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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Assay, das
auf verschiedenen Gebieten der Technik verwendbar ist,
einschließlich der Immunologie, der Molekularbiologie, der
Diagnose und dergleichen. Genauer gesagt betrifft sie ein
Verfahren zur qualitativen und quantitativen Messung einer
Substanz, die in einer Probe nachgewiesen werden soll,
mittels der Durchflußzytometrie, wobei die genannte Substanz
an ein Mikropartikel über eine zweite Substanz, welche an das
genannte Partikel immobilisiert und zu einer spezifischen
Bindung der Substanz fähig ist, gebunden ist.
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Ein zuverlässiges und effizientes Assay für eine
bestimmte Substanz in einer Probe wird laufend auf
verschiedenen Gebieten der Technik benötigt, einschließlich
der Medizin, der Chemie, der Landwirtschaft und dergleichen,
und es wurden vor der vorliegenden Erfindung verschiedene
Verfahren zur Verfügung gestellt. Eine Gruppe von weit
bekannten Verfahren verwendet eine spezifische Reaktion
zwischen der Substanz, die nachgewiesen werden soll (im
folgenden als Analyt bezeichnet) und einer zweiten Substanz,
z.B. eine Reaktion zwischen einem Antigen und seinem
Antikörper. Diese Verfahren werden im allgemeinen
durchgeführt, indem die genannte zweite Substanz an einen
unlöslichen Träger immobilisiert wird, eine den Analyt
enthaltenden Probe mit der immobilisierten zweiten Substanz
in Berührung gebracht wird, der Träger aus der
Reaktionsmischung abgetrennt wird und das Vorhandensein oder die
Abwesenheit, oder die Konzentration des genannten Analyts,
der an dem Träger durch die genannte zweite Substanz
abgefangen wird, bestimmt wird. Typische Assays von diesem Typ sind
Immunoassays wie das enzymgebundene Immunosorbensassay
(ELISA). Ein Überblick über ein solches konventionelles
Immunoassay wird nachstehend wiedergegeben.
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Eine Kunststoffplatte mit vielen Löchern wird oft
als fester Träger verwendet. Zu jedem der Löcher wird eine
ein Antigen enthaltende Lösung gegeben und die Platte wird
über Nacht bei 4ºC oder für etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur
gehalten. Nachdem die Lösung verworfen wurde, werden die
Löcher blockiert, um etwaige unspezifische Adsorptionen zu
verhindern. Das Blockieren wird durchgeführt, indem die
Löcher mit einem blockierenden Mittel, wie Magermilch,
gefüllt werden, mehrere Stunden bei Raumtemperatur oder über
Nacht bei etwa 4&sup6;C stehen gelassen und sorgfältig mit PBS-
Puffer gewaschen werden. Zu den blockierten Löchern wird eine
Probelösung, von der man vermutet, daß sie den zu
untersuchenden Antikörper enthält, zugegeben, und die Platte
wird mehrere Stunden stehengelassen, anschließend wird ein
Antikörper zugegeben, der mit einer geeigneten, ein Signal
erzeugenden- Substanz, wie einem Enzym, einer Fluoreszenz
bildenden Substanz oder dergleichen markiert ist. Die Platte
wird dann mehrere Stunden stehen gelassen. Nach Waschen der
Platte wird das in jedem Loch erzeugte Signal mittels
irgendeiner bekannten Methode beobachtet. Wenn die Markierung
eine Fluoreszenz bildende Substanz ist, wird die Beobachtung
durchgeführt, indem zu den Löchern ein geeigneter Puffer
zugegeben wird und die Intensität der Fluoreszenz mit einem
Fluorophotometer gemessen wird. Wenn die Markierung ein Enzym
ist, wird die Lösung eines Substrats zu jedem Loch zugegeben
und eine Zeit lang reagieren gelassen. Danach wird die
Reaktion abgebrochen und die Absorption des Lichts, welches
durch die Produkte der enzymatischen Reaktion erzeugt wurde,
wird mit einem Spektrophotometer gemessen.
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FR-A-26 38 849 beschreibt die Markierung von
Partikeln mittels eines Fluoreszenz-Reagens. Wenn Partikel
markiert sind, kann keine exakte quantitative Bestimmung
durchgeführt werden, da es sehr schwierig ist, die gleiche
Menge eines Fluoreszenz bildenden Mittels auf jedes Partikel
anzulagern. Somit kann die Anwesenheit einer nachzu-weisenden
Substanz nur qualitativ festgestellt werden.
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Das im US-A-4.665.020 beschriebene Verfahren
schildert ein "indirektes Verfahren". Das heißt, es wird ein
Antigen in einer Probenlösung zuerst mit einem Träger in
Berührung gebrächt, auf dessen Oberfläche ein Antikörper
immobilisiert wurde. Kleinere Fluoreszenzpartikel, die mit
dem Antigen beschichtet sind, werden mit dem genannten Träger
in Berührung gebracht, wobei die freien Antikörper auf dem
Träger an die kleineren Fluoreszenzpartikel binden, welche
mit dem Antigen beschichtet sind. Die Menge solcher
Fluoreszenzpartikel. welche über den Antikörper an den Träger
gebunden sind, wird mittels Durchflußzytometrie bestimmt.
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GB-A-20 29 571 betrifft spezifische (z.B.
immunologische) Bindungsassays vom Sandwich-Typ.
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EP-A-01 35 051 beschreibt immunologische Assays für
die Bestimmung von anti-DNA-Antikörpern unter Verwendung von
immobilisierter DNA.
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FR-A-26 27 286 beschreibt ein Verfahren für die
gleichzeitige Durchführung von mehreren Assays (das heißt
Antigen/Antikörper-Reaktionen), ohne die verwendeten Partikel
zu prazisieren.
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Wie oben festgestellt wurde, verwenden die
vorhandenen Verfahren als festen Träger ein Kunststoffprodukt
in der Form einer Mikrotiterplatte, eines Rohrs und
dergleichen. Ein solcher fester Träger aus Kunstoffliefert
jedoch wegen seiner Tendenz zu einer nicht spezifischen
Bindung nicht immer zuverlässige Meßergebnisse. Somit macht
es eine unspezifische Bindung oder Anlagerung verschiedener
Substanzen an den Träger schwierig, eine Einheitlichkeit der
Bindung zwischen dem Träger und der zu immobilisierenden
Substanz herzustellen, und verursacht unerwünschte
Hintergrundeffekte. Wenn ferner eine Mikrotiterplatte als fester
Träger verwendet wird, liefert jedes Loch nur einen Meßwert,
der sich von Loch zu Loch unterscheidet, woraus sich eine
Ineffizienz des Experiments oder eine Unzuverlässigkeit der
Meßergebnisse ergibt.
