KR101614196B1 - 자성 실리카 입자를 사용한 측정 방법 및 그 측정 방법용 시약 - Google Patents

자성 실리카 입자를 사용한 측정 방법 및 그 측정 방법용 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명의 측정 대상 물질 측정 방법은 평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 인 초상자성 금속 산화물을 60 ∼ 95 중량％ 함유하는 실리카 입자의 표면에 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 고정화된 자성 실리카 입자를 사용하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하는 것을 특징으로 한다.

Description

자성 실리카 입자를 사용한 측정 방법 및 그 측정 방법용 시약{ASSAY METHOD USING MAGNETIC SILICA PARTICLES AND REAGENT FOR SAID ASSAY METHOD}
본 발명은 자성 실리카 입자를 사용한 측정 대상 물질 측정 방법 및 그 방법에 사용되는 시약에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 진단의 보조, 치료 효과 확인의 보조, 단백질 정제시 및 세포 분리시의 정제도의 확인 등에 사용하는 측정 방법 및 시약에 관한 것이다.
종래, 생체 물질을 함유하는 시료, 예를 들어 생체 샘플 중의 단백질 등을 측정 또는 정제하는 방법으로서 단백질이 결합될 수 있는 입자 표면에 생체 샘플 중의 단백질 등을 결합시키고, 생체 샘플 중의 목적 단백질 등 이외의 불순물을 제거하기 위해, 입자를 세정하고 단백질 등이 결합된 입자를 회수하여, 단백질의 결합량을 측정하는 방법이나 단백질 해리 용액 중에 해리시켜 정제하는 방법이 알려져 있다.
또, 자력에 의해 용이하게 분리, 회수가 가능한 점에서, 자성을 갖는 입자가 사용되고 있으며, 예를 들어 특허문헌 1 에는, 산화철로 이루어지는 심(芯) 입자의 표면에 실리카의 피막이 형성되어 이루어지는 자성 실리카 입자가 기재되어 있다. 그러나, 이 자성 입자는, 자성체가 강자성으로, 회수시의 자장을 제거해도 강자성에 의해 자성체 자신이 일시적인 자장을 나타내고 입자끼리가 자기 (自己) 회합되어, 세정성이 나쁘거나 및/또는 다음의 조작 (예를 들어, 면역 반응) 에 악영향을 미친다는 문제가 있다.
또한, 강자성에 의한 자성체 자신의 자기 회합을 해결할 목적으로, 예를 들어, 특허문헌 2 에는, 자성체에 초상자성인 자성체를 사용한 자성 실리카 입자가 개시되어 있다. 그러나, 이 자성 입자는, 입자 직경이 작은 경우에는, 자성체의 함유량이 낮아 자력으로 입자를 회수할 때에 시간이 걸리고, 입자 직경이 큰 경우에는, 비표면적이 작기 때문에 결합되는 단백질 등의 양이 적다는 문제가 있다.
일본 공개특허공보 2000-256388호 일본 공개특허공보 2000-40608호
본 발명은 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질을 담지시킬 때의 결합성이 우수하고, 또한 자력에 의한 회수성 및 자력을 제거한 상태에서의 분산성이 우수하고, 단시간의 세정 공정에서도 면역 측정에 있어서 우수한 감도를 낼 수 있는 자성 실리카 입자를 사용한 측정 대상 물질 측정 방법, 및 그 측정법용 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 본 발명에 도달하였다. 즉, 본 발명은 평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 인 초상자성 금속 산화물을 60 ∼ 95 중량％ 함유하는 실리카 입자의 표면에 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 고정화된 자성 실리카 입자를 사용하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질 측정 방법, 및 평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 인 초상자성 금속 산화물을 60 ∼ 95 중량％ 함유하는 실리카 입자의 표면에 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 고정화된 자성 실리카 입자를 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 측정 방법용 시약이다.
본 발명의 측정 방법 및 시약에 있어서는, 자성 실리카 입자를 자기를 사용하여 회수함으로써 간편한 B/F 분리를 가능하게 한다. 또, 자성 실리카 입자가 초상자성 금속 산화물을 함유하는 것이기 때문에, 그 자기 특성에 의해 집자 후의 입자의 재분산성이 우수하고, 그 결과, 단시간에 고감도로 측정 대상 물질을 측정 (검출) 할 수 있다.
본 발명에 있어서의 측정 대상 물질로는, 통상적으로 이 분야에서 측정되는 것이면 특별히 한정되지는 않고, 예를 들어 혈청, 혈액, 혈장, 뇨 등의 생체 체액, 림프액, 혈구, 각종 세포류 등의 생체 유래의 시료 중에 포함되는 단백질, 지질 단백질, 핵산, 면역 글로블린, 혈액 응고 관련 인자, 항체, 효소, 호르몬, 암 마커, 심질환 마커 및 각종 약물 등을 대표적인 것으로서 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예를 들어 알부민, 헤모글로빈, 미오글로빈, 트랜스페린, 프로테인 A, C 반응성 단백질 (CRP) 등의 단백질, 예를 들어 고비중 리포 단백질 (HDL), 저비중 리포 단백질 (LDL), 초저비중 리포 단백질 등의 지질 단백질, 예를 들어 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA) 등의 핵산, 예를 들어 알칼리성 포스파타아제, 아밀라아제, 산성 포스파타아제, γ-글루타밀트랜스페라아제 (γ-GTP), 리파아제, 크레아틴키나아제(CK), 락트산 탈수소 효소 (LDH), 글루탐산옥살로아세트산트랜스아미나아제 (GOT), 글루탐산피루브산트랜스아미나아제 (GPT), 레닌, 프로테인키나아제 (PK), 티로신키나아제 등의 효소, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 등의 면역 글로블린 (혹은 이들의 예를 들어 Fc 부, Fab 부, F(ab)2 부 등의 단편), 예를 들어 피브리노겐, 피브린 분해 산물 (FDP), 프로트롬빈, 트롬빈 등의 혈액 응고 관련 인자, 예를 들어 항스트렙토라이신 O 항체, 항인간 B 형 간염 바이러스 표면 항원 항체 (HBs 항원), 항인간 C 형 간염 바이러스 항체, 항류마티스 인자 등의 항체, 예를 들어 갑상선 자극 호르몬 (TSH), 갑상선 호르몬 (FT3, FT4, T3, T4), 부갑상선 호르몬 (PTH), 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG), 에스트라디올 (E2) 등의 호르몬, 예를 들어 α-페트프로테인 (AFP), 암태아성 항원 (CEA), CA19-9, 전립선 특이 항원 (PSA) 등의 암 마커, 예를 들어 트로포닌 T (TnT), 인간 뇌성 나트륨 이뇨 펩티드 전구체 N 단 프래그먼트 (NT-proBNP) 등의 심질환 마커, 예를 들어 항간질약, 항생 물질, 테오필린 등의 약물 등을 들 수 있다. 상기한 것 중에서도, 항체, 호르몬, 암 마커, 심질환 마커 등이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 측정 대상 물질의 유사 물질 (아날로그) 은 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (측정 대상 물질 결합 물질) 이 갖는 측정 대상 물질과의 결합 부위와 결합될 수 있는 것, 바꿔 말하면, 측정 대상 물질이 갖는 측정 대상 물질 결합 물질과의 결합 부위를 갖는 것, 다시 바꿔 말하면, 측정 대상 물질과 측정 대상 물질 결합 물질의 반응시에 공존시키면 그 반응과 경합할 수 있는 것이면 어느 것이어도 된다.
본 발명에 있어서의 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (측정 대상 물질 결합 물질) 로는, 예를 들어 「항원」-「항체」간 반응, 「당 사슬」-「단백질」간 반응, 「당 사슬」-「렉틴」간 반응, 「효소」-「인히비터」간 반응, 「단백질」-「펩티드 사슬」간 반응, 「염색체 또는 뉴클레오티드 사슬」-「뉴클레오티드 사슬」간 반응, 또는 「뉴클레오티드 사슬」-「단백질」간 반응 등의 상호 반응에 의해 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질과 결합되는 것 등을 들 수 있고, 상기 각 조합에 있어서 어느 일방이 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질인 경우, 다른 일방이 이 측정 대상 물질 결합 물질이다. 예를 들어, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질이 「항원」일 때에는 측정 대상 물질 결합 물질은 「항체」이고, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질이 「항체」일 때에는 측정 대상 물질 결합 물질은 「항원」이다 (이하, 그 밖의 상기 각 조합에 있어서도 동일하다).
