
Los aspectos adicionales de la presente invención se relacionan a kits qué comprenden uno . más sustratos de polinucleótido/s descritos en la presente; Los kits pueden comprender una enzima de ácido nucleico capaz de catalíticamente . modificar el sustrato/s. En ciertas modalidades, la enzima de ácido nucleico puede, ser, una MNAzima.
1. Sustrato da énmlM da ácido nucleico catalítico
La presente Invención proporciona sustratos de polinucleótido para enzimas de ácido nucleico catalíticas. La présente invención . también proporciona los . miembros de familias de sustrato de los cuales han incrementado la capacidad para modificación catalítica por diferentes ácidos nucleicos (por ejemplo MNAzimas) cón las mismas o diferentes especificidades de objetivo.
Los sustratos de polinucleótido . comprenden al menos una porción de secuencia que.puede modificarse por una enzima de ácido nucleico catalítico. No existe limitación respecto al tipo particular de enzima de ácido nucleico catalítico que pueden modificar un sustrato de polinucleótido de lá' presente invención. La porción de secuencia puede comprender cualquiera de uno ó más de al menos un nucleótido de ADN, al menos un nucleótido de ARN, al menos un análogo de un nucleótido de ADN, y- al menos un análogo de nucleótido de ARN.
Los ejemplos no limitantes de porciones dé secuencia idóneas incluyen aquellas reconocidas y modificadas por ADNzimas (por ejemplo ADNzimas 10-23; ADNzimas 8-17; "7Z81", "7Z48" y "7Q10" . ADNzima ligasas; ADNzimas MUV1G" fptoinversión díijaéro timina, ADNzimas MDAB22" formando enlace carbono-cárbonp; y derivados dé los mismos) , ribozimas (por
ejemplo ribozimas. de martillo; . ribozimas homodiméricas, ribozimás heterodiméricas; y derivados de los mismos)/ y MAzimas (ver, por ejemplo, MNAzimas descritas en la publicación de la patente PCT números WO/2007/041774, WO/2008/040095 y: WO2008/122084, y publicación de la patente E.U.A relacionada números 2007-0231810, 2010-013.6536, y 2011-0143338; cada una de la cuales se incorpora en. la presente como referencia en su totalidad) .
Los ejemplos no limitantes de porciones de secuencia idóneas incluyen aquellas establecidas en la Tabla l a continuación. .
Tabla 1: Porciones catalíticas de ejempllflcación
cualquier nucleótido complementario a N; (N)x o (N )x - cualquier número de nucleótidos; W .- A o T; R = A, G o AAí rN = Cualquier base de . ribonucÍeótido;.(rN)x - · .;cualquier número de ribonucleótidos; rR - A o G ribonucleótidos; rY - C o 0 ribonucleótidos; M A o C; H = A, C o T; D « G, A ó T
Los ácidos núcieicos catalíticos se ha demostrado que toleran únicamente ciertas modificaciones en el área que
forma el núcleo catalítico (Perreault et al., 1990 Nature 344(6266): 565-7.; Perreault et al., 1991 Biochemistry 30(16): 4020-5; Zaborowska et al., 2Ó02 J Biol Chem. 277(43): 240617-22; Cruz et al., 2004 Chem Biol. Jan;ll(-1):; 57-6; Silverman, 2004 Chem Biol. Jan; 11(1): 7-8). Los ejemplos de secuencias respónsábles para actividad catalítica de ADNzimas se enlistan en la Tabla 2.
Tabla 2: Secuencias de ejemplificaclón para algunas
ADNzimas activas y sus sustratos
Tipo de Secuencia de ADNzima Secuencia de ADNzima sustrato
( ) xTNNNAGCNNN CGR( ) ? (N')x (rN)
8-17
SEQ ID NO: 189 (?·)?
(N)xGGMTMGHNDNNNMGD (N) ? (?')? rR rY
10-23
SEQ ID NO:' 190 (N')x
Para la secuencia ADNzima N es generalmente A, C, T o G o cualquier análogo,' en algunos ejemplos N puede ser ü; para la secuencia de sustrato N ·« A, C, T/U, G , o cualquier análogo ; N' » ..cualquier . nucleótido complementario a N; (N)x o (N')x - cualquier número de nucleótidos; W - A o T, en algunos ejemplos W puede ser ü; R * A, G o AA; rN = cualquier ribónucleótido base; (rN)x » cualquier número de ribonucleótidos; rR ¦ A o G ribonucleótido; rY C o ü ribonucleótido; M ,= A. ó C; H = A, C o T, en algunos ejemplos H pueden ser O; D = G, A o T, en algunos ejemplos D pueden ser ü.
Los . sustratos de polinucleótidos pueden comprender múltiples porciones de secuencia. Las porciones pueden reconocerse y modificarse por un tipo de enzima de ácido nucleico catalítico. Alternativamente, . las porciones de 5 secuencia diferentes dentro del sustrato pueden reconocerse y modificarse por diferentes tipos de enzimas catalíticas de ácido nucleico.
Como se observa anteriormente,., los ..sustratos de polinucleótido de la presente invención comprenden al menos 10 una porción de secuencia capaz de modificación por una enzima de ácido nucleico catalítico. En algunas modalidades, los nucleótidos en la proximidad de. porciórt de secuencia . son nucleótidos de pirimidina. Por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más .nucleótidos precedentes y/o sucesivos (esto és 15 seguido) la porción de secuencia puede ser nucleótidos de pirimidina. Cualquiera uno o más de los nucleótidos de pirimidina pueden ser nucleótidos de citosina.
En: otras modalidades, la porción de .. secuencia . es precedida y/o sucesiva (esto es seguidos) directamente (esto 20 es en secuencia continua) por uno. b. más nucleótidos de pirimidina. Por ejemplo, la porción de secuencia puede ser directamente precedida y/o directamente sucesiva por una secuencia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10 o más nucleótidos de pirimidina. Cualquiera uno o más de los nucleótidos de
pirimidina pueden ser riucleótidos de citosina.
En modalidades adicionales, 1, 2, 3,. 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más nucleótidos dentro de diez nucleótidos.5' (esto es cadena arriba) y/o dentro de diez nucleótidos 3' (esto es cadena abajo) de la porción de secuencia son nucleótidos de pirimidina. Cualquiera uno o más de los nucleótidos de pirimidina pueden ser nucleótidos. de citósina.
Aún en otras modalidades, más que 9, más que 10, o más que .11 nucleótidos del sustrato de · polinucleótido pueden ser nucleótidos de citosina. Por ejemplo, el sustrato puede comprender o consistir' de 10, 11, 12, 13, 14, .15, o más que .15 nucleótidos, y 9, 10, 11 o más que 11 de estos nucleótidos pueden ser nucleótidos de citosina.
Adicionalmente ó alternativamente, menos que 5, menos que 4, menos que 3, o menos que 2 nucleótidos del sustrato de polinucleótido pueden ser nucleótidos de guanina. Por ejemplo, el sustrato puede comprender o consistir de 10, 11# 12, 13, 14, 15, o más que 15 nucleótidos, y 4, 3, 2, l o ninguno de estos nucleótidos pueden ser nucleótidos 'de guanina.
No existe limitación particular respecto a la longitud de un sustrato de polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, el sustrato puede ser menor que.100, 75, 50, 40, 30, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11,
10, 9, 8, 7, 6, o 5 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, el sustrato puede ser entre 5 y 30, 10 y 15,. 10 y 20,. 10 y. 25, 10 y 30, 16 y 23; .16 y 21, 16 y 18, 18 y 21, 18 y 23, or 21 y 23 nucleótidos. en longitud.
Un sustrato de polinucleótido de la presente invención puede diseñarse para poseer una temperatura de fusión especifica (Tm) como se calcula usando la regla Wallace, por la cual Tm = 2eC(A+T) + 4eC(G+C) (ver Wallace et al.., (1979) Nucí. Acids Res. 6.(11) : 3543-3558) .. En ciertas modalidades, el sustrato puede ser reconocido y catalíticamente modificado por una MNAzima, y la Tm.de las bases que son. enlazadas por los brazos del sustrato partzima de la MNAzima pueden sér entre alrededor de 52°C y alrededor dé 76eC, entre alrededor de 55°C y alrededor de 75°C, entre alrededor de 60°C y alrededor de 70°C, entre alrededor de 65°C y alrededor de 70°C, entre alrededor de 64eC y 68eC, o- entre 64°C y 70°C (como se calcula usando la regla Wallace).
En otras modalidades, el sustrato puede ser reconocido y catalíticamente modificado por una. MNAzima o una ADNzima,. y la Tm de las , bases que son enlazadas . por los brazos de sustrato partzima de la MNAzima pueden ser entre 68:eC y 90°C, entre 66°C y 76°C, entre 68°C y 76°c,. entre 64*C y 70eC, entre 70°C y 76°^ entre 70°C y 759C^ entre .72°C y 76°C, 52eC, 58°C, 64*C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C, o 76°C-.
A modo de ejemplo no limitante únicamente, un sustrato de pplinucleótido d la presente invención puede comprender una secuencia definida en cualquiera de una o más de SEQ ID NOs: 25-27, 29^30, 72-90, o 172-175. En ciertas modalidades, él sustrato de polinucleótido puede consistir de una secuencia definida e cualquiera una o más de SEQ ID NOs:-25-27, 29-30, 72-90, o 172-175.
En algunas modalidades, un sustrato de polinucleótido de la presente invención puede comprender una secuencia definida po SEQ ID NO: 28. En otras modalidades, el sustrato de
polinucleótido puede consistir de una secuencia definida por SEQ ID NO: 28.
En algunas modalidades, los sustratos de polinucleótido de la presente invención son capaces de modificación : catalítica por una MNAzima que comprende dos: partzimas de oligonucleótido. Las secuencias del sustrato de polinucleótido y las partzimas de oligonucleótido pueden ser cualquier combinación especifica de tres secuencias (como se representa por SEQ ID NOs) que se muestran en la Tabla .'€, 8,
En otras modalidades, los sustratos de polinucleótido de la presente invención son capaces de modificación catalítica por una ADNzima. Las secuencias del sustrato -de polinucleótido. y ADNzima .pueden ser cualquier par especifico
···:·· · 61
de secuencias (como es representado por SEQ ID NOs) que se muestra en la Tabla 15..
Los sustratos de polinucleótido. de la presente invención pueden contener una ó más sustituciones tal como análogos, derivados, bases modificadas o alteradas, ribonucleótidqs, alteraciones de la columna vertebral de azúcar o fosfató, varias eliminaciones, inserciones, sustituciones, duplicaciones u otras modificaciones, ó cualquier combinación de estas, bien conocidas para aquellas · personas expertas en la técnica.
Los ejemplos no limitantes dé adiciones o sustituciones incluyen fosforamidita LNA,. 4-acetilcitidina, . 5- (carboxihidroxilmetil)uridina, . 2 ' -O-metilcitidina, .5-carboximetilaminometil tiouridina, dih.idrouridina, 2'-Q-metilpseudouridiná, beta D-galactósilqueosina:, 2'??-metilguanosina, inosina, N6<-isbpenteniladenosina, i-métiladenosina, 1-metilpseudouridina, l-metil<guanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metiladeno'sina, 2-metilguanosiná, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina,. N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-methoxiaminometilT2-tiouridina, beta D-manosilmetiluridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metbxiuridina, 2-metiltio-N€-isopenteniladeñósiria, . N- (
metiltiopurina'6-il)carbamoil)treonina, N-((.$-betá-
ribofuranosilpurina-6-il)N-metil-carbamoil) treohina, ácido uridiná-5-oxiacetico metiléster, ácido uridina-5-oxiacetico (v) , wibutoxosina, pseudouridina, queosina, 2-tiocitidiija, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, . '.·..4-tiouridina, 5-metiluridina, N- ( (9-beta-p-ribofuranosilpurina-€-il)carbamoii)treoniha, 2'-0-p?ß??-5-????ß???G?¾1?3, ..· 2'-0-metiluridina, wibutosina^- 3- (3-amihOT3-carboxipropil)uridina, beta D-arabinosir uridina, y beta D-arabinosil timidina. .
Los ejemplos no limitantes de derivados incluyen ácidos nucleicos .o riucleótidos funcionalmente equivalentes, incluyendo cualquiera de las moléculas de fusión producidas integralmente (por ejemplo por medios recómbinantes) o postsíntesis agregada (por ejemplo por medios químicos). Tales fusiones pueden comprender oligonucleótidos de la invención con ARN o ADN agregados al mismo . o conjugados a un polipéptido (por ejemplo puromicina u otro polipéptido) , una molécula pequeña (por ejemplo psoralen) , un mícroportador; o nanóportador, o un anticuerpo.
Los ejemplos . no limitantes de análogos incluyen compuestos que tienen una estructura fisica qu s relaciona a una molécula o residuo de ADN ó ARN, . y puede ser capaz de formar un enlace de hidrógeno con un residuo de ADN o ARN análogo del mismo (esto es capaz de recocer con un residuo de ADN o ARN o un análogo del mismo para formar una base-par),
péro tal enlace no se requiere para que dicho compuesto sea abarcado dentro del término "análogo". Tales análogos pueden poseer diferentes propiedades químicas y biológicas para el residuo ribonucleótido o desoxlrrlbonucleótido al cual están estructuralmente relacionados. Los residuos metilados, yodados, bromados., o biotilinados son ejemplos de análogos. Las AD zimas activas han sido descritas las cuales contienen análogos de nucleótido, incluyendo desoxilnosina, C-5-immidazol desoxiuridina, · 3-(aminopropinil)-7-déaza-dATP, 2'-O-metil RA, 2' 0-metil cap. Otros análogos también podrían s r compatibles con actividad catalítica dé ADNzimas y MNAzimas. La alteración de un ácido nucleico con actividad catalítica, por ejemplo por sustitución de una base por otra, por sustitución de un análogo por una base, o alteración del componente de azúcar o columna vertebral fosfodiéster, puede ser simple para la persona experta en la técnica. Por ejemplo, pueden hacerse alteraciones durante la síntesis, .o por modificación de bases especificas después de la- síntesis. La prueba empírica de · los ácidos nucleicos catalíticos incorporando alteraciones, tal como cambios de base o análogos dé. base permite la evaluación del impacto de las secuencias alteradas, o análogos específicos, en actividád catalítica. Los análogos de las bases A, C, G, T y ü se conocen en la técnica, y ún subcbnjunto se enlista en. la Tabla 3.
Tabla 3: Análogos de nucleótido de ejemplificación
Los sustratos, de polinucleótido de la presente invención pueden incorporar entidades adicionales tal. como ácidos nucleicos etiquetados/ nanoparticulas,: raicroparticulas, proteínas, anticuerpos, AfcN, ADN, análogos de ácido- nucleico, proteínas, glicoproteinas, lipoproteinas, péptido ácidos nucleicos, ácidos, nucleicos cerrados, quimeras . péptido-ácido
nucleico, o cualquier combinación de los mismos. Las nanoparticulas pueden ser nanoparticulas doradas.
Los sustratos de pollnucleótido de la presente invención pueden ser catalíticamente modificados por una enzima de ácido nucleico catalítico. Los ejemplos no limitantes fíie modificaciones catalíticas potenciales incluyen escisión de áéidos nucleicos, ligación de ácidos nucleicos, fosforilación de ácidos nucleicos, nivelación de ácidos nucleicos, adenilación de amin ácidos, síntesis dé cofactor, polimerización de ARN, polimerización dirigida a la plantilla, conjugación ARN-protein , reacción aldol, oxidación de alcohol,, reducción de aldehido,, síntesis de nucleótido de purina y pirimidina, alquilación, síntesis de amida, síntesis de urea, formación de enlaces dé péptidp, síntesis peptidil-AR , transferencia de acil, aminoacilación, hidrólisis de carbonato, alquilació de fosfórotioato, metalación de porfirina, formación dé enlaces, carbono-carbono, formación . de nano partícula Pd, isomeriz.ación de bifenilo, formación, de enlaces de éster, formación de enlaces amida, deglicosilación de ADN, fotoreversión de díméro timina y escisión de fosforamidata.
En ciertas aplicaciones, puede ser deseable, detectar producto/s . originándose de modificación catalítica de sustratos de pollnucleótido de la presente invención. Es:to
puede alcanzarse usando cualquier número de técnicas estándar conocidas en la técnica.
Por ejemplo, el sustrato puede comprender una porción detectable y uña porción extintora, en donde bajo modificación de dicho sustrato por un ácido nucleico catalítico, se incrementa o disminuye un efecto detectable proporcionado por . dicha porció . detectable.· El efecto detectable puede ser detectado por espectroscopia de fluorescencia, resonancia de plasinón de superficie,
• ? . · · · . . ·
espectroscopia dé masa, RMN, resonancia de giro de electrón, espectroscopia de fluorescencia de polarización, dicroismo circular, inmunoensayo, *· cromatografía, radiometría, electroquímico, fotometría, . ganimagrafia, métodos electrónicos, ÜV, espectroscopia infrarroja o dé luz visible, métodos eñzimáticos o cualquier combinación de los mismos.
Adicionalmente . o alternativamente, el producto/s originándose de modificación catalítica de sustratos de polinucleotido de . la presente invención puede detectarse en la base del tamaño (por ejemplo por. electroforeáis estándar), secuenciado. de ácido nucleico, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, quimioluminiscencia, poténtiometria, espectrometría de masa, resonancia de plasmón, colórimetria, polarimetria, citometria de flujo, escanometria, y secuenbiado de ADN o cualquier jiombinación de
los mismos.
Los productos de ácido nucleico originándose de la modificación catalítica de los sustratos de polinucleótidó. de la presente invención pueden amplificarse para ayudar en la detección del uso de técnicas tales como, por ejemplo la reacción de cadena polimerasa (PCR) .
Los sustratos de polinucleótidó de la presente invención pueden., reconocerse y modificarse por enzimas catalíticas de ácido nucleico (por ejemplo MNAzlmas) diseñadas para detectar un objetivo que difiere del sustrato para ser modificado p r la enzima. Por consiguiente, los sustratos de polinucleótidó de la presente invención pueden sér sustratos "genéricos" o "universales" que son reconocidos . por y accionados catalíticamente por una pluralidad de enzimas catalíticas de ácido nucleico (por. ejemplo una pluralidad de MNAzlmas), cada una de las cuales puede reconocer un objetivo diferente» El uso. de tales sustratos puede facilitar el desarrollo de los ensayos separados para detección, identificación o cuántificación de una amplia variedad de objetivos usando enzimas nucleicas catalíticas que reconocen un sustrato universal. Los sustratos universales pueden ser cada uno independientemente etiquetado» con una o más etiquetas, ¾n ciertas . modalidades, las etiquetas . independientemente etiquetadles pueden usarse para etiquetar uno o más sustratos
universales para permitir la detección independiente o simultánea de una variedad de objetivos usando MNAzimas. Por ejemplo, una serie de sustratos universales puede usarse en una reacción multiplex permitiendo detección simultánea de objetivos múltiples. .
Los sustratos de polinucleótidos de la presente invención pueden proporcionarse enlazados, adjuntos o atados a un soporte, sólido. o ihsolüble para su uso en varias aplicaciones (por ejemplo cascadas enzimáticas o cualquier otra de las cascadas de tránsducción de señal) . El soporte puede ser un material insoluble, p una matriz que retenga el sustrato y la excluya de moverse libremente en la mayor parte de la mezcla de reacción. Tales soportes son conocidos en la técnica por inmovilizar o localizar sustratos, incluyendo objetivos de ácido nucleico. El destinarlo experimentado apreciará que él soporte. pueda, seleccionarse de una amplia variedad de matrices, polímeros,, y similares en una variédad de formas incluyendo camas de perlas convenientes para su uso en microensayos, asi como también otros materiales compatibles con las condiciones de reacción. En ciertas modalidades préferidas, el soporte puede ser un material plástico., tal como camas de perlas o láminas de plástico, o del pocilio: o tubo en el cual se .conduce un ensayo particular. En ciertas modalidades, el soporte puede ser un microportador o un
nanoportador. La adjunción del sustrato al soporte puede designarse de manera . que bajo modificación (por ejemplo escisión) del sustrato por el ácido nucleico catalítico (por ejemplo MNAzima), una porción del sustrato modificado se mantenga adjunta. al soporte, mientras la otra esta libre para moverse en la mayor parte de la mezcla de reacción, lejos de la porción restante adjunta.
2, . Métodos de éjemplificación
Los sustratos de polinucleótido dé la presenté invención pueden usarse en cualquier número de aplicaciones potenciales utilizando ácidos nucleicos catalíticos que reconozcan/modifiquen los. sustratos.
Por ejemplo, los sustratos pueden usarse en aplicaciones que implican ADNzimas '(por ejemplo ADNzimas 10-23; ADNzimas 8-17; ADNzima ligasss "7Z81", "7Z48" y "7JQ10"; "ÜVlC" ADNzimas fotoreversión de dimero tintina, ADNzimas formadorés de enlace carbono-carbonowDAB22"; y derivados de los mismos), ribozimas (por ejemplo ribozimas martillo; ribozimas homodiméricas, ribozimas heterodiméricas; y derivaciones de las mismas), y/o MNAzimas.
En ciertas modalidades de la invención, los sustratos pueden usarse como .sustratos para MNAzimas.. Las característica de MNAzimas y varias aplicaciones' usando
MNAzimas se describen. a detalle en publicación de la patente PCT números WO/2007/041774, WO/2008/040095 y WO2008./122084, y publicación de la patente relacionada E.U.A. números 2007- 0231810, 2010-0136536, y 2011-0143338 (los contendios de cada uno de los documentos que se incorporan en la .presente como referencia en su totalidad).
. Las MNAzimas son capaces de auto ensamblar de dos a más componentes de oligonucleótido, también referidos en la presente como partzimas. Los oligonucleótidos partzima auto- ensamblan en la presencia de un facilitador de auto ensamble MNAzima para formar una MNAzima. Las MNAzimas son por lo tanto, enzimas de ácido nucleico catalíticamente activas. En algunas modalidades, la ' presencia . de una MNAzima puede detectarse, y es indicativa de la presencia de un objetivó, ya que la MNAzima se forma únicamente en la presencia del objetivo., e donde el objetivo comprende el facilitador de ensamblé.
En modalidades preferidas, las estructuras de MNAzima se bsán en una o más ADNzimas y/o ribozimas. Las más preferidas son aquellas estructuras de MNAzima que se basan en una
estructura de ANzima particular. Las estructuras presentemente preferidas se basan en ADNzimas incluyendo las ANzimas 10-23 y 8-Í7. En varias modalidades" las MNAzimas comprenden ya . sea. bases ribonucleótido o bases
desoxirribonucleótido o ambas. En modalidades más preferidas, una estructura de MNAzima se basa al menos en parte en la estructura de una ADNzima. En otras modalidades preferidas, las MNAzlmas comprenden al menos algunas bases desoxirribonucleótido o análogos, de los mismos. En modalidades más preferidas, el núcleo catalítico de una MNAzima comprende una o. más bases desoxirribonucleótido o análogos de las mismas. Aún en modalidades más preferidas, una o más bases desoxirribonucleótido o análogos de las mismas están implicadas en la catálisis de un . sustrato. En otras modalidades, al menos una base desoxirribonucleótido, o su análogo, en el núcleo catalítico mejora la actividad catalítica. Aún en otras modálidades, hay un requisito estricto para al menos una base dé desoxirribonucleótido, o su análogo, en el núcleo catalitico.de la MNAzima para.que la catálisis ocurra en una tasa razonable, relativa a. la de la MNAzima comparable con la base desoxirribonucleótido presente.
Las MNAzimas pueden contener una o más . sustituciones tales como análogos, derivados, bases modificadas ó alteradas, ribonucleótidos, alteraciones de la columna vertebral fosfato o azúcar, varias eliminaciones, inserciones, sustituciones, duplicaciones. u . otras modificaciones, .cualquier combinación de estas, bien
conocidas para aquellas personas expertas en la técnica. Tales modificaciones, sustituciones, eliminaciones, inserciones, etc. pueden hacerse en los brazos de sensor y/o sustrato y/o en las porciones de núcleo catalítico, tal como la molécula qué retiene actividad catalítica. Las sustituciones y modificaciones a los brazos que- enlazan al sustrato o facilitador, de ensamble pueden ser bien toleradas y de hecho son la base de permitir la confección de las moléculas a diferentes sustratos/facilitadores de ensamble* Por ejémplo, la modificación de los brazos de sensor permitirá la confección para diferentes facilitadores de ensamble, mientras que la modificación de los brazos de. sustrato permitirá la confección para diferentes sustratos.
La MNAzima puede comprender ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, incluso ambos. Las . MAzimas que comprenden al me os uno y más preferiblemente, todos, oligonucleótidos de componente .desoxirribonucléótido de prefieren. También se prefieren las MNAzimas que comprenden al menos una base desoxirribonucléótido, o su análogo, dentro del núcleo catalítico de la MNAzima. Incluso más preferidas son aquellas modalidades donde tal base se requiere para la actividad catalítica; ··>
El ensamble y desensamble de MNAzima también puede controlarse cambiando el microambiente. Los ejémplos de tales
cambios incluyen, pero no se limitan a, temperatura, tipo de catión divalente y concentraciónt concentración de sal, pH, aditivos, y la presencia o ausencia de; componentes críticos esenciales para ensamble y/o actividad de una MNAzima activa. Por consiguiente, las MNAzimas desensambladas o parcialmente ensambladas pueden prevenirse de ensamblarse en una MNAzima catalíticamente activa en la presencia de un facilitador de ensamble modulando el microambiente, así proporcionando un "interruptor molecular".