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Eine Lösung des Problems liegt darin, daß die
Bindung zwischen dem Träger und der zu immobilisierenden
Substanz mehr spezifisch gemacht wird, wodurch die
Hintergrundeffekte und die Streuung der Meßergebnisse
verringert wird.
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Die jetzigen Erfinder haben nun gefunden, daß die
obigen Probleme gelöst werden können, indem man eine
Probenlösung, welche den Analyt enthält, mit aus
Partikelbestehenden Trägern zusammenbringt, an denen eine
zweite Substanz, die fähig ist, spezifisch an den genannten
Analyt zu binden, immobilisiert wurde und der Analyt, der an
die Partikel über die zweite Substanz gebunden wird, mittels
Durchflußzytometrie nachgewiesen wird.
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Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur qualitativen oder quantitativen Messung eines Antikörpers
A in einer Probenlösung zur Verfügung, welche im Prinzip die
um Anspruch 1 dargestellten Stufen umfaßt.
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Für das Ziel der Erfindung, wie sie hier offenbart
und beansprucht wird, werden unten die folgenden Ausdrücke
definiert:
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Der Ausdruck "Substanz A" oder "Analyt" betrifft
einen Antikörper.
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Der Ausdruck "Substanz B" oder "zweite Substanz"
betrifft ein Antigen, welches mit der Substanz A oder Analyt
spezifisch reagieren und daran binden kann und welches an ein
Mikropartikel aus Silicagel, welches als Träger verwendet
wird, spezifisch binden kann. Eine Kombination eines Antigens
und seines spezifischen monoklonalen Antikörpers wird
bevorzugt.
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Der Ausdruck "Probenlösung" ist eine Lösung, von der
man weiß oder vermutet, daß sie die Substanz A enthält.
Beispiele für Probenlösungen umfassen Blut, Urin,
Körperflüssigkeiten, Nährböden und dergleichen.
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Der für die Durchflußzytometrie verwendete Apparat
ist im Handel erhältlich und jedes der vorhandenen Geräte
kann für das vorliegende Verfahren verwendet werden. Die
Bestimmung mittels Durchflußzytometrie wird grundsätzlich so
durchgeführt, daß man eine Suspension von fein verteilten
Substanzen, die nachgewiesen werden sollen, z.B. Zellen oder
Chromosome, mit hoher Geschwindigkeit durch ein
Flüssigkeitssystem laufen läßt und hierbei die photoelektrischen
Signale der einzelnen Partikel auf dem Detektor nachweist.
Der Nachweis wird durchgeführt, indem man die suspendierten
Partikel, die sich mit hoher Geschwindigkeit bewegen, mit
einem Laserstrahl anstrahlt und so die optischen
Eigenschaften jedes Partikels in photoelektrische Signale
umwandelt. Die optische Eigenschaft des Partikels wird
allgemein durch geeignete Signale erzeugende Systeme
geliefert. Solche Signale erzeugende Systeme umfassen die
Erzeugung von nachweisbaren Signalen wie Absorption, Streuung
oder Emission von Licht. Beispiele für Substanzen, die
Signale erzeugen, sind fluoreszenzbildende oder farbbildende
Verbindungen wie Rhodamin, FITC (Fluorescein-isothiocyanat),
Acridinorange, Propiodiumiodit und dergleichen. Ein solches
Signale erzeugendes System kann an die Mikropartikel
angelagert werden, indem Substanzen zugegeben werden, die
eine geeignete Signale erzeugende Substanz in Verbindung mit
einem Molekül enthalten, das fähig ist, an die Substanz A zu
binden. In der vorliegenden Erfindung ist die genannte
markierte Substanz ein in geeigneter Weise markierter zweiter
Antikörper.
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Beispiele von Apparaten für die Durchflußzytometrie
umfassen die FACS-Reihe, vertrieben von Becton Dickinson, die
EPICS-Reihe, vertrieben von Nippon Bunko Ltd., Showa Denko
Ltd., Cor-tar Electronics Ltd. und dergleichen.
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Die als feste Träger zu verwendenden Mikropartikel
können jede beliebige Form haben, für die Bestimmung mittels
Durchflußzytometrie sind sie jedoch bevorzugt sphärisch mit
einem geeigneten Durchmesser. Die Größe der Partikel kann
abhängig von der Größe der Düse, die an dem Apparat für die
Durchflußzytometrie angebracht ist, variieren. Die
Mikropartikel können jedoch einen Durchmesser im Bereich von
etwa 1 nm bis 1000 µm, bevorzugt von etwa 1 nm bis etwa
400 µm, noch mehr bevorzugt von 100 nm bis 100 µm, aufweisen.
Konkret kann der mittlere Durchmesser der Partikel zwischen
etwa 1 nm bis etwa 400 µm liegen, wenn der Durchmesser der
Düse zwischen etwa 10 bis etwa 1.000 µm liegt, und der
mittlere Durchmesser der Partikel kann zwischen etwa 0,1 bis
etwa 100 µm liegen, wenn derjenige der Düse zwischen etwa 10
bis etwa 500 µm liegt. Besonders bevorzugte Partikel sind
diejenigen, welche einen Durchmesser von etwa 0,1 bis 100 µm
aufweisen.
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Die Mikropartikel oder die aus Partikeln bestehenden
Träger bestehen aus Silicagel.
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Obwohl diese Mikropartikel ohne weitere Behandlung
verwendet werden können, können sie verschiedenartig
modifiziert werden, um die Immobilisierung der Substanzen
stabiler und gleichmäßiger zu machen. Die Partikel können
einem die Oberflächenbeschaffenheit verbessernden Verfahren
mittels physikalischer und/oder chemischer Behandlung, z.B.
mit dem Ionenplattierungsverfahren, unterworfen werden.