구체적으로는, 예를 들어 뉴클레오티드 사슬 (올리고뉴클레오티드 사슬, 폴리뉴클레오티드 사슬) ; 염색체 ; 펩티드 사슬 (예를 들어 C-펩티드, 안지오텐신 I 등) ; 단백질 [예를 들어 프로칼시토닌, 면역 글로블린 A (IgA), 면역 글로블린 E (IgE), 면역 글로블린 G (IgG), 면역 글로블린 M (IgM), 면역 글로블린 D (IgD), β2-마이크로글로블린, 알부민, 이들의 분해 산물, 페리틴 등의 혈청 단백질] ; 효소 [예를 들어 아밀라아제 (예를 들어 췌장형, 타액선형, X 형 등), 알칼리 포스파타아제 (예를 들어 간성, 골성, 태반성, 소장성 등), 산성 포스파타아제 (예를 들어 PAP 등), γ-글루타밀트랜스페라아제 (예를 들어 신장성, 췌장성, 간성 등), 리파아제 (예를 들어 췌장형, 위형 등), 크레아틴키나아제 (예를 들어 CK-1, CK-2, mCK 등), 락트산 탈수소 효소 (예를 들어 LDH1 ∼ LDH5 등), 글루탐산옥살로아세트산트랜스아미나아제 (예를 들어 ASTm, ASTs 등), 글루탐산피루브산트랜스아미나아제 (예를 들어 ALTm, ALTs 등), 콜린에스테라아제 (예를 들어 ChE1 ∼ ChE5 등), 류신아미노펩티다아제 (예를 들어 C-LAP, AA, CAP 등), 레닌, 프로테인키나아제, 티로신키나아제 등] 및 이들 효소의 인히비터, 호르몬 (예를 들어 PTH, TSH, 인슐린, LH, FSH, 프로락틴 등), 리셉터 (예를 들어 에스트로겐, TSH 등에 대한 리셉터) ; 리간드 (예를 들어 에스트로겐, TSH 등) ; 예를 들어 세균 (예를 들어 결핵균, 폐렴구균, 디프테리아균, 수막염균, 임균, 포도구균, 렌서구균, 장내 세균, 대장균, 헬리코박터·파일로리 등), 바이러스 (예를 들어 루벨라 바이러스, 헤르페스 바이러스, 간염 바이러스, ATL 바이러스, AIDS 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 아데노 바이러스, 엔테로 바이러스, 폴리오 바이러스, EB 바이러스, HAV, HBV, HCV, HIV, HTLV 등), 진균 (예를 들어 칸디다, 크립토코커스 등), 스피로헤타 (예를 들어 렙토스피라, 매독 트레포네마 등), 클라미디아, 마이코플라스마 등의 미생물 ; 당해 미생물에서 유래하는 단백질 또는 펩티드 혹은 당 사슬 항원 ; 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염 등의 알레르기의 원인이 되는 각종 알레르겐 (예를 들어 하우스 더스트, 예를 들어 아메리카 집먼지진드기, 유럽 집먼지진드기 등의 진드기류, 예를 들어 삼목, 노송나무, 참새피, 돼지풀, 큰조아재비, 향기풀, 호밀 등의 화분, 예를 들어 고양이, 개, 게 등의 동물, 예를 들어 쌀, 흰자 등의 음식물, 진균, 곤충, 목재, 약제, 화학 물질 등에서 유래하는 알레르겐 등) ; 지질 (예를 들어 리포 단백질 등) ; 프로테아제 (예를 들어 트립신, 플라스민, 세린프로테아제 등) ; 종양 마커 단백 항원 (예를 들어 PSA, PGI, PGII 등) ; 당 사슬 항원 [예를 들어 AFP (예를 들어 L1 내지 L3 등), hCG (hCG 패밀리), 트랜스페린, IgG, 사일로 글로블린, Decay-accelerating-factor (DAF), 암태아성 항원 (예를 들어 CEA, NCA, NCA-2, NFA 등), CA19-9, PIVKA-II, CA125, 전립선 특이 항원, 암 세포가 산생하는 특수한 당 사슬을 갖는 종양 마커 당 사슬 항원, ABO 당 사슬 항원 등] ; 당 사슬 (예를 들어 히알루론산, β-글루칸, 상기 당 사슬 항원 등이 갖는 당 사슬 등) ; 당 사슬에 결합되는 단백질 (예를 들어 히알루론산 결합 단백, β글루칸 결합 단백 등) ; 인지질 (예를 들어 카르디올리핀 등) ; 리포 다당 (예를 들어 엔도톡신 등) ; 화학 물질 (예를 들어 T3, T4, 예를 들어 트리부틸주석, 노닐페놀, 4-옥틸페놀, 프탈산디-n-부틸, 프탈산디시클로헥실, 벤조페논, 옥타클로로스티렌, 프탈산디-2-에틸헥실 등의 환경 호르몬) ; 인체에 투여·접종되는 각종 약제 및 이들의 대사물 ; 앱타머 ; 핵산 결합성 물질 ; 및 이들에 대한 항체 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 사용되는 항체에는, 파파인이나 펩신 등의 단백질 분해 효소, 혹은 화학적 분해에 의해 생성되는 Fab, F(ab')2 프래그먼트 등의 분해 산물도 포함된다.
상기와 같은 측정 대상 물질 결합 물질로는, 「항원」-「항체」간 반응 혹은 「당 사슬-단백질」간 반응에 의해 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질과 결합되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질에 대한 항체, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질이 결합되는 항원, 혹은 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질에 결합되는 단백질이 바람직하고, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질에 대한 항체, 혹은 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질에 결합되는 단백질이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자는 실리카의 매트릭스 중에 평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 이고 초상자성을 갖는 금속 산화물을 분산시킨 것이다.
본 발명에 있어서의 초상자성 금속 산화물의 평균 입자 직경은 임의의 200 개의 초상자성 금속 산화물에 대해 주사형 전자 현미경으로 관찰하여 측정된 입자 직경의 평균값이다.
초상자성 금속 산화물의 평균 입자 직경은 후술하는 초상자성 금속 산화물 제조시의 금속 이온 농도를 조절함으로써 제어할 수 있다. 또, 통상적인 분급 등의 방법에 의해서도 초상자성 금속 산화물의 평균 입자 직경을 원하는 값으로 할 수 있다.
초상자성이란, 외부 자장의 존재하에서 물질 개개의 원자 자기 모멘트가 정렬되어 유발된 일시적인 자장을 나타내고, 외부 자장을 제거하면 부분적인 정렬이 손상되어 자장을 나타내지 않게 되는 것을 말한다.
평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 이고 초상자성을 나타내는 초상자성 금속 산화물로는, 철, 코발트, 니켈 및 이들의 합금 등의 산화물을 들 수 있지만, 자계에 대한 감응성이 우수한 점에서 산화철이 특히 바람직하다. 초상자성 금속 산화물은 1 종을 단독으로 사용해도 되고 2 종 이상을 병용해도 된다.
평균 입자 직경이 1 ㎚ 미만인 경우에는 합성이 곤란하고, 평균 입자 직경이 15 ㎚ 를 초과하는 경우에는 얻어진 자성 실리카 입자의 자기 특성이 강자성이 되어, 실제 용도면에 있어서 자장을 제거해도 자성체 자신이 일시적인 자장을 나타내고 입자끼리가 자기 회합하여, 세정성이 나쁘거나 및/또는 면역 반응 등에 악영향을 미친다는 문제가 있다.
산화철로는 공지된 여러 가지 산화철을 사용할 수 있다. 산화철 중, 특히 화학적 안정성이 우수한 점에서, 마그네타이트, γ-헤마타이트, 마그네타이트-α-헤마타이트 중간 산화철 및 γ-헤마타이트-α-헤마타이트 중간 산화철이 바람직하고, 큰 포화 자화를 갖고, 외부 자장에 대한 감응성이 우수한 점에서, 마그네타이트가 더욱 바람직하다.
자성 실리카 입자 중의 초상자성 금속 산화물의 함유량의 하한은 통상적으로 60 중량％, 바람직하게는 65 중량％ 이고, 상한은 통상적으로 95 중량％, 바람직하게는 80 중량％ 이다. 초상자성 금속 산화물의 함유량이 60 중량％ 미만인 경우, 얻어진 자성 실리카 입자의 자성이 충분하지 않기 때문에 실제 용도면에 있어서의 분리 조작에 시간이 걸리고, 95 중량％ 를 초과하는 것은 합성이 곤란하다.
초상자성 금속 산화물의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, Massart 에 의해 보고된 것을 베이스로 하여 수용성 철염 및 암모니아를 사용하는 공침전법 (R. Massart, IEEE Trans. Magn. 1981, 17, 1247), 또는 수용성 철염의 수용액 중의 산화 반응을 사용한 방법에 의해 합성할 수 있다.