Un ejemplo básico de una estructura MNAzima .se representa en la Figura 1. La estructura mostrada comprende partzima A y partzima B, los brazos sensores (i) los cuales tienen base-emparejada con una molécula de facilit dor de ensamble MNAzima, por ejemplo un objetivo ADN o ARN. Las Partzimas. A y B interactuando con el facilitador de ensamble han permitido que los núcleos catalíticos parciales (iii) entren en proximidad y por lo tanto formen un núcleo catalítico sencillo. Los brazos de sustrato (ii) de la MNAzima han i ter ctuado con y forman pares de . bases . con . un sustrato, representado aquí como un Sustrato Reportero. De este modo la MNAzima se ha auto-ensamblado y este proceso se facilita; a través de la presencia de la molécula de facilitador, de ensamble MNAzima. En ía ausencia de facilitador de ensamble, rio se formará MÁzimá. La modificación (éri éste - caso,
escisi n) de un sustrato de polinucleótido. dé la presente invención se cataliza por el núcleo catalítico de la MNAzima en el Sitio de Modificación MNAzima (por ejemplo Sitio de Escisión dentro del sustrato denotado por. una cruz. (X) ) .. El sustrato de polinucléótido en esta modalidad particular comprende una porción detectable que tiene una señal detectable, por ejemplo fluoróforo F, y una porción extintora Q que tiene un efecto de extinción en la señal F detectable a través de la acción del extintor Q. Bajo escisión en el Sitio de Escisión MNAzima, hay un. incremento sustancial en la señal detectable, aqui fluorescencia, que puede fácilmente
detectarse y cuantificarse si se desea.
La Figura 1 puede además entenderse para representar un ejemplo de un método básico del uso de MNAzimas para detectar un objetivo, que en algunas modalidades comprende un facilitador de ensamble. Más específicamente, la partzim A · y partzima B se muestran en la igura 1, cada una comprende una porción de brazo sustrato (ii),. porción de núcleo catalítico (iii), y uña porción de brazo sensor (i) .. En la présencia de un objetivo, las porciones de brazo sensor de la . partzima A y partzima B pueden, comenzar a hibridar. a, y
emparejar base con porciones complementarias, del . objetivó, por ejemplo una Secuencia ADN o ARN. Bajo el contacto del objetivo en esta tendencia, la MNAzima auto-ensambla formando
un núcleo catalítico que puede modificar un sustrato qué está enlazado por los brazos del sustrato. Preferiblemente la presencia de la MNAzima se detecta a través de la detección o medición de su actividad catalítica. Los brazos dé sustrato de la MNAzima de este modo ensamblada pueden acoplar un sustrato de polinucleótido de la presente invención a través d la interacción de las secuencias complementarias en los brazos de sustrato y el sustrato. Una vez que el sustrato está tan acoplado con los brazos · de sustrato, el núcleo catalítico puede promover la modificación (por ejemplo escisión) del sustrato, que puede en turno medirse o detectarse, directamente o indirectamente.
La persona expérta apreciará fácilmente que los métodos descritos en la présente pueden implicar la amplificación de un objetivo antes, durante o después de la actividad catalítica de MNAzima.. Tal amplificación, de objetivo ; encuentra aplicación particular en modalidades de la presente invención donde la cantidad objetivo prevista1 a detectar, identificar o cuantificar es de tal cuantía en cuanto a proporcionar una señal que puede de otro modo no ser detectable. Tal amplificación puede comprender uno o .más de: reacción de cadena polimerasa (PCR).·, . amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) , amplificación isotérmica mediada de rizo (LAMP) , amplificación circulo rodante
(RCA) , amplificación mediada de transcripción (TMA) , replicación de secuéncia auto sostenida (3SR) , amplificación basada en secuencia de ácido nucleico. (NASBA) , reacción de cadena polimerasa .de transcripción inversa (RT-PCR). .
La Figura 2 proporciona aplicaciones de ejemplificación de métodos para detección de objetivo usando. MAzimas. La estrategia 1 ejemplifica MNAzimas adaptádas para detección de objetivos incluyendo ÁDN, ARN y proteínas. Como se describe anteriormente (ver descripción de la Figura 1) una MNAzima compuesta de dos oligonucleótidos separados con secuencias de reconocimiento para tanto un objetivo como una forma de sustrato cuando los oligonucleótidos reconocen y enlazan un objetivo. El sustrato, por ejemplo el sustrato reportero, es modificado por la acción catalítica de la MNAzima y causa la generación de una señal detectablé, ya sea directamente (Estrategia 1), durante o después de la amplificación objetivo (Estrategia 2) o por medio .de una cascada de señal (Estrategia 3) . É algunas modalidades, tanto el objetivo como la amplificación' de señal ocurren simultáneamente o secuencialmente.
La estrategia 2 de. la Figura.2 ejemplifica el uso de una MNAzimá. adaptada para monitorear la acumulación, de amplicones durante, o seguido, de amplificación in vitro de objétivos ácido nucleico. Las técnicas para amplificación in vitro de
secuencias de ácido nucleico se conocen en la técnica. Éstas incluyen técnicas mediadas por una poiimerasa ADN, tal como la reacción de cadena poiimerasa ("PCR") (ver, por ejemplo, Patente de E.Ü.A. No. 4,683,202; Patente de E.Ü.A. No. 4;68.3*Í95; Patente de E.Ü.A. No. 4,800/159; Patente de É.U.A. No. 4,965,188; Patente de E.Ü.A. No. 5; 176; 995), amplificación de . desplazamiento . de- hebra . (WSDA') , amplificación por circulo rodante PRCA"), reacción de. cadena poiimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) y. amplificación isotérmica mediada . de rizo ("LAMP").. Otras técnicas, de amplificación de objetivo son mediadas por una poiimerasa de ARN, por ejemplo amplificación mediada de transcripción (VTMA"), replicación de secuencia auto sostenida ("3SR") y amplificación basada en replicación de secuencia de ácido nucleico ("NASBA") . Los productos de . amplificación ("amplicónes") producidos por PCR, RT-PCR, SDA, RCA y LAMP están compuestos de ADN, mientras que los amplicones de ARN son producidos por. MA, 3SR y NASBA..
Con referencia adicional a la estrategia 2 de la Figura; 2 un NÁzima que., reconoce y modifica un-, sustrato de ppiinucleótido dé la presente invención puede usarse en conjunto con métodos de amplificación de objetivo que incluyen, por ejemplo, los PCR, RT-PCR, . SDA, RCA, LAMP, TMA, 3SR y NASBA anteriormente mencionados. La acumulación de
amplicones producidos por PCR usando ya sea relaciones de cebador asimétrico o simétrico puede monitorearse usando MNAzimas. Los Ejemplos 1, 2, 4, 6, 8 y 9 dé la presente especificación demuestran la detección de amplicones PCR en tiempo real utilizando MNAzimas que cataliticamente modifican varios sustratos de polinucleótido de la presente invención.
De nuevo refiriéndonos a la estrategia 2 dé la Figura 2, un objetivo de ácido nucleico puede amplificarse de acuerdo con un procedimiento para amplificar ese ácido nucleico (esto es ADN o ARN) . Preferiblemente, se usan métodos estándar de amplificación in vitro. Los amplicones generados durante la amplificación pueden servir como facilitadores de ensamble de objetivo para un .MNAzima. La actividad MNAzima,. que está hecha detectable. por modificación de un . sustrato de polinucleótido de la presente invención por la MNAzima, es indicativa de la presencia del objetivo. La persona experta apreciará que los ensayos de esta naturaleza puedan conducirse en un contenedor sencillo bajo condiciones que permiten tanto la amplificación de ácido nucléico objetivo como el ensamble . de MNAzima y actividad catalítica. Adicionalmente o alternativamente, . pueden conducirse subsecuente, en. puntos de tiempo a lo largo de, la amplificación de ácid<> nucleico objetivo, removiendo muestras al final o durante el curso de las reacciones de
amplificación.
La estrategia 3 de la Figura 2 muestra un panorama general de un método de uso de una MNAzima para iniciar la amplificación dé. una señal a través del uso de una cascada de señal. El ejemplo 3 de la presente especificación, demuestra la detécción directa isotérmica dé un objetivo utilizando MNAzimas que catalíticamente modifican varios sustratos de polinucleótido de la presenté invención, que podrían usarse para iniciar una cascada de señal*.
El destinarlo experto · apreciará los. métodos, o protocolos que combinan amplificación de objetivo con actividad de ácido nucleico catalítico puede requerir condiciones de reacción especifica (por ejemplo aquellas descritas en los Ejemplos 1, 2, , 6, 8 . y 9. de la presente especificación) . Preferiblemente, las condiciones de reacción son compatibles tanto con actividad polimerasa (para amplificación) , como modificación de ácido nucleico catalítico de un sustrato (para detección} < . Los protocolos para determinar las condiciones para actividad catalítica concurrente y actividad polimerasa a temperatura alta, tal como durante PCR, han sido descritas para ADNzimas. La influencia de factores incluyendo longitud del brazo ADNzima, solución amortiguadora, temperatura, concentración de ión . di alente y efectos de aditivos se conocen en la técnica. Las enzimas de ÁDN son
adecuadas para su uso en combinación con estrategias de amplificación in yitro. Por ejemplo, no son reversiblemente desnaturalizadas por exposición a temperaturas altas durante la amplificación.
En ciertas modalidades, un sustrato de polinucleótido de la presente invención capaz de reconocimiento y modificación por una MNAzima puede enlazarse, adjuntarse o atarse a un soporte sólido o insoluble. Por ejemplo, con referencia a la Figura 3, Panel (i), un método de ejemplificación para detectar objetivos usando una MNAzima y un sustrato de polinucleótido de la presente invención anclado a un soporte sé representan.. En esta modalidad, el sustrato es preferiblemente un . sustrato con una porción detectable que comprende una señal detectable, por ejemplo un . flupró oro, y una porción extintora que. desvanece o elimina la señal detectable mientras la porción detectable y la porción extintora del sustrato se mantienen én proximidad cercana; por ejemplo, hasta que el sustrato es modificado (por ejemplo por escisión). El sustrato se adjunta a un soporte. Preferiblemente el soporte es un material insoluble, o una matriz que retiene el sustrato y lo excluye . dé moverse libremente en · la mayoría de la mezcla de reacción. La adjunción del sustrato, al soporte puede designarse de manera que bajo la modificación (por ejemplo por escisión) del
sustrato por la MNAzima, ya sea la porción detectable o la porción extintora, pero no ambas, se mantenga adjunta al soporte, mientras la otra es libre de moverse en la mayoría de la mezcla de reacción, lejos de la porción que se mantiene adjunta; Asi, e un ejemplo de escisión, la señal detectable vastamente incrementa a medida que la porción extintora y la porción detectable se separan bajo éscisión. En la modalidad mostrada en.la Figura 3, Panel (i), la porción detectable que contiene fluorófóro se mantiene adjunta después de la escisión. Esto tiene el beneficio de pérmitir la localización de la señal en el soporte pero en ciertos ejemplos, el flubróforo/s puede liberarse en la solución. En una modalidad adicional donde, por ejemplo, ocurre la ligación, el extintor puede estar ligado a un fluorófóro asi disminuyendo la señal detectable.
En ciertas modalidades, los sustratos universales múltiples pueden atarse a un soporte sólido en diferentes posiciones para :proporcionar una configuración de sustrato. Con referencia a la Flgnxa 3 Panel (iij, dos sustratos pueden adjuntarse en posiciones definidas en una superficie sólida. Cada sustrato universal puede escindirse únicamente por una MNAzima formada en la presencia de una. molécula de facilitador de ensamble MNAzima especifica . (por ejemplo objetivo 1 u objetivo 2) y la señal puede, localizarse por el
posiciónamiento del sustrato en la superficie (posición 1 o posición 2), de este modo permitiendo la definición especifica de diferentes facilitadores de ensamble. En tales modalidades los sustratos universales atados pueden todos etiquetarse con .el mismo fluorófóro. En otras modalidades los sustratos universales atados pueden etiquetarse con diferentes fluoróforos. La estrategia descrita en la Figura 3 (ii) puede extenderse para crear configuraciones dé sustrato universal con muchos diferentes sustratos adjuntos en posiciones definidas -en una superficie sólida. En tales modalidades el incremento del número de sustratos universales que están disponibles para su USQ en configuraciones pueden proporcionar una ventaja permitiend la creación de configuraciones más complejas. Tales configuraciones universales de sustratos universales pueden tener utilidad para su uso en análisis áltamente multiplexados de analitos objetivo. La presente invención proporciona sustratos universales adicionales con carácteristicas que pueden aumenta la función de actividad catalítica que puede ser útil en mejorar; la capacidad para realizar en gran medida análisis más complejo usando MNAzimas. .
En ciertas modalidades, un sustrato de polinucleótido de la presente . invención puede reconocerse y modificarse por una MNAzima para proporcionar un facilitador de . ensamble,
componente . facilitador de ensamble, o partzima.. para una segunda MNAzima diferente.
Con referencia a la Figura 4, una MNAzima de inicio (Mt) puede formarse en la presencia de un objetivo (T) . La MNAzima de inicio (Mt) escinde un (primer) sustrato de polinucleótido de ia presente invención (SI) para, crear un primer componente, facilitador de ensamblé (Slf),. que dirige la formación de una primera MNAzima de cascada (MNAzima M¿1 de cascada). En este ejemplo la primera MNAzima (Mcl) de cascada comprende dos partzimas y tres componentes de facilitador de ensamble diseñados Fl, F2 y Slf. . Mcl puede escindir un sustrato adicional (S2) de este modo liberando un facilitador de ensamble de componente adicional (S2f) , qué dirige la formación de una segunda MNAzima de cascada (MNAzima Mc2 de cascada) . En este ejemplo la segunda MNAzima (Mc2) de cascada comprende dos partzimas y tres componentes de facilitador de. ensamble diseñados F3, F4 y S2f. Mc2 puede entónces escindir- más del' primer sustrato (SI) de este modo creando más del primer, componente de facilitador de ensamble (Slf) . Esto lleva a la formación de la primera MNAzima de cascada adicional. (Mcl) de este modo formando una cascada de amplificación. El destinarlo experto reconocerá qué la Figura 4 muestra tres componentes de facilitador dé ensamblé se requieren para facilitar el ensamble de MNAzima activa.
Más o menos componentes de facilitador de ensamble podrían utilizarse en un esquema similar.. ·
La . persona experta fácilmente entenderá que los métodos descritos en la presente pueden optimizarse usando una variedad de parámetros experimentales para optimizar la detección, identificación y/o cuantificación de un objetivo, y/o el reconocimiénto y modificación · catalítica de . un sustrato de polinucleótido de la presente invención . por un ácido nucleico catalítico (por ejemplo una MNAzima o una AQNzima) . Los parámetros experimentales particulares que se optimizan, y el nivel de tal optimización, dependerá del método particular siendo- empleado y el objetivo particular y/o sustrato implicado. Tales parámetros incluyen, pero no sé limitan a, tiempo, temperatura, concentración de sales, detergentes, cationes y otros reactivos incluyendo pero no limitado. a dimetilsulfóxido. (DMSO) , y longitud, complementariedad, contenido GC y punto de fusión (Tm). de ácidos nucleicos.
En algunas modalidades, por ejemplo aquellos métodos que implican la detección de variación dé . secuencia y/o detección de ADN metilado, los parámetros experimentales, y preferiblemente incluyendo la temperatura a la cual el método se realiza, pueden optimizarse para discriminar entre el enlace de un ácido nucleico de componente MNAzima a un
objetivo ácido nucleico que comprende ó no una. variación de secuencia o un nucleótido metiládo, respectivamente. La temperatura a lá cual tales métodos pueden realizarse puede estar en el intervalo dé alrededor de 20°C a. alrededor de 96°C, alrededor de .20°C a alrededor de 75°C, 20% a alrededor dé 60°C o alrededor de 20 a alrededor de 55°C.
En algunas modalidades, las reacciones optimizadas para la práctica de los métodos del uso de MNAzimas y ADNzimas se proporcionan en la presente. En tales reacciones optimizadas, la actividad catalítica sé. incrementa hasta 10, 20, o 30% arriba de las reacciones no optimizadas.. Las condiciones de reacción más preferidas mejoran la actividad catalítica por al menos 35%, o 40%, y preferiblemente hasta 50% o más. Aún en modalidades más preferidas, las reacciones optimizadas tienen un incremento de actividad catalítica de más dé 50%, y hasta 66%, 75% o incluso 10.0%. Aún en modalidades más preferidas, un método de reacción completamente optimizado ofrecerá 100, 200 o incluso 300% o más incremento en la actividad catalítica. Otras condiciones de reacción preferidas pueden mejorar lá actividad catalítica por hasta 1,000% o más sobre otros métodos practicados con condiciones de reacción no. optimizadas.. Una condición de reacción altamente preferida para optimiza los métodps proporcionados en la presente es la inclusión . dé ciertos
cationes divalentes. La actividad catalítica de la mayoría de las enzimas de ácido nucleico puede ser influenciada en una tendencia dependiente de concentración por la concentración de cationes divalentes. Las reacciones optimizadas preferidas son optimizadas para uno o más de Ba2+, Sr2*, Mg2+, Ca2+, Ni2V Co2+, Mn2+, Zn2\' y Pb2\
En algunas modalidades,, el usó de sustratos de póiinucleótido dé. la. presente invención en. ensayos con enzimas de ácido nucleico (por ejemplo MNAzimas o ADNzimas) puede incrementar u efecto detectable (por ejemplo un incremento o una disminución en señal fluorescente) originándose de la modificación catalítica del sustrato pór la enzima arriba del efecto detectable ganado usando un sustrato conocido en, el mismo ensayo bajo las mismas condiciones. Por; ejemplo, el efecto detectable puede ser incrementado por más que 2%, más que 3%, más que 4%, más que 5%, más que 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, o más que 50%. comparado al sustrato común. En ciertas modalidades, el efecto detectable es una señal fluorescente..
En algunas modalidades,-, los métodos de . la invención implican el uso dé un sustrato de póiinucleótido. para uria MNAzima en corabináción con una MNAzimá que comprende dos partzimas de oligonucleótido. Las secuencias del sustrato de
polinucleótido y las partzimas de ollgoñucleótido pueden ser cualquier combinación especifica de tres secuencias (cómo es representado por SEQ ID NOs). que se muestran en la Tablá 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 y/o 24.
En algunas modalidades, los métodos de ...la invención implican el uso de . un sustrato de polinucleótido en combinación con una ADNzima. Las secuencias del sustrato de polinucleótido y ADNzima puede ser cualquier par especifico de secuencias (como es representado por SEQ ID NOs) que se muestra en la Tabla 15.
3. Kits
También se proporcionan- en la présente los kits '. que comprenden uno o más sustratos de polinucleótido de la présente invención.
Los kits pueden comprender reactivos adicionales para la práctica de los métodos descritos en; la presente. Por ejemplo, los kits pueden comprender, uno o. más ácidos nucleicos catalíticos capaces de recónocer y modificar el sustrato. Los ejemplos no limitantes de ácidos nucleicos catalíticos idóneos incluyen ADNzimás (por ejemplo ADNzimas 10-23; ADNzimas 8.-17; ligases ADNzima W7Z81", "7Z48" y "7Q10"; ADNzimas fotoreversión de dimero timina "UVÍC'% ADNzimas que forman enlace carbono-carbono "DAB22"; ;.y
derivados de los mismos)·, ribozimas (por ejemplo ribozimas martillo; ribozimas homodiméricas, ribozimas heterodiméricas; y derivaciones de los mismos), y MNAzimas.
Los kits de la presente invención pueden ser kits "compartimentados". ün kit compartintentado abarca cualquier kit en los que los. reactivos se proporcionan en contenedores separados tal como, por ejemplo, contenedores pequeños de vidrio, contenedores de plástico o tiras de plástico o papel. Tales contenedores pueden permitir la trans erencia eficiente dé reactivos de un compartimento a otro . compartimento mientras se evita contaminación cruzada de muestras y reactivos, y/o permite la adición de agentes o soluciones de cada contenedor de un compartimento a otro e una tendencia cuantitativa. Tales kits pueden también incluir un contenedor que aceptará que se pruebe una. muestra, un contenedor que contiene reactivos para usarse en el ensayo, contenedores que contienen reactivos de lavado, y contenedores que contiene un reactivo de detección.
En ciertas modalidades, los kits comprenden uno o más sustratos de polinucleótido de la presente invención y una pluralidad de partzimas de oligonucléótido diseñadas para ensamblar una MNÁzimá : capaz de reconocer y catalíticamente modificando el sustrato de polinucleótido en la presencia del objetivó. El objetivó puede actuar como un facilitador de
ensamble causando el ensamble de las partzimas de oligonucleótido en una MNAzima catalíticamente activa capaz de reconocer y modificar el sustrato de polinucleótido.
En algunas modalidades, los kits comprenden un sustrato de polinucleótido de la presente invención y una MNAzima guie comprende dos partzimas de oligonucleótido. Las . secuencias del sustrato de polinucleótido y las partzimas de oligonucleótido pueden ser cualquier combinación especifica de las tres secuencias (cómo es representado par SEQ ID NOs) que se muestran en la Tabla 6, 8, 10, 13, 16, 20, 22 y/o 24¿
En otras modalidades, los kits comprenden un sustrato de polinucleótido de la presente invención y una- ADNzima. Las secuencias del sustrato de polinucleótido y ADNzima pueden ser cualquier par especifico de secuencias (como es representado por SEQ ID NOs) que se muestran en la Tabla 15.
Las partzimas de oligonucleótido individuales pueden estar presentes en el mismo contenedor. Alternativamente, las partzima/s oligonucleótido individuales pueden estar presentes en contenedores separados. Se entenderá que no todos los componentes . para todas las MNAzimas pretendidas para usarse en un método dado necesitan necesariamente proporcionarse en un kit como tales, componente/s pueden generarse como .parte de una reacción de cascada.
En otras modalidades, los componentes para ácidos
nucleicos catalíticos adicionales con,, por ejemplo, ya sea actividad de escisión o ligasa también pueden formar parte de los kits de la présente invención. En aún otras modalidades los kits de la presente invención pueden incluir AD zimas · o componentes de los mismos.
Los kits de la presente invención pueden incluir instrucciones para el uso de los componentes del kit para conducir los métodos deseados.
Los kits y métodos de la invención pueden usarse en conjunción con equipo de análisis automatizado y sistemas incluyendo, pero no limitado a, máquinas PCR en tiempo real.
Los kits dé la presénte . invención pueden incluir reactivos adicionales para ' conducir reacciones de amplificación objetivo (por ejemplo PCR) incluyendo, por ejemplo, cebadores oligónucleótido, soluciones amortiguadoras, iones de magnesio, enzimas de polimerasa y similares.
Los kits de la presente invención pueden comprender uno o más ensambles qué comprenden uno o más soportes sólidos y uno 6 más sustratos de polinucleótido de la presente invención. Uno o más de los soportes sólidos pueden estar enlazados a uno o más de los sustratos de polinucleótido. En ciertas modalidades, los kits pueden comprender uno o más ensambles qué comprenden una pluralidad de diferentes soportes sólidos.
La pluralidad de los diferentes soportes sólidos puede enlazarse a una pluralidad de diferentes sustratos de polinucleótido de la presente invención.
EJEMPLOS
En los siguientes ejemplos, se probó la habilidad de NAzimas basadas en la ADNzima 10-23, y ADNzimas 10-23, para eficientemente escindir los sustratos universales. Los sustratos universales probados incluyeron algunos dé aquellos previamente, conocidos en la técnica (Tabla 4) y los sustratos novedosos diseñados de acuerdo a ya sea todas o un subconjunto de las pautas de diseño de la presente invención (Tabla 5). Estos ejemplos demuestran la robustez, como es indicado por la escisión eficiente en un intervalo de condiciones, de sustratos universales diseñados de acuerdo a todas un subconjunto de las pautas.dé diseño de la presente invención.
Tabla 4: Sustratos universales previamente conocidos usados en los ejemplos-
Sub4 (SEQ ID NO; .171) CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA
*Las letras mayúsculas indican ADN, las letras minúsculas indican ARN.
Tabla 5: Sustratos universales mejorados de la invención actual usados en los Ejemplos
*Las letras mayúsculas indican ADN, las letras minúsculas indican ARN.
Kjaaplo 1: El uso da sustrato» univarsalas. opn Mntsiinas «o PC» cuantitativo da tiaapo raal (qPCR) , a una taaperatura da combinación da paras da basas a 52°C.