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Die Immobilisierung der Substanz B an die Partikel
kann gemäß bekannten Verfahren des Standes der Technik
durchgeführt werden. Obwohl die Arbeitsweise abhängig von der
Substanz B und dem Material der Partikel variieren kann, kann
die Substanz B im allgemeinen kovalent an eine funktionelle
Gruppe gebunden werden, die in dem Molekül, aus welchem das
genannte Partikel zusammengestzt ist, vorhanden ist, z.B.
eine Hydroxylgruppe oder dergleichen. Somit kann die
Immobilisierung erreicht werden, indem beispielsweise eine
Aminogruppe der Substanz B und eine Hydroxylgruppe des
Trägers nach der Aktivierung der Hydroxylgruppe mit einem
Aktivierungsmittel, wie Trifluorethansulfonylchlorid oder
dergleichen, zur Reaktion gebracht wird [R. Axen et al,
Nature, Vol. 214, Seite 1302 (1967); T.H. Finlay et al.,
Anal. Biochem. Vol 87, Seite 77 (1978); 1. Matsumoto et al.,
J. Biochem. Vol. 85, Seite 1091 (1979); L. Sundberg et al.,
J. Chromatogr. Vol.90, Seite 87 (1974); K. Nilson et al.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol.102, Seite 449 (1981); und
J. Porath, Meth. Enzymol. Vol 34, Seite 27 (1974)); indem
eine Aminogruppe oder eine Carboxylgruppe der Substanz B mit
einer Carboxylgruppe oder einer Aminogruppe des Trägers in
Gegen-wart eines Kondensationsmittels wie eines
wasserlöslichen Carbodiimids (WCS, erhältlich von Wako
Junyaku Co., Ltd., Japan, und dergleichen) zur
Reaktiongebracht wird [A. Tengblad, Biochem. J. Vol.199, Seite 297
(1981); M. Funabashi et al., Anal. Biochem. Vol 126, Seite
414 (1982); G. Saccomani et al., J. Biochem. Vol.256,Seite
12405 (1981); B. Belleau et al., J.Am. Chem. Soc. Vol 90,
Seite 1651 (1968); und P. Cuartecasas et al., Biochemistry
Vol.11, Seite 2291 (1972)]; indem eine Aminogruppe mit einer
Aldehydgruppe zur Reaktion gebracht wird, um eine Schiff'sche
Base oder ein Hydrazid zu ergeben, und erforderlichenfalls
nachträglich reduziert wird [Y. Ito et al., J. Biochem.
Vol.97, Seite 1698 (1985); und R. J. Baues et al., J. Biol.
Chem. Vol.252, Seite 57 (1977)]; oder indem -S-S-Bindungen
unter Verwendung einer Thiolgruppe gebildet werden [K.
Brocklehurst et al., Biochem. J. Vol.133, Seite 573 (1973)].
In der vorliegenden Erfindung ist die Substanz B ein Antigen,
insbesondere ein DNA-Molekül, und die Substanz A ist ein
monoklonaler anti-DNA-Antikörper, wobei die genannte Substanz
B durch terminale Immobilisierung an ein Mikropartikel aus
Silicagel gebunden ist.
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Die immobilisierte Substanz B ist für die Bestimmung
des Vorhandenseins oder der Abwesenheit, oder der
Konzentration der Substanz A in einer Probe verwendbar.
Dementsprechend wird in einer anderen Ausführungsform der Erfindung
eine immobilisierte Substanz B zur Verfügung gestellt, die
für die qualitative oder quantitative Bestimmung der Substanz
A mittels Durchflußzytometrie verwendbar ist, worin die
genannte Substanz B spezifisch mit der Substanz A reagieren
und sie binden kann, und der feste Träger ein Mikropartikel
ist.
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Wie oben erwähnt wurde, ermöglicht das vorliegende
Verfahren, die Substanz A nachzuweisen, indem die Substanz A
mit Hilfe der Substanz B, die an das Partikel immobilisiert
ist und fähig ist, spezifisch mit der Substanz A zu
reagieren, sich mit einem Mikropartikel verbindet und das
Mikropartikel der Durchflußzytometrie unterworfen wird. In
der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die
Substanz B gleichmäßig auf einem aus Partikeln bestehenden
Träger über eine kovalente Bindung zwischen funktionellen
Gruppen, wie Amino-, Hydroxy-, Carboxy-, Thiolgruppen und
dergleichen, immobilisiert. Als ein aus Partikeln bestehender
Träger wird einer von denjenigen verwendet, die für HPLC
benutzt werden, nämlich Silicagel, da dieses kaum
irgendwelche unspezifische Bindungen erzeugt, wodurch eine
Verringerung der Hintergrundeffekte und eine Verbesserung der
Genauigkeit der Messung resultiert.
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Im Vergleich mit dem gegenwärtig verwendeten ELISA,
bei dem eine Mikrotiterplatte als fester Träger verwendet
wird, weist das vorliegende Assay folgende Vorteile auf. Das
vorliegende Essay ist effizienter als ELISA, da ein Partikel
des vorliegenden Assays als äquivalent zu einem Loch von
ELISA betrachtet werden kann und nahezu 10&sup5; Partikel mit
einem Versuch gemessen werden können. Ferner werden anomale
Meßwerte aus den Resultaten fortgelassen und der
Hintergrundeffekt ist, wie bereits früher erwähnt, verringert.
Somit liefert das vorliegende Verfahren etwa 10&sup4;&supmin;&sup5; mal so
viele Meßdaten mit einer hohen Genauigkeit und weniger
Fehlern innerhalb der gleichen Nachweiszeit verglichen mit
ELISA. Gemäß dem vorliegenden Verfahren ist die Stärke der
Affinität und der Reaktivität in Form von Nachweisbildern
erhältlich, wie aus den beigefügten Zeichnungen, Figuren 1
bis 8, hervorgeht.