자성 실리카 입자의 평균 입자 직경은 바람직하게는 1 ∼ 5 ㎛, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 3 ㎛ 이다. 평균 입자 직경이 1 ㎛ 미만인 경우, 분리 회수시에 시간이 걸리는 경향이 있고, 5 ㎛ 를 초과하면, 표면적이 작아져 담지하는 물질 (대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질) 의 결합량이 낮아 결합 효율이 저하되는 경향이 있다.
본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자의 평균 입자 직경은 임의의 200 개의 자성 실리카 입자에 대해 주사형 전자 현미경 (니혼 전자 주식회사 제조 「JSM-7000F」)으로 관찰하여 측정된 입자 직경의 평균값이다.
자성 실리카 입자의 평균 입자 직경은 후술하는 수중유형 에멀션을 제조할 때의 혼합 조건 (전단력 등) 을 조절하여 수중유형 에멀션의 입자 직경을 조정함으로써 제어할 수 있다. 또, 자성 실리카 입자 제조시의 수세 공정의 조건 변경 또는 통상적인 분급 등의 방법에 의해서도 평균 입자 직경을 원하는 값으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자의 제조 방법으로는, 예를 들어 평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 인 초상자성 금속 산화물 입자, 상기 초상자성 금속 산화물 입자 100 중량％ 에 대해 30 ∼ 500 중량％ 의 (알킬)알콕시실란 및 분산제를 함유하는 분산액 (A1), 또는 추가로 비수용성 유기 용매를 함유하는 분산액 (A2) 와, 물, 수용성 유기 용매, 비이온성 계면 활성제 및 (알킬)알콕시실란의 가수 분해용 촉매를 함유하는 용액 (B) 를 혼합하여 수중유형 에멀션을 제조하고, (알킬)알콕시실란의 가수 분해 반응 및 축합 반응을 실시하여, 초상자성 금속 산화물이 실리카에 포함된 입자를 제조하는 방법을 들 수 있다.
(알킬)알콕시실란의 가수 분해 반응 및 축합 반응 후, 원심 분리 및 자석에 의해 고액 분리시키고, 물 또는 메탄올로 세정하고 건조시킴으로써 자성 실리카 입자가 얻어진다.
상기 및 이하에 있어서 (알킬)알콕시실란이란, 알킬알콕시실란 또는 알콕시실란을 의미한다.
상기 분산제로는, 분자 내에 1 개 이상의 카르복실기를 갖는 유기 화합물, 1 개 이상의 술포기를 갖는 유기 화합물 및 1 개 이상의 카르복실기와 1 개 이상의 술포기를 갖는 유기 화합물 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 이하에 예시하는 (a-1) ∼ (a-5) 의 유기 화합물 등을 들 수 있고, 이들은 1 종을 단독으로 사용해도 되고 2 종 이상을 병용해도 된다.
(a-1) 카르복실기를 2 개 이상 갖는 유기 화합물 :
탄소수 2 ∼ 30 의 지방족 폴리카르복실산 (옥살산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바크산, 프로판-1,2,3-트리카르복실산, 시트르산 및 도데칸이산 등의 포화 폴리카르복실산 그리고 말레산, 푸말산 및 이타콘산 등의 불포화 폴리카르복실산 등), 탄소수 8 ∼ 30 의 방향족 폴리카르복실산 (프탈산, 이소프탈산, 테레프탈산, 트리멜리트산 및 피로멜리트산 등) 및 탄소수 5 ∼ 30 의 지환식 폴리카르복실산 (시클로부텐-1,2-디카르복실산, 시클로펜텐-1,2-디카르복실산, 푸란-2,3-디카르복실산, 비시클로[2,2,1]헵타-2-엔-2,3-디카르복실산 및 비시클로[2,2,1]헵타-2,5-디엔-2,3-디카르복실산 등) 등.
(a-2) 술포기를 2 개 이상 갖는 유기 화합물 :
탄소수 1 ∼ 30 의 지방족 폴리술폰산 (메티온산, 1,1-에탄디술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 1,1-프로판디술폰산, 1,3-프로판디술폰산 및 폴리비닐술폰산 등), 탄소수 6 ∼ 30 의 방향족 폴리술폰산 (m-벤젠디술폰산, 1,4-나프탈렌술폰산, 1,5-나프탈렌디술폰산, 1,6-나프탈렌디술폰산, 2,6-나프탈렌디술폰산, 2,7-나프탈렌디술폰산 및 술폰화폴리스티렌 등), 비스(플루오로술포닐)이미드 및 탄소수 2 ∼ 10 의 비스(퍼플루오로알칸술포닐)이미드 [비스(트리플루오로메탄술포닐)이미드, 비스(펜타플루오로에탄술포닐)이미드, 비스(노나플루오로부탄술포닐)이미드, 펜타플루오로에탄술포닐트리플루오로메탄술포닐이미드, 트리플루오로메탄술포닐헵타플루오로프로판술포닐이미드, 노나플루오로부탄술포닐트리플루오로메탄술포닐이미드 등］등.
(a-3) 카르복실기와 술포기를 각각 1 개 이상 갖는 유기 화합물 :
탄소수 2 ∼ 30 의 술포카르복실산 (술포아세트산 및 술포숙신산 등) 및 탄소수 7 ∼ 30 의 술포 방향족 모노 또는 폴리카르복실산 (o-, m- 또는 p-술포벤조산, 2,4-디술포벤조산, 3-술포프탈산, 3,5-디술포프탈산, 4-술포이소프탈산, 2-술포테레프탈산, 2-메틸-4-술포벤조산, 2-메틸-3,5-디술포벤조산, 4-프로필-3-술포벤조산, 4-이소프로필-3-술포벤조산, 2,4,6-트리메틸-3-술포벤조산, 2-메틸-5-술포테레프탈산, 5-메틸-4-술포이소프탈산, 5-술포살리실산 및 3-옥시-4-술포벤조산 등) 등.
(a-4) 카르복실기를 1 개 갖는 유기 화합물 :
탄소수 1 ∼ 30 의 지방족 포화 모노카르복실산 (포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 이소부티르산, 발레르산, 카프로산, 에난트산, 카프릴산, 펠라르곤산, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산 및 베헨산 등), 탄소수 3 ∼ 30 의 지방족 불포화 모노카르복실산 (아크릴산, 메타크릴산, 올레산 등), 탄소수 3 ∼ 30 의 하이드록시 지방족 모노카르복실산 (글리콜산, 락트산 및 타르타르산 등), 탄소수 4 ∼ 30 의 지환식 모노카르복실산 (시클로프로판카르복실산, 시클로펜탄카르복실산 및 시클로헥산카르복실산 등), 탄소수 7 ∼ 30 의 방향족 모노카르복실산 (벤조산, 신남산 및 나프토산 등), 탄소수 7 ∼ 20 의 하이드록시 방향족 모노카르복실산 (살리실산 및 만델산 등) 및 탄소수 2 ∼ 20 의 퍼플루오로카르복실산 (트리플루오로아세트산, 운데카플루오로헥산산, 트리데카플루오로헵탄산, 퍼플루오로옥탄산, 펜타데카플루오로옥탄산, 펩타데카플루오로노난산 및 노나데카플루오로데칸산 등) 등.
(a-5) 술포기를 1 개 갖는 유기 화합물 :
탄소수 1 ∼ 30 의 지방족 모노술폰산 (메탄술폰산, 에탄술폰산, 프로판술폰산, 부탄술폰산, 헥산술폰산, 데칸술폰산, 운데칸술폰산 및 도데칸술폰산 등), 탄소수 6 ∼ 30 의 방향족 모노술폰산 (벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, o-톨루엔술폰산, m-톨루엔술폰산, 4-도데실벤젠술폰산, 4-옥틸벤젠술폰산 및 나프탈렌술폰산 등) 및 탄소수 1 ∼ 20 의 퍼플루오로알칸술폰산 (트리플루오로메탄술폰산 등) 등.
이들 중, (알킬)알콕시실란과의 상용성의 관점에서 (a-4) 중의 탄소수 10 ∼ 30 의 유기 화합물이 바람직하다.
분산제의 사용량은 초상자성 금속 산화물의 중량을 기준으로 하여 100 ∼ 2,000 중량％, 특히 250 ∼ 1,000 중량％ 인 것이 바람직하다. 분산제가 100 중량％ 미만인 경우, 초상자성 금속 산화물이 (알킬)알콕시실란 용액에 잘 분산되지 않는 경향이 있고, 2,000 중량％ 를 초과하면 이후의 공정의 수용액에 대한 분산시에 에멀션이 잘 형성되지 않는 경향이 있다.
사용하는 (알킬)알콕시실란으로는, 하기 일반식 (1) 로 나타내는 화합물을 들 수 있다.