Las . MNAzimas pueden µ3ßG3ß para monitorear la amplificación de ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando métodos, dé amplificación objetivo in vitro tal cómo PCR, referidos como qPCR MNAzima. Además, el. monitoreo en tiempo real durante qPCR . usando sustratos de MNAzima etiquetados con fluoróforo y pares extintorés genera, una curva en la que una linea de umbral, dé un nivel arbitrario dé fluorescencia, puede colocarse sobre ia fase exponencial d las reacciones, produciendo un valor que puede ser conocido como un Ct (umbral de ciclo) . Las reacciones que producen un valor C inferior son indicadoras de escisión más e iciente de uá sustrato especifico ya que tales reacciones
alcanzan, el ciclo, dé umbral más rápido» En este ejemplo la amplificación y detección se realizan e un proceso de uha etapa, en donde la amplificación PCR y detección mediada de MAzima aparecen simultáneamente en un tubo sencillo. La cantidad de tiempo tomado para alcanzar la fluorescencia de umbral, medida por el valor Ct generado, puede ser influenciada por la secuencia del sustrato universal.
En este ejemplo, los sustratos universales previamente conocidos de la serie 1 (Sub2, Sub3, Sub6 y Sub7, ver Tabla 4). se comparan a nuevos sustratos universales mejorados, serie 2 (Sub44, Sub45, Sub46, Sub49, Sub55 y Sub60, ; ver Tabla 5) que son el objeto de la presente invención para determinar si los sustratos de la serie 2 tiene el. mismo, nivel más bajo o más alto de actividad en PCR de tiempo real como los sustratos, de . la serie 1. El nivel de actividad fue determinado por él Ct obtenido de cada reacción que contiene sustratos individúales durante PCR tiempo real. "
. 2.2. OUgómelmótidom da Pmrtxi *
En los experimentos conducidos para medir la eficiencia de escisión de sustratos universales previamente conocidos (Tabla 4) y sustratos universales novedosos (Tabla 5) <3n tiempo real, todos los oligonucleótidos partzima A y B se designaron con brazos sensores complementarios a la misma
secuencia del gen RPLPO humano. Las secuencias de las partzimas A y. B partzimas se enlistan a continuación de 5' a 3' , donde las bases, subrayadas hibridan á .. stL sustrato combinado. la W-P" indica fosforilación 3' del oligonucleótido.
SEQ ID NO: 1 partzima' A RPLP0A/2-P:
CAAACGAGTCCTGGCC TGTCTACAACGAGAGGA ACCTT
SEQ ID NO: 2 partzima B RPLP0B/2-P:
TGCCCAGGGAGGCTÁGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO: 3 partzima A RPLP0A/3-P: >
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO: 4 partzima B RPLP0B/3-P:
CGGTTGGTGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO: 5. partzima A RPLP0A/6-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO: 6 partzima B RPLP0B/6-P:
CTGGGAGGAAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTÁCACCTTC
SEQ ID NO: 7 partzima A RPLP0A/7-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGTGC.CATGTTAA
SEQ ID NO: 8 partzima B RPLPOB/7-P:
TATCACAGCCAAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACC TC
SÉQ ID NO: 9 partzima A RPLPOA/44-P:
CAAACGAGTCCTGCICCTTGTCTACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO: 10 partzima B RPLP0B/44-P: .
TCACTATAGGGAG6CTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO: 11 partzima A RPLPOA/45-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGGGACCCGT
SEQ ID NO: 12 partzima B RPLPOB/45-P:
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTGT.GGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO: 13 partzima A RPLPQA/46-P:
CAAACGAGTCCTGGOCTTGTCTACAACGAAGGTGCGGT
SEQ ID NQ: 14 partzima B RPLPOB/46-P:
. GAGGTGGGGAGGCTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
SEQ ID NO: 15 ¡partzima A RPLPOA/49-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGAGCCAAGTTTA
SEQ ID NO: 16 partzima A RPLPOA/55-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACÁACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 17 partzima A RPLPOA/60-P:
CAAACGAGTCCTGGCCTTGTCTACAACGAGTGGTTGGC
SEQ ID NO: 18 partzima B RPLPOB/60-P:
GTCGTGTTGGAGGOTAGCTGTGGAGACGGATTACACCTTC
. 1.2. Samtx tom rmportro
Los sustratos reportero probados en este ejemplo se muestran a continuación con la secuencia, 5' a 3'. Las bases en minúscula representan ARN y las bases en mayúscula representan ADN. En el ejemplo actual los sustratos/, otros qué no son Sub60, .se etiquetaron en término con una porción
6-FAM en el extremo .5'. y una porción extintor en el extremo 3'. La molécula extintora fue ya sea Black Hole Quencher 1 (indicado por una *B" en el nombre del sustrato a continuación) o Iowa Black* FQ (indicado por una MIB" en él nombre, de los sustratos a continuación) . Sub60 se etiquetó en extremo con una porción extintdra en el extremo 5' y uria porción. FAM en el extremo 3' (debido a. la base terminal 5' siendo una G" que se conoce para fluorescencia FAM extintora) . La escisión de los sustratos se monitoreó entre 510-530 nm (intervalo de longitud de onda de emisión FAM en CFX96 (BioRad)) con excitación entre 450-490 nm (intervalo de longitud de onda dé excitación FAM en CFX96 (BioRadj ) .
SEO ID NO: 21 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO: 22 Sub3^FB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO: 23 Sub6-FIB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 24 Sub7-FB:
. TTAACATGGCÁCguTGGCTGTGATA
, SEQ ID NO: 25 : Sub44-FIB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
SEQ ID NO: 26 Sub45-FIB:
ACGGGTCCCguCTCCT TGGAA
SEQ ID NO: 27 Sub46-FIB:
ACCGCACCTguCCCCAGCTC
. SEQ ID NO: 28 Sub49-FB:
TAAACTTGGCTCguTGGCÍGTGATA
SEQ ID NO: 29 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
d KP£FO
El amplicón PCR objetivo para este ejeimplo se generó por amplificación PCR in vitro de ADN genómico humano usando los cebadores PCR oligonucleótido enlistados a continuación Las secuencias de cebador se escriben 5' a 3'.
SEQ ID NO: 31 Cebador delantero 5RPLPO:
CCCATTCTATCATCAACGGGTA
SEQ ID NO: 32 Cebador interno 3RPLPO.
GCCCACTGTGGTCCTGGTG
1.4. 8maauim objmtiiro
La secuencia objetivo para este ejemplo fue un amplicón PCR del gen RPLPO generado por amplificación PC in vitro de ADN.. genómicó humanó extraído de las células K562.
1.5. Ccponmntmm dm remoción: Awpl1fiaaeión y dmtmcalón dé ana mmemnaím dm bjmtivo
La amplificación y detección PCR en tiempo real .de la secuencia objetivó sé realizó en un volumen de reacción total de 25 uL. Todas, las reacciones se condujeron en un Sistema de Detección PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad) . Los parámetros de ciclo fueron 95°C por 10 minutos, 10 ciclos de 95°C por 15 segundos y 60°C por 30 segundos (-l'C por ciclo para la última temperatura), 40 ciclos de 95eC por 15 segundos y 52°C por 60 segundos (datos recolectados en la etapa. 52°C).. Las reacciones se establecieron con sustratos y sus partzimas asociadas como, en la Tabla 6. Cada conjunto de condiciones de reacción se corrió en duplicado y contuvo 80 nM 5RPLP0 y 400 nM de 3RPLPO, 200 nM cada uno de partzima A y partzima B, 200 nM! de sustrato, 8 m MgCl2, 200 uM de cada dNTP, 10 unidades inhibidor RiboSafe RNase (Bioline), 1 x Immobuffer (Bioline) ; 2 unidades de Immolase (Bioline) y ya sea plantilla de ADN genómico (50 ng) u - objetivo no-DNün (H2Q. libre dé nucleasa (NF-H2O) ) . Las reacciones separadas se establecieron para probar cada sustrato con sus partzimas combinadas. Los mismos cebadores PCR se usaron para todas las reacciones y todas las partzimas tuvieron las: mismas porciones sensores de objetivo. Cualquiera de las diferenpias de eficiencia de reacciones por ló tanto será atribuible a diferencias en la eficiencia de
escisión de los sustratos.
Tabla 6: Coiñbinaciones de partzima usadas para cada sustrato universal
.1.5. Resultados: Amplificación de objetivo, y escisión ¡de sustrato reportero.
Cada reacción qPCR. MNAziraa qPCR que- contiene ADN genómico
humano, con cada sustrato diferente, mostró un incremento en la fluorescencia, sobre el tiempo para la detección en tiempo réal de RPLPO de ADN genómicó humano. Para todos los sustratos, la fluorescencia del control objetivo no-DNUn fue mejor que en las reacciones que contienen objetivo DNUn. Esto demuestra que el incremento en la fluorescencia producida en reacciones que contiene objetivo ..es debido al ensamble dependiente de objetivo de MNAzimas catalíticamente activas que. las escindidas de los sustratos universales.
Los sustratos de las series 1 y 2 todos cruzaron él umbral produciendo un valor Ct, como se e en la Tabla 7. Los sustratos de la serie .1 tuvieron valores Ct en el intérválo dé 16.9 (Sub6) a 18.4 (Sub3 y Sub7) y los sustratos de la serie 2 tuvieron valores Ct en el intervalo de 17,1. (Sub55)r a 19.2 (Sub45) . Esto. indica que los sustratos de la série 2 son altamente activos y muy comparables a los sustratos de la serie 1 bajo las condiciones de reacción probadas. Estos resultados demuestran que, en promedio, los sustratos que se escindieron con la eficiencia más grande (esto es el Ct más bajó) fueron aquellos con un número más alto de pirimidinas en las ocho bases rodeando los ribonucleótidos en el sustrato (subrayados en la Tabla 7).
Tabla 7: Kfioianoia da ascisión da Sustratos univarsalas (nlisados an ordan da aioianoia da asoisión basada aá Ct)
Las letras mayúsculas representan DN y las etras
minúsculas representan ARN
* La Tm dada aquí es igual a la temperatura de fusión de las bases enlazadas . a las dos partzimas calculadas usando la regla Wallacé. Cuando el sustrato se enlaza a la MNAzima basada en la ADNzima 10-23 el ribónucleótido xg" permanence sin enlazar por . lo tanto no contribuye a la Tm enlazada total.
~ .Únicamente una réplica debido al error experimental.
Rjaaplo 2: Uso da sustratos univarsalas oon MN&ximas qPCR
* una taaparatura da coabinación da paras da basas da 58*C.
Las MNAzimas pueden usarse para monitorear la amplificación de ácidos nucleicos objetivos en tiempo real usando métodos de amplificación objetivo in vitro tal como PCR. Además, el monitoreo en tiempo real durante qPCR. usando sustratos MNAzima ¦ etiquetados ¦ con fluoróforo y pares extintores genera una cuerva en la cual lina linea de umbral, de un nivel arbitrario de fluorescencia/ puéde colocarse sobre la fase exponencial de las reacciones, produciendo un valor que puede ser conocido como un Ct (umbral ele ciclo). Las reacciones que producen un valor Ct inferior son indicativas de espisión más eficiente de un sustrato especifico ya que tales reacciones alcanzan el cicio de umbral más rápido. En este ejemplo, la amplificación ;y
detección se realizan e.n un proceso de. una etapa, en. dónde la amplificación PCR y detección mediada de MNÁzima ocurren simultáneamente en un tubo sencillo. Donde todas las otras condiciones de reacción son las mismas el valor Ct puede ser influenciado por la .secuencia del sustrato universal. La temperatura de detección/combinación de pares de bases para qPCR MNAzima usada en la técnica es entre 50 54°C. Esta temperatura fue dictada por el hecho que los sustratos universales conocidos en la técnica tuvo una limitación en la temperatura en la cual fueron eficientemente escindidos con 54*C siendo el límite superior para los sustratos universales de la serie 1. Hay la necesidad de sustratos universales que escinde a temperaturas, más altas para permitir mayor flexibilidad en el. diseño de cebadores y partzimas que recosen a temperaturas más altas. Esta fléxibilidad de diseño para cebadores y partzimas podría ser de gran beneficio pa¿a muchas aplicaciones tal como objetivos genéricos de interés que tienen porcentajes altos de bases 6 y C en su secuencia, requiriendo temperaturas de reacción más altas y por lo tanto partzimas y cebadores con Tms más altas para detección específica.
La investigación en la eficiencia de escisión de los sustratos basada en él desempeño de los sustratos de las series 1 y 2, lleva al desarrollo de pautas para ayudar en
una tercera ronda de diseños de sustrato, resultando en los sustratos de. la serie 3. Estas pautas incluyeron pero no se limitaron a (i) . siete . o más nucleótidos de citosina en las diez bases rodeando los ribonucleótidos (N^- n) , <ii) las bases inmediatamente adyacentes a los ribonucleótidos son citosinas (N8 y N9) (iii) el contenido total de sustrato tiene >64% pirimidinás y (iv) la Tm total del oligónucleótido . es 66°C o mayor (donde esta última pauta es únicamente aplicable si la temperatura de reacción para la escisión de sustrato es arriba de 50°C) .
En este ejemplo, los .sustratos universales de la serie 1 (Sub2, Sub3 y Sub6) se comparan a los sustratos universales de la serie 2 <Sub44, Sub 45, Sub46, Sub60T y Sub55), los sustratos de la serie 3 (Sub61, Sub65, Sub72, Sub73, Sub74, Sub75, Sub77, Sub79, Sub80, Sub82, Süb83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 y Sub90) para comparar, la eficiencia de escisión de todos los sustratos en PCR. tiempo real a 58°C para asegurar que las pautas, de diseño producen sustratos universales con una alta . probabilidad de
a una temperatura elevada. El nivel de eficiencia de escisión fue determinado por la medición del valor Ct para las reacciones que contienen diferentes sustratos universales.
2.1. Oligamtclmótldom d Paxtxim*
En los experlméntos conducidos para medir la eficiencia de escisión de los sustratos universales de las series 1, 2 y 3.en PCR tiempo real, todos los oligonuCléótidos partzima Á.y B se designaron -con brazos sensores complementarios a la misma secuencia del gen TFRC humano. Las secuencias de. las partzittias A y B se enlistan a continuación de 5' 3' , donde las bases subrayadas hibridan a su sustrato universal emparejado. La -P" indica. fosforilación 3'. del oligonucleótido.
SEQ ID NO: 34 partzima A TFRCA/2-P:
GGAATATGGAAGGÁGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT SEQ ID NO: 35 partzima B TFRCB/2-P:
TGCCCAGGGAGGCTASCTGCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 36 partzima A TFRCA/3-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO: 37 partzima B TFRCB/3-P:
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO: 38 partzima A TFRCA/6-P:
GAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO: 39 partzima B TFRCB/6-P:
CTGGGAGGAAGGCTÁGCT.CCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO: 40 partzima A TFRCA/44-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO: 41 partzima B TFRCB/44-P: TCACTATAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAAGÁGACT SEO ID NO: 42 partzima A TFRCA/45-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGACCCGT SEQ ID NO: 43. partzima B TFRCB/45-P: TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 44 partzima A TFRCA/46-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGTGCGGT SEQ ID NO: 45 partzima B TFRCB/46-P: GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 46 partzima A TFRCA/55-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT'
SEQ ID NO: 48 partzima A TFRCA/60-P: . GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGfGGTTGGC
SEQ ID NO: 49 partzima B TFRCB/60-P: GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 50 partzima A TFRCA/61-P: GGAATATGGAAGGÁGACTGTCACAACGAGGGGTCGAG SEQ ID NO: 51 partzima B TFRCB/61-P: TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 52 partzima A TFRCA/65-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTCGAGA SEQ ID NO: 55: partzima B TFCB/72-P: CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO: 56 partzima A TFRCA/73-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGACGCCA SEQ- ID NO: 57 partzima B TFRCB/73-P: CACGAGGGGAGGCTÁGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO:.58 partzima A TFRCA/74-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT SEQ ID NO: 59 partzima B TFRCB/74-P:
CTGGGAGGGGAGGCT GCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 60 partzima A TFRCA/75-P: GGAATATGGAAGGÁGACTGTCACAACGAGAGGAGGGTCA SEQ ID NO: 61 partzima B TFRCB/75-P: TA6TGGGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 62 partzima A TFRCA/77-P: GGAATATGGAAGGAGACtGTCACAACGAGAGGGAGGAG SEQ ID NO: 63 partzima B TFRCB/77-P: AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 64 partzima A TFRCA/79-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGAGGÁ SEQ ID NO: .65 ; partzima B TF CB/79-P: GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 66 partzima A TFRCA/80-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT: SEQ ID NO: 67 partzima B TFRCB/80-P: GGTTCACGGGAGGCTAGCTGCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO: 68 · partzima B TFRCB/82-P:
TGGACGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 69 partzima A TFRCÁ/83-P.:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGCGGA SEQ ID NO: 70 partzima B TFRCB/83-P:
GTTGCAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SÉQ ID NO: 71 partzima A TFRGA/9.0-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGTCGAG
.2.2. . Suetxmtóm reportero .
Los sustratos reportero para este ejemplo se muestran a continuación en la secuencia, 5' a 3/. Las bases en minúscula representan. ARN y y las bases en mayúsculas representan ADN. En el ejemplo . actual, los .sustratos se etiquetaron en el extremo con una porción 6-FAM en el «xtremo 5' (indicado por una WF" en el nombre dé los sustratos á continuación) y uña porción extintora Iowa Black* FQ en el extremo 3.' (indicada por una "IB" en el. nombre de los sustratos a Continuación) . La secuencia de Sub60 ha sido modificada para incluir una "T"
en el : extremo 5' , esto le permitió ser etiquetada en . el extremo 5' con 6-FAM. La secuencia, de enlace sustrato partzima A no ha sido- cambiada y por. lo tanto la eficiencia de escisión es comparable a la secuencia Sub60 en el Ejemplo 1 que carece de la WT" extra .en el extremo 5' . La escisión de
los sustratos fue monitoreada entre 510-530 nm (intervalo de longitud de onda .de emisión FAM en CFX96 (BioRad) ) con excitación entre 450-490 nm (intervalo de longitud de onda de excitación FAM en £FX96 (BioRad)).
SEQ ID NO: 21 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguCCCTGGGCA
SEQ ID NO: 22 Sub3-FIB:
CAGCACAACCgúCACCAACCG
SEQ ID NO: 23. Sub6-FIB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 25 Sub44-FIB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA .
:. SEQ ID NO: 26 Sub45-FIB:
ACGGGTCCCguCTCCTTTGGAA
SEQ ID NO: 27 Sub46-FIB:
SEQ ID NO: 75 Sub72-FIB':
SEQ ID NO: 77. Sub74-FIB: ATCACTCCCCgueCCCTCGCAG SEQ ID NO: 7$ ./ Sub75-FIB:
TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA SEQ ID NO: 79 Sub77-FIB: CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT SEQ ID NO: 80 Sub79-FIB': TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC SEQ ID NO: 81 Sub80-FIB: AACCGCCCTCguCCCGTGAACC SEQ ID NO: 82 Sub82-FIB: CTCCTCCCTCguCCCTCGTCCA SEQ ID NO: 83. Sub83-FIB: TCCGCTCCCCguCCCCTGCAAC SEQ ID NO: 84 Sub84-FIB: ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 87 Sub87-FIB:
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 88 Sub88-FIB:
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 89 S.ub89-FIB:
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO: 90 Sub90-FIB:
CTCGACCCTCguGCCTCGTCCA
2.3. 8m mmna±* objetivo y cebador— PCR para apUfíieaeián d WRC
La secuencia objetivo para este ejémplo fue un amplicón PCR del gen TFRC generado por amplificación in vitro del ÁDN genómico humano, extraído de la linea celular IM9 (Promega), usando los cebadores PCR oligonucleótido enlistados a continuación. La secuencia en negritas en las secuencias de cebador corresponde a una etiqueta universal (Ql o Ü2) que incrementa la Tm del cebador dentro de la afectación de la especificidad del. cebador a! gen objetivo. Esta., etiqueta méjora la eficiencia de amplificación en reacciones PCR. Las secuencias de cebador se enlistan de 5' a 3' .
SEQ ID NO: 91 Cebador delantero 5TFRCJJ1:
GCTAAAACAATAAC.TCAGAACTTACG
SEQ ID NO: 92 Cebador interno 3TFRC_ü2:
CAGCTTTCTGAGGTTACCÁTCCTA
2.4. Oempónmntmm dm eacción; Urnpl1ficmalón y aumntitiamaión dm asonancia obje vo
La amplificación y detección de PCR tiempo real, dé la secuencia de objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 uL. Todas las reacciones se condujeron, en un Sistema de Detección PCR en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Las reacciones se establecieron con sustratos y sus partzimas asociadas como en la Tabla 8. Los parámetros de ciclo fueron, 95°C por 2 minutos, 50. ciclos de 95°C por 15 segundos y 58°C por 60 segundos (datos recolectados en la etapa 5$°C) . Cada conjunto de condiciones de reacción se corrió en duplicado y contuvo 40 nM 5TFRC_U1, 200 nM de 3TFRC_U2, 200 n cada uno de partzima ? y partzima B, sustrato 200 nM, 8 mM MgCl2, 200 uM de cada dNTP, 10 unidades de. inhibidor RiboSafe Rase (Bioline) , 1 x Immobuffer- (Bioline) , 2 unidades de MyTaqHS™ DNA polimerasa (Bioliné) y ya sea plantilla de ADN genómico (50 ng) o sin objetivo (NF-H20) .
Tabla 8: Cdabinaolon»» dm parsiaa usadas para oad sustrato univarsal
2.5. Resaltado*: ñmpllflamción dm objetivo y m»oiión dm mu trmtó xojportoxo
Cada reacción qPCR MNAzima que Contiene AD genómico
humano mostró un incremento en fluorescencia sobre el tiempo para la detección en tiempo real ' de TFRC de. ADN genómico humano. Para todas las reacciónes . la fluorescencia del control de objetivo no-DNA fue más baja que en las reacciones que contienen Objetivo DNA. Esto demuestra que el incremento
en fluorescencia producida en reacciones .que contiene objetivo es debido ál ensamble dependiente de objetivo de MNAzimas catalíticámerite activas que entonces escindieron uno de los sustratos reporteros universales.
La comparación de los valores . Ct para cada sustrato universal (Figura 5 y Tabla 9) muestra los sustratos de la serie i (Sub2, Sub3 y Sub6) y sustratos de la serie 2 (SÍib44, Sub45, Sub46 y Sub60T) todos tiene valores Ct > 27, mientras que los otros sustratos de las series 2 y 3 p obados (Sub55, Sub61, Sub65, Sub72, Sub73, Sub74, S.ub75, Sub77, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 y Sub90.) tuvieron , valores Ct menores qüe 27. Esto indica qüe los últimos sustratos universales de la serie 2 y todos los sustratos universales de la serie 3 mostraron eficiencia incrementada de la reacción de escisión MNAzima a una temperatura de combinación de pares de bases/detección más alta que previamente posible para qPCR MNAzima. Esta eficiencia mejorada de la escisión ahora permite la detección eficiente y fuerte del objetivo, usando qPCR MNAzima a una temperatura más alta que previamente posible. Esto también puede probar ser benéfico cuando se usan las formulaciones de polimerása de ADN .qüe requiere una temperatura más alta para amplificación.
Es de destacar la importancia de la naturaleza., de la
secuencia de nucleótido de estos sustratos eficientemente escindidos y la proximidad de nucleótidos específicos para los ribonucleótidos de los sustratos. Estas características forman la base de un conjunto de pautas que resultan en sustratos universales con una probabilidad, más. alta de ser efectivamente escindidos a temperaturas elevadas... Estas pautas de diseño incluyen pero no se limitan a (no todas pueden ser necesarias):, (i) siete o más nucleótidos de citosina en las diez bases rodeando los ribonucleótidos (N4-N13) ; (ii) las. bases inmediatamente adyacentes a los ribonucleótidos son citosinas (N¿ y N9) ; (iii) el contenido total de sustrato tiene >64% pirimidina' s;; (iv) la Tm total del oligonuoleótido es 66eC o mayor (donde est última pauta es únicamente aplicable si la temperatura de reacción para escisión de sustrato está arriba de 50eC) (Tabla 9). Además, se observó que un número bajo de nucleótidos de guanina (por ejemplo tres, dos, uno, o ninguno) en las 10 bases rodeando a los ribonucleótidos es también benéfica
Todos los sustratos, universales en la Figura 5 que tuvieron una Ct < 27 a una temperatura de combinación de pares de bases de 58°C cumplieron tres ó más de estas pautas de diseño Tabla 9) .
Tabla 9: Kfioiancia da escisión d sustratos onivarsala (enlistados en al ócdan da eficiencia da escisión basada en
Ct)
minúscula representan ARN y la posición de la base en un. sustrato es representada por (Nx) -Ni-N2!-N3-N~ s-iN6-N7- 8-iíR-rYr N¿- io-Nu- i2- i3- w-Ni5- (Nx)
* % C/T (pirimidinas) de longitud de secuencia mostradas arriba para cada sustrato; no incluyen ribonucleótidos
* la Tm dada aquí es. igual a la temperatura de fusión de las bases de enlace calculadas usando la regla Wallace - únicamente calculadas para bases que hibridan a su
complemento. Cuando el sustrato se; enlaza a la MNAzima basada en. la ADNzima 10-23 el ribonucleótido g'' permanece sin enlazar por lo tanto no contribuye a la Tm de enlacé total. ~ El número de pautas de diseñó (i), (ii), (iii) y/o (iv). que han sido cumplidas por: la secuencia de sustrato.