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In den Figuren:
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Die Figur 1 zeigt die Nachweisbilder von anti-DNA-
Antikörpern unter Verwendung von aus Partikeln bestehenden
Trägern, an welchen DNA-Fragmente (a) und (b), wie es im
Beispiel 1 beschrieben wird, getrennt als einsträngige DNA
immobilisiert sind. Die Anzahl der Partikel wird auf der
Ordinate aufgetragen und die Intensität der Fluoreszenz auf
der Abszisse. Die durchgezogenen Linien stellen das
Nachweisbild dar, welches in den Experimenten, die unter Verwendung
von antikörperhaltigen Proben erhalten wurden, und die
gestrichelten Linien stellen diejenigen dar, die in den
Kontrollexperimenten unter Verwendung von antikörperfreien
Proben durchgeführt wurden. Das Diagramm A veranschaulicht
den Bindungseffekt von IgG an die aus Partikeln bestehenden
Träger mit immobilisierter DNA, das Diagramm B
veranschaulicht denjenigen von IgM, und das Diagramm C veranschaulicht
denjenigen des monoklonalen anti-DNA-Antikörpers. Die Ordnung
der Zahl der Partikel, die auf der Ordinate gezeigt werden,
beträgt 10.000.
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Die Figur 1 läßt erkennen, daß keiner der
unspezifischen Antikörper IgG und IgM, die keine Affinität zu
der DNA, die nachgewiesen werden soll, aufweisen, den Shift
des Peaks (Diagramme A bezw. B) bewirken, während der
spezifische monoklonale Antikörper einen signifikanten Shift
des Peaks (Diagramm C) bewirkt, womit gezeigt wird, daß das
vorliegende Verfahren den Nachweis eines spezifischen
Antikörpers korrekt ermöglicht.
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Die Figur 2 ist ähnlich der Figur 1, mit der
Ausnahme, daß Träger verwendet werden, an die DNA (a) und (b)
in Form einer doppelsträngigen DNA immobilisiert sind.
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Die Figur 3 ist ähnlich der Figur 1, mit der
Ausnahme, daß Träger verwendet werden, an die DNA (c) und
(d), wie im Beispiel 1 beschrieben, als einsträngige DNA
immobilisiert sind.
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Die Figur 4 ist ähnlich der Figur 3, mit der
Ausnahme, daß Träger verwendet werden, an die DNA (c) und (d)
als doppelsträngige DNA immobilisiert sind.
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Die Figur 5 ist ähnlich der Figur 1, mit der
Ausnahme, daß Träger verwendet werden, an die DNA (e) und
(f), wie im Beispiel 1 beschrieben, als einsträngige DNA
immobilisiert sind.
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Die Figur 6 ist ähnlich der Figur 5, mit der
Ausnahme, daß Träger verwendet werden, an die DNA (e) und (f)
als doppelsträngige DNA immobilisiert sind.
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Die Figur 7 ist ähnlich der Figur 1, mit der
Ausnahme, daß Lysozym an aus Partikeln bestehenden Trägern
immobilisiert ist und daß ein monoklonaler anti-Lysozym-
Antikörper als spezifischer Antikörper verwendet wird.
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Die Figur 8 ist ähnlich der Figur 1, mit der
Ausnahme, daß die Diagramme A und C die Resultate zeigen,
welche unter Verwendung von Trägern erhalten wurden, an die
DNA (a) und (b), wie im Beispiel 3 gezeigt, als einsträngige
DNA immobilisiert sind, während die Diagramme B und D die
Resultate zeigen, welche unter Verwendung von Trägern
erhalten wurden, an die doppelsträngige DNA, bestehend aus
(a) und (b), immobilisiert sind. Außerdem veranschaulichen
die Diagramme A und B den Bindungseffekt von IgG und die
Diagramme C und D den Bindungseffekt von monoklonalen anti-
DNA-Antikörpern.
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In dem vorliegenden Assay zeigt sich die Schwankung
der Meßergebnisse, namlich die Schwankung der Intensität der
Fluoreszenz von Partikel zu Partikel, in Form der Breite des
Peaks. Ferner kann jedes Partikel als äquivalent zu einem
Loch dem gegenwärtig verwendeten ELISA betrachtet werden. Das
bedeutet, daß gemäß dem vorliegenden Verfahren im Vergleich
zu ELISA etwa 10&sup4; bis 10&sup5; mal so viele Meßergebnisse mit nur
einem Experiment erhalten werden können. Die Meßergebnisse,
welche als ein Peak gezeigt werden, sind äußerst zuverlässig
und ermöglichen es, die Affinität zwischen zwei Substanzen,
z.B. einem Antigen und einem Antikörper, korrekt und
effizient zu bestimmen.
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Obwohl das vorliegende Assay auf verschiedenen
Gebieten brauchbar ist, ist es besonders gut bei klinischen
Experimenten, in der Immunologie, Biochemie und dergleichen
zum Zwecke des Nachweises oder der Diagnose von verschiedenen
Krankheiten und/oder für den Nachweis eines Antikörpers, von
spezifischen Substanzen und dergleichen verwendbar.
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Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende
Erfindung weiter und schildern sie ausführlich, sie sollen
jedoch nicht so ausgelegt werden, daß sie die Erfindung
begrenzen.
Beispiel 1
TRÄGER MIT IMMOBILISIERTER DNA
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1. Herstellung des aus Partikeln bestehenden Trägers
mit immobilisierter DNA.
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A. Herstellung von aktivierten Mikropartikeln für die
Immobilisierung von DNA
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Als fester Träger für die Immobilisierung von DNA
wird Silicagel mit Trifluorethansulfonylchlorid
(Tresylchlorid: K & K, Co. Ltd.) aktiviert. SIMPACK-diol 300
(mittlere Partikelgröße = 5 µm im Durchmesser; SHIMAZU Co.
Ltd.) (1 g) wird in einen No.5-Mesh-Glasfilter gegeben und
mit Aceton (20 ml) und dann mit trockenem Aceton (20 ml)
unter Absaugen gewaschen. Das Gel wird in einen 25 ml
Rundkolben überführt und trockenes Aceton (1 ml), Pyridin
(100 µl) und ein kleiner Rührerchip werden zugegeben. In den
Kolben werden allmählich innerhalb von etwa 1 Minute
tropfenweise unter kräftigem Rühren und unter Ausschluß von
Luft durch Einführen von Stickstoffgas 100 bis 200 µl
Tresylchlorid zugegeben. Nachdem der Rundkolben mit einem
Stopfen verschlossen wurde, wird die Reaktion über weitere 20
Minuten unter Kühlen und leichtem Rühren fortgesetzt. Wenn
die Reaktion beendet ist, wird die Mischung durch einen No.5-
Mesh-Glasfilter filtiert und mit je 25 ml trockenem Aceton,
Aceton/5mm HCl (1:!), 5 mM HCl und Aceton nacheinander
gewaschen, und das Aceton wird abgedampft. Das so erhaltene
mit Tresyl aktivierte SIMPAK-diol 300 wird in einem
Kjeldahlkolben gesammelt. Nach Abdampfen des Acetons unter
vermindertem
Druck wird das resultierende aktivierte Silicagel in dem
Kolben bis zum Gebrauch fest verschlossen.