R1 (4-n)Si(OR2)n (1)
일반식 (1) 중, R1 및 R2 는 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 또는 글리시딜옥시기로 치환되어 있어도 되는 탄소수 1 ∼ 10 의 1 가의 탄화수소기를 나타낸다.
탄소수 1 ∼ 10 의 탄화수소기로는, 탄소수 1 ∼ 10 의 지방족 탄화수소기 (메틸기, 에틸기, n- 또는 iso-프로필기, n- 또는 iso-부틸기, n- 또는 iso-펜틸기 및 비닐기 등), 탄소수 6 ∼ 10 의 방향족 탄화수소기 (페닐기 등) 및 탄소수 7 ∼ 10 의 방향 지방족기 (벤질기 등) 등을 들 수 있다.
일반식 (1) 에 있어서의 n 은 1 ∼ 4 의 정수를 나타낸다. 단, n 이 1 인 알킬알콕시실란을 사용하는 경우에는, n 이 2 ∼ 4 인 (알킬)알콕시실란과 병용할 필요가 있다. 반응 후의 입자의 강도 및 입자 표면의 실란올기의 양의 관점에서 n 은 4 인 것이 바람직하다.
일반식 (1) 로 나타내는 화합물의 구체예로는, 테트라메톡시실란, 테트라에톡시실란, 테트라이소프로폭시실란 및 테트라부톡시실란 등의 알콕시실란 ; 메틸트리메톡시실란 및 메틸트리에톡시실란 등의 알킬알콕시실란 ; 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, N-2(아미노에틸)3-아미노프로필트리메톡시실란 및 N-2(아미노에틸)3-아미노프로필트리에톡시실란 등의 아미노기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란 ; 7-카르복시-헵틸트리에톡시실란 및 5-카르복시-펜틸트리에톡시실란 등의 카르복실기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란 ; 3-하이드록시프로필트리메톡시실란 및 3-하이드록시프로필트리에톡시실란 등의 수산기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란 ; 3-메르캅토프로필트리메톡시실란 및 3-메르캅토프로필트리에톡시실란 등의 메르캅토기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란 ; 3-글리시딜옥시프로필트리메톡시실란 및 3-글리시딜옥시프로필트리에톡시실란 등의 글리시딜옥시기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란 등을 들 수 있다.
(알킬)알콕시실란은 1 종류를 단독으로 사용해도 되고, 2 종 이상을 병용해도 된다.
(알킬)알콕시실란의 사용량은 초상자성 금속 산화물 100 중량％ 에 대해 통상적으로 30 ∼ 500 중량％, 바람직하게는 40 ∼ 200 중량％ 이다. (알킬)알콕시실란이 30 중량％ 미만인 경우, 초상자성 금속 산화물의 표면이 균일하게 잘 피복되지 않게 되고, 500 중량％ 를 초과하면, 초상자성 금속 산화물의 함유율이 작아져 자력에 의한 회수 시간이 길어진다.
물의 사용량은 초상자성 금속 산화물 100 중량％ 에 대해 500 ∼ 3,000 중량％ 인 것이 바람직하고, 특히 800 ∼ 2,000 중량％ 가 바람직하다.
비수용성 유기 용매로는, 25 ℃ 에 있어서의 물에 대한 용해도가 0.1 g/물 100 g 이하인, 탄소수 6 ∼ 16 의 방향족 탄화수소 용제 (톨루엔 및 자일렌 등) 및 탄소수 5 ∼ 16 지방족 탄화수소 용제 (n-헵탄, n-헥산, 시클로헥산, n-옥탄, 데칸 및 데카하이드로나프탈렌 등) 등을 들 수 있다. 이들은 1 종류를 단독으로 사용해도 되고, 2 종 이상을 병용해도 된다.
비수용성 유기 용매의 사용량은 초상자성 금속 산화물 100 중량％ 에 대해 200 ∼ 1,000 중량％, 특히 250 ∼ 500 중량％ 가 바람직하다. 유기 용매의 사용량이 200 중량％ 미만이면 초상자성 금속 산화물의 분산성이 나빠지는 경향이 있고, 1,000 중량％ 를 초과하면 자성 실리카 입자의 입자 직경이 불균일해지는 경향이 있다.
수용성 유기 용매로는, 25 ℃ 에 있어서의 물에 대한 용해도가 100 g/물 100 g 이상인, 탄소수 1 ∼ 3 의 알코올 (메탄올, 에탄올 및 n- 또는 iso-프로판올 등), 탄소수 2 ∼ 9 의 글리콜 (에틸렌글리콜 및 디에틸렌글리콜 등), 아미드 (N-메틸피롤리돈 등), 케톤 (아세톤 등), 고리형 에테르 (테트라하이드로푸란 및 테트라하이드로피란 등), 락톤 (γ-부티로라톤 등), 술폭사이드 (디메틸술폭사이드 등) 및 니트릴 (아세토니트릴 등) 등을 들 수 있다.
이들 중, 자성 실리카 입자의 입자 직경의 균일성의 관점에서 탄소수 1 ∼ 4 의 알코올이 바람직하다.
수용성 유기 용매는 1 종류를 단독으로 사용해도 되고, 2 종 이상을 병용해도 된다.
수용성 유기 용매의 사용량은 물 100 중량％ 에 대해 100 ∼ 500 중량％ 인 것이 바람직하다.
비이온성 계면 활성제로는, 고급 알코올알킬렌옥사이드 (이하, AO 로 약기) 부가물 ; 탄소수 8 ∼ 24 의 고급 알코올 (데실알코올, 도데실알코올, 야자유 알킬알코올, 옥타데실알코올 및 올레일알코올 등) 의 에틸렌옥사이드 (이하, EO 로 약기) 1 ∼ 20 몰 및/또는 프로필렌옥사이드 (이하, PO 로 약기) 1 ∼ 20 몰 부가물(블록 부가물 및/또는 랜덤 부가물을 포함한다. 이하 동일), 탄소수 6 ∼ 24 의 알킬을 갖는 알킬페놀의 AO 부가물 ; 옥틸 또는 노닐페놀의 EO 1 ∼ 20 몰 및/또는 PO 1 ∼ 20 몰 부가물, 폴리프로필렌 글리콜 EO 부가물 및 폴리에틸렌글리콜 PO 부가물 ; 플루로닉형 계면 활성제 등, 지방산 AO 부가물 ; 탄소수 8 ∼ 24 의 지방산 (데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 야자유 지방산 등) 의 EO 1 ∼ 20 몰 및/또는 PO 1 ∼ 20 몰 부가물 등 및 다가 알코올형 비이온성 계면 활성제 ; 탄소수 3 ∼ 36 의 2 ∼ 8 가의 다가 알코올 (글리세린, 트리메틸올프로판, 펜타에리트리톨, 소르비트 및 소르비탄 등) 의 EO 및/또는 PO 부가물 ; 상기 다가 알코올의 지방산 에스테르 및 그 EO 부가물 [TWEEN (등록상표) 20 및 TWEEN (등록상표) 80 등] ; 알킬글루코사이드 (N-옥틸-β-D-말토사이드, n-도데카노일수크로오스 및 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드 등) ; 설탕의 지방산 에스테르, 지방산 알칸올아미드 및 이들의 AO 부가물 (폴리옥시에틸렌 지방산 알칸올아미드 등) 등의 비이온성 계면 활성제를 들 수 있다. 이들은 1 종류를 단독으로 사용해도 되고, 2 종 이상을 병용해도 된다.
비이온성 계면 활성제의 사용량은 초상자성 금속 산화물 100 중량％ 에 대해 100 ∼ 1,000 중량％, 특히 300 ∼ 500 중량％ 가 바람직하다. 100 중량％ 미만 또는 1,000 중량％ 를 초과하면, 에멀션이 안정되지 않고, 생성되는 입자의 입도 분포가 넓어지는 경향이 있다.
비이온성 계면 활성제를 함유하는 수용액의 사용량은 초상자성 금속 산화물 100 중량％ 에 대해 1,000 ∼ 10,000 중량％, 특히 1,500 ∼ 4,000 중량％ 가 바람직하다. 1,000 중량％ 미만 또는 10,000 중량％ 를 초과하면, 에멀션이 안정되지 않고, 생성되는 입자의 입도 분포가 넓어지는 경향이 있다.
(알킬)알콕시실란의 가수 분해용 촉매로는, 루이스산이나 염산 등을 사용할 수 있고, 구체적으로는 염산 등의 무기산, 아세트산 등의 유기산, 암모니아 등의 무기 염기 화합물, 에탄올아민 등의 아민 화합물을 사용할 수 있다.