§ La "T" adicional en Sub60T no es enlazada por un brazo partzi a y por lo tanto no está incluida en los cálculos de % C/T y Tm..
.. Kjaaplo 3: Uao. da sustrato* univorsalas con Jttasiaas *n tía foraato para dataoeión diraota da un ebjativo da áoldo nucleico.
La investigación en la eficiencia de la escisión de sustratos basada en él desempeño de los sustratos, de las series.1 y 2,. lleva al .desarrollo dé pautas para ayudar en el diseño de una tercera ¿onda de sustratos, serie, 3. Estas pautas incluyeron pero no se limitaron a (i) siete o más nucleótidos de citosina en las diez bases rodeando los ribonucleótidos (N4-N13)., (ii) las bases inmediatamente adyacentes a ios ribonucleótidos son citosinas (N8 y N9) (iii) él contenido total de sustrato tiene >64% pirimidinas . y (iv) la TM total del oligonucleótido es 66eC o mayor (donde esta última pauta es únicamente aplicable si la temperatura de reacción para escisión de sustrato está arriba de 50°C) .
Las MAzimas pueden usarse para directamente detectar
ácidos nucleicos objetivo en una reacción isotérmica dentro de cualquier amplificación de objetivo. Esjt método de detección de objetivo directa puede usarse para evaluar la eficiencia de escisión de sustratos. . Las partzimas se designaron para probar la eficiencia; de escisión de un intervalo de sustratos universales cuando se acoplan, con detección directa del gen TFRC a un intervalo de temperaturas. En este ejemplo, los sustratos universales previamente conocidos de la serie 1 (Sub2, Sub3, y Súb6) se compararon a los sustratos universales de la série 2 (Sub44, Sub45, Sub46, Sub49, Sub55 y Sub60T) y sustratos dé la serie 3 (Sub61, Sub65, Sub72, Sub73, Sub74, Sub75, Sub77, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Súb84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 y Sub90) para determinar si las pautas de señal derivadas de los análisis de sustratos de la serie 1 y 2 serian útiles en el desarrollo, de. sustratos de la serie 3 que se escinden con el mismo o nivel más altó de actividad como sustratos de las series 1 y 2. El nivel de eficiencia de escisión sé determinó calculando la relación de señal a ruido (de resultados de una reacción de "prueba" que contiene .plantilla y una reacción de control sin plantilla) después de. 10 minutos sobre un intervalo de temperatura de 52, 54, .56 y 58°C. La desviación estándar de las relaciones señal a ruido sobre este intervalo de temperatura también se calculó como una medida dé robustez
de los sustratos respecto a la temperatura.
3.1. Oligomtoleótidos d» Partzima
En los experieiéntos conducidos . para inedir la eficiéncia de escisión de los sustratos universales serie 1, 2 y 3 descritos en las Tablas 4 y 5 usando detección objetivo directa, todos los . oligonucleótidos .A y B dé. partzima se diseñaron con extremidades sensibles complementariamente a la misma secuencia del gen TFRC humano. Las secuencias de las partzimas A y B se enlistan enseguida desde 5' .hasta 3' donde las bases subrayadas hibridizan al sustrato. El *-p" indica, fosforilación 3' del oligonucleótido.
SEQ ID NO: 34 partzima A TFRCA/2-P:
GGAATATGGAAGGÁGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT SEQ ID NO: 35 partzima B TFRCB/2^P:
TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGÁAAACAGACT SEQ ID NO: 36 partzima A TFRCA/3-P:
GGÁATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO: 37 partzima B TFRCB/3-P:
CGGTTGGTGAGGCTAGCT'CCTCTGACTGGAAAAGAGACT
SEQ ID NO: 38 partzima A TFRCA/6-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT SEQ ID NO: 39 partzima B TFFjCB/6-?:
CTGGGAGGAAGGCTÁGCTCCTCTGACTGGAAAACÁGACT
SEQ ID NO: 40 partzima A TFRCA/44-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAGACCTG SEQ ID NO: 41 partzima B TFRCB/44-P:
TCACTATAGGGAGGCTAGCTCCTCT'GACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 42 partzima A TFRCA/45-P: .
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGACeCGT SÉQ ID NO: 43 partzima B TFRQB/45-P: TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGAGT SEQ ID NO: 44 partzima A TFRCA/46-P: GGÁATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGTGCGGT SEQ ID NO: 45 partzima B TFRCB/46-P: GAGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 93 partzima A TFRCA/49-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACA CGAGAGCCAAGTTTA SEQ ID NO: 94 . partzima B TFRCB/49-P:
TATCACAGGCAAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 46. partzima A TFRCA/55-P: GGAATATGGAAGGÁGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGT SEQ ID NO: 48 partzima A TFRCA/60-E: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGTGGTTGGC SEQ ID NO: 49 ; partzima B TFRCB/60-P; GTCGTGTTGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAÁCAGACT SEQ ID NO: 50 partzima A TFRCA/61-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NQ: 51 partzima B TFRCB/61-P: TGGGGTGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 52 : partzima A TFRCA/65-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTCGAGA SEQ ID NO: 55 partzima B TFRCB/72-P: CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 56 partzima A TFRCA/73-P: GGAATATÓGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAeGCCA SEQ ID NO: 57 partzima B TFRCB/73-P: CACGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACÁGACT SEQ.ID NO: 58 partzima A TFRCA/74-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT SEQ ID NO: 59. partzima B TFRCB/74-P.: CTGGGAGGGGAGGOTAGCTCCTCTGACTGGAAAACÁGACT SEQ ID NO: 60 partzima A TFRCA/75-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAA'CGAGAGGAGGGTCA
SEQ ID NO: 61 partzima B TFRCB/75-P: TAGTGGGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAAGAGACT SEQ ID NO: 6 partzima A TFRCA/77-P: GGAATATGGAAGGÁGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG SEQ ID NO: 63 partzima B TFRCB/77-P: . AGGAGGAGGGAGGCTAGCT.CCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID ÑO: 6 . partzima A TFRCA/79-P: GGAATATGGAAGGAGÁCTGTCACAACGAGGGGAGAGGA
SEQ ID NO: 65 partzima B TFRCB/79-P:
GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ.ID O: 66 partzima A TFRCA/80-?:
GGAATATGGAAGGAGACTgTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID ÑO: 67 partzima B TFRCB/80-P:
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 68 partzima B TFRCB/82-P:
TGGACGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 69 partzima A TFRCA/83-P:
GGAATATG6AAGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGCGGA
SEQ ID NO: 70 partzima B TFRCB/83-P:
GTTGCAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 71 partzima A TFRCA/90-P:
GGAATATGGAAGGAGACTqTCACAACGAGAGGGTCGAG
3.2. Sustratos Reportero*
Los sustratos reporteros para este ejemplo se muestran enseguida con la secuencia, 5' hasta 3'. Las bases en minúscula representan ARN y ' las bases en mayúscula representan ADN. En el ejemplo actual, los sustratos se etiquetaron al final con una porción 6-FAM en el extremo 5'
(indicado por una XXF" en el nombre de los sustratos enseguida) y una porción de apagador íowa Black® FQ en el extremo. 3' (indicado . por un WIB" en el nombre de . los
sustratos enseguida) . La escisión de ios sustratos. se vigiló entre 510-530 nm intervalo' de longitud de onda de emisión FAM en CFX96 (BioRad)) con. excitación entré .450-490 nm intervalo de longitud de onda de excitación FAM en CFX96 (BioRad)).
SEQ ID NO: 21 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCgúCCCTGOGCA
SEQ ID NO: 22 '. Sub3-FIB:
CAGCACAACCguCACCAACCG
SEQ ID NO: .23 Sub6-FIB:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 25 Sub44-FIB:
CAGGTCTCCTCguOCCTATAGT'GA
SEQ ID NO: 26 Sub45-FIB:
ACGGGTCCCguCTGCTTTGGAA
SEQ ID NO: 27 Sub46-FIB:
ACGGCACCTguCÓCCAGCTC
SEQ ID NO: 28 Sub49-FB:
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
SEQ ID NO: 29 Sub55-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 72 Sub60T-FIB:
TGCCAACCACguCCAACACGAC
SEQ ID NO: .73 Sub61-FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA.
SEQ ID NO: 74 Sub65-FIB: TCTCGACCTCguCTCCACGCCA SEQ ID NO: 75 Sub72-FIB: ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG SEQ ID NO: 76 Sub73÷FIB: TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG-SEQ ID NÓ: 77 Sub74TFIB: ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG SEQ ID NO: 78 Sub75-FIB: TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA SEQ ID NO: 79 Sub77-FIB: CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT SEQ ID NO: 80 Sub79-FIB: TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC SEQ ID NO: 81. Sub80-FIB: AACCGCCCTCguCCCGTGAACC SEQ ID NO: 82 Sub82-FIB: CTCCTCCCTCgÜCCCTCGTCCA SEQ ID NO: 83 Sub83-FIB: TCCGCTCCCCguCCCCTGCAAC SEQ ID NO: 84 Sub84-FIB: ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG SEQ. ID NO: 85 Sub85-FIB: ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO: 8.6 Sub86-FIB:
ATCACGCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 87 Sub87-FIB;
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 88 Sub88-FIB:
CTCCTCCCTCguCCCGAGCTC
SEQ ID NO: 89. . Sub89-FIB:
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCt
SEQ ID NO: 90 . Sub90-FIB: .
CTCGACCCTCguCCCTCGTCCA
3.3. Socranoia objetivo
La secuencia objetivo · para este ejemplo fue un oíigohucleótido AFTTFRC sintético con la secuencia, 5' hasta
3' enseguida. Esta secuencia objetivo tiene la misma secuencia como la sección del gen TFRC.
SEQ ID NO: 95 Facilitador dé Ensamblado AF-TFRC: AGTCTGTTTTCCAGTCAGAGGGACAGTCTCCTTCCATATTCC :. .
3.4. CÓMponont— da reacción: Dotoooión isotéxaiea directa, .da —coancia objetivo
La detección de la secuencia objetivo se midió por un increméhto en la señal fluorescente causada por escisión del sustrato reportero . por la MNAzima catalíticamente activa. El
volumen total de todas las reacciones fue 25 y todas las reacciones se condujeron en Sistemas dé Detección PCR en Tiempo Real CFX96"1 (BioRad) , con cada combinación de partzimas y sustratos (Tabla 10) se prueba a 52°C, 54°C, 56*C, 58 C y 60°C. La fluorescencia paré cada reacción se programó para. leerse después de 1 segundo para los primeros 50 ciclos y luego se programa para leerse después de 25 segundos para los siguientes 50 ciclos. Todas las reacciones contienen. 1 x Solución Amortiguadora II PCR (Applied Biosystems), MgCÍ2 10 mM, y 0.2 uM de. Partzimas A y B y 0>2 uM de sustrato (probado en combinaciones co o en la Tabla 10) . Cada reacción se realizó por duplicado ya. sea como una "prueba" con secuencia objetivo 10 nM (ÁF-TFRC). o control rio de plantilla (NF- H20) .
·
Tabla 10: Combinaciones de partzima usadas para:cada sustrato
3.5. Resultados: Detección isotéxaioa dittete dt —ouencie objetivo
Cada reacción con . cada sustrato universal muestra un incremento en fluorescencia con el tiempo para reacciones que contienen la plantilla sintética AF-TFRC (secuencia o jetivo correspondiente a una porción del gen TFRC} . Para todos los sustratos, la fluorescencia del control no de plantilla fue tah baja cómo en las reacciones que contienen secuencia objetivó. Esto demuestra que el incremento en fluorescencia producida en reacciones que contienen objetivo se debe a ensamblado dependiente del objetivo de MNAzimas catalíticamente activas que luego escinden el sustrato
reportero universal. .
Para cada reacción/ los puntos de datos fluorescentes puros obtenidos del CFX96 se normalizaron al. dividir cada punto de datos por. el. valor obtenido por la reacción no de plantilla emparejada en la primera . lectura. Estos datos normalizados se usaron entonces para . calcular la señal para valor de ruido en aproximadamente la marca de 10 minutos l dividir puntos de datos de prueba por los puntos de datos ;no de plantilla. Este .cálculo se realizó para cada sustrato en cáda temperatura de reacción. La señal: para valor de ruido proporciona una medición de la eficiencia de la escisión de sustratos (Figura 6, (i)), con una señal alta para ruido que indica escisión eficiente. La desviación, estándar de la señal a relación de ruido para cada sustrato sobre el intervalo de temperatura también se calculó y colocó en gráfica para determinar sustratos con actividad . consistentemente alta sobre el intervalo probado de temperaturas (Figura 6, (ii) j . Un valor menor para esta desviación estándar indica cambio mínimo de señal a niveles de ruido, entre temperaturas. Esto sugiere qué estos sustratos son robustos con respecto a temperatura.
El análisis de la señal a relación de ruido para cada sustrato en el intervalo de temperaturas (Figura 6, <i)) muestra que. los . sustratos de serie 1 (Sub2, : Sub3 y - Sub6)
tienen una señal a ruido superior, «n las temperaturas más bajas medidas. Sin embargo la eficiencia de escisión de estos sustratos cae dramáticamente conforme la temperatura de reacción se incrementó hasta 58°C. Sé observo un patrón similar para un subconjunto de los sustratos de la serie 2 (Sub44, Sub45, Sub46, y Sub60T) . El sustrato de la serie 2 Sub49, se desempeña pobremente en las temperaturas más bajas y ligeramente mejor en las más altas pero en general tiene señal a ruido más baja que otros sustratos. El sustrato de serie 2 Sub60T muestra una reducción en señal, a ruido con temperatura incrementada, y señal a ruido más baja en general e las temperaturas más bajas que la mayoría . de otros sustratos de serie 1 y 2. El otro sustrato serie 2 (Sub55), y un subconjunto de los sustratos de serie 3 (Sub61, Sub65, Sub74, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88j Sub89 y Sub90) . exhiben, altos niveles de fluorescencia y por lo tanto se escindieron eficientemente a través de todas las temperaturas probadas. Los sustratos de serie 3 Sub73, Sub75 y Sub77 exhiben aproximadamente la misma señal para valor de ruido a través . de las temperaturas ·· probadas, sin embargo el nivel de señal a ruido general fue bajo. Estos tres . sustratos todos dan buenos resultados con valores Ct relativamente bajos cuando sé prueban con MNAzima qPCR (ver Ejemplo 2). La comparación de los datos para estos
sustratos para 10s Ejemplos 2 y 3 puede indicar que cuando una temperatura constante en el intervalo de 52 a 58°C se usa, la rotación de estos sustratos es más bajá afectando de esta manera la Eficiencia de escisión. Esto reduce la rotación del sustrato que pudiera relacionarse a la relación "apagada" de los productos escindidos.. En el Ejemplo 2, lós productos escindidos se disociarían de las extremidades de sustrato de partzima al menos una vez un ciclo, cuando la temperatura se incrementó hasta arriba de 90°C como parte del perfil termocíclico del PCR.
En general, los sustratos que están conforme a las guias de diseño (Tabla 9) muestran una señal mayor á relación de ruido a través del intervalo de temperatura probado que los sustratos que caen fuera de estas guias (Figura 6, (i)). Más específicamente las reacciones con Sub55, Sub61, Sub65, Sub72, Sub74, Su 79, Sub80, Sub82, Sub83, . Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, Sub89 y Sub90 exhiben señal alta paira valores de ruido, en cada temperatura probada lo que demuestra que estos on sustratos* robustos .sobre un intervalo de temperaturas. Esta mejora fue además evidente cuando la desviación estándar se calculó a parti de la señal a relación de ruido a través de las temperaturas para cada sustrato (Figura -.6, (ii) ) . Esta medida de variabilidad se empareja con los valores absolutos de. señal a. ruido l que
indica que, sobré el intervalo de temperatura probado, el sustrato de serie 2 Sub55, y los sustratos de serié 3 Sub6í, Sub65, Sub74, Sub79, Sub80, Sub82, Sub83, Sub85, Sub86~, Sub87 Sub88, Sub89 y Sub90, tienen una señal alta a relación de ruido con poca variabilidad a través de un amplio intervalo dé¦ temperatura. Hubo tres sustratos serie 3, Sub65, : Sub72 y Sub84, que sólo emparejan tres de las cuatro guias de diseño y dos de estas, Sub72 y Sub84, tiene una desviación estándar ligeramente mayor de la señal a ruido que los sustratos de serie 3 que emparejan las cuatro- de las guias de diseño cómo se especifica en iá Tabla .9.
Los sustratos que tienen una señal para valores de ruido de menos de 1.6 a 3 o más temperaturas (Sub60, Sub73, Sub75 y Sub77) no se consideraron fuerte con respecto al intervalo de temperaturas probado.
• Estos datos sugieren que conforme a las cuatro de estas guias de diseño (Tabla 9) , en general, se producirán sustratos que se escinden eficientemente y fuertemente sobre un intervalo de temperaturas.
Un estudio de la secuencia de la mayoría dé los sustratos exitosos dé series 2 y 3 muestra que estos sustratos comparten características comunes. Loe sustratos que tienén poca variación entre relaciones de séñal a ruido sobre las temperaturas . probadas * (Figura 6, (i) y (ii) ). generalmente
contienen siete o . más nucleótidos de citosina dentro de las bases N4 a 13. Esto indica que la región núcleo, es decir las 10 bases que rodean los ribonucleótidos,, tiene alta influencia en la actividad del sustrato. Además, se observó que un número bajó de nucleótidos dé guanina (por ejemplo tres, dos, uno o ninguno) en las 10 bases que rodean los ribonucleótidos también es benéfico.
Kjeaplo 4: Uso da sustratos universales con leokxiaa qFCR, en temperaturas da coabinación an sus paras basa da 52*C y 58°C.
Las MNAzimas. pueden usarse para vigilar la amplificación de.ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando métodos de amplificación objetivó in vitro tal como PCR. Además, el vigilado en tiempo real durante qPCR usando sustratos MNAzima etiquetados con pares fluoróforos y apagador genera una curva que puede indicar la eficiencia de una [reacción por su valor Ct y cambio, ascendente (relación de reacción).. En este ejemplo se realizan la amplificación, y detección en un proceso, de una etapa, en donde la amplificación PCR y detección mediada por MNAzima se presentan simultáneamente en un tubo sencillo. La relación de producción de señal (medida por Ct y cambio, ascendente de curvas de reacción) #n diferentes temperaturas, de combinación en sus pares base tal como 52°C y 58°C; (la temperatura que se colectó de los
datos), puede estar influenciada por la secuencia del sustrato universal...
La temperatura de combinación en sus pares base/detección por MNAzima qPCR usada en el campo está entre 50 y.54°C. Esta temperatura se dictaminó por el hecho de que los sustratos universales conocidos en la técnica tienen una limitación en la temperatura a la cual' estos se escindieron eficientemente con 54°C siendo el limite superior] para los sustratos universales serie 1.. Hay una necesidad para sustratos universales que escindan en temperaturas más altas para permitir mayor flexibilidad en el diseño dé cebadores y pártzimas que se escindan en temperaturas más altas. Esta flexibilidad en el diseño para cebadores y pártzimas sería de mayor beneficio para muchas aplicaciones tales como objetiyós genéticos de interés que tienen altos porcentajes de bases G y C en su secuencia,, que requieren pártzimas y cebadores con Tms. más altas para detección especifica. La utilidad de sustratos universales seria mayormente incrementada si los sustratos que existen fueran escindidos eficientemente en. un intervalo de temperaturas entre 52 y 58°C.
En este ejemplo, las pártzimas correspondientes a sustratos universales serie 1, 2 y 3, se diseñaron para dirigir un intervalo de genes, como sé resume en la Tabla 11. Alguien . experto en el. campo' apreciaría que cualquier
secuencia de genes o transcripto de genes o Cualquier otro producto de amplificación de ácido nucleico pueden usarse como un objetivo como se describe en la presente. Cada combinación de partzimas y sus sustratos universales .' 5 asociados se probaron en temperaturas de combinación en sus ,¦ ·' pares base de 52°e y 58°C en qPCR. Los resultados de esta comparación determinarán ' sus sustratos . serie 1, 2 y 3 dirigidos a diferentes genes, y en diferentes temperaturas de combinación en sus pares base permiten un . nivel . igual, 10 superio o inferior dé escisión eficientemente en PCR en tiempo real. El ivel de escisión eficientemente se determinó al medir el valor Ct y observar en el cambio ascendente de curvas de reacción para reacciones que contienen diferentes sustratos universales.
• 15 ·'·· · . · . ' . _ ·.
Tabla 1 . Sustratos, usados para dataotar ganas difarantas por MNJtsiaa qPCR .
20
En los experimentos conducidos para medir la eficiencia de escisión de los sustratos universales en PCR en tiempo real, los oligonucl ótidos de partzima A y B se diseñaron con extremidades sensibles complementariamente a los genes CYP2C9, TP53, B2H, HMBS, RPL13a . o TFRC humanos. Las secuencias de las partzimas A y B se enlistan enseguida desde 5' hasta 3' , donde las bases subrayadas hibridizan al sustrato.. El w-p" indica .fosforilación .3' del oíigonucleótido. ·.
SEQ ID NO: 96 partzima A CYP2C9A/3-P:
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO: 97 ' partzima B CYP2C9B/3-P:
CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC SEQ ID NO: 98 partzima A CYP2C9A/61-P:
GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGGGTCGAG SEQ ID NO: 99 partzima B CYP2C9B/61-P:
TGGCGTGGAGAGGCTÁGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC SEQ ID NO: 100. partzima A TP53A/6-P:
; , GACGGAACAGGTTTGAGGTGACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO: 101 partzima B TP53B/6-P:
CTGGGAGGAAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG SEQ ID NO: 103 partzima B TP53B/72-P: CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG SEQ ID NO: 104 partzima A TP53A/74-P: GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGTGAT SEQ ID NO: 105 partzima B TP53B/74-P: CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG SEQ ID NO: 106 partzima A TP53A/79-P: GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGAGGA SEQ ID NO: 107; partzima B TP53B/79-P: GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCGTGTTTGTGCGTGTCCTGG SEQ ID NO: 108 partzima A B2MA/60-P: ATTCAGGTTTACTCACG CATCACAACGAGTGGTTGGC SEQ ID NO: 109 partzima B B2MB/60-P:
GTCGTGTTGGAGGCTAGCT'CAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
SEQ ID NO: 110 . partzima A B2MA/6Í-P
ATTCAGGTTTÁCTCACGTCATCACAACGAGGGGTCGAG
SEQ ID NO: 111 partzima B B2 B/61-rP
TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA
SÉQ ID NO: 112 partzima A B2MA/79-P
ATTCAGGTTTÁCTCACGTCATCACAACGAGG6GAGAGGA SEQ ID NO: 113 partzima B B2MB/79- GGTTGAAGGGGAGGCTAGCTCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAA SEQ ID NO: 114 partzima A HMBSA/49-P:
GCCATGTCTGGTAACGGCAAACAACGAGAGCCAAGtTTA SEQ ID NO: 115 partzima B HMBSB/49-P: TATGACAGCCAAGGCTAGCTT6CGGCTGCAACGGCGGTG SEQ ID NO: 116 partzima A HMBSA/75-P: GCCATGTCTGGTAACGGCAAACAACGAGAGGAGGGTCA SEQ ID NO: 117. partzima B HMBSB/75-P: TAGTGGGGAGAGGCTAGCTTGCGGCTGCAACGGCGGTG SEQ ID NO: 34 partzima A TFRCA/2-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT SEQ ID NO: 35 partzima B TFRCB/2-P: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 38 partzima A TFRCA/72-P: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGCGTGAT SEQ ID NO: 55 partzima B TFRCB/72-P: CTGGGAGGAGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 66 partzima A TFRCA/80-P: GGAATATGGAAGGÁGACTGTCACAACGAGAGGGCGGTT SEQ ID NO: 61 partzima B TFRCB/80-P: GGTTCACGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 118 partzima A RPL13aA/55-P TTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGTGCGGT SEQ ID NO: 119 partzima B RPL13aB/55-P GAGCTGGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT SEQ ID NO: 120.;·. partzima A RPL13aA/80-P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID NO: 121 partzima B RPL13aB/8Q-P
GGTTCACGGGAGGCTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT SEQ ID NO: 12 partzima A RPL13aA/88-P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGGAGGAG
4.2. Sustratos reporteros
En el ejemplo actual/ los sustratos fueron etiquetados en el extremo 5' con un fluoróforo y etiquetados en el extremo 3' con una porción apagadora. La Tabla 12 describe las combinaciones Sustrato - fluoróforo/apagador. Algunos sustratos se probaron con más de una combinación flüóróforo/apagador particular. La escisión de los sustratos se vigiló en varias longitudes de onda de emisión y excitación (Tabla 12) .
Tabla 12. Sustratos y s
ABHQ1; apagador 1 de orificio negro, BHQ2; apagador 2 de orificio negro, IB; Iowa black® FQ, I.BR; Iowa black® RQ ?Sistema de Detección PCR en Tiempo Real CFX96 (Biorad) excita y mide lá emisión de, cada ;fluorófóro sobre un intervalo de longitudes de onda para cada canal
Los sustratos reporteros probados . en este ejemplo se muestran enseguida con la secuencia, 5' hasta 3'. Las bases en minúscula representan ARN y las bases en mayúscula representan ADN. ·..