B. Herstellung von DNA
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Die folgenden DNA-Fragmente wurden unter Verwendung
des DNA Synthesizer A-391EP PCR MATE (Applied Biosystems Inc.
(ABI)) synthetisiert. Unter den folgenden Fragmenten ist (a)
ein zu immobilisierendes 27-er Fragment und (b) ist ein
komplementärer Strang hiervon, (c) ist ein zu
immobilisierendes 24-er Fragment und (d) ist ein komplementärer Strang
hiervon und (e) ist ein zu immobilisierendes 21-er Fragment
und (f) ist ein komplementärer Strang hiervon.
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5' X ACT TTC TGT TGC TTC ATC TTT GCA GAG 3' (a)
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5' CTC TGC AAA GAT GAA- GCA aca GAA AGT (b)
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5' X GTC TGG GAA AAA CCC CCT TTG AGT (c)
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5' ACT CAA AGG GGG TTT TTC CCA GAC (d)
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5' X AGG TGA ATT TCT TAA ACA GCT (e)
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5' AGC TGT TTA AGA AAT TCA CCT (f)
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X: Aminolink-2 (ABI Co. Ltd.), ist ein Reagens, welches in
der DNA-Synthese verwendet wird, um eine Aminogruppe am
5'-Terminus eines DNA-Moleküls einzuführen und welches mit
der Formel gezeigt wird:
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Die Synthese und die Reinigung der obigen DNA-
Fragmente wurden gemäß der Unterweisung des Herstellers
durchgeführt.
C. Immobilisierung von DNA an den Träger
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Die Immobilisierung von DNA, die oben unter B.
erhalten wurde, an einen aus Partikeln bestehenden Träger,
der oben unter A. erhalten wurde, wird mit einem Verfahren
durchgeführt, das folgende Stufen umfaßt:
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1) Löse die DNA-Fragmente (a) und (b) (je 400 µg) in
1 M NaCl (250 µl);
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2) erhitze die oben unter 1) genannte Lösung auf
90ºC auf einem Wasserbad und lasse sie für etwa 5 Minuten bei
dieser Temperatur stehen;
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3) kühle die oben unter 2) genannte Lösung eine
Stunde auf 35ºC;
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4) füge 0,4 M NaHCO&sub3; (pH 7,5) (250 µl) zu der oben
unter 3) genannten Lösung hinzu und mische sorgfältig;
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5) füge mit Tresyl aktiviertes Silicagel (250 mg) zu
der oben unter 4) genannten Mischung hinzu und mische
sorgfältig;
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6) rühre die oben unter 5) genannte Mischung 18
Stunden bei Raumtemperatur;
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7) stelle 2 Typen von aus Partikeln bestehenden DNA-
immobilisierten Trägern in der folgenden Weise her.
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Die oben unter 6) genannte Mischung wird in zwei
Teile geteilt und einer von ihnen wird 3 mal mit einer
Mischung von 0,5 M NaCl und 0,2 M NaHCO&sub3; (pH 7,5) gewaschen,
um einen Träger zu liefern, an den aus einer doppelsträngigen
DNA bestehendes (a) und (b) immobilisiert ist.
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Die andere Hälfte wird verwendet, um Träger zu
erhalten, an welche einsträngige DNA (a) und (b) getrennt
angelagert ist. So wird die Mischung 5 Minuten auf 95ºC
gehalten und schnell zentrifugiert (12.000 Umdr./Min. über 1
Minute), um den Überstand abzutrennen. Zu der festen Phase
werden 300 µl von 0,5 M NaCl und 0,2 M NaHCO&sub3; (pH 7,5)
zugegeben, und die Mischung wird zweimal mit einem Verfahren
behandelt, das in 5-minütigem Erhitzen auf 95ºC und Abtrennen
des Überstands mittels Zentrifugation besteht, um einen aus
Partikeln bestehenden Träger zu erhalten, an den einsträngige
DNA angelagert ist. Dieser Trägertyp ist vorwiegend ein mit
DNA (a) immobilisierter Träger.
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Die gleiche Verfahrensweise wie oben wird unter
Verwendung der DNA-Fragmente (c) und (d) bezw. (e) und (f)
wiederholt und es werden für jedes Paar der DNAs zwei Typen
von Trägern erhalten. Dementsprechend wurden 6 Typen von
Trägern mit immobilisierter DNA erhalten, welche 3 Träger mit
immobilisierter doppelsträngiger DNA und 3 Träger mit
immobilisierter einsträngiger DNA für 3 Paare von DNAs
umfassen, nämlich (a) und (b), (c) und (d) und (e) und (f).
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2. Nachweis des anti-DNA-Antikörpers
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Die Effektivität der oben erhaltenen Partikel mit
immobilisierter DNA bei dem Nachweis des anti-DNA-Antikörpers
wurde wie folgt bestimmt.
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Als spezifischer anti-DNA-Antikörper wurde
monoklonaler anti-DNA-Antikörper verwendet. Für
Vergleichszwecke wurden unspezifische Antikörper, das heißt,
Immunoglobulin G (IgG) und Immunoglobulin M (IgM), verwendet. Der
Kontrollversuch wurde unter Verwendung einer Probe ohne
Antikörper durchgeführt.
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Der in dem vorliegenden Experiment verwendete
monoklonale anti-DNA-Antikörper wurde mit in der Literatur
beschriebenen Verfahren erhalten (z.B. T. Koike et al.,
Immunology Letter 4, 93 (1982)) und die Einzelheiten des
Verfahrens sind dem Fachmann wohlbekannt. Eine autoimmune
Maus mit anti-DNA-Antikörper produzierenden Zellen wird dann
getötet und die erhaltenen Milzzellen werden mit Myelomzellen
fusioniert, wodurch Hybridzellen erhalten werden, die als
Hybridomas bezeichnet werden. Aus den Hybridomas wird ein
gewünschter Klon, der eine einzige Antikörperspezies gegen
DNA absondert, isoliert, um so den spezifischen monoklonalen
Antikörper zu erhalten.