가수 분해용 촉매의 사용량은 (알킬)알콕시실란의 중량에 대해 0.01 ∼ 100 중량％, 특히 0.2 ∼ 50 중량％ 가 바람직하다.
분산액 (A1) 또는 분산액 (A2) 와 용액 (B) 의 혼합 방법은 특별히 한정되지 않고, 후술하는 설비를 사용하여 일괄 혼합할 수도 있지만, 자성 실리카 입자의 입자 직경의 균일성의 관점에서 용액 (B) 를 교반하면서 분산액 (A1) 또는 분산액 (A2) 을 적하하는 방법이 바람직하다.
분산액 (A1) 또는 분산액 (A2) 와 용액 (B) 를 혼합할 때의 설비로는, 일반적으로 유화기, 분산기로서 시판되고 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 호모게나이저 (IKA 사 제조), 폴리트론 (키네마티카사 제조) 및 TK 오토 호모 믹서 (토쿠슈 기화 공업사 제조) 등의 배치식 유화기, 에바라마이루다 (에바라 제작소사 제조), TK 필믹스, TK 파이프라인 호모 믹서 (토쿠슈 기화 공업사 제조), 콜로이드 밀 (신코 팬텍사 제조), 클리어 믹스 (M 테크닉사 제조), 스래셔, 트리고날 습식 미분쇄기 (미츠이 미이케 화공기사 제조), 캐피트론 (유로텍사 제조) 및 파인 플로우 밀 (타이헤이요 기공사 제조) 등의 연속식 유화기, 마이크로 플루이다이저 (미즈호 공업사 제조), 나노마이저 (나노마이저사 제조) 및 APV 가우린 (가우린사 제조) 등의 고압 유화기, 막 유화기 (레이카 공업사 제조) 등의 막 유화기, 바이브로 믹서 (레이카 공업사 제조) 등의 진동식 유화기, 초음파 호모 게나이저 (브렌슨사 제조) 등의 초음파 유화기 등을 들 수 있고, 입자 직경의 균일화의 관점에서 APV 가우린, 호모 게나이저, TK 오토 호모 믹서, 에바라마이루다, TK 필 믹스, TK 파이프라인 호모 믹서 및 클리어 믹스가 바람직하다.
(알킬)알콕시실란의 가수 분해 반응 및 축합 반응의 온도는 25 ∼ 100 ℃ 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 45 ∼ 60 ℃ 이다. 또, 반응 시간은 바람직하게는 0.5 ∼ 5 시간, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 2 시간이다.
본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자는, 초상자성 금속 산화물이 실리카에 포함되고, 입자 표면에 존재하지 않는 점에서, 많은 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질을 그 표면에 고정화시킬 수 있다.
본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자에 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (이하, 이들을 총칭하여 담지용 물질로 약기하는 경우가 있다) 을 고정화시키는 방법으로는, 상기 서술한 자성 실리카 입자에 담지용 물질을 물리 흡착시키는 방법을 들 수 있지만, 보다 효율적으로 담지용 물질을 고정화시키는 관점에서 글루타르알데히드, 알부민, 카르보디이미드, 스트렙토아비딘, 비오틴 및 관능기를 갖는 알킬알콕시실란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유기 화합물을 자성 실리카 입자 표면에 결합시키고, 그들을 통하여 담지용 물질을 자성 실리카 입자에 고정화시키는 것이 바람직하다. 이들 유기 화합물 중, 특정한 담지용 물질을 결합시키는 관점에서 관능기를 갖는 알킬알콕시실란이 더욱 바람직하다.
상기 알킬알콕시실란이 갖는 관능기로는, 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 및 글리시딜옥시기 등을 들 수 있고, 알킬알콕시실란 1 분자 중에 상이한 종류의 관능기를 갖고 있어도 된다.
자성 실리카 입자의 표면에 관능기를 갖는 알킬알콕시실란을 결합시키는 방법으로는, 자성 실리카 입자를 제조할 때의 (알킬)알콕시실란으로서 전술한 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 또는 글리시딜옥시기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란을 사용하는 방법, 또는 이들 치환기를 갖지 않는 (알킬)알콕시실란을 사용하여 자성 실리카 입자를 제조한 후, 자성 실리카 입자를 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 또는 글리시딜옥시기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란으로 처리하는 방법 등을 들 수 있다.
후자의 방법의 구체예로는, 자성 실리카 입자를 그 농도가 1 ∼ 50 중량％ 가 되도록 용매에 분산시키고, 이 분산액에 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 또는 글리시딜옥시기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란의 용액을 첨가하여, 1 시간 이상 실온에서 가수 분해 반응 및 축합 반응을 실시하는 방법을 들 수 있다.
이 방법에 있어서의 용매는 사용하는 알킬알콕시실란의 용해성에 따라 적절히 선택되고, 물에 가용인 아미노기, 카르복실기, 수산기 또는 메르캅토기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란을 사용하는 경우에는, 물 또는 물-알코올의 혼합 용매 등을 사용하는 것이 바람직하고, 물에 잘 용해되지 않는 글리시딜옥시기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란을 사용하는 경우, 아세트산부틸 등을 사용하는 것이 바람직하다.
아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 또는 글리시딜옥시기로 치환된 알킬기를 갖는 알킬알콕시실란의 사용량은 처리 전의 자성 실리카 입자에 대해 0.1 ∼ 5 중량％ 인 것이 바람직하다. 0.1 중량％ 미만이면, 도입되는 관능기수가 충분하지 않은 경우가 있고, 5 중량％ 를 초과하면, 입자 표면의 관능기량을 더욱 증가시키는 효과가 적어지는 경향이 있다.
글루타르알데히드, 알부민, 카르보디이미드, 스트렙토아비딘 또는 비오틴을 자성 실리카 입자의 표면에 결합시키는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 이하와 같이 하여 결합시킬 수 있다.
알데히드기를 갖는 글루타르알데히드 및 카르복실기를 갖는 비오틴은, 아미노기를 갖는 알킬알콕시실란이 표면에 결합된 자성 실리카 입자와 반응시킴으로써, 자성 실리카 입자의 표면에 결합시킬 수 있다. 또, 아미노기를 갖는 알부민 및 스트렙토아비딘 그리고 카르보디이미드 기를 갖는 카르보디이미드는, 카르복실기를 갖는 알킬알콕시실란이 표면에 결합된 자성 실리카 입자와 반응시킴으로써, 자성 실리카 입자의 표면에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 측정 대상 물질 측정 방법은 상기 본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자를 사용하여 실시되는 것 이외에는 이 분야에서 통상적으로 실시되는, 문헌 [예를 들어, 효소 면역 측정법 제2판 (이시카와 에이지 등 편집, 의학 서원) 1982년] 에 기재된 샌드위치법, 경합법 및 일본 공개특허공보 평6-130063호에 기재된 측정법에 준하여 실시하면 된다.
샌드위치법은, 예를 들어, 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (측정 대상 물질 결합 물질) 을 표면에 고정화시킨 자성 실리카 입자와, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질 결합 물질 (표지 측정 대상 물질 결합 물질) 을 접촉시켜, 자성 실리카 입자 상에 측정 대상 물질 결합 물질과 측정 대상 물질과 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 그 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정함으로써 이루어진다.
구체적으로는 예를 들어, 측정 대상 물질을 함유하는 시료와 측정 대상 물질 결합 물질을 표면에 고정화시킨 자성 실리카 입자를 접촉시켜, 자성 실리카 입자 표면에 측정 대상 물질 결합 물질과 측정 대상 물질의 복합체를 형성시키고, 다시 그 복합체에 표지 측정 대상 물질 결합 물질을 접촉시켜, 자성 실리카 입자에 담지된 측정 대상 물질 결합 물질과 측정 대상 물질과 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 그 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하면 된다. 그 방법에 있어서는, 측정 대상 물질과 측정 대상 물질 결합 물질이 고정화된 자성 실리카 입자를 반응시킨 후, 표지 측정 대상 물질 결합 물질을 반응시키고 있지만, 표지 측정 대상 물질 결합 물질과 측정 대상 물질을 반응시킨 후에 측정 대상 물질 결합 물질이 고정화된 자성 실리카 입자를 반응시켜도 상관없고, 이들 3 개를 동시에 반응시켜도 상관없다.
상기 샌드위치법에 있어서의 B/F 분리란, 상기 표지 복합체와 표지 복합체의 형성에 관여하지 않은 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 분리를 의미하고, 구체적으로는, 자성 실리카 입자에 담지된 측정 대상 물질 결합 물질, 자성 실리카 입자에 담지된 측정 대상 물질 결합 물질과 측정 대상 물질의 복합체, 및 상기 표지 복합체와 다른 성분 (시료 중의 측정 대상 물질 이외의 성분, 표지 복합체의 형성에 관여하지 않은 표지 측정 대상 물질 결합 물질 등) 의 분리를 의미한다.