SEQ ID NO: 21 Sub2:
AAGGTTTCCTGguCCCTGGGCA
SEQ ID NO: 22 Sub3:
CAGCACAACCguCACCAACCG.
SEQ ID NO: 23 Sub6:
ATCACGCCTCguTCCtCCCAG
SEQ ID NO: 28 Sub49:
TAAACTTGGCTCguTGGCTGTGATA
. SEQ ID NO: 29 Sub55:
ACCGCACCTCguCCCGAGCTC
SEQ ID NO: 30 Sub60:
GCCAACCACguCCAACACGAC
SEQ ID NO: 73 Sub61:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO: 75 Sub72:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG '
SEQ ID NO: 77 Sub74:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO: 78 Sub75;
TGACCCTCCTCguCTeCCÓACTA
SEQ ID NO: 80 Sub79:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO: 81 Sub80:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO: 88 Su 88:
CTCCTCCCTCguCQCCAGCTC
4.3. 8an&na± objetivo y abádoz** PCR para mmplit±OMa±ón dm lom gn m CYP2C9, TP33, 2M, BBS, TFRC y R½2J« . . ··' _ · ·. '
El ADN genóraico humano extraído de: línea de célula IM9 (Promega) se usó como plantilla para, amplificación in vitró de los genes objetivo.. Se generaron los amplicones por qPCR
usando los cebadores PCR de oligonucleótido enlistados enseguida. Las secuencias de cebador son enlistadas desde 5' hasta .3'. La secuencia en negrita en las secuencias dé cebador corresponde a una etiqueta universal (Ul, 02 o U3) que incrementa el Tm del cebador sin afectar la espécificidad del cebador al objetivo del gen. Esta etiqueta mejora la amplificación eficientemente en reacciones PCR.
SEQ ID NO: 91 Cebador delantero 5TFRC_ül
QCllUkAACAATAACTCAGAACTTACG
SEQ ID NO: 92 Cebador inverso . 3TFRC_ü
CakeCTTTCTGAGGTTACCATCCTA
SEQ ID NO: 123 Cebador delantero 5B2M_ül
OCT-ATCTTTTCCCGATAtTCCTCAG
SEQ ID NO: 12 Cebador inverso 3B2MJJ2 ;
CMCCCAGACACATAGCAATTCAG
SEQ ID NO: 125 Cebador delantero 5TP53JJ3
CaaükCTTACTGCCTCTTGCTTCTC
SEQ ID NO: 126 Cebador inverso 3TP53JD2.
OHeCTCTGTGCGCCGGTCTCTC
SEQ ID NO: 127 Cebador delantero 5RPL13a_03
CTJUkACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
SEQ ID NO: 128 Cebador inverso 3RPL13a_.02
C3M3GAGGAÁTTAACAGTCTTTATTGG
SEQ ID NO: 129 Cebador delantero 5CYP2C903
CTAACCTCATGACGCTGCGGAA
SEQ ID NO: 130. Cebador inverso . 3CYP2C9 02
CASATATGGAGTAGGGTCACCCA SEQ ID NO: 131 Cebador delantero 5HMBS_ü3
CTfcAACCCACACACAGCCTACTTTC
SEO ID NO: 132' Cebador inverso 3HMBS_02;
CAGAGCCCAAAGTGTGCTGGTCA
4.4. Ccmpanmf* á rmaaalón: *mp11f1ameiÓB y cuantifia*ai6n d mmaamnaím cbjmtivo
La amplificación PCR en tiempo real y la detección de la secuencia objetivó. se realizó en un. volumen de reacción total de 25 µ??. Todas las reacciones se condujeron en un Sistema de Detección PCR en . Tiempo Real CFX96 (Bió-Rad) . Las reacciones se establecieron con sustratos y sus partzimas asociadas como en la tabla 13. Los parámetros de ciclizado fueron cualquiera de; , '
1) 95°C por 2 minutos, 50 ciclos de 95*C por Í5 segundos y 52°C por 60 segundos (datos colectados en la etapa de 52°C) o
2) 95°C por. 2 minutos, 50 ciclos de 95eC por 15 segundos y 58°C por 60 segundos (datós colectados en la etapa de 58°C) .
Cada conjunto de condiciones de reacción se corrió por
duplicado y contiene cebador delantero 40 nM y 200 nM de cebádor inverso, 200 nM de cada uno de partzima A y partzima B, sustrato 200 nM, 8 mM de MgC±2/ 200 uM de cada uno de dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe ARNsa (Bioline), 1 x Immobuffer (Bioline) , 2 unidades de polimerasa de AON MyTaqHS"* (Bioline) y ya sea plantilla de ADN genómico (100 ng) o no objetivo .(NF-H20) .
Tabla 13: Coibinaeienaa da oligonudeótido usados par* oáda a atrao universal
4.5. Rmsultmdom: *mpl±£la*c±ón dm objetivo y mmoimión dm umtx to portero .
Cada reacción qPCR de MNAzima que contienen ADN genómico humano muestra üri incremento en fluorescencia con el tiempo para la detección en tiempo real de los genes CYP2C9, TP53, B2M, HMBS, RPL13a. y. TPRC, en temperaturas de combinación en su pares base dé tanto 52°C como 58°C (Figura 7). Para todos los sustratos universales, la fluorescencia 5 del control objetivo no de ADN fue tan baja como las de las reacciones que contienén ADN Objetivo. Esto demuestra que el incremento en fluorescencia producida en reacciones que contienen
objetivo se debe a ensamblado dependiente del objetivo.de
··· '. · * * * · ·
MNAzima catalíticamente activas que luego escinden uno de los sustratos universales reporteros.
Los resultados . de la detección qPGR de MÁzima de los genes CYP2C9 y TP53 muestra que todos los sustratos universales probados Se desempeñan equivalente a.52*0 con menos de 0.5 Ct de diferencia entre los ... sustratos y pendientes similares de las curvas de amplificación (Tabla 14 y Figura 7, (i) a y (ii)a respectivamente). Los sustratos de serie 1 probados (Sub3 y Sub6) se desempeñan peor en las ·.· temperaturas más altas de 58 *G que. los sustratos de serie 3 probados (Sub61, Sub72, Sub74 y Sub79) con una .diferencia de más de 1 Ct entre los sustratos y una pendiente mucho menos acentuada para las : curvas de amplificación para Sub3 y Sub6 lo que indica una reacción menos eficiente (Tabla 14 y Figura 7, (i)b y (ii)b respectivamente).. Estos datos muestran .que el diseño mejorado de estos sustratos serie 3 (Sub61, Súb72, Sub74 y Sub79) lleva a una escisión más eficiente a 58eC, y que esto mejora el desempeño a temperaturas elevadas sin prevenir que estos sustratos se escindan eficientemente a una · temperatura más baja.
Los resultados, de la detección qPCR de MNAzima de los genes B2M y HMBS muestra que todos los sustratos universales probados se desempeñan equivalentemente a 52*C sólo con
aproximadamente 0.5 Ct de diferencia éntre los sustratos y pendientes similares de las curvas de amplificación. (Tabla 14 y Figura 7, (iii)á y (iv)a respectivamente). Los sustratos de la serie 2 probados (Sub60 y Sub49) sé desempeñan peor en las temperaturas más altas de 58*C que los sustratos de serie .3 probados (Sub61 y Sub75, y Sub79) con una diferencia de más de 1 Ct entre los sustratos y una pendiente menos acentuada para las curvas de amplificación para Sub60 y Sub49 ló que indica una reacción menos eficiente (Tabla 14 y Figura 7, (iii)b y (iv.)b respectivamente). Estos datos muestran que el diseño mejorado de estos sustratos serie 3 (Sub61, Sub75 .y Sub79) lleva una escisión más eficiente a 58°C,. pero que esto mejora el desempeño a temperaturas elevadas sin prevenir qué los sustratos se escindan eficientemente a una temperatura más baja. El mejor desempeño de los sustratos de serie 3 contra los sustratos de la serié 2 a 58*C se atribuye al hecho de que los sustratos de . serie 3 siguen todas las guias de diseño para sustratos altamente activos y los sustratos de la serie 2 no (ver Tabla 9).
Los resultados de la detección qPCR de MÁzima del gén
TFRC muestran que ^odos los sustratos üniyersalés probados se desempeñan equivalente a 52°C sólo con aproximadamente 0.5 Ct dé. diferencia entre los sustratos y pendientes similares de las curvas de amplificación (Tabla 14 y Figura 7, (v)a). Los
sustratos de serie 3 probados (Sub72. y Sub80) ambos se desempeñan mejor a 58*C que el sustrato de serie 1 probado (Sub2) con una diferencia de más de 1 Ct entre los sustratos y una . pendiente menos acentuada para la curva de amplificación para Sub2 lo que indica una reacción menos eficiente (Tabla 14 y Figura 7, (v)b)..El sustrato serie 3, Sub80, se desenipeña mejor a 58°C que 1 sustrato serie 3, Sub72, con más de .1 Ct de diferencia entre los sustratos. Sub80 sigue todas las guias de diseño para sustratos altamente activos y Sub72 no (ver' Tabla 9) .
Los. resultados de la detección qPCR de MNAzima del gen RPL13a muestra que a 52°C el sustrato de serié 2 Sub55 y el sustrato serie 3 Sub88 fueron mejores que el sustrato serie 3 Sub80 (Tabla 14 y Figura 7, (vi) a)..A 58°C el sustrato serie 3 Sub80 y el Sub55 serie 2 se desempeñan igual, y ambos de estos sustratos se desempeñan mejor que el sustrato serie.3 Sub88 (Tabla 14 y Figura 7, (vi)b) . El sustrato de serie 2 Sub55 cumple todas las guias de diseño para sustratos altamente activos (ver Tabla 9) y por lo tanto debería esperarse que se desempeñe bien.. El Sub88 serie .3 también cumple todas las guias de diseño para sustratos altamente activos (Tabla 9). pero no se desempeña tan bien como Sub55. En "general, las guias de diseño . muestran una alta probabilidad de producir sustratos que se . escinden
eficientemente bajo condiciones qPCR de MNAzima.
En general, con un intervalo de secuencias objetivo diferentes, los . sustratos serie 1, 2 y 3 se desempeñan comparablémente en qPCR MNAzima realizada á 52°C. A 58°C, los sustratos de serie 3 superan los . sustratos serie y 2, con l excepción del. sustrato de serie 2 Sub55 que, como se explica anteriormente,* cae dentro de todas las guias de diseño para sustratos altamente activos. Estos datos muestran qué las guias de diseño, en general, producen sustratos que son robustos y eficientemente escindidos en un intervalo de temperaturas en el contexto de protocolos termociclicos usados para qPCR.
Notar qué en algunos de los. sustratos de serie 3, indicados por (A) en la Tabla 14, hay Tm's muy altas, y por lo tanto temperaturas, más bajas estos pueden tener una rotación más pobre sobre la del sustrato escindido, y por lo tanto aunque lá actividad es comparable a de ios otros sustratos, el valor de fluorescencia final es más bajo.
Tabla 14. Sustrato —cindidoa por MNasiaas dirigido* a difarantas ganas.
*La forma d,e la cürva de amplificación (cambio ascendente, y tiempo tomado para alcan2ar meseta) demuestra la reacción eficientemente. . . .
A Tm de estos sustratos es muy alto, para temperaturas de reacción más bajas y esto puede resultar en rotación pobre
sobre la de las porciones escindidas del sustrato y de esta manera disminuir los valores de fluorescencia finales.
Sjoaplo 5: Uso dt tnf ntot universal** con ADN*iaas
La ADNzima 10-23 es una estructura unimolecular qué puede unirse directamente a, y modificar/ una secuencia de sustrato. La ADNzima 10-23 tiene utilidad en aplicaciones de diagnóstico in vitro. Debido a la similitud en la región catalítica, la ADNzima 10-23 puede unir y escindir sustratos que son escindiblés por. la MNAzimá con base en la ADNzima 10-23.. Al contrario ·. de la MNAzima, . la ADNzima no necesita una secuencia objetivo para formar el núcleo activo, y por lo tanto la unión y posterior escisión del sustrato por la ADNzima 10-23 no está influenciado por la secuencia objetivo y no utiliza un núcleo catalítico de separación. La capacidad de las ADNzimas 10-23 emparejadas para escindir los sustratos universales serie 1 (Sub2, · Sub3, y Sub6) , los sustratos universales serie 2 (Sub44, Sub45, Sub49, Sub55 y Sub60T) y lós sustratos de serie 3 (Sub61, Sub72, Sub73, Sub74, Súb S, Sub77, Sub79, Sub80 Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88, y Sub89) se midió para determinar si las guías de diseñó de la presente invención llevan al desarrollo de sustratos que pueden: ser escindidos por la ADNzima 10-23 con alta actividad y fuertemente sobre. urt intervalo de temperaturas.
5.1. OUgouaalmótídm dm JUXTMÍM* 10-23
Una serle de ADNzlmas 10-23 se diseñaron con extremidades sensibles complementariamente a los sustratos descritos anteriormente y. enlistados en las Tablas .4 5. L s secuencias de las ADNzlmas se enlistan enseguida desde 5' hasta 3', donde las bases subrayadas hibridizan al sustrato y las bases en cursivas forman el núcleo catalítico. Algunas secuencias de ADNzlma enseguida contienen un 6 extra en todos los extremos 5r y 3' (por ejemplo Dz55) . Estas bases agregadas no se hibridizan con los sustratos y no impactan en la eficiencia en la cual la ADNzlma escinde el sustrato.
SEQ ID NO: 133 ADNzlma Dz2
TGCCCAGGGAGGCTAgCTACAACGAGAGGAAACCTT
SEQ ID NO: 13 ADNzima Dz3
: CGGTTGGTGAGGCTÁGCTACAACGAGGTTGTGCTG
SEQ ID NO: 135. DNzlma Dz6
CTGGGAGGAAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGAT SEQ ID NO: 136 ADNzima Dz44 .
TCACTATAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO: 137 ADNzima Dz45
TTCCAAAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGACCCGT
SEQ ID NO: 138. ADNzima Dz49
TATCACAGCCAAGGCTAGCTACAACGAGAGCCAAGTTTA
SEQ ID NO: 139 ADNzima Dz55
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG SEQ ID NO: 140 ADNzima Dz60
GTCGTGTTGGAGGCTAgCTÁCAACGAGTGGTTGGC
SEQ ID NO: 141 ADNzima Dz61
GTGGCGTGGAGAGGCTAGCTACAACGAGGGGTCGAGG '. SEQ ID NO: 142 ADNzima Dz72
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG SEQ ID NO: 143 ADNzima Dz73
GCACGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGACGCCAG SEQ ID NO: 144 ADNzima Dz74
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG SEQ ID NO: 145 ADNzima Dz75
GTAGTGGGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGGGTCAG SEQ ID NO: 146 ADNzima Dz77
GAGGAGGAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGAGGAGG SEQ ID NO: 147 ADNzima Dz79
GGGTTGAAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGAGGAG
SEQ ID NO: 148 ADNzima Dz80
GGGTTCACGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGGCGGTTGG SEQ ID NO: 149 ADNzima Dz84
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTCCGGTG SÉQ ID NÓ: 150 ADNzima Dz85
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
SEQ ID NO: 151 ADNzima Dz86
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG SEQ ID NO: 152 ADNzima Dz87
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG SEQ ID NO: 153 ADNzima Dz88
GGAGCTGGGGAGGCTÁGCTÁCAACGAGAGGGAGGAGG SEQ ID NO: 154 ADNzima Dz89
GAGGAGGAGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
5.2. Sustrmtom xmportro*
En el ejemplo actual, los sustratos se etiquetaron al final con una porción 6-FAM en el extremo 5' (indicado por un *F* en el nombre de los sustratos enseguida) y una porción de apagador Iowa Black® FQ en el extremo 3' (indicado por á "IB" en el nombre de los sustratos enseguida) . La escisión de los sustratos se vigiló entre 510-530 nm intervalo de longitud de onda de emisión FÁM en GFX96 (BioRad) ) con excitación entre 450-490 nm intervalo de longitud de. onda de excitación FAM en CFX96 (BioRad)). Los sustratos reporteros para este ejemplo se muestran enseguida con la secuencia, 5' hasta 3'. Las bases en minúscula representan ARN y las bases en mayúscula representan ADN.
SEQ ID NO: 21 Sub2-FIB:
AAGGTTTCCTCguGCCTGGGCÁ
SEQ ID NO: 22 Sub3-FIB: CAGCACAACCguCÁCCAACCG
SEQ ID NO: 23 Sub6-FIB: ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 25 Sub44-FIB: CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA SEQ ID NO: 26 Sub45-FIB: ACGGGTCCCgüCTCCTTTGGAA SEQ ID NO: 28 Sub49-FB: TAAACTTGGCTCgüTGGCTGTGATA . SEQ ID NO: 29 Sub55-FIB: ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 72 Sub60T-FIB: TGCCAACCACguCCAACACGAC SEQ ID NO: 73 Sub61-FIB: CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO: 75 Stab72-FIB: ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG SEQ ID NO: 76 Sub73-FB: TGGCGTCCCCguCCCCTCGTG
SEQ ID NO: 77 Sub74-FIB: ATCACTCCCCguGCCCTCCCAG SEQ ID NO: 78 Sub75-FIB: TGACCCTCCTCguCTCCCCACTA
SEQ ID NO: 79 Sub77-FB:
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
; SEQ ID NO: 80 Sub79^FIB:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO: 81 Sub80-FIB:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO: 84 Sub84-FIB:
ACCGCACCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 85 Sub85-FIB:
ACCGCACCTCguCCCGTCCCAG
SEQ ID NO: 86 Sub86-FIB:
ATCACGCCTCgupCCCAGCTC
' SÉQ ID NO: 87 Sub87-FIB:
ATCACTCCCCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 88 Sub88-FIB:
CTCCTCCCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NOí 89 Sub89-FIB:
ACCGCACCTCguCCCTCCTCCT
5.3, Copoamitmm dm mecida: Escisión d un «o* rato peor n» AOtMlmm m tmaprmtur— ntx 509C y 60*C
La escisión de un sustrato se midió por un incremento en séftal fluorescente causada por la unión y posterior escisión por una ADNzima emparejada. Las reacciones separadas se
establecierón para medir la escisión de cada sustrato con su ADNzima emparejada (oligonucleótidos como en la Tabla 15) . Las reacciones que contienen 1 x Solución Amortiguadora II PCR (Applied Biosystems), MgCl2 10 mM, Sustrato 200 nM y NF-H2O en un. volumen total de 25 uL. Cada reacción se corrió por duplicado ya sea como una reacción de "prueba" (adición de ADNzima 1 nM) o "control" (adición de NF-H20) . Las reacciones se realizaron en un sistema de Detección dePCR en Tiempo Real CFX96«* (BioRad) a 5F, .52, 54 56, 58. y 60°C. La fluorescencia para, cada reacción se programó para leerse después de 1 segundo para los primeros 50 ciclos y luego se programa para leerse después de 25 segundos para ios siguientes 50 ciclos.
Tabla 15: JUBfaima» probada» con sustrato* «aparajado»
5.5. Rmsn
Cada reacción de prueba que contiene ADNzimas con sustratos emparejados muestra un incremento en fluorescencia con el: tiempo. No hubo incremento, en. la fluorescencia del ag a sólo reacciones de control (no se agrega ADNzima) . Esto demuestra que el incremento en fluorescencia producida en las reacciones que contienen ADNzima se debió a la unión y posterior escisión catalítica del sustrato reportero por la ADNzima.
Para cada conjunto de datos de sustrato (reacciones de prueba y control) , los puntos de datos de fluorescencia purps se exportaron en Excel (Microsoft), los . valores duplicados se promediaron y luego normalizaron. La normalización se realizó
al dividir cada uno del punto de datos promediados por el valor promedio de la reacción no de ADNzima en la primera lectura de reacciones gue contienen el mismo sustrato (por ejemplo los datos promediados para las reacciones de prueba para Sub61 se dividió .por la fluorescencia promediada en el ciclo 1 para la reacción de control no de Sub61 ADNzima; los datos promediados para las reacciones de control no de ADNzima para Sub61 se dividió por la fluorescencia promediada eri el ciclo 1 para la reacción de control.. no . de. Sub61 ADNzima.) Estos datos normalizados fueron usados entonces para calcular la señal a relación de ruido, en aproximadamente 10 minutos después del inicio de la reacción, al dividir la fluorescencia normalizada de la reacción de prueba a 10 minutos por la fluorescencia normalizada de la reacción no de ADNzima a 10 minutos. Este cálculo de señal a ruido se realizó por cada combinación de ADNzima y sustrato y en cada una de la temperatura probada. La señal para valor de ruido s colocó entonces en 'gráfica en una gráfica de barras para comparar la eficiencia de escisión de cada uno, del sustrato por su ADNzima emparejada en las diversas temperaturas (Figura 8, (i)). La desviación estándar de la señal a relación de ruido para cada sustrato sobre el intervalo de temperatura también se. calculó y colocó e gráfica para determinar sustratos con señal a ruido consistente sobre el
intervalo probado de. temperaturas (Figura 8, (ü) ) · Esto sugiere . que estos sustratos son robustos con respecto . a temperatura.
Debido al error experimental no hubo datos para Sub2 a 54*C o para Sub79 a 58eC, sin embargo esto tuyo impacto mínimo en la interpretación general de los datos.
El análisis de la señal a relación de ruido para cada sustrato (Figura 8, (i) ) muestra que los sustratos de serie.1 (Sub2, Sub3 Sub6) . tienen señal alta a ruido en las temperaturas más bajas medidas. Sin embargo la eficiencia de escisión de estos sustratos cae dramáticamente conforme la temperatura de reacción se incrementó. Se observó un. patrón similar para un sübconjunto de los sustratos de la serie 2 (Sub44, Sub45, Sub4? y Sub60T) . El otro sustrato setie 2 (Sub55), y la mayóriá de los sustratos de serie 3 próbadps (Sub61, Sub72¿ Sub74, Süb75, Sub79,. Sub8.0, Sub84, Sub85, Sub86, Sub87, Süb88 y Sub89) exhiben señal alta a ruido a través de todas las temperaturas probadas. Los sustratos de serie 3 Sub73 y Sub77 tienen señal a ruido uniformemente baja en todas las temperaturas probadas lo que indica que aunque las guias de diseño nuevas proporcionan una - buena probabilidad de diseño de sustratos robustos (8.3% de relación de éxito para esta aplicación), todávia habrá algunas secuencias ..que cumplan éstas guias pero ,que no son apropiadas
para un subconjunto de aplicaclónés de diagnóstico MNAzima y/o ADNzima. Los resultados para Sub73 y Sub77 también prueba que los métodos que utilizan ADNzimas para selección en masa de secuencias de sustratos potenciales para encontrar aquellas que son apropiadas para aplicaciones de diagnóstico MNAzima pueden perderse en la detección de sustratos que serían fuerte y eficientemente escindidos por MNAzimas en aplicaciones qPCR y vice versa (ver Ejemplo 2 para la utilización exitosa de Sub73 y Süb77 en MNAzima qPCR, ;Figura 5).
En general, la mayoría . de los sustratos que están conforme a todas las guías de diseño (Tabla 9) muestra una señal mayor a relación de ruido a través del intervalo de temperatura probado que los sustratos que caen fuera de una o más de estas guías (Figura 8, (i)). Más específicamente reacciones con Sub55, Sub61, Sub72, Sub74, ;Sub75, Sub79, Süb80, Sub8 , Sub85, . Sub86, Sub87, Sub88 y Sub89 exhiben señal, alta para valores de ruido en cada temperatura probada, lo que demuestra que estos son sustratos robustos sobre un intervalo de temperaturas. Esta mejora fue además evidente cuando la desviación estándar se calculó á partir de la señal a relación de ruido que cruzan las temperaturas para cada sustrato (Figura 8, (ii)). Esta medida de variabilidad indica que, sobre el intervalo de temperatura probado, el sustrato
de la serie 2 SubS5, y los sustratos dé serie 3 Sub61> Sub72 Sub74, Sub75, Sub79, ·, Sub80, Sub82, Sub83, Sub85, Sub86, Sub87, Sub88 y. Süb89, tienen señal a ruido similar a través de . las temperaturas \ probadas . lo que demuestra que son sustratos robustos que cruzan un amplio intervalo de temperatura. Notar que aunque Sub60T, Sub73 y Sub77 demuestran una baja desviación estándar en señal a ruido sobre el intervalo de temperatura, la señal a ruido absoluta es muy baja en todas las temperaturas lo que excluye estos sustratos de ser un sustrato robusto en esta aplicación.
Bjaaplo 6: Frotba para aaeiaióa da auaratoa univaraalaa no •spaeifiea oon MHAsima qFCR.
. Las MNAzimas pueden usarse para vigilar la amplificación de ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando métodos de amplificación objetivo in vítro tal como PCR. Se realizan la amplificación y detección en ün proceso de una etapa, en donde la amplificación PCR y la detección mediada por MAzima se presentan, simultáneamente en un tubo sencillo. Pueden amplificarse y detectarse objetivos múltiples en un recipiente de reacción sencillo usando partzimas con extremidades sensibles objetivo especificas para los objetivos individuales. Las partzimas para la detección de ün primer objetivo se unirán a y escindirán un primer sustrato, las partzimas para la detección
de un segundo objetivó se unirán a y. escindirán ún segundo sustrato etc. Para la detección de objetivos a ser específicos, puede no haber escisión no especifica de un sustrato por partzimas diseñadas para escindir cualquier otro sustrato en la mezcla de reacción.