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Das Assay, welches den obigen Träger mit
immobilisierter DNA verwendet (hergestellt unter dem obigen 1., C.),
wird folgendermaßen durchgeführt:
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a) Gib Silicagel mit immobilisierter DNA auf eine 96
Loch-Mikrotiterplatte mit einer Konzentration von etwa 5 x
10&sup5;/Loch;
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b) wasche das Gel mit 200 µl des Puffers A [1% BSA
(Rinderserumalbumin), 0,05% Tween 20, 0,1% NaN&sub3; und 100 mM
Tris-HCl (pH 7,4)];
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c) gib 30 µl einer Verdünnung (1 µg/ml) von
monoklonalem anti-DNA-Antikörper in jedes Loch und laß die Platte 60
Minuten bei Raumtemperatur stehen;
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d) wasche die Platte dreimal mit dem Puffer A;
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e) gib 20 µl eines markierten sekundären
Antikörpers, eine 1/150-Verdünnung von Ziegen-anti-Maus IgG + IgM +
FITC (TAGO Co., Ltd.) in jedes Loch und laß die Platte 30
Minuten bei Raumtemperatur stehen;
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f) wasche die Platte zweimal mit dem Puffer A;
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g) gib 400 µl 1%ige Trifluoressigsäure und 10 mM
Phosphatpuffer in jedes Loch, mische gründlich und überführe
den Inhalt des Lochs getrennt in ein Teströhrchen, um Proben
zu erhalten;
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h) weise mittels Durchflußzytometrie unter
Verwendung von FACS-Tar (einer der FACS-Reihe) das Signal
nach, das auf den Partikeln in jeder Probe vorhanden ist.
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Die obigen Arbeitsweisen wurden unter Verwendung von
IgG oder IgM statt des monoklonalen anti-DNA-Antikörpers in
der Stufe c) und in Abwesenheit eines Antikörpers wiederholt.
Die Resultate werden in den beigefügten Zeichnungen, Figuren
1 bis 6, gezeigt.
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In den Figuren wird die Anzahl der Partikel auf der
Ordinate und die Intensität der Fluoreszenz auf der
Mittellinie aufgetragen. Die durchgezogenen Linien stellen das
Nachweisbild dar, das in den Experimenten erhalten wurde, die
unter Verwendung von antikörperhaltigen Proben durchgeführt
wurden, und die gestrichelten Linien stellen ein solches dar,
das bei den Kontrollexperimenten unter Verwendung von
antikörperfreien Proben durchgeführt wurde.
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Die Figuren 1 und 2 zeigen die Resultate, die bei
Verwendung von Trägern erhalten wurden, auf denen DNA (a) und
(b) als einsträngige bezw. als doppelsträngige DNA
immobihsiert wurden. Die Figuren 3 und 4 zeigen die Resultate, die
bei Verwendung von Trägern erhalten wurden, auf denen DNA (c)
und (d) als einsträngige bezw. als doppelsträngige DNA
immobilisiert wurden. Die Figuren 5 und 6 zeigen die Resultate,
die bei Verwendung von Trägern erhalten wurden, auf denen DNA
(e) und (f) als einstrangige bezw. als doppelsträngige DNA
immobilisiert wurden. Überall in den Figuren 1 bis 6
veranschaulicht das Diagramm A den Bindungseffekt von IgG,
das Diagramm B veranschaulicht denjenigen von IgM und das
Diagramm C veranschaulicht denjenigen des monoklonalen anti-
DNA-Antikörpers. Die Ordnung der Zahl der Partikel, die auf
der Ordinate gezeigt werden, beträgt 10.000.
-
Wenn die an ein Partikel immobilisierte DNA effektiv
an den Antikörper gebunden ist, der nachgewiesen werden soll,
steigt die Intensität der Fluoreszenz des genannten Partikels
und der Peak als die Gesamtfluoreszenz von allen
nachgewiesenen Partikeln sollte sich nach rechts verschieben. Das Ausmaß
des Shifts zeigt die Leichtigkeit oder Festigkeit der Bindung
zwischen der immobilisierten Substanz (Antigen) und der
anderen Substanz, die nachgewiesen werden soll (Antikörper),
an, mit anderen Worten, es zeigt die Affinität dieser
Substanzen an.
-
Aus den Figuren 1 bis 6 ist leicht zu ersehen, daß
keiner der unspezifischen Antikörper IgG und IgM den Shift
des Peaks (Diagramme A bezw. B) hervorruft, während der
spezifische monoklonale Antikörper einen signifikanten Shift
des Peaks (Diagramm C) hervorruft. Das zeigt, daß das
vorliegende Verfahren für den Nachweis der Substanz A, welche
spezifisch zu einer auf Mikropartikeln immobilisierten
Substanz B ist, effektiv ist.
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In dem vorliegenden Assay zeigt sich die Schwankung
der Meßdaten, das heißt die Schwankung der Intensität der
Fluoreszenz von Partikel zu Partikel, in Form der Breite des
Peaks. Jedes Partikel kann ferner als äquivalent zu einem
Loch des gegenwärtig verwendeten ELISA betrachtet werden.
-
Daher können gemäß dem vorliegenden Verfahren im Vergleich zu
ELISA etwa 10&sup4; bis 10&sup5; mal so viele Daten mit nur einem
Experiment erhalten werden. Die Meßergebnisse, welche als ein
Peak gezeigt werden, sind äußerst zuverlässig und ermöglichen
es, die Affinität zwischen zwei Substanzen, z.B. zwischen
einem Antigen und einem Antikörper, korrekt und effizient zu
bestimmen.
Beispiel 2
TRÄGER MIT IMMOBILISIERTEM LYSOZYM
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1. Herstellung von aus Partikeln bestehenden Trägern
mit immobilisiertem Lysozym
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A. Als fester Träger für die Immobilisierung von
Lysozym wurde SIMPACK-diol 300 mit Tresylchlorid in der
gleichen Weise aktiviert, wie es im Beispiel 1, 1. A.
beschrieben wird. Das tresylaktivierte Silicagel wurde in
einem Kjeldahlkolben bis zum Gebrauch aufbewahrt.