또, B/F 분리 공정은 표지 복합체의 형성 후에는 필수 공정이지만, 자성 실리카 입자 표면에 측정 대상 물질 결합 물질과 측정 대상 물질의 복합체를 형성시킨 후에도 실시할 수 있다.
경합법의 일 양태로는, 측정 대상 물질을 함유하는 시료, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (표지 측정 대상 물질 결합 물질), 및 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질을 그 표면에 고정화시킨 자성 실리카 입자를 접촉시켜, 자성 실리카 입자 상에 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질과 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 그 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정함으로써 이루어진다.
구체적으로는 예를 들어, 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 표지 측정 대상 물질 결합 물질과, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 담지한 자성 실리카 입자를 접촉시키고, 표지 측정 대상 물질 결합 물질에 시료 중의 측정 대상 물질과 자성 실리카 입자 상의 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질과 경합 반응시켜, 자성 실리카 입자 상에 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질과 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 그 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하면 된다. 그 방법에 있어서는, 측정 대상 물질, 표지 측정 대상 물질 결합 물질, 및 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 담지한 자성 실리카 입자를 동시에 경합 반응시키고 있지만, 측정 대상 물질과 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 담지한 자성 실리카 입자를 접촉시킨 후에 표지 측정 대상 물질 결합 물질을 첨가하여 경합 반응시켜도 되고, 측정 대상 물질과 표지 측정 대상 물질 결합 물질을 접촉시킨 후에 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 담지한 자성 실리카 입자를 첨가하여 경합 반응시켜도 된다.
상기 경합법에 있어서의 B/F 분리란, 상기 표지 복합체와 표지 복합체의 형성에 관여하지 않은 다른 성분 (표지 측정 대상 물질 결합 물질, 및 표지 측정 대상 물질 결합 물질과 측정 대상 물질의 복합체) 의 분리를 의미하고, 구체적으로는, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 담지한 자성 실리카 입자, 및 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 담지한 자성 실리카 입자와 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체 (표지 복합체) 와 다른 성분 (시료 중의 측정 대상 물질 이외의 성분, 표지 측정 대상 물질 결합 물질, 측정 대상 물질의 복합체 등) 의 분리를 의미한다.
또, 경합법의 다른 양태로는, 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질 (표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질) 과, 측정 대상 물질 결합 물질을 담지한 자성 실리카 입자를 접촉시켜, 자성 실리카 입자 상에 측정 대상 물질 결합 물질과 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 그 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정함으로써 이루어진다.
구체적으로는 예를 들어, 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질과, 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자를 접촉시키고, 자성 실리카 입자 상의 측정 대상 물질 결합 물질에 시료 중의 측정 대상 물질과 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 경합 반응시켜, 자성 실리카 입자 상에 측정 대상 물질 결합 물질과 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 그 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하면 된다. 그 경합법에 있어서는, 측정 대상 물질, 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질, 및 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자를 동시에 경합 반응시키고 있지만, 측정 대상 물질과 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자를 접촉시킨 후에 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 첨가하여 경합 반응시켜도 되고, 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질과 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자를 접촉시킨 후에 측정 대상 물질을 첨가하여 경합 반응시켜도 된다.
상기 경합법에 있어서의 B/F 분리란, 상기 표지 복합체와 표지 복합체의 형성에 관여하지 않은 다른 성분 (표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질) 의 분리를 의미하고, 구체적으로는, 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자, 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자와 측정 대상 물질의 복합체, 및 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자와 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질의 복합체와 다른 성분 (시료 중의 측정 대상 물질 이외의 성분, 표지 복합체의 형성에 관여하지 않은 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질 등) 의 분리를 의미한다.
또, 측정 대상 물질이 효소인 경우에는, 상기 샌드위치법 및 경합법 이외의 효소 활성 방법을 사용하는 방법, 예를 들어, 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 측정 대상 물질 결합 물질 (예를 들어, 항체 등의 효소와 결합될 수 있는 물질) 을 담지시킨 자성 실리카 입자를 표면에 고정화시킨 자성 실리카 입자를 접촉시켜, 자성 실리카 입자 상에 효소와 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체를 형성시키고, 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시킨 후, 효소의 종류에 따른 기질, 또는 효소의 종류에 따른 기질 및 발색제, 필요하면 추가로 공액 효소를 첨가하고, 그 기질의 변화 또는 발색제의 발색 결과에 기초하여 시료 중의 효소량을 측정하는 방법에 의해 측정해도 된다. 또한, 기질, 발색제, 공액 효소는 공지된 것을 사용하면 되고, 예를 들어 효소가 퍼옥시다아제인 경우에는, 과산화수소와 루미놀 발광 시약 등을 사용하면 된다. 이들의 사용량도 통상적으로 이 분야에서 사용되는 범위이면 된다. 상기 방법에 있어서의 B/F 분리란, 측정 대상 물질과 측정 대상 물질 결합 물질을 담지시킨 자성 실리카 입자의 복합체와, 그 밖의 성분 (시료 중의 측정 대상 물질 이외의 성분 등) 의 분리를 의미한다.
본 발명의 측정 대상 물질 측정 방법에 있어서, 시료, 자성 실리카 입자, 표지된 측정 대상 물질 결합 물질, 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질 등을 접촉시키는 방법으로는, 통상적으로 이루어지는 교반, 혼합 등의 처리에 의해 자성 실리카 입자가 분산되면 된다. 반응 시간은 측정 대상 물질, 사용되는 측정 대상 물질 결합 물질, 샌드위치법, 경합법 등의 차이에 따라 적절히 설정되면 되지만, 통상적으로 1 ∼ 10 분, 바람직하게는 1 ∼ 5 분이다.
본 발명의 측정 대상 물질 측정 방법에 있어서의 B/F 분리는, 예를 들어, 자성 실리카 입자의 자성을 이용하여, 반응조의 외측 등으로부터 자석 등에 의해 자성 실리카 입자를 모아 반응액을 배출하고, 세정액을 첨가한 후, 자석을 제거하고, 자성 실리카 입자를 혼합하여 분산시키고, 세정함으로써 이루어진다. 상기 조작을 1 ∼ 3 회 반복해도 된다. 세정액으로는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 것이면 특별히 한정되지는 않는다.
측정 대상 물질 결합 물질, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질 등을 표지하기 위해 사용되는 표지 물질로는, 예를 들어 효소 면역 측정법 (EIA) 에 있어서 사용되는 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 퍼옥시다아제, 마이크로 퍼옥시다아제, 글루코오스옥시다아제, 글루코오스-6-인산 탈수소 효소, 말산 탈수소 효소, 루시페라아제, 티로시나아제, 산성 포스파타아제 등의 효소류, 예를 들어 방사 면역 측정법 (RIA) 에 있어서 사용되는 99 mTc, 131I, 125I, 14C, 3H, 32P 등의 방사성 동위 원소, 예를 들어 형광 면역 측정법 (FIA) 에 있어서 사용되는 플루오레세인, 단실, 플루오레스카민, 쿠마린, 나프틸아민 혹은 이들의 유도체, 그린 형광 단백질 (GFP) 등의 형광성 물질, 예를 들어 루시페린, 이소루미놀, 루미놀, 비스(2,4,6-트리플루오로페닐)옥살레이트 등의 발광성 물질, 예를 들어 페놀, 나프톨, 안트라센 혹은 이들의 유도체 등의 자외부에 흡수를 갖는 물질, 예를 들어 4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실, 3-아미노-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-1-옥실, 2,6-디-t-부틸-α-(3,5-디-t-부틸-4-옥소-2,5-시클로헥사디엔-1-일리덴)-p-트리옥실 등의 옥실기를 갖는 화합물로 대표되는 스핀 라벨화제로서의 성질을 갖는 물질 등을 들 수 있다.
이들 중, 감도 등의 관점에서 효소, 형광성 물질이 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제 및 글루코오스옥시다아제이고, 특히 바람직한 것은 퍼옥시다아제이다.
상기한 바와 같은 표지 물질을 측정 대상 물질 결합 물질, 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질 등에 결합시키려면, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 방법, 예를 들어 자체 공지된 EIA, RIA 혹은 FIA 등에 있어서 일반적으로 실시되고 있는 자체 공지된 표지 방법 [예를 들어, 의화학 실험 강좌, 제8권, 야마무라 유이치 감수, 제1판, 나카야마 서점, 1971 ; 도설 형광 항체, 카와오이 아키라 편저, 제1판, (주) 소프트 사이언스사, 1983 ; 효소 면역 측정법, 이시카와 에이지, 카와이 타다시, 무로이 키요시 편저, 제2판, 의학서원, 1982 등에 기재된 글루타르알데히드법, 과요오드산법, 말레이미드법 또는 피리딜디술파이드법 등] 등을 이용하면 된다.