El grado de complementariedad de ' las extremidades sensibles del sustrato de MNAzimá partzimas con otros sustratos presentes en la reacción impacta en la especificidad de la unión. La complementariedad. completa de bases más cercanas a los ribonucleótidos son más cruciales para la escisión especifica. Las guias de diseño para creación de sustrato universales eficientemente escindidos incluyen limitar alrededor de la composición dé secuencia de sustratos universales es decir siete o más nucléótidos de citosina en las. diez bases que rodean los ribonucleótidos (N4-N13) ; las bases inmediatamente adyacentes . a los ribonucleótidos son citosinas (N8 y N9) ; el contenido total de sustrato tiene >64% de pirimidinas. Estás limitaciones pueden llevar a similitudes en la secuencia del sustrato cercanas, a los ribonucleótidos, y resultan posiblémente en escisión no especifica de un sustrato .universal al emparejar parcialmente partzimas, especialmente en un formato multiplex donde un intervalo de sustratos universales se presentan, con süs partzimas asociadas en. una mezcla de reacción sencilla. Si ún
sustrato es escindido en una . manera no especifica al emparejar parcialmente partzimas . diseñadas para escindir específicamente un segundo sustrato, entonces tal combinación particular de sustratos puede no ser apropiada paira uso en formato multiplex.
En este ejemplo, los sustratos universales Sub44, Sub55, Sub61, . Sub65, Sub72 y. Sub74 se probaron para actividad de escisión no especifica por las partzimas asociadas con Sub44, Sub55, Sub72 y Sub74. Esto involucra probar cada sustrato universal individualmente con pares de partzima diseñados para unir con la complementariedad completa a los otros sustratos para ver si se detectó una señal en un formato MAzima qPCR. Las partzimas de Sub72 y Sub74 se eligieron para esta prueba ya que sus sustratos respectivos difieren sólo por 3 bases (Tigúra 9, (i) a y (ii)a). Las partzimas .de Sub55 se eligieron para ser probadas con Sub61 y Sub65 ya que son muy similares en ·' la región central alrededor de los ribonucleótidos (¿UrNu) (Figura 9, (iii)a). Las partzimas de Sub44 se eligieron como un control ya que son menos similares a los otros sustratos (Figura 9, (iv)a).
6.1. Olágomalmótidom á Pártela»
En los experimentos conducidos para probar la escisión especifica por . partzimas no complementarias,
oligonucleótidos de partzima A y B se diseñaron con extremidades sensibles objetivo complementariamente al gen RPL13a humano y extremidades sensibles del sustrato complementariamente a cada uno de los sustratos universales como se discute anteriormente. Las secuencias de las partzimas A y B se enlistan enseguida desde 5' hasta 3', donde las bases subrayadas hibridizan al sustrato. El "-p" indica fosforilación.3' del oligonucleótido.
SEQ ID NO: 155 partzima A RPL13aA/44-P:
AATTGACAAATACÁCAGAGGTCACAACGAGAGGAGACCTG
SEQ ID NO: 156 partzima B RPL13aB/44-P:
TCACTATAGGGAGGCrAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO: 118 partzima A RPL13aA/55-P
TTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGTGCGGT SEQ ID NO: .119 partzima B RPL13aB/55-P
GAGCTGGGGAGGCTÁGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO: 157 partzima A RPL13aA/72-P:
AATtGACAAATACACÁGAGGTCACAACGAGAGGCGTGAT
SEQ ID NO: 158 partzima B RPL13aB/72-P: ;
CTGGGAGGAGAGGGTAGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO: 159 partzima A RPL13aA 74-P:
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGGGGAGTGAT
SEQ ID NO: 160 partzima B RPL13aB/74-P:
CTGGGAGGGGAGGCTAGGTCTCAAGACCCACGGAiCTCCT
6,2. Sustratos xsportmrom
En el ejemplo actual, los sustratos se etiquetaron al final con una porción 6-FAM en el extremo 5' (indicado por un en el nombre dé los sustratos enseguida) y una porción de apagador Iowa Black® FQ en el extremo. 3' (indicado por un IB" en el nombre e los sustratos enseguida) . La escisión de los sustratos se vigiló a 530 nm (longitud de onda de emisión FAM) con éxcitacióñ a 485 nm (longitud de onda de emisión FAM) . Los sustratos reporteros para este ejemplo sé muestran enseguida con . la secuencia, 5' hasta 3'. Las bases éh minúscula representan' ARN y las bases en mayúscula representan ADN.
SEQ ID NO: 25 Sub44-FB:
CAGGTCTCCTCguCCCTATAGTGA
SEQ ID NO: 29 Sub55-FB:
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
SEQ ID NO: 73 Sub61-FB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO: 74 Sub65-FB:
TCTCGACCTCguC CCACGCCA
SEQ ID NO: 75 ·;' Sub'72-FB:
ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 77 Sub74-FB:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
6.3. S*au*nó±* objetivo y cbMdorms PCR para •wpli ioaióu d KPL13m
La secuencia objetivo para este ejemplo fue un amplicón PCR del gen RPL13a generado por amplificación PCR in vitro de ADN genómico humano extraído de la línea de célula IM9 (Promega) usando los cebadores PCR de oligonucleótido enlistados enseguida. Los sustratos, reporteros para este ejemplo se muestran enseguida con la secuencia, 5' hasta 3'.
SEQ ID NO: 161 Cebador delantero 5RPL13a:
ACCGGAAGAAGAAACAGCTCA
SEQ ID NO.: 162 Cebador inverso 3RPL13á:
GAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
6.4, C pcmmntmm d xmaaión: AwpUfiaaión y amdiaión dm ma±m±ÓD. dm uBtxmtcm vnivrmal mmpmcifiem y no mmpmoiíla*
La amplificación PCR en tiempo real y la detección de. la secuencia objetivo se realizó en u volumen de reacción totál de 25 uL. Todas las reacciones se condujeron en un sistema Mx3005P QPCR (Stratagene) . Los parámetros de . ciclizado fueron, 95eC por 2 minutos, 40 ciclos de 95°C por 15 segundos y 52°C por 60 segundos (datos colectados en 52°C) . Las reacciones se establecieron con sustratos y partzimas como en la Tabla 16. Cada conjunto de condiciones de. reacción fue probado por duplicado y contienen 5RPL13a 40 riM y 200 nM de
3RPL13a¿ 200 nM de. partzima A, partzima B 200 nM, sustrato 200 nM, MgCl2 8 mM, 200 uM de cada uno de dNTP, 10 unidades de ARNsin (Promegá), 1 x Immobuffer (Bioline) , 2 unidades de de polimerasa de ADN M^rTagMe** (Bioline) y plantilla de ADN ya sea genómico (50 ng) o no objetivo (NF-H20) .
Tabla 16: Coalbinaoianas da partsiaa usadas para oada sustrato uaivarsal
6.5. Smsalt*dam: mdición d meclsión msj cític* y no •ep*e££±e* potneiml por tau WO imm
Hubo un Incremento en fluorescencia en todas las reacciones qué. contienen ÁDN genómico y un sustrato universal con partzimas con extremidades sensibles del; sustrato que fueron completamente complementarias al sustrato universal (es decir reacciones prueba para la escisión especifica). La fluorescencia dé los controles objetivo no de AD fue más baja que la fluorescencia en prueba, de reacciones para la escisión especifica, lo que demuestra que el incremento en la fluorescencia en prueba de reacciones · pará la escisión especifica se debió al ensamblado dependiente del objetivo de MNAzima catalíticamente activas que . luego escinden los sustratos universales reporteros completamente complementarios.
No hubo incremento - en la fluorescencia en ninguna reacción, que prueba la reactividad cruzada (Figura 9, (i)b - (iv)b) . Esto demuestra que las partzimas diseñadas para escindir estos sustratos univérsales « cercanamente relacionados sólo escinden sustratos con los cuales tienen complementariedad completa. Estos datos muestran que estos sustratos universales son compatibles en ensayos MNAzima qPCR multiplex.
175 . ·· ··:
K ipio 7: Prueba para aseisión ida sustrato* universales no especifica con ADNsiaas
La ADNzima 10-23 es una estructura uñímolecúlar. que puede unirse directamente, a y modificar una secuencia de. sustrato. Al contrario de la MNAzima, la ADNzima 10-23 no necesita una secuencia objetivo para formar el núcleo activó por lo tanto la unión y posterior escisión del sustrato por la ADNzima 10-23 no está influenciado pór la secuencia objetivo o. tiene un núcleo catalítico de separación. .
El grado de complementariedad de las extremidades sensibles de ADNzimas con el sustrato impacta en la especificidad de la unión. La complementariedad completa de bases más cercanas . a los ribonucleótidos son más. cruciales para la escisión especifica. Las gulas de. diseño para creación de sustrato universales eficientemente escindidos incluyen limitar alrededor de la composición dé secuencia de sustratos universales es decir siete o más nucleótidos de citosiná en las diez bases que rodean los ribonucleótidos (N4-N13) ; las bases . inmediatamente adyacentes a los ribonucleótidos son citosinas (N$ y N9) ; el contenido total de sustrato tiene >64% pirimidinas. Estas limitaciones pueden llevar a similitudes en la secuencia del sustrato cercanas a los ribonucleótidos, y resultan posiblemente en escisión no especifica de un' sustrato universal al emparejar parcialmente
ADNzimas, especialmente en un formato multiplex donde un intervalo de sustratos universales se presentan con su ADNzimas asociadas en una mezcla de reacción sencilla. Si ún sustrato es esci *ndi·do· en una mane·ra no especifica' . al emparejar parcialmente ADNzimas diseñadas para escindir específicamente un .segundo sustrato, entonces tal combinación particular de sustratos puede no ser apropiada para uso ién formato multiplex.
En este ejemplo, los sustratos universales Sub55, Sub61, Sub72, Sub74, Sub75, Sub79, Sub80 y Sub85 y sus ADNzimas 10-23 asociadas sé probaron para actividad de escisión no específica. Esto involucra probar cada . sustrato universal individualmente con las ADNzimas diseñadas par unir con la complementariedad .completa a todos ios otros sustratos para apreciar sü la señal pudiera detectarse en un formato de detección isotérmico. Estos sustratos se eligieron para ser probados ya que tienen secuencias similares en diferentes áreas del sustrato.
7.1. Ollgoaaalmótldom dm JUHkiae 10-23
. Las ADNzimas 10-23 ' usadas en los experimentos conducidos para probar para Escisión no especifica por ADNzimas no complementarias se. enlistan enseguida; desde .5' hasta 3', donde las bases subrayadas hibridizán al sustrato y-las bases
en cursivas forman el núcleo catalítico. Algunas, secuencias de ADNzima enseguida contienen un G extra en cada extremo 5' y 3'. Estas bases agregadas no hlbidrizan con la secuencia de sustrato y no impactan en la eficiencia en la cual la ADNzima escindide el sustrato.
SEQ ID NO: 139 ADNzima Dz55
GGAGCTGGGGAGGCTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
SEO ID NO: 141 ADNzima Dz61
GTGGCGTGGAGAGGCJAGCTACAACGAGGGGTCGAGG SEQ ID NO: 142 ADNzima Dz72
GCTGGGAGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGCGTGATG
SEQ ID NO: 14 ADNzima Dz74
GCTGGGAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGTGATG
SEQ ID NO: 145. ADNzima Dz75
GTAGTGGGGAGAGGCTAGCTACAACGAGAGGAGGGTCAG
SEQ ID NO: 147 AQNzima Dz79
GGGTTGAAGGGGAGGCTAGCTACAACGAGGGGAGAGGAG
SEQ ID NO: 148 ADNzima Dz80
GGGTTCACGGGAGGGTAGCTACAACGAGAGGGCGGTTGG SEQ ID NO: 150 ADNzima Dz85
GCTGGGAGGGGAGGGTAGCTACAACGAGAGGTGCGGTG
7.2. 8amtraom xtpoxfrzom
En el e emplo actual, los sustratos se etiquetaron ..al
final con una porció.n 6-FAM en el extremo 5' (indicado por un F" en el nombre de los sustratos enseguida) y una porción de apagador Iowa Black®. FQ en el éxtremo 3' (indicado por ún "IB en. el nombre de los sustratos enseguida). La escisión de los sustratos se vigiló entre 510-530 nm (intervalo de longitud de onda. de. emisión FAM on . CFX96 (BioRad) ) con excitación entre 450-490 nm (intervalo de longitud de onda de excitación FAM en CFX96 (BioRad) ) . Los sustratos reporteros para este ejemplo se. muestran enseguida con la secuencia, 5' hasta 3' . Las bases en minúscula representan ARN y las bases en mayúscula representan ADN.
SEQ ID NO: .29 Sub55-FIB:
ACCGCAdCTCguCCGCAGCTC
SEQ ID NO: 73 Süb61-FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO: 75 Sub72-FIB:
. ATCACGCCTCguCTCCTCCCAG
' SEQ ID NO: 7 Sub74-FIB:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO: 78 Sub75^FIB:
TGACCCTCCTCguCT CCCACTA
SEQ ID NO: 80 Sub79-FIB:
. TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO: .81 Sub80-FIB:
AACCGCCCTCguCCCGTGAACC
SEQ ID NO: 85 Sub85-FIB:
ACCGCACCTCguCCCCTCCCAG
'¦[-¦ · 5 7.S. Componontm d rmáeoión: Mmdieión do omeiáíón ospoelfíc* y no épooittQ* potencial dm muBtrmto* mi tmal m por una kOtMiMM ? 52*C y 58?C
La escisión de sustratos universales se midió al vigilar la señal fluorescente causada por la unió y posterior
10 modificación de .un sustrato por una ADNzima. La escisión de un sustrato universal por una ADNzima resultará en la separación del fluoróforo y apagador producidos en un incremento en fluorescencia. Todas las reacciones, como se resume en la Tabla 17/ contienen lx Solución Amortiguadora II
15 PCR (Applied Biosystems) , MgCl2 10 mM, Sustrato 200 nM y NF- H2O en un volumen total de 25 uL.. Cada reacción se . corrió por duplicado ya sea como una reacción dé Aprueba" (adición de ADNzima 10 nM) o "control" {adición de NF-H20) . Las reacciones sé realizaron en un Sistema de Detección PCR en
20 Tiempo Real CF%3&* (BioRad) a 52 y 58eC. La fluorescencia para cada reacción se programó para leerse después de 1 segundo para los primeros 50 ciclos y lüego se programa para leerse después de 25 segundos para los siguientes 50 ciclos.
Tabla 17: Combinaciones ADNzima-Sustrato probadas para escisión especifica ynó especifica
complementarias (prueba para la escisión especifica)
-ve; extremidades . de reacciones de control, sustrato y AD zima no completamente complementarias (prueba para escisión no especifica)
7.5. Rmmaltmdom: Mmdiclón dm mmotmión mmjpmeítiem y no epmeitiem potmneial dm mutxmtom unínmrmmlmm póx ana AONkiaa
Hubo un incremento en la fluorescencia en cada una de la reacción de Aprueba que contiene ADNzimas y sus sustratos completamente complementarios. No hubo incremento en la fluorescencia en ninguna reacción que no contenga ADNzima (No se agrega ADNzima). Ésto demuestra que el incremento en fluorescencia producida en las reacciones de. ^pruetaa' que contienen ADNzima se debió a la unión y posterior escisión catalitica del sustrato reportero por la. ADNzima.
Para cada conjunto de datos de sustrato (reacciones de prueba y control), los puntos de datos de fluorescencia puros se exportaron en Excel (Microsoft), los. alores duplicados se promediaron y luego normalizaron. La normalización se realizó al dividir, cada uno de punto de datos promediados. por el valor promedio de la reacción no de ADNzima. después de la primera lectura de reacciones que contienen el mismo sustrato (por ejemplo la fluorescencia promediada por la reacción de prueba para Sub61 se dividió .por la fluorescencia del ciclo 1 promediada (después, dé los primeros 8 segundos) para la reacción no de ADNzima Sub61; la fluorescencia promediada pOr lá reacción de control no de ADNzima para Sub61. se dividió por la fluorescencia del ciclo 1 promediada por la reacción de control no de ADNzima.) Estos datos normalizados fueron usados entonces par calcular la señal a relación de ruido a 10 minutos, al dividir la fluorescencia normalizada de prueba a 10 minutos por l fluorescencia normalizada no de ADNzima a 10 minutos. Este cálculo de señal a ruido se realizó para cada temperatura. La señal .a relación de ruido se colocó entonces en gráfica en una gráfica de barras para comparar la eficiencia, de escisión de cada sustrato universal^ con cada una de ADNzima en las diversas temperaturas probadas (Figura
Algunas reacciones ' con diversas combinaciones ;de
sustratos y ADNzimas no complementarias muestran un nivel de fluorescencia ligeramente elevado comparado con la reacción de control no de ADNzima emparejada. Esta 'señal no se incrementa con el tiempo y por lo tanto no es indicativa de escisión del sustrato universal por. la AD zima no complementaria. Las gráficas de detección que. muestran esta fluorescencia de respaldo horizontal todas tienen una señal a ruido de menos de 1.2. Cualquier reacción que muestra, una señal a ruido arriba de 1.2 por lo tanto se consideraron ya sea que (i) indican escisión de un sustrato universal (ya sea especifica o no especifica), o (ii) . indican que una combinación particular del · sustrato y ADNzima no complementaria produce un . nivel de ruido de respaldo que no se distinguirla de la escisión especifica cuando esté en un formato multiplex.
. .. Todas las combinaciones de sustratos universales con sus ADNzimas completamente emparejadas muestran relaciones' señal a ruido altas (arriba del umbral de 1.2) en ambas temperaturas probadas (Figura 10, (i) y (ii) ) .
No hubo escisión no especifica de los sustratos universales Sub61, Sub74, Sub75, Sub79 y SubSO por ninguna ADNzima no complementaria en cualquier temperatura (Figu a 10, . (i) y (ii)). r
A 52*C . algunos sustratos universales fueron escindidos
por las ADNzimas que fueron no completamente emplarejadas al sustrato (donde la escisión se define como una relación señal a ruido arriba . del umbral de 1.2 como se describe anteriormente) . Las combinaciones que muestran escisión no especifica fueron: Sub85¦ no específicamente .escindido por Dz55, Sub72. no específicamente escindido por Dz74 y Dz85, y Sub55 no específicamente escindido por Dz85 (Figura 10, (i)).
La escisión no especifica de Sub55 po Dz85 puede esperarse como Sub55 y Dz85 difiere sólo por cuatro bases. El alineado de Sub55 con Dz85 muestra las cuatro bases mal emparejadas en el extremo dista! de la e tremida de sustrato 3' lejos de la región critica adyacente a los ribonucleótidos (Tabla .18) . Además, una de las 4 bases és una G/T mal emparejada que es conocida en la técnica para unir con algo de afinidad, no obstante más débil que para emparejados. A/T y G/C. La escisión no específica de Sub85 por Dz55 también puedé esperarse como Sub85 y Dz55 difiere sólo por cinco bases y estas cinco bases mal emparejadas se encuentran en el extremo distal de la extremidad del
sustrato 3' lejos de la región crítica adyacente a los ribonucleótidos (Tabla 18). Sin embargo al contrario del escenario inverso .anterior, no hay G/T mal emparejadas presentes y por lo tanto parece que el Sub85 no escinde tan eficientemente como la combinación inversa de Sub55 -y
Dz85. .La escisión no . especifica de Sub72 por Dz74 puede esperarse como Sub72 y Sub74 difiere sólo por 3 bases. El alineado de Sub72 con Dz74 muestra que las dos mal emparejadas más cercanas a los ribonucleótidos son G/T mal emparejadas (Tabla 18). Esto también explica porque. Sub74 no está escindida por Dz72 como, las dos mal emparejadas que son C/A y se presenta muy cerca a los ribonucleótidos y esto es suficiente para incapacitar la escisión del sustrato por la AD zima (Tabla 18) . La escisión no especifica dé Sub72 por Dz85 puede explicarse por el . alineado de la secuencias en la Tabla 18, que muestra, que las bases mal emparejadas son principalmente G/T y esto podria por lo tanto llevar a Dz85 a unir y escindir Sub72. De nuevo, la situación invérsa de Dz72 que no escinde específicamente Sub85. no se esperarla cómo mal emparejadas relevantes que se vuelven las mal emparejadas C/A más desestabilizantes que al contrarió llevan a una unión suficientemente fuerte entre la ADNzima y el sustrato para llevar a la escisión.
Tabla 18. Alinaado da Sustrato* y ADNziaas donda sa obsarvó •seision no aspaeí£ioa.
ÁEscritura de secuencia de sustrato 5' hasta 3* y escritura de secuencia de ADNzima 3' hasta 5'. Las bases mal emparejadas están en negrita y subrayadas y las bases mal emparejadas que son G/T sólo están en negrita. Las. secuencias de núcleo ADNzima están en cursivas.
Al incrementar la temperatura de reacción hasta 58°C se crean condiciones: - más severas para hibridización de óligonucleótidos y resulta en la pérdida de casi toda la escisión no especifica, vista a 52°C (Figura .10, (ii).) . La única combinación de sustrato universal y ADNzima que muestra escisión no especifica a 58eC fue Sub55 siendo escindidos no específicamente por Dz85. Esta no especificidad se espera que sea como Sub55 y Dz85 difiere sólo por cuatro bases' y estas cuatro bases mal emparejadas se encuentran en el extremo distal de la extremidad del sustrato lejos de la región critica adyacente a los ribonucleótidos y una de las mal emparejadas es un G/T (Tabla 18) . Aunque sólo hay tres bases diferentes entre Sub72 y Sub74, estos tres mal emparejados base s presentan
en la región crítica cercana a los. ribonucleótidos y por lo tanto son más críticas para especificidad . y serán más desestabilizadas a temperaturas más altas que las condiciones más severas creada para. unión de
oligonucleótidos. . ' · "
Estos resultados demuestran que las guías dé diseño producen sustratos universales que pueden ser efectivamente multiplexados en. un intervalo de temperaturas para aplicaciones que involucran ADNzimas 10-23, Hay una ·. . .
necesidad para alguna optimización de la temperatura de reacción para proporcionar severidad suficiente de la unión para algunas combinaciones de sustratos pero en general las guías producen conjuntos de sustratos que pueden sér multiplexados. Alguien experto en el campo puede apreciar que la longitud del sustrato y extremidade de . unión de
ADNzimá pueden ajustarse para crear enlace más severo a temperaturas más bajas. y más altas.
Bjaaplo 8: Uso . da sustratos universal** oon MNAzima qPCR anltiplaxada para la ooant icaolón da cinco difarantas objativos da ácido nuolaloo an una raaooión anltiplaxada oon taaparatoras da ooablnaoion an sus paras basa da 52'C o 58*C.
Los objetivos múltiples pueden amplificarse y detectarse simultáneamente en tiempo real usando métodos de amplificación objetivo in vitro tal cómo qPCR. Además, la amplificación de los objetivos puede vigilarse simultáneamente en tiempo real en una reacción multiplexada
que comprende múltiples MNAzimas únicas. Cada MNAzima puede ser diséñada con extremidades sensibles especificas para un nobjetivo y extremidades de sustrato especificas para un miembro único de una serie de sustratos universales. Cada objetivo puede detectarse individualmente si cada tino de las series, de sustratos universales se etiqueta, con un fluoróforo diferente. La amplificación y la detección de ios objetivos múltiples se. realizan en un proceso de una etapa, en donde la amplificación PCR y detección mediada por MNAzima se presentan simultáneamente en un tubo sencillo. La vigilancia en tiempo real genera una curva de amplificación que puede indicar la eficiencia de una reacción por la forma de la curva (cambio ascendente y velocidad para alcanzar la meseta) .
La temperatura de combinación en sus pares base/detección para MNAzima qPCR usada en el campo es entre 50 y 54°C. Esta temperatura se dictaminó por el hecho - de que los sustratos universales conocidos en la técnica tienen una limitación en la temperatura a la cual estos se escindieron eficientemente con 54°C siendo el limite superior para escisión eficiente de los sustratos universales serie 1. Hay una necesidad para un panel de sustratos universales que puedan combinarse en una reacción multiplexada y eficientemente escindidos a temperaturas más .- altas; Esto no sólo permite mayor
flexibilidad en el diseño de cebadores y partzimas que se escindan en temperaturas más altas y la dirección de plantillas ricas en G/C, sino también permitirian detección de MNAzima qPCR para multiplexarse con .otras químicas en tiempo real bien conocidos en la técnica tal cómo TaqMan® en la cual los intervalos de temperatura de combinación en s s pares base/detección estándar es desde 60 - 65*C. La utilidad de sustratos universales seria mayormente incrementada si los sustratos que existen trabajan bien en un intervalo mayor de temperaturas.