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Lysozym (Funakoshi & Co., Ltd.) wurde wie folgt
immobilisiert:
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1) Löse Lysozym (1 mg) in 500 µl von 0,5 M NaCl und
0,2 M NaHCO&sub3; (pH 7,5);
-
2) füge 250 mg von tresylaktiviertem Silicagel zu
der obigen unter 1) beschriebenen Lösung hinzu und mische
sorgfältig;
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3) rühre die obige unter 2) beschriebene Mischung 18
Stunden bei Raumtemperatur;
-
4) wasche das resultierende Silicagel dreimal mit
0,5 M NaCl und 0,2 M NaHCO&sub3; (pH 7,5).
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Die so erhaltenen Mikropartikel mit immobilisiertem
Lysozym werden dann wie folgt für den Nachweis des anti-
Lysozym-Antikörpers verwendet.
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2. Nachweis des anti-Lysozym-Antikörpers
Die Bestimmung der Effektivität der aus Partikeln
bestehenden Träger mit immobilisiertem Lysozym in dem Assay
des anti-Lysozym-Antikörpers wurde in ähnlicher Weise
durchgeführt, wie es im obigen Beispiel 1 beschrieben wird.
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Der lysozymspezifische monoklonale Antikörper wurde
aus einem Hybridoma hergestellt, das durch Fusion von
Milzzellen einer lysozymimmunisierten Maus und Mäusemyelomzellen
erhalten wurde. Immunoglobuline G (IgG) und M (IgM) wurden
ebenfalls verwendet und der Kontrollversuch wurde unter
Verwendung einer Probe ohne irgendwelche Antikörper
durchgeführt.
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Das Assay wurde in Übereinstimmung mit den im
Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweisen durchgeführt. So wurde
zu einer 96 Loch-Mikrotiterplatte Silicagel mit
immobilisiertem Lysozym mit einer Konzentration von etwa 5 x 10&sup5;/Loch
zugegeben und mit 200 µl des Puffers A gewaschen. Nach Zugabe
von 30 µl einer Lösung (1 µg/ml) des monoklonalen anti-
Lysozym-Antikörpers in jedes Loch wurde die Platte 60 Minuten
bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Waschen der Platte
mit dem Puffer A (dreimal) wurden 20 µl einer Lösung eines
sekundären Antikörpers, eine 1/150 Verdünnung eines
Ziegenanti-Maus IgG + IgM + FIFTC (TAGO Co., Ltd.) zu jedem Loch
zugegeben und die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehen gelassen. Die Platte wurde dann zweimal mit dem Puffer
A gewaschen. Zu jedem Loch wurden 400 µl 1%iger
Trifluoressigsäure und 10 mM Phosphatpuffer zugegeben und sorgfältig
gemischt. Der Inhalt jedes Lochs wurde in ein Teströhrchen
übertragen, um Proben zu ergeben. Jede Probe wurde unter
Verwendung von FACS-Tar einer Durchflußzytometrie
unterworfen, um die auf den Mikropartikeln vorhandenen Signale
nachzuweisen.
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Die obige Arbeitsweise wurde unter Verwendung von
IgG oder IgM statt des monoklonalen anti-Lysozym-Antikörpers
und in Abwesenheit eines Antikörpers wiederholt. Die
Resultate werden in der beigefügten Zeichnung, Figur 7,
gezeigt.
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In der Figur 7 ist die Anzahl der Partikel auf der
Ordinate und die Intensität der Fluoreszenz auf der Abszisse
aufgetragen. Die durchgezogenen Linien stellen das
Nachweisbild dar, das in den Experimenten unter Verwendung von
antikörperhaltigen Proben erhalten wurde, und die
gestrichelten Linien stellen dasjenige dar, das in den
Kontrollexperimenten unter Verwendung einer antikörperfreien Probe
erhalten wurden. Das Diagramm A veranschaulicht den
Bindungseffekt von IgG, das Diagramm B veranschaulicht den
Bindungseffekt
von IgM und das Diagramm C veranschaulicht den
Bindungseffekt des monoklonalen anti-Lysozym-Antikörpers. Die
Ordnung der Zahl der Partikel, die auf der Ordinate gezeigt
werden, beträgt 10.000.
-
Wenn das auf einem Partikel immobilisierte Lysozym
effektiv an den Antikörper gebunden wird, der nachgewiesen
werden soll, sollte die Intensität der Fluoreszenz steigen
und der Peak, als die Gesamtfluoreszenz aller nachgewiesenen
Partikel, sollte sich nach rechts verlagern. Das Ausmaß des
Shifts des Peaks zeigt die Leichtigkeit oder Festigkeit der
Bindung zwischen dem immobilisierten Lysozym (Antigen) und
dem anti-Lysozym-Antikörper an, mit anderen Worten, es zeigt
die Affinität dieser Substanzen an.
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Aus der Figur 7 ist leicht zu ersehen, daß keiner
der unspezifischen Antikörper IgG und IgM den Shift des Peaks
(Diagramme A bezw. B) hervorruft, während der spezifische
monoklonale anti-Lysozym-Antikörper einen signifikanten Shift
des Peaks (Diagramm C) hervorruft. Die Schwankung der
Meßergebnisse, das heißt die Schwankung der Intensität der
Fluoreszenz von Partikel zu Partikel, zeigt sich in Form der
Breite des Peaks. Somit liefert das vorliegende Assay, in dem
jedes Partikel wie ein Loch in ELISA betrachtet werden kann,
fast 10.000 mal so viele Meßdaten wie diejenigen, die mit
ELISA erhalten werden. Die Meßergebnisse, welche mit dem
vorliegenden Assay erhalten werden, sind äußerst zuverlässig
und ermöglichen es, die Affinität zwischen dem Antigen und
dem Antikörper korrekter zu bestimmen.
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Das Beispiel zeigt auch, daß das vorliegende
Verfahren Meßergebnisse mit hoher Zuverläßigkeit liefert und
für den Nachweis einer Substanz in einer Probe und für die
korrekte und effiziente Bestimmung der Affinität zwischen
einem Antigen und einem Antikörper verwendbar ist.