표지 물질의 사용량은 사용하는 표지 물질의 종류에 따라 상이하기 때문에 일률적으로는 말할 수 없지만, 예를 들어 퍼옥시다아제를 표지 물질로서 사용하는 경우에는, 측정 대상 물질 결합 물질과 표지 물질을, 예를 들어 통상적으로 1 : 1 ∼ 20 의 몰비, 바람직하게는 1 : 1 ∼ 10 의 몰비, 더욱 바람직하게는 1 : 1 ∼ 2 의 몰비가 되도록, 예를 들어 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액 등의 통상적으로 이 분야에서 사용되고 있는 완충액 중에 함유시켜 사용하면 된다. 또한, 당해 완충액으로는, 통상적으로 이 분야에서 사용되고 있는, 예를 들어 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액 등을 들 수 있고, 그 pH 는 항원 항체 반응을 억제하지 않는 범위이면 되고, 통상적으로 5 ∼ 9 이다. 또, 이와 같은 완충액 중에는, 목적으로 하는 항원 항체 반응을 저해하지 않는 것이면, 예를 들어 알부민, 글로블린, 수용성 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜 등의 안정화제, 계면 활성제, 당류 등을 함유시켜 두어도 된다.
표지 물질 또는 그 활성의 측정 방법으로는, 방사 면역 측정법 (RIA), 효소 면역 측정법 (EIA), 형광 면역 측정법 (FIA) 및 화학 발광 면역 측정법 (CLIA 및 CLEIA) 을 들 수 있고, 단시간에서의 면역 측정에 있어서의 감도의 관점에서 바람직한 것은 EIA, CLIA 및 CLEIA 이고, 더욱 바람직한 것은 CLEIA 이다.
본원 발명의 측정 방법은, 예를 들어 샌드위치법으로 AFP 를 측정하는 경우, 이하와 같이 하여 실시하면 된다.
즉, 예를 들어 AFP 를 함유하는 시료 10 ∼ 25 ㎕ 와 예를 들어 본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자에 항 AFP 항체를 담지시킨 것을 0.1 ∼ 1 ㎎/㎖ 함유하는 인산 완충액 등의 완충액 (자성 실리카 입자를 함유하는 시약) 40 ∼ 50 ㎕ 를 반응조에 첨가하고, 그 반응 용액을 교반하고, 자성 실리카 입자를 분산시켜, 자성 실리카 입자 상에 담지되어 있는 항 AFP 항체와 AFP 를 접촉, 반응시켜 복합체를 형성시킨다. 이어서, 예를 들어 반응조의 외측으로부터 자석 등에 의해 자성 실리카 입자를 모아 반응액을 배출하고, 생리 식염수 등의 세정액을 첨가한다. 그 후, 자석을 제거하고, 그 자성 실리카 입자를 분산시켜 세정한다. 이 조작은 1 ∼ 3 회 반복해도 된다. 또한, 이 세정 조작은, 시료 또는 자성 실리카 입자를 함유하는 시약을 남긴 채, 서양 와사비 유래 등 퍼옥시다아제 (이하 POD 로 약기) 표지된 항 AFP 항체 (이하 표지 시약으로 약기) 를 첨가하여 반응시키는 경우에는, 이 세정 조작을 생략해도 상관없다. 그 후, 예를 들어 표지 시약을 첨가하고, 그 반응 용액을 교반하고, 자성 실리카 입자를 분산시켜, POD 표지된 항 AFP 항체와 상기 복합체를 반응 결합시킨다. 이어서, 상기 세정과 동일하게 하여 생리 식염수 등의 세정액을 첨가하고 분산시켜 세정을 실시한다. 마지막으로 예를 들어 루미놀 및 과산화수소를 첨가하고, 화학 발광계로 1 초간의 화학 발광 적산량을 측정하고, 그 측정값을 기초로 시료 중의 AFP 량을 산출한다. 또한, 이 경우에는 미리 규정된 AFP 함유 용액을 시료로서 상기와 동일한 조작에 의해 제조된 AFP 량과 1 초간의 화학 발광 적산량의 관계를 나타내는 검량선 등을 사용함으로써 용이하게 시료 중의 AFP 량을 산출할 수 있다.
본 발명의 시약은 상기 본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자를 함유하여 이루어지는 것으로, 상기 측정 방법에 사용되는 것이다. 구체적으로는, 예를 들어, 본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자를 함유하는 완충액 등을 들 수 있고, 그 완충액으로는, 면역 측정 등에 통상적으로 사용되는 완충액을 바람직하게 들 수 있고, 예를 들어 1,4-피페라진디에탄술폰산/수산화나트륨 완충액, MOPS [3-(N-모르폴리노)프로판술폰산]/수산화나트륨 완충액, 트리에탄올아민/염산 완충액 및 PBS (인산 완충액) 등을 들 수 있다.
이들 완충액 중의 완충제의 농도는 1 ∼ 500 mM 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 300 mM, 특히 바람직하게는 10 ∼ 200 mM 이다.
상기 및 이하에 있어서, mM 은 25 ℃ 에서의 농도 (밀리몰/리터) 를 나타낸다.
자성 실리카 입자의 양은 특별히 한정되지 않고, 사용되는 측정 대상 물질 결합 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질의 종류, 측정 대상 물질의 종류 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 시약은 본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자가 완충액에 분산된 형태인 것이 바람직하다.
본 발명의 시약은, 본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자를 함유하는 시약 이외에, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질, 혹은 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질을 함유하는 시약 (이하, 표지 시약으로 약기하는 경우가 있다) 을 포함하고 있어도 된다. 그 표지 물질은 상기 본 발명의 측정 방법의 항에서 기재한 것과 동일한 것을 들 수 있고, 바람직한 것도 동일하다.
표지 시약에는, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질, 혹은 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질 이외에 완충액 등을 함유할 수 있다. 표지 시약에 사용되는 완충액으로는, 면역 측정에 통상적으로 사용되는 완충액이 바람직하고, 예를 들어, 상기 서술한 자성 실리카 입자를 함유하는 시약에 사용되는 완충액과 동일한 것을 들 수 있고, 완충액 중의 완충제의 농도도 상기 서술한 자성 실리카 입자를 함유하는 시약에 사용되는 경우와 동일하다.
본 발명의 시약은, 본 발명에 있어서의 자성 실리카 입자를 함유하는 시약, 및 표지 시약 이외에, 화학 발광 시약을 포함하고 있어도 되고, 그 화학 발광 시약은 상기 표지 물질에 기초하여 선택되고, 예를 들어, 표지 물질이 POD 인 경우, 2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온 화합물 및 화학 발광 증강제를 필수 구성 성분으로 하여 이루어지는 화학 발광 시약 제 1 액과, 산화제 및 물을 필수 구성 성분으로 하여 이루어지는 화학 발광 시약 제 2 액을 함유해도 된다.
2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온 화합물로는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평2-291299호, 일본 공개특허공보 평10-319015호 및 일본 공개특허공보 2000-279196호 등에 기재된 공지된 2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온 화합물 및 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.
이들 중, 루미놀, 이소루미놀, N-아미노헥실-N-에틸이소루미놀 (AHEI), N-아미노부틸-N-에틸이소루미놀 (ABEI) 및 이들의 금속염 (알칼리 금속염 등) 이 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 루미놀 및 그 금속염, 특히 바람직한 것은 루미놀의 나트륨염이다.
화학 발광 시약에 있어서의 2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온 화합물의 함유량은, 그 종류 및 적용하는 측정 방법이나 측정 조건 등에 따라 적절히 설정되지만, 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성 등의 관점에서 0.5 ∼ 80 mM 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1.8 ∼ 40 mM, 특히 바람직하게는 3.5 ∼ 21 mM 이다.
화학 발광 증강제로는, 예를 들어, 일본 공표특허공보 소59-500252호, 일본 공개특허공보 소59-171839호 및 일본 공개특허공보 평2-291299호 등에 기재된 공지된 화학 발광 증강제 및 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.
이들 중, 화학 발광 증강 효과 등의 관점에서 페놀이 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 P-요오드페놀, 4-(시아노메틸티오)페놀 및 4-시아노메틸티오-2-클로로페놀, 특히 바람직한 것은 4-(시아노메틸티오)페놀이다.