En este ejemplo, dos reacciones multipléxadás se realizaron ambas comprenden MNAzimas diseñadas para detectar cinco objetivos diferentes, especialmente genes TFRC, HPRT, TP53, RPL13a y CYP2C9 humanos. En el Multiplexado 1, cada MNAzima objetivo fue diseñada para escindir uno de los sustratos universales serie 1, Sub2, Sub3, Sub4, Sub6 y Sub7 y en el Multiplexado 2 cada MNAzima objetivo fue diseñada para escindir uno de ios sustratos, universales serie 2 o 3 mejorados, Sub55, . Sub61, Sub7 , Sub79 y Sub8Ó. Se . apreciará que cualquier número de objetivos puede usarse de acuerdo con el método y que aquellos expertos en el campo pueden diseñar partzimas apropiadas para detectar cualquier objetivo.
Las dos reacciones multipléxadás . se compararon para
determinar la eficiencia de escisión de cada conjunto de sustratos universales al observar eri la forma de la curva (cambió ascendente y velocidad para alcanzar meseta). En este ejemplo, la amplificación y detección se comparan n temperatura favorable para todos los sustratos,.52*C, y una temperatura fuera .del intervalo -eficiente para sustratos de serie 1, 58*C.
8.1. Oligomtalmótido» d* pmxtmám
Las secuencias de las partzimas A y B para cada objetivo se enlistan enseguida desde 5' hasta 3' . Para cada objetivó, las partzimas se diseñaron para ser usadas con uno de. los sustratos . universales serie 1 originales y uno de los sustratos mejorados novedosos de la serie 3.. En las siguientes secuencias, las bases subrayadas hibridizan al sustrato. El indica fosforilación 3' del
oligonucleótido.
SEQ ID NO: 157 partzima A RPL13aA/6-P
AATTGACAAATACACAGAGGTCACAACGAGAGGCGTGAT SEQ ID NO: 163 partzima B RPL13aB/6rP
CTGGGAGGAAGGTÁGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT
SEQ ID NO: 120 partzima A RPL13aA/80-P
AATTGACAAATACACÁGAGGTCACAACGAGAGGGCGGTT
SEQ ID NO: 121 partzima B RPL13aB/80-P
GGTTCACGGGAGGCTÁGCTCTCAAGACCCACGGACTCCT SEQ ID NO: 96 partzima A CYP2C9Á/3-P GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGÁGGTTGTGCTG SEQ ID NO: 97 partzima B CYP2C9B/3÷P CGGTTGGTGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC SEQ ID NO: 98 partzima A CYP2C9A/61-P GGGAAGAGGAGCATTGAGGAACAACGAGGGGTCGAG SEQ ID NO: 99 partzima B CYP2C9B/61-P TGGCGTGGAGAGGCTAGCTCCGTGTTCAAGAGGAAGC SEQ ID NO: 164 partzima A TP53A/4-P GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGTGCGCCATG SEQ ID NO: 165 .partzima B TP53B/4-P: TACTTCTCCCAAGGCTAGCtCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG SEQ ID NO: 106 partzima A TP53A/79-P: GACGGAACAGCTTTGAGGTGACAACGAGGGGAGAGGA SEQ ID NO: 107 partzima B TP53B/79-P: GGTTGAAGGGGA6GCTAGCTCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG SEQ ID NO: 34 partzima A TFftCA/2-?: GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGAAACCTT SEQ ID NO: 35 partzima B TFRCB/2-P: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 58 partzima A TFRCA/74-P: GGAATATGGAÁGGAGACTGTCACAACGAGGGGAGTGAT SEQ ID NO: 59 ; partzima B TFRCB/74-P:
CTGGGAGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO: 166 partzima A HPRTA/7-P
¦CTGAATAGAAATAGTGATAGÁTCACAACGAGTGCCATGTTAA
SEQ ID NO: 167 partzima B HPRTB/7.-P
SEQ ID NO: 168 partzima A HPRTA/55-P
CTGAATAGAAATAGTGATAGATCACAACGAGAGGTGCGGT
SEQ ID NO: 169 partzima B HPRTB/55- GAGCTGGGGAGGCTAGCTCATTCCTATGACTGTAGATTTTA
· ·" ·· ·' · ' . · ¦ .·.. ; ·. '·'· · · ' ·
8.2. Sustrato* reportero*
Para este ejemplo, en cada multiplexado, se usaron cinco diferentes sustratos universales juntos en una cámara de reacción. Cada sustrato . universal en cada mültiplexado se
etiquetó con uno. de cinco fluoróforos diferentes. Eñ el ejemplo actual, los sustratos fueron etiquetados -en el extremo 5' con un fluoróforo y etiquetados en el extremo 3' con una porción apagadora {Tabla 19) . La escisión de los sustratos se vigiló en diversas longitudes de onda de emisión y excitación (Tabla 19):
Tabla 19. Suatratoa y en etiquetado fluoraaoenta
BHQ1; apagador 1 de orificio negro, 6HQ2; apagador orificio negro, IB; Iowa black® EQ, IBR; Iowa black® RQ.
?Sistema de Detección. PCR en Tiempo Real CFX96 (BÍorad) excita y mide la emisión de, cada fluoró oro sobre un intervalo de longitudes de onda para cada canal...
Los. sustratos reporteros probados en este ejemplo se muestran enseguida con la secuencia,- 5' hasta 3' . Las bases en minúscula representan AR y las bases en mayúscula representan ADN.
.
SEQ ID NO: 23 . Sub6-Q670B2:
ATCACGCCTCguTCCTCCCAG
SEQ ID NO: 24 Sub7-JB:
TTAACATGGCACguTGGCÍGTGATA
SEQ ID NO: 171 Sub4-TRB2:
CATGGCGCACguTGGGAGAAGTA
SEQ ID NO: 73 Sub61-FIB:
CTCGACCCCguCTCCACGCCA
SEQ ID NO: 77 : Sub74-Q705B2:
ATCACTCCCCguCCCCTCCCAG
SEQ ID NO: 80 Sub79-TRIBR:
TCCTCTCCCCguCCCCTTCAACC
SEQ ID NO: 81 Sub80-Q670B2: '
AACCGCCCTCguCCCGTGÁACC-
ACCGCACCTCguCCCCAGCTC
8.3 Séaumal* objetivo* y eebmdae PCR pmrm aspliflemelón dm lo* gwM CXP2C9, TP53, BPRT, TRC y BPL13*
Los amplicones PCR objetivo para todos los cinco genes se generaron por amplificación in vitro de ADN Humano extraído de línea de célula IM9 (Promega) . Los amplicones se generaron usando los cebadores PCR de ol'igpnucleótido enlistados 5' hasta 3' enseguida. La secuencia en negrita corresponde a una
etiqueta universal (01, 02 o 03) que .incrementa el Tm del cebador sin afectar la especificidad del cebador al objetivo del gen. Esta etiqueta mejora la amplificación eficientemente en reacciones PCR.
SEQ ID NO: 91 Cebador delantero 5TFRC_ül
OCTJIAAACAATAAGTCAGAACTTACG
SEQ ID NO: 92 Cebador inverso 3TFRC_02 C3M3CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
SEQ ID NO: 125 Cebador delantero 5TP53_ü3 CTAACTTACTGCCTCTTGCTTCTC
SEQ ID NO: 126 Cebador inverso 3TP53JJ2·.
CMCTCTGTGCGCCGGTCTCTC
SEQ ID NO: 127 Cebador delantero 5RPL13a_03
CTAAACCGGAAGAAGAAACAGCTCA SEQ ID NO: 128 Cebador inverso 3RPL13a^U2 .
CJU3GAGGAATTAACAGTCTTTATTGG
SEQ ID NO: 129 Cebador delantero 5CYP2C9_03
CTlOkCCTCATGACGCTGCGGAA
SEQ ID NO: 130 Cebador inverso 30^209 02
CMATATGGAGTAGGGTCfíCCCA
SEQ ID NO: 176 Cebador delantero 5HPRT_03
CTAACTTTGCTGACCTGCTGGATTA
SEQ ID NO: 177 Cebador inverso 3HPRT_02
CAeCAATAGCTCTTCAGTCTGATAA
8.4. Campoomntmm d» Reacción: HnpTIfieaión y dtccíón do moeuuaaiom ebjmtiro «n un Formato MUkmiam gPC iwltipl<ydo
Amplificación y detección en tiempo reál de la secuencias objetivo se realizó en un volumen de reacción total de 25 uL. Todas las reacciones se condujeron en un Sistema de Detección PCR en Tiempo Real CFX96 (Bio-Rad) . Los parámetros de ciclizado fueron cualquiera de, 1) 95 ~C por 2 minutos, 4.0 ciclos de 95eC por 15 segundos y 52°C por 60 segundos o 2) 95 C por 2 minutos, 40 ciclos de 95°C por 15 segundos y 58°C por 60 segundos. Los datos fluorescentes se colectaron ya sea en la etapa a 5?QC o 58°C. Cada reacción Multiplexada se corrió por duplicado y contiene MgCl2 10 raM, 200 uM de cada uno de dNTP, 10 unidades de inhibidor RiboSafe AR sa (Bioline)^ 1 x immobuffer (Bioline), 2 unidades de MyTaqHS (Bioline)? La identidad de las partzimas, cebadores y sustratos y sus respectivas concentraciones fueron cómo se enlista en la Tabla 20. Las reacciones contienen ya sea plantilla de ADN (100 ng o 391 pg) o control no objetivo (NF- H20). . ··
Las reacciones multlplexadas sé establecieron con cebadores, sustratos y sus partzimas asociadas como en la Tabla 20 (Multiplexado 1 o Multiplexado 2)'» Lós mismos cebadores PCR se usaron para ambas reacciones Multlplexadas y todas las partzimas tienen las mismas porciones que detectan
el objetivo. Cualquier diferencia en . la eficiencia de reacciones que detectan el mismo objetivó por lo tanto será atribuible a las diferencias en la eficiencia de escisión de los sustratos.
Tabla 20. Combinación»» da oligonuoleótido osados paca cada reacción Mol iplasada
8.5. Jtaeultadoe; 9p\ifiama±6u de objetivo y mmoimíón de mamtxmo reportero en Tormto JflO iae ojFCSR maltplmxmd
Cada reacción multiplexada que contiene AD genómico humano muestra un .incremento en fluorescencia con el tiempo para la detección en tiempo real de los genes CYP2C9> TP53, HPRT, RPL13a y TFRC. Para todas las reacciones, la fluorescencia del control objetivo no de ADN fue tan baja como la de las reacciones que contienen ADN objetivo. Esto demuestra que el incremento en fluorescencia producida en reacciones que contienen objetivo se debe a ensamblado dependiente del objetivo de NAzima catalíticamente activa que luego escinden uno de los sustratos universales.
Las gráficas de amplificación de los genes CYP2C9, TP53, HPRT, RPL13a y TFRC a 52*C demuestran que el Multiplexado 2 (Figura 11, (i))/ güe usa los sustratos universales serie 2 y
3 mejorados nuevos, tienen curvas más inclinadas, que alcanzan la meseta más rápido que aquellas observadas para Multiplexado 1 (Figura 11, (i)), que usan sustratos universales serié 1. Sólo hubo una pequeña diferencia en las gráficas de amplificación para la detección de TFRC con Su¾>2 contra Sub74 a 52*C. Alguien experto en el campo apreciarla que todas las gráficas de la amplificación de Multiplexado 1, qué usan sustratos serie. 1 contra serie 2 y 3, son de una calidad suficientemente buena para ser fácilmente aceptables en el campo para la detección de estos objetivos.
Las gráficas de amplificación de ios genes. CYP2C9, TP53, HPRT, RPL13a y TFRC a 58 *C demuestran que el Multiplexado 2 (Figura 11, (ii) ) , que usa los sustratos universales serie 2 y 3 mejorados nuevos, tiene curvas considerablemente más inclinadas y alcanzan la meseta sustancialmente más rápido que el Multiplexado 1. (Figura 11, . (ii)), que usa sustratos universales serié 1. Además, alguien experto en el campo reconoceria qué las curvas de amplificación producidas por el uso de Sub2, Sub3, Süb6 y Sub7 en Multiplexado 1 no pueden ser dé calidad suficiente para la detección robusta de objetivo y de esta manera no son generalmente aceptables eh el campo.
En general, los sustratos serie 2 y 3 nuevós muestran. una calidad mejorada, y por lo tanto solidez, de datos de
Multiplexado a temperaturas actualmente en uso con reacciones MNAzima qPCR y permite la detección del Multiplexado a una temperatura much más alta que la que es previamente capaz.. Las nuevas guias de diseño incrementan la probabilidad de sustratos universales diseñados que extienden la capacidad para Multiplexar a. temperaturas actualmente usadas para MNAzima qPCR y que producen datos robustos a temperaturas de réácción más altas.
Sjeaplo 9: Uso da sustrato* unlv«rsal«s, disonados para sor funcionáis* a diversas tosporatnras, con mksiaas «n PCR on tioapo roal.
Se. ha invéntado una serie nueva dé. sustratos altamente activos, usando un conjunto novedoso de guias de diseño; para usar con la ADNzima 10-23 o. MNAzima con base en la AD zima 10-23.
. Las MNAzimas pueden confeccionarse para producir un efecto detectable, por medio de escisión o ligación de un sustrato, a diversas temperaturas. La eficiencia y" severidad de la actividad catalítica de una MNAzima o ADNzima puede manipularse al cambiar la temperatura de reacción. Otra mánera para optimizar la eficiencia y severidad de la actividad catalítica es modificar el: ím y/o la longitud de los sustratos y emparejar partzimas o emparejar ADNzima. El
Tm de un sustrato puede Incrementarse al agregar nucleótidos en los extremos 5f y/o- 3' de la secuencia de sustrato. Estos cambios pueden hacerse dentro de las guias de diseño. Los nucleótidos elegidos para esta extensión también pueden tener un efecto en el Tm. La adición dé bases 6 b C extra al extremo 3' o 5' tendrá un impacto mayor en el Tm que la adición de bases A o T extra. Similarmente, el Tm de sustratos puede reducirse al remover nucleótidos del extremo 3' o 5' . Las partzimas MNAzima y A Nzimas pueden truncarse o extenderse, para emparejar la secuencia de sustrato ajustada..
En este ejemplo, la longitud y composición base del sustrato de la serie 2 Sub55, se modificó para producir un intervalo de sustratos derivados con una variedad de Tm' s (Tabla 21) . Las modificaciones incluyen truncar el sustrato al remover uno de los tres nucleótidos de cada uno de los extremos 5' y 3'; extender el sustrato por la adición de nucleótidos en ambos extremos 5' y 3' . El efecto de agregar nucleótidos diferentes para producir esta extensión también fue probado al diseñar sustratos con cualquiera de los nucleótidos A o C adicionales en los extremos 5' y 3'. Los sustratos resultantes se probaron entonces en una reacción MNAzima qPCR para evaluar la flexibilidad de diseño de los derivados de sustratos y su utilidad en. un intervalo de temperaturas. La amplificación PCR y detección mediada por
MNAzima se realizaron en un proceso de una etapa, en donde amplificación PCR y detección mediada por MNAzima ocurren simultáneamente en un tubo sencillo. La eficiencia de escisión de sustratos ' puede estár medida por el valor Ct generado a varias temperaturas de combinación en sus pares base. Las reacciones que producen un valor Ct. más bajo són indicativas de, escisión más eficiente de un sustrato específico ya que; tales reacciones alcanzan el ciclo umbral más rápido.
Tabla 21: 8nb55 y derivados
A Todas las secuencias se escriben 5' hasta 3' ; . las mayúsculas representan ADN y las minúsculas representan ARN * Tm dado aquí es. igual a la temperatura de fusión de las bases unidas á las dos partzimas calculado usando la regla Wallace. Cuando el sustráto se une a la MNAzima con base n
la ADNzima 10-23, o la ADNzima 10-23 en sí misma, el ribonucleótido g" se mantiene no unido por lo tanto no contribuye a la unión general Tm.
9.1, OIigomalmótldm dm p*xtm±ma
En los experimentos conducidos para medir la relación de actividad catalitica de Sub55 y sus derivados descritos en la Tabla 21, los oligdnucleótidos de pártzima A y B se diseñaron con extremidades sensibles objetivo complementariamente al gen TFRC humano. Las secuencias dé las partzimas A y B se enlistan enseguida desde 5' hasta 3' , donde las bases subrayadas hibridizan al sustrato. El «-p" indica fosforilación 3' del oligonucleótidb.
SEQ ID NO: 179 pártzima A TFRCA/55 (18) -P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCG
SEQ ID NO: 180 pártzima B TFRCB/55 (.18) -P.:
AGOTGGGGAGGCTÁGCTGCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 181 pártzima A TFRCA/55 (16) -P:
··, GGAATATGGAAGGAGACTGCACAACGAGAGGTGC
SEQ ID NO: 182 pártzima B TFRCB/55 (16) -P: ,
GCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT SEQ ID NO: 183 pártzima A TFRCA/55 (23A) -P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGTT SEQ ID NO: 184 pártzima B TFRCB/55 (23A) -P:
204 . ·. ·;.
TGÁGCTGGGGAGÓCTAGCfCCTCTGACTGGAAAACAGACT
SEQ ID NO: 185 partzima B TFRCA/55{23C) -P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGTGCGGTG SEQ ID NO: 186 partzima B TFRCB/55(23C)-P:
GGÁGCTGGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
. SEQ ID NO: 46 partzima A TFRCA/55-P:
GGAATATGGÁAGGAGÁCTGTCACAACGAGAGGTGCGGT SEQ ID NO: 45 partzima B TFRCB/55-P:
GAGCTGG6GAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
:'··. · · ·· ' · ' . _ .'. ,'· ·. ··"
9.2. SuMtrAtom *port*Tom
En el ejemplo actual, los sustratos se etiquetaron al final con una porción Quasar 670 en el extremo 5' y una porción. BHQ2 en el extremo 3'. La escisión de los sustratos se vigiló a 665 nm. (longitud de onda de emisión Quasar 670) con excitación a 635 nm (longitud dé. onda de excitación Quasar 670). Los sustratos reporteros probado en este ejemplo s muestran enseguida con la secuencia, 5' hasta 3' . Las bases en minúscula representan ARN y las bases en mayúscula representan ADN;
SEQ ID NO: 29 Sub55-Q670B2:
ACCGCACCTCguCCCCÁGCTC
SEQ ID NO: 172 Sub55 (16) -Q670B2:
GCACCTCguCCCCAGC
SEQ ID NO: 173 Sub55 (18) -Q670B2:
CGCACCTCguCCCCAGCT
: SEQ ID NO: Í74 . Súb55 (23A) -Q670B2:
AACCGCACCTCguCCCCAGCTCA
SEQ ID NO: 175 Sub55 (23C) -Q670B2: .
CACCGCACCTCguCCCCAGCTCC .
9.3. 8maamna± obetivo y cebador**. . FGR . pora wpl1ti??a??a dm tWStC
La secuencia objetivo para este ejemplo fue uñ amplicón
PCR generado por. amplificación in yitro de AD genómico humano, extraido de la linea de célula IM9 (Promega), usando lós cebadores PCft. de . oligonucleótido enlistados enseguida. Las secuencias de cebador son enlistadas 5' hasta 3'.
- SEQ ID NO: 187 Cebador delantero 5TFRC:
AACAATAACTCAGAACTTACG
SEQ ID NO: 186 Cebador inverso 3TFRC:
CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
·· ..
9.4. CoponmntmM dm rmaalón: Aaplitlcmclón y detección dm «ecuencle objetivo
La amplificación y detección en tiempo real de la secuencia objetivo se realizó en un volumen de reacción total
de 25 pL. Todas las reacciones se condujeron en un sistema Mx3005P QPCR (Stratagene/Agilent) . Los parámetros de ciclizado variaron por la temperatura . de combinado, en sus pares base, (subrayadas, como sigue), y fueron cualquiera de, 1) 95°C por 10 minutos, 5 ciclos de 95°C por 15 segundos y 55°C por 30 segundos, 50 ciclos de 9S°C por 15 segundos y 50°C por .60 segundos, o
2) 95°C por 10 minutos, .5 ciclos de 95eC por 15 segundos y 55eC por .30 segundos', .50 ciclos de 95PC por 15 segundos y 52?C por 60 segundos, o
3) 95°C por 10' minutos, 5 ciclos de 95*C por 15 segundos y 55°C por .30 segundos, 50 ciclos de 95°C por 15 segundos y 55°C por 60 segundos, o
4) 95°C por 10. minutos, 5 ciclos de 95°C por .15
segundos y 55eC por. 30 segundos, 50 ciclos de 95,°C por 15 segundos y.60°C por 60 segundos.
Todos los datos fluorescentes se colectaron en la temperatura de combinado en sus pares base. Las reacciones, se establecieron con sustratos y sus partzlmás asociadas como, n la Tabla 22. Cada conjunto de condiciones de reacción · se corrieron por duplicado y contienen 5TFRC 40 nM, 200 nM de 3TFRC, 200 nM cada uno de partzima A y partzima B, 200 nM de sustrato, MgCl2 8 mM, 200 uM de cada, uno de dNTP, 10 unidades de AR sin (Promegaj, i x Immobuffer (Bioline) * 1 unidad de
Immolase (Bioline) y ya sea plantilla de AD genómico (100 ng) o no objetivo (NF-H2O) . Las. reacciones separadas se establecieron para probar cada sustrato con sus ;partzimas emparejadas. Se usaron los mismos cebadores PCR se usaron para todas las reacciones y todas partzimás tienen las mismas porciones que détectan' el objetivo. Cualquier diferencia en la eficiencia de las reacciones por lo tanto será átribuible a las diferencias en la eficiencia de escisión de los sustratos a diversas temperaturas.
:
Tabla 22: Caabinaeionaa da parfcatam tiaadaa para oada aua rab universal
9.5. R—altado*: Maplitiomaión da objetivo y mmolelón dm momtxmto raporavo
Cada reacción; que contienen ADN genómico humanó muestra
un incremento en fluorescencia con el tiempo la detección en tiempo real del gen TFRC usando Sub55 y varios derivados. La fluorescencia del control objetivó no de ADN fue tan baja como la de las reacciones que contienen ADN objetivo. Esto demuestra que el incremento en fluorescencia, producida en reacciones qué contienen objetivo se debe al ensamblado dependiente del objetivo de MNAzima catalíticamente activas que luego escinden uno de los sustratos universales.
La eficiencia dé las reacciones, medida por el Ct, fue dependiente de la compatibilidad de. la temperatura de reacción (temperatura de combinado en sus pares base/escisión) y el Tm del sustrato usados en la reacción. Los diversos derivados Sub55 tienen longitudes y composiciones de nucleótido diferentes y de esta manera diferentes temperaturas de fusión (Tm) y por lo- tanto se espera que se desempeñen diferentemente en ·.' las diversas temperaturas de combinación en sus pares base: probadas (50,
52, 55, y 60eC). Los resultados, en la .Tabla 23, muestran el Ct para cada sustrato en las diferentes temperaturas de reacción. Los valores Ct en negrita indican los. sustratos que se desempeñan más eficientemente en las temperaturas indicadas.
En las temperaturas más bajas, entre más corto sea él sustrato (Sub55(Í8)) se desempeña mejor (tiene el valor Ct
más bajo) . Como la temperatura de combinado en sus pares base se incrementa, los sustratos con longitud incrementada y por lo tanto Tm, se desempeñan óptimamente. Alguien experto en el campo produciria . derivados de sustratos que fueran eficientemente escindidos en la temperatura de' reacción elegida al alargar o acortar las extremidades del sustrato desde los extremos.5' y/o 3', y/o al cambiar la composición de nucleótido en los extremos 5' y 3' del sustrato..
Tabla 23: Valoras Ct para MNAiiaa qPCR dasaapafiada usando Sub55 y darivados a divareas taaparausas da ooabinaclóa an sus paras basa
Kosjplo 10: Oso da sustratos universal** oon MOkslaas qVCR a uaa aiparatora d ocabinado an sos paras basa da 58*C.
Las MNAzimas pueden usarse para vigilar amplificación de ácidos nucleicos objetivo en tiempo real usando métodos de amplificación objetivo in vitro tal como PCR. Adiciohalmente, el vigilado en tiempo real durante qPCR usando sustratos
MNAzima etiquetados con fluoróforo y paires de apagador genera una curva en la cual una línea dé umbral, \ de un nivel arbitrario de fluorescencia, puede colocarse sobre la fase exponencial de las reacciones, lo que produce un valor que puede conocerse como un Ct (umbral de ciclo) . tas reacciones qué producen un valor Ct inferior, son indicativas de escisión más eficiente de un sustrato específico ya que tales reacciones alcanzan el- ciclo de umbral más rápido. En este ejemplo, se realizan la amplificación y detección en un proceso de una etapa, en donde la amplificación PCR y detección mediada por MNAzima se presentan simultáneamente én un. tubo sencillo. Üonde todas las otras condiciones de reacción son iguales, el valor Ct puede estar influenciado por la secuencia del sustrato universal. La temperatura de combinación en sus pares base/detección para MNAzima qPCR usada en el campo está entre 50. y 54°C. Esta temperatura se dictaminó por el hecho de que los sustratos universales conocidos en la técnica tienen una limitación en la temperatura a la cual estos se escindieron eficientemente don 54°C siendo el límite superior para los sustratos universales serie 1.. Hay una necesidad para sustratos universales qiie escindan en temperaturas más altas . para permitir mayor flexibilidad én e\ diseño de cebadores y partzimas que se escindan en temperaturas más altas. Esta flexibilidad en él
diseño para cebadores y partzimas pudiera ser de gran beneficio para muchas aplicaciones tal como objetivos genéticos de interés que tienen altos porcentajes de bases G y C en su secuencia, que requieren temperaturas de reacción más altas y por lo tanto partzimas y cebadores con Tms más altas para detección, especifica.