TRÄGER MIT IMMOBILISIERTER DNA
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1. Herstellung von aus Partikeln bestehenden Trägern
mit immobilisierter DNA
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Als fester Träger für die Immobilisierung von DNA
wurde ein im Handel erhältliches, aus Partikeln bestehendes,
organisches Polymer verwendet, Tresyl 5PW (TOSO & Co., Ltd.).
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Das folgende zu immobilisierende 27-er DNA-Fragment
(a) und seine komplementäre Sequenz (b) wurden unter
Verwendung des DNA Synthesizer A-391EP PCR MATE (ABI Inc.)
synthetisiert.
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5' X ACT TTC TGT TGC TTC ATC TTT GCA GAG 3' (a)
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5' CTC TGC AAA GAT GAA GCA ACA GAA AGT 3' (b)
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Die Immobilisierung der obigen DNA-Fragmente wurde
in der gleichen Weise durchgeführt, wie es im Beispiel 1, 1.
C. beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß Tresyl 5PW statt
des SIMPACK-diols und zwei Typen von Trägern mit
immobilisierter DNA verwendet wurden, ein Träger, an den aus (a) und
(b) bestehende doppelsträngige DNA immobilisiert wurde, und
getrennt davon eine Mischung von Trägern, an welche aus (a)
und (b) bestehende einsträngige DNA immobilisiert wurde.
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2. Nachweis des anti-DNA-Antikörpers
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Die Bestimmung der Effektivität der aus Partikeln
bestehenden Träger mit immobilisierter DNA in dem Assay des
anti-DNA-Antikörpers wurde in der gleichen Weise durchgeführt
wie in dem obigen Beispiel 1, 2.
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Der DNA-spezifische monoklonale Antikörper wurde so
hergestellt, wie es oben erwähnt wurde. Als unspezifischer
Antikörper wurde IgG verwendet.
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Das Assay wurde in Übereinstimmung mit den im
Beispiel 1, 2. beschriebenen Arbeitsweisen durchgeführt. So
wurde zu einer 96 Loch-Mikrotiterplatte Silicagel mit
immobilisierter DNA mit einer Konzentration von etwa 5 x 10&sup5;/Loch
zugegeben, und die Platte wurde mit 200 µl des Puffers A
gewaschen. Nach der Zugabe von 30 µl einer Lösung (1 µg/ml)
von monoklonalem anti-DNA-Antikörper in jedes Loch wurde die
Platte 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen -gelassen. Nach
Waschen der Platte mit dem Puffer A (dreimal) wurden 20 µl
einer Lösung eines sekundären Antikörpers, eine 1/150
Verdünnung eines Ziegen-anti-Maus IgG + IgM + FIFTC (TAGO
Co., Ltd.) zu jedem Loch zugegeben und die Platte wurde 30
Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Platte wurde
dann zweimal mit dem Puffer A gewaschen. Zu jedem Loch wurden
400 µl 1%iger Trifluoressigsäure und 10 mM Phosphatpuffer
zugegeben und es wurde sorgfältig gemischt. Der Inhalt jedes
Lochs wurde dann in ein Teströhrchen überführt, um Proben zu
liefern. Jede Probe wurde einer Durchflußzytometrie
unterworfen, um unter Verwendung von FACS-Tar die auf den
Mikropartikeln vorhandenen Signale nachzuweisen.
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Die obige Arbeitsweise wurde unter Verwendung von
IgG statt des monoklonalen anti-DNA-Antikörpers wiederholt.
Die Resultate werden in den beigefügten Zeichnungen, Figur 8,
gezeigt.
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In der Figur 8 wird die Zahl der Partikel auf der
Ordinate aufgetragen und die Intensität der Fluoreszenz auf
der Abszisse. Die Diagramme A und C zeigen die Resultate,
welche unter Verwendung von Trägern erhalten wurden, an die
DNA (a) und (b) als einsträngige DNA immobilisiert ist,
während die Diagramme (B) und (D) die Resultate zeigen,
welche unter Verwendung von Trägern erhalten wurden, an die
doppelsträngige DNA immobilisiert ist. Die Diagramme A und B
veranschaulichen den Bindungseffekt von IgG und die Diagramme
C und D veranschaulichen den Bindungseffekt des monoklonalen
anti-DNA-Antikörpers. Die Ordnung der Zahl der Partikel, die
auf der Ordinate gezeigt werden, beträgt 10.000.
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Wenn die auf einem Partikel immobilisierte DNA
effektiv an den Antikörper gebunden wird, der nachgewiesen
werden soll, sollte die Intensität der Fluoreszenz steigen
und der Peak, als die Gesamtfluoreszenz aller nachgewiesenen
Partikel, sollte sich nach rechts verlagern. Das Ausmaß des
Shifts des Peaks zeigt die Leichtigkeit oder Festigkeit der
Bindung zwischen der immobilisierten DNA (Antigen) und dem
anti-DNA-Antikörper an, mit anderen Worten, es zeigt die
Affinität dieser Substanzen an.
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Aus der Figur 8 ist leicht zu ersehen, daß der
unspezifische Antikörper IgG den Shift des Peaks (Diagramme A
und B) nicht hervorruft, während der spezifische monoklonale
anti-DNA-Antikörper einen signifikanten Shift des Peaks
(Diagramme C und D) hervorruft. Die Schwankung der
Meßergebnisse, das heißt die Schwankung der Intensität der
Fluoreszenz von Partikel zu Partikel, zeigt sich in Form der Breite
des Peaks. Somit liefert das vorliegende Assay, in dem jedes
Partikel wie ein Loch in ELISA betrachtet werden kann, fast
10.000 mal so viele Meßdaten wie diejenigen, die mit ELISA
erhalten werden. Die Meßergebnisse, welche mit dem
vorliegenden Assay erhalten werden, sind äußerst zuverlässig und
ermöglichen es, die Affinität zwischen dem Antigen und dem
Antikörper korrekter zu bestimmen.
-
Das Beispiel zeigt auch, daß das vorliegende
Verfahren Meßergebnisse mit hoher Zuverläßigkeit liefert und
für den Nachweis einer Substanz in einer Probe und für die
korrekte und effiziente Bestimmung der Affinität zwischen
einem Antigen und einem Antikörper verwendbar ist.