La investigación .en la eficienci de la escisión de sustratos con base en. el desempeño de los sustratos serie 1 y 2, llevan al desarrollo de guias para auxiliar en una tercera ronda de diseños de sustrato, lo que resulta en los sustratos de serie 3.. Estas guias incluyen, pero, no se limitan a (i) siete o más nucléótidos de citosina en las diez bases que rodean. los ribonucleótidos (N4-N13) , (ii) . las bases inmediatamente adyacentes a los ribonucleótidos son. citosinas ( e y N9) (iii). el contenido total de sustrato tiene >64% de pirimidinas y (iv). la Tm total del oligonucleótido es 66°C o mayor (donde esta última guia sólo es aplicable si la temperatura de reacción para la escisión del. sustrato está arriba de 50°C) . ¦ ; .
En este ejemplo, el sustrato universal serie 2, Sub59 es comparado con el sustrato serie 3, Süb77 para comparar la eficiencia de escisión en PCR en tiempo real a 58°C para asegurar que las. guias de diseño ; producen sustratos universales con. una alta probabilidad de 'capacidad de
aplicación a MNAzima qPCR a una temperatura elevada. El nivel de escisión se determinó eficientemente al medir el valor Ct para reacciones que contienen diferentes sustratos universales.
10.1. Olígonaalmótidom depártelas
En ios experimentos conducidos para medir la eficiencia de escisión del sustrato universal, serie 2 y serie 3 en PCR en tiempo real, todos los oligonucleótidos de partzima ? y B se diseñaron con extremidades sensibles complementariamente .a la misma secuencia del gen TFRC humano. Las secuencias de las partzimas A y B se enlistan enseguida desde 5' hasta 3', donde las bases subrayadas hibridizan a¦ su sustrato universal emparejado. El w-p" indica fosforilación 3' del oligonucleótido.
SEQ ID NO: 47 partzima A TFRCA/59-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAAGGGAGGAGG
SEQ ID NO: 62 partzima A TFRCA/77-P:
GGAATATGGAAGGAGACTGTCACAACGAGAGGGAGGAG SEQ ID NO: 63 partzima B TFRCB/77-P:
AGGAGGAGGGAGGCTAGCTCCTCTGACTGGAAAACAGACT
10.2. SmtrMtom xporfro*
Los sustratos reporteros para ste ejemplo se muestran
enseguida con la secuencia, 5' .hasta 3'. Las bases en minúscula representan ARN y las bases en mayúscula representan ADN. En él ejemplo actual, los sustratos se etiquetaron al final con una porción 6-FAM en el extremo 5' (indicado por un "F" en el nombre de los sustratos enseguida) y una porción de apagador lowa Black® FQ en el extremo .3' (indicado por un X,IB" en el nombre de los sustratos enseguida) . La escisión de los sustratos se vigiló a 530 nm (longitud de onda de emisión FAM en Mx3005P . (Stratagene) ) con excitación a 485 nm (longitud de onda de exitación FAM én Mx300SP (Stratagene)).
SEQ. ID O: 33 Sub59-FIB:
CCTGCTCCCTguCCCTCCTCCT
SEQ ID NO: 79 Sub77-FIB:
CTCCTCCCTCguCCCTCCTCCT
10.3. Smemuac£m objetivo ombmdori PCR para a¾f71tipación d TFRC
La secuencia ob etivo para este ejemplo fue un amplicón PCR del gen TFRC generado por amplificación in vitro de ADN genómico humano, extraído de ' la linea de célula IM9 (Promega), Usando los cebadores PCR de oligonucleótido enlistados enseguida. Las secuencias de . cebador son enlistadas 5' hasta 3' .
SEQ. ID NO: 187 Cebador delantero 5TFRC:
AACAATAACTCAGAACTTÁCG
SEQ ID NO: 188 Cebador inverso.3TFRC:
CTTTCTGAGGTTACCATCCTA
10.4. Campon*&f* á reacción; Amlificación y enmn ififímctión d m enaaiM cbjmtlw
La amplificación PCR en tiempo real y la détección de la secuencia objetivó se realizó en un volumen de reacción total de 25 µ?·. Todas las reacciones se condujeron en un sistema Mx3005P QPCR (Strátagene) . Las reacciones se . establecieron con sustratos y sus partzimas asociadas como en la Tabla 24. Los parámetros de ciclizado fueron, 95eC por 2 minutos, 40 ciclos de 95eC por 15 segundos y 58°C. por 60 segundos (datos colectados en la etapa a 58'C). Cada conjunto de condiciones de reacción se corrieron · por duplicado y contienen.5TFRC -40 nM, 200 nM de 3TFRC, 2Q0 nM cada, uno de de partzima A y partzima B> sustrato 200 nM, MgCl2 8 mM, 200 µ? de cada uno de dNTP, 10 unidades, de ARNsin (Promega) , 1 x Immpbuffer (Bioline) , 2 unidades de de polimerasa de ADN MyTaqHS''" (Bioline) y ya sea plantilla de ADN genómico (50 ng) o no objetivo (NF-H20).
Tabla 24: Cabinación»» da partsiaa usadas para bada sustrato universal
10.5. Rmltmdom: ?a??itipación da objetio y m»aá ±ó d sustrato xpoxtx
Cada reacción qPCR' de MNAzima que contienen ADN genómico humano muestra un incremento en fluoréscencia con el tiempo para la. detección en tiempo real de TFRC del ADN genómico humano. Para todas' las reacciones, la fluorescencia del control objetivo no de ADN fue tan baja como la de las reacciones que contienen ADN objetivo. Esto demuestra que el incremento en fluorescencia producida en reacciones que contienen objetivo se debe al ensamblado dependiente del objetivo de MNAzima catalíticamente activa que luego escinden uno de los sustratos universales reporteros.
Las reacciones con el sustrato Sub59, serié 2, muestra un valor Ct promedio de 28.5 aunque las reacciones con el sustrato serie 3 Sub77 muestran un valor Ct promediado de 26,5.
.Es de notar que Sub59 y Sub77 tienen la misma Tm y %C/T
pero difieren en número, de citosinas en la región central N - 13 y la composición de N8. En la región central . que. rodea los ribonucleótidos Sub77 tiene una citosina en la posición N8 que parece llevar a escisión méjorada eficientemente sobre Sub59 indicado por un valor Ct menor (26.5). Sub59 contienen una timina en la posición N8 y una citosina agregada en el extremo distal de la extremidad 5' que lleva a una reacción de escisión reducida y por lo tanto un valor Ct más alto (28.5) .
Es de notar la importancia de la naturaleza de la secuencia de nucléótido del sustrato eficientemente escindido y la proximidad de los nucleótidós específicos a los ribonucleótidos de os sustratos. Estas características forman las bases de un conjunto de guías que resultan en sustratos universales con una probabilidad más alta de ser escindidos eficientemente a temperaturas elevadas. Estas guías de diseño incluyen pero no se limitan a (no todas pueden ser necesarias): (i) siete o más nucleótidós de citosina en las diez bases que rodean los ribonucleótidos ( 4- 13) ; (ii) las bases inmediatamente adyacentes a los ribonucleótidos son citosinas (Ne y N9); (iii). el contenido total de sustrato tiene >64% de pirimidina; (iv) Tm total del oligonúcleótido es .66eC o mayor (donde ésta última guía sólo es aplicable si la temperatura de reacción para escisión de
sustrato está arriba de 50°C) (Tabla 25) . El valor Ct previo para el. sustrato serie 3, Sub77, se espera que este sustrato cumpla con todas estas guias de diseño, ya qué Sub59 cumple sólo con dos de estas guias de diseño (Tabla 25).
Tabla 25: Eficiencia da escisión da sustratos universales (enlistados «a ordm da escisión afielante oon base,en Ct)
? las bases n mayúscula representan ADN y las bases én minúscula representan ARN y la posición de la base: ! en el sustrato está representada por (Nx) -Ni-N2-N3-N -N5-N6-N7-N8-rpÍ-rY-N9- io-Nii-Ni2-Ni3- u-Ni5- (Nx) .
* .% C/T (pirimidirias) de longitud de secuencia mostradas anteriormente para cada sustrato, no incluyen ribonucleótidos
* Tm dada aqui es igual a la temperatura de las bases unidas calculada usando la regla Wallace- sólo se calcula para bases que hibridizan a su complemento. Cuando, el sustrato sé une a la MNAzima con base en la ADNzima 10t23 el ribonucleótido "g" se mantiene sin unir por lo tanto no contribuye a la Tm de unión general.
~ El número de las guias de diseño (i), (ii), (iii) y/o (iv) que.se han cumplido por la secuencia de. sustrato.
Publicación Internacional PCT No. WO/2007/041774
Publicación Internacional PCT No. WO/2008/040095
Publicación Internacional PCT No. WO/2008/122084
Patente E.Ü.A. No. '4,683,202
Patente E.Ü.A. NO. 4,683,195
Patente E.Ü.Á. No..4,800,159
Patente E.Ü.A. No. 4,965,188
Patente E.Ü.A. No. 5,176,995 .
Número de Publicación E.Ü.A. 2007-0231810
Número de Publicación E.Ü.A. 2010-0136536
Número de Publicación E.Ü.A. 2011-0143338
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Claims (52)
1. un sustrato polinucleótido aislado para, una enzima de ácido nucleico catalítico, el sustrato polinucleótido caracterizado porque comprende una secuencia Nj.-N2-N3-N-Ns-N$-N7-N8-rR-rY-N9-Nio- u-Ni2-Ni3-Ni4-Ni5 en donde: . rR es un ribonucleótido de purina; rY es un ribonucleótido de pirimidina; cada uno de N1-N15 son nucleótidos; seis o más de N5-N13 son nucleótidos de citosina;. y menos de tres de N9-N15 son nucleótidos de guanina.
2. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación. 1, caracterizado.' porqué el polinucleótido de sustrato comprende, consiste de una secuencia definida ^or cualquiera de SEQ ID NÓs: 25-27, 29-30, 33, 72-90, o 172-?5.
3. / El . sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque siete o más, u ocho o más de N5- 13 son nucleótidos de citosina.
4. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque siete o más de N5-N13..son ñucleótidos. de citosiná y el polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 73, 76-80, 82-83, 85-90, o 172- 175.
5. El sustrato, polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caractérizado porque ocho de N5-NÍ3 • .son ñucleótidos de citosina y el polinucleótido de sustrato comprende p consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 76, 77, 80, 83 u 87.
6. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación.1 o reivindicación 2, caracterizado porque siete o más, u ocho o más de N4-N13 son ñucleótidos de citosina.
7. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque siete o más de N4- i3 son ñucleótidos de citosina y el polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID ÑOs: 27, 29, 73, 76-83, 85-90, o 172- 175. .
8. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la. reivindicación .6, caracterizado porque, ocho de 4÷ i3 son ñucleótidos de citosina y el polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 76, 77, 79-80, 82-83, 87, 88 o 90.
9. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con lá reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque seis ó más, siete o más, u ocho o más de ?«- ?2 son nucleótidos de citosina.
10. £1 sustrato polinucleótido aislado de. conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque siete o más de N4-N12 son nucleótidos de citosina y el polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 27, 29, 73, 76, 77, 79-83, 85-88, 90 o 172-175.
11. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque ocho de N4-N12 son nucleótidos de citosina y el polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia .definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 76, 77, 80, 83, 87, u 88.
12. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, . caracterizado porque seis o más, siete o más, ú ocho o más de N5-N12 son nucleótidos de citosina.
13. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 12,· caracterizado porque siete o más .de N5-N12 son nucleótidos de citosina y el. polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 29, 73, 76, 77, 80, 83, 85-88 o 172-175. .'"
14. El sustrato poiinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque ochó de N5-N12 son. nucleótidos de citosina y. el poiinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 76, 77, 80, 83, u 87.
15. El sustrato poiinucleótido aislado de conformidad con cualquiera.de las reivindicaciones 1 á 14, caracterizado porque cualquiera uno o más de Ni, N2, N8 y/o N9 es un nucleótido cisteina. .
16. El sustrato poiinucleótido aislado de conformidad -. con la reivindicación 15, caracterizado porque N$ y..N$ son nucleótidos de citosina,' y el poiinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 25-26, 29-30, 72-90, o 172-175.
.17. El sustrato poiinucleótido aislado dé conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado. porque os, uno o ninguno, de N9-N15 son nucleótidos de guanina.
18. El sustrato poiinucleótido aislado de . conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque uno o ningüpo de Nj-is son nucleótidos de guariina y el poiinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida pór cualquiera de SEQ ID NOs: 25-27, 29-30, 33, 72-80, 82-90, o 172-175.
19. El sustrato polinucleótido aislado dé conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque ninguno de g- is. son nucleótidos de guanina y el polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por cualquiera de SEQ ID NOs: 25, 26, 3?', 72, 75, 77-80, 84-85, u 89.
20. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque más de diez, más que once, más que doce, o más de trece dé Ni-Nu son nucleótidos pirimidina.
21. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con. la reivindicación 20, - caracterizado . porque once, doce, o más que doce de . Ni- is son nucleótidos pirimidina y él polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por una cualquiera de SEQ ID NOs: 25-27, 29 33, 73-90 o 173-175..
22. El sustrato polinucleótido aislado dé conformidad con la reivindicación 20 o reivindicación 21, caracterizado porque trece o catorce de 1-N15 son nucleótidos pirimidina y el polinucleótido de . sustrato comprendé o consiste de una secuencia definida. por una cualquie.ra.de SEQ ID NOs: 75, 77-807 . 82-85 u 88r-89.
23. Él sustrato polinucleótido aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque más de ocho, más de nueve, más de diez, u once de Ni-Nu son nucleótidos de*citosina.
24. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque diez u once de Ni- u son nucleótidos de citosina y el polinucleótido de sustrato comprende o consiste de una secuencia definida por una cualquiera de SEQ ID NOs: 33, 76-80, 82-83, 85, 87, 8.8,,. U 89.
25. Él sustrato polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 23 o reivindicación 24, caracterizado porque once de Ni-N14 son nucleótidos de citosina y el polinucleótido de sustrato comprende, o consiste de una secuencia definida por una cualquiera de SEQ ID NOs.: 77^79.
26. El sustrato polinucleótido aislado dé conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado además porque comprende una etiqueta detectable para detectar el sustrato polinucleótido, .
':··· 27. El sustrato polinucleótido aislado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado además porque comprende una porción detectable y una porción extintora, en donde un·· efecto detectable proporcionado por la. porción detectable se . incrementa o reduce durante la codificación del polinucieótido de sustrato por la. enzima de ácido .nucleico catalítico.
28. El sustrato polinucieótido aislado dé conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizado porque el ribpnucleótido de purina comprende guanina.
29. El sustrato polinucieótido aislado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado porque el ribonucleótido de pirimidina comprende uracil.
30.. El sustrato polinucieótido. aislado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque una porción del sustrato que une a la enzima de ácido nucleico catalítico tiene una temperatura de fusión (Tm) de entre 50°C y.90eC, entre 50°C y 65°C, entre 50 C y 60°C, entre 52°C y 58°C, entre 66°C y 76°C, entre 68°C y 76°C, entre 64°C y ,7Ü°C, entre 70°C y 76°C, entre 70°C y 75°C, entre 72°C y 76°C, 52°C, 58°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C, o 76°C.
31. El sustrato . polinucieótido aislado de conformidad con. uña cualquiera . de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque la enzima de ácido nucleico catalítico es:. ·* (a) una enzima de ácido nucleico multi-componente (MNAzima) y la porción une al menos una extremidad de sustrato de la MNAzima; o . (b) una ADNzimá.
32* Un método, para detectar la presencia de al menos un objetivo, caracterizado porgue comprende: (a) proporcionar dos o más partzimas de oligonucleótido, en donde al menos una primera partzima de oligonucleótido y una segunda partzima de oligonucleótido se auto-ensamblan en la. presencia del objetivo, para formar al. menos una primera enzima de ácido nucleico muíti-componente catalíticamente activa (MNAzima) ;'.*· . (b) proporcionar el sustrato polinucleótido aislado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones l a 31; en donde el sustrato polinucleótido es capaz de modificarse por la primera MNAzima, en donde la modificación del sustrato polinucleótido por la MNAzima proporciona un efecto detectable; (c) poner en contacto las dos o más partzimas de oligonucleótido cón una muestra que supuestamente contiene el objetivo bajo condiciones que permiten: (1) el auto-ensamblado de al menos la primera MNAzima, y (2) la actividad cátalitica de al menos la primera MNAzima; y . (d) detectar el efecto detectable.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el objetivo es un ácido nucleico.
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el ácido nucleico se selecciona del 5 grupo que consiste de ADN, ADN metílado, ADN alquilado, ARN, ARN metilado, micróARN, siARN, shARN, tAR , mARN, snoARN, stAR , smARN, pre- y pri-microARN, otros AR s no codificados, ARN ribosomal, derivados de los mismos, amplicones, o cualquier, combinación de los mismos.
10. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33 o reivindicación 34, caracterizado porque el ácido nucleico se amplifica. .
36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la amplificación comprende una o más de: 15 reacción de cadena de polimerasa (PCR), amplificación de desplazamiento de hebra (SDA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación de circuló ondulado (RCA) , amplificación mediada por transcripción (TMA) , replicación de secuencia auto-sostenida (3SR) , amplificación 20. basada en secuencia de ácido nucleico. (NASBA) , · o reacción de cadena de polimerasa dé transcripción inversa (RT-PCR).
37. El método, dé conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, caracterizado porque las. primera y segunda partzimas de oligonucleótido comprenden secuencias respectivas definidas por: SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NÓ: 12; SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NÓ: 14; SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 5 41; SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44 y SEQ. ID NO: 45; SEQ IDi NO: 46 y SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47 y SEQ ID NO: 63; SEQ ID NÓ: 48 y SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 38 y SÉQ ID NO: 55; SÉQ ID NO: 56 y SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 58 y SEQ ÍD 10. NO: 59; SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63; SÉQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 68 SEQ ID NO: 69 y SÉQ ID ÑO: 70; SÉQ ID NO: 46 y SEQ ID. NO: 55; SEQ ID NO: 46 y SEQ ID ÑO: 59; SEQ ID NO: 38 y SÉQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 58 15 y SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 45; SEQ. ID NO: 46 y SEO. ID NO: 63; SÉQ ID NO: 71 y .SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 98: y SEQ ID NÓ: 99/ SEQ ID NO: 100 y SEQ ID NO: 103; SEQ ID NO: 104 y SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106 y SEQ ID NO: 107; SEQ ID NO: 108 y SEQ ID NO: 109; SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 0 111; SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 113; SEQ ID ÑO: 116 y SEQ ID NO: 117; SEQ ID NÓ: 118 y SEQ ID NO: 119; SEQ ID ÑO: 120 y SEQ ID NO: 121;, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 119; SEQ ID NQ: 155 y SÉQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 157 y SEQ ID NÓ 158.; SEQ ID NO: 159 y SÉQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 168 y SEQ ID NO: 169; SEQ II NO: 179 y SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 181 y SEQ ID NO: 182; SEQ ID NO: 183 y SEQ ID NO: 164 o SEQ ID NO: 185 y SEQ ID NO: 186.
38. El método de conformidad con .. cualquiera de las reivindicaciones 32 . a 37, caracterizado. porque él polinucleótido de sustrato hibridiza con extremidades de sustrato de la MNAzima a una temperatura de entre 50°C y 90°C, entre 50°C y 65°C, entre 50°C y 60QC, entre 52°C y 58°C, entre 66°C y 76°C, entre 68°C y 76°C, entre 64°C y 70°C, entre 70°C y 76°C, entre 70PC y 75*0, entre 72°C y 76°C, 52°C, 58°C, 64°C, 66°C, 68°C/ 70°C, 72°C, o 76°C.
39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 38, el método caracterizado además porque comprende proporcionar: dos o más partzim s de oligonúcleótido adicionales capaces de auto-ensamblarse en la presencia de un objetivo diferente para formar una segunda MNAzima catalíticamente activa; y al menos un sustrato polinucleótido adicional; . en donde el sustrato polinucleótido adicional es capaz de modificarse por la segunda MNAzima én la presencia del objetivo diferente.
40. El método de conformidad con la. reivindicación 39, caracterizado porque él sustrato polinucleótido adicional no es capaz de modificarse por la primera MNAzima.
41. El método de conformidad con una cualquiera de lás reivindicaciones 32.a 40, caracterizado porque la detección en la parte . (d) comprende usó de espectroscopia . de 5 fluorescencia, . resonancia de ' plasmón de superficie, espectroscopia de . masa, RMN, resonancia de giro de electrón, polarization espectroscopia de fluorescencia, dicroismo circular, inmunóensayo, cromatografía, radiometría, electroquímico, fotometría, gammagrafia, métodos 10. electrónicos, espectroscopia ÜV, infra-roja o. luz visible, métodos enzimáticos, . o cualquier combinación de los mismos.
42. El método de conformidad con una cualquiera de lás reivindicaciones 3.2 a 41, caracterizado porque la detección en la parte (d) comprende uso de espectroscopia de 15 fluorescencia.
43. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 42, caracterizado porque la detección en · la parte (d) . comprende la detección de un efecto detectable FRET.
20. . ·.. 44 Uso del sustrato polinucleótido. aislado de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones l a 31 como un sustrato para una enzima de ácido nucleico catalítico.. . ..·_·
45. El uso de conformidad con ia reivindicación 44, en donde la enzima de ácido nucleico catalítico es una enzima de ácido nucleico multi-componente (MNAzima), la MNAzima comprende al menos dos o más partzimas de oligonucleótido en donde al menos una' primera partzima de oligonucleótido y una segunda partzima de oligonucleótido se auto-ensamblan en la presencia de un Facilitador de Ensamblado de MNAzima para formar una enzima de ácido nucleico multi-componente catalíticamente activa (MNAzima), en donde cada uno de al menos la primera y la segunda partzimas de . oligonucleótido comprende una porción de extremidad de sustrato, una porción de núcleo . catalítico, . y una porción de extremidad sensible; . en donde durante el auto-ensamblado, la porción de extremidad sensible de la primera y segunda partzimas de oligonucleótido actúa como * extremidades sensibles de la MNAzima, la porción de extremidad de sustrato de la primera y segunda partzimas de. oligpnucleótido actúa como extremidades de sustrato de la MNAzima, y la porción núcleo catalítica ele la primera y segunda partzimas de oligonucleótido actúa como un núcleo catalítico de la MNAzima; . y en donde las extremidades sensibles de la MNAzima interactúan con el Fácilitador de .Ensamblado de MNAzima de manera que mantienen la primera y segunda partzimas de oligonucleótido en proximidad para asociación . dé sus respectivas porciones de núcleo catalítico para formar el núcleo catalítico de la MNAzima, el. núcleo catalítico capaz dé modificar el sustrato polinucleótido, y en donde las extremidades de sustrato de la MNAzima engancháh el sustrato «polinucleótido de manera que el núcleo catalítico de la MNAzima puede modificar el sustrato polinucleótido.
46. El uso de conformidad con la reivindicación 45, en donde la porción, núcleo catalítica de. cada, partzima de oligonucleótido comprende ADN o un análogo del mismo.
47. El usó de conformidad con la reivindicación 45. o reivindicación 46, en donde el Facilitador de Ensamblado es un objetivo a identificarse, detectarse o cuantificarse.
48. El usó de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones .44 a 47, en donde el sustrato polinucleótido hibridiza con la enzima de ácido nucleico catalítico a una temperatura de entré 50°C y 9Q°C, entre 5Q°C y 65°C, entre 50°C y 60°C, entre 52°C y 58PC, entre 66°C y 76°C, entre 68°C y 76°C, entre 64*0 y ?0°C, entre 70°C y 76°C, entre 70°C y 75°C, entre 72°C y 76°C, 52°C, 58°C, 64°C, 66eC, 68*C, 70eC, 72eC, o 7€eC.:
49. ün kit, caracterizado porque, comprende el sustrato polinucleótido aislado dé conformidad con una cualquiera de lás reivindicaciones 1 a 31.
50. El kit de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado además porque comprende una enzima, de ácido . 234 ··- . · nucleico catalitico capaz de modificar catalíticamente él sustrato polinucleótido.
51. Un kit> caracterizado porque comprende el sustrato polinucleótido aislado de conformidad con una cualquiera de lás reivindicaciones 1 a 31 y una pluralidad d partzimas de oligonucleótido diseñadas para ensamblar una enzima de ácido nucleico multi-componente (MNAzima) capaz de detectar l menos un objetivo, en donde la MNAzima es capaz de modificar catalíticamente el sustrato polinucleótido.
52. Un ensamble; caracterizado porque comprende un soporte sólido unido a un sustrato polinucleótido de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31. RBSCMPf DB IA IHVraCIÓW La invención, se relaciona a sustratos de ácido nucleico para enzimas, de. ácido nucleico catalíticas y métodos utilizando los sustratos.
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