화학 발광 시약에 있어서의 화학 발광 증강제의 함유량은 그 종류 및 적용하는 측정 방법이나 측정 조건 등에 따라 적절히 설정되지만, 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성 등의 관점에서 0.1 ∼ 15 mM 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.3 ∼ 7.0 mM, 특히 바람직하게는 0.6 ∼ 3.4 mM 이다.
화학 발광 시약 제 1 액에는, 2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온 화합물 및 화학 발광 증강제 이외에, 완충액 및/또는 킬레이트제 등을 함유할 수 있다.
완충액으로는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평10-319015호 및 일본 공개특허공보 2003-279489호 등에 기재된 공지된 완충액 등을 사용할 수 있다.
이들 중, 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성 등의 관점에서 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산/수산화나트륨 완충액, 2-하이드록시-3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산·1 수화물/수산화나트륨 완충액 및 피페라지닐-1,4-비스(2-하이드록시-3-프로판술폰산)·2 수화물/수산화나트륨 완충액이 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산/수산화나트륨 완충액 및 2-하이드록시-3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산·1 수화물/수산화나트륨 완충액, 특히 바람직한 것은 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산/수산화나트륨 완충액이다.
이들 완충액에 있어서의 완충제의 함유량은 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성 등의 관점에서 1 ∼ 500 mM 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 300 mM, 특히 바람직하게는 10 ∼ 200 mM 이다.
킬레이트제로는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평9-75099호 및 일본 공개특허공보 2003-279489호 등에 기재된 공지된 킬레이트제 등을 사용할 수 있다.
이들 중, 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성 등의 관점에서 4 배위 킬레이트제가 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 및 그 염 (에틸렌디아민사아세트산이나트륨, 에틸렌디아민사아세트산삼나트륨, 에틸렌디아민사아세트산사나트륨, 에틸렌디아민사아세트산이칼륨 및 에틸렌디아민사아세트산삼칼륨 등) 그리고 트랜스-1,2디아미노시클로헥산-N,N,N',N'-사아세트산 (CyDTA), 특히 바람직한 것은 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 및 그 염이다.
킬레이트제를 함유하는 경우, 그 함유량은 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성의 관점에서 2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온 화합물의 중량에 기초하여 0.001 ∼ 4 중량％ 가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.01 ∼ 2 중량％, 특히 바람직하게는 0.05 ∼ 1 중량％ 이다.
화학 발광 시약 제 1 액은 액체인 것이 바람직하고, 또 효소의 형광 강도의 관점에서는 알칼리성인 것이 바람직하다. 제 1 액의 pH 는 7 ∼ 11 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 8 ∼ 10 이다. 또한, pH 는 JIS K 0400-12-10 : 2000 에 준거하여 측정된다 (측정 온도 25 ℃).
화학 발광 시약 제 1 액은 2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온 화합물, 화학 발광 증강제 그리고 필요에 따라 완충액 및/또는 킬레이트제를 균일 혼합함으로써 용이하게 얻을 수 있다.
화학 발광 시약 제 2 액이 함유하는 산화제로는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평8-261943호 및 일본 공개특허공보 2000-279196호 등에 기재된 공지된 산화제 등 [무기의 과산화물 (과산화수소, 과붕산나트륨 및 과붕산칼륨 등), 유기 과산화물 (과산화디알킬 및 과산화아실 등), 퍼옥소산 화합물 (퍼옥소황산 및 퍼옥소인산 등) 등] 의 수용액을 들 수 있다.
이들 중, 보존 안정성 등의 관점에서 과산화수소 수용액, 과붕산나트륨 수용액 및 과붕산칼륨 수용액이 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 과산화수소 수용액이다.
화학 발광 시약 제 2 액에 있어서의 산화제의 농도는 그 종류 및 적용하는 측정 방법이나 측정 조건 등에 따라 적절히 설정되지만, 화학 발광 증강 효과 등의 관점에서 0.5 ∼ 40 mM 이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 20 mM, 특히 바람직하게는 2.5 ∼ 10 mM 이다.
화학 발광 시약 제 2 액이 함유하는 물로는, 증류수, 역침투수 및 탈이온수 등을 들 수 있다. 이들 중, 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성 등의 관점에서 증류수 및 탈이온수가 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 탈이온수이다.
화학 발광 시약 제 2 액은 산화제 및 물 이외에 킬레이트제 등을 함유할 수 있다.
킬레이트제로는, 상기 서술한 제 1 액에 함유할 수 있는 킬레이트제로서 예시한 것과 동일한 것을 들 수 있고, 바람직한 것도 동일하다.
킬레이트제를 함유하는 경우, 그 함유량은 화학 발광 증강 효과 및 보존 안정성의 관점에서 산화제의 중량에 기초하여 0.2 ∼ 100 중량％ 가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.5 ∼ 20 중량％, 특히 바람직하게는 1 ∼ 10 중량％ 이다.
화학 발광 시약 제 2 액은 산화제, 물 및 필요에 따라 킬레이트제를 균일 혼합함으로써 용이하게 얻어진다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 이하, 특별히 규정하지 않는 한, ％ 는 중량％, 부는 중량부를 나타낸다.
제조예 1
반응 용기에 염화철 (Ⅲ) 6 수화물 2.7 부, 염화철 (Ⅱ) 4 수화물 1.0 부 및 물 375 부를 주입하고 용해시켜 50 ℃ 로 승온시키고, 교반하에서 온도를 50 ∼ 55 ℃ 로 유지하면서, 25 ％ 암모니아수 3.8 부와 물 100 부를 혼합한 용액을 1 시간에 걸쳐 적하하고, 적하 후 1 시간 교반하고, 올레산 10.5 부를 첨가하고 2 시간 교반을 계속하였다. 실온으로 냉각 후, 디캔테이션에 의해 고액 분리시켜 얻어진 올레산이 흡착된 마그네타이트 입자를 물 50 부로 세정하는 조작을 3 회 실시하였다. 얻어진 올레산이 흡착된 마그네타이트 입자를 용기에 주입하고, 데칸 5.7 부 및 테트라에톡시실란 2.2 부를 첨가하고 혼합하여, 분산액 (A2-1) 을 조제하였다.
반응 용기에 25 ％ 암모니아 수용액 39.0 부, 이소프로판올 55.4 부, 소르비탄모노올레에이트 2.9 부 (산요 화성 공업사 제조 「이오넷 S-80」) 및 폴리옥시에틸렌 (부가 몰수 20 몰) 알킬 (C16 ∼ 18) 에테르 (산요 화성공업사 제조 「에멀민 200」) 2.0 부를 첨가하여 클리어 믹스 (M 테크닉사 제조) 를 사용하여 혼합하고, 50 ℃ 로 승온 후, 클리어 믹스의 회전수 6,000 rpm 으로 교반하면서, 상기 분산액 (A2-1) 을 1 시간에 걸쳐 적하 후, 50 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후, 2,000 rpm 으로 5 분간 원심 분리시켜 미립자가 존재하는 상청을 제거하였다. 얻어진 고상에 물 50 부를 첨가하여 입자를 분산시켜 1,000 rpm 으로 10 분간 원심 분리 후, 미립자가 존재하는 상청을 제거하는 조작을 10 회 실시하였다. 계속해서, 얻어진 고상에 물 50 부를 첨가하여 입자를 분산시켜 500 rpm 으로 5 분간 원심 분리시킴으로써, 큰 입자 직경의 입자를 침강시켜 목적으로 하는 입자 직경을 갖는 입자를 함유하는 상청 (1) 을 회수하였다. 남은 고상에 물 50 부를 첨가하여 500 rpm 으로 5 분간 원심 분리 후, 상청 (2) 를 회수하는 조작을 2 회 실시하여, 고상 중에 존재하는 목적으로 하는 입자 직경을 갖는 입자를 회수하였다. 다음으로, 상청 (1) 및 (2) 에 대해, 자석을 사용하여 입자를 집자하고, 집자된 입자를 80 ℃ 에서 8 시간 건조시켜 자성 실리카 입자 (S1) 을 얻었다.
제조예 2
유화시의 클리어 믹스의 회전수를 6,000 rpm 에서 7,500 rpm 으로 바꾼 것 이외에는, 제조예 1 과 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S2) 를 얻었다.
제조예 3
테트라에톡시실란의 주입량을 2.2 부에서 0.5 부로 바꾼 것 이외에는, 제조예 1 과 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S3) 을 얻었다.
제조예 4
유화시의 클리어 믹스의 회전수를 6,000 rpm 에서 7,500 rpm 으로 바꾼 것 이외에는, 제조예 3 과 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S4) 를 얻었다.
제조예 5
마그네타이트 입자 제조시에 있어서의 25 ％ 암모니아수 3.8 부와 혼합하는 물의 양을 100 부에서 33.8 부로 바꾼 것 이외에는, 제조예 1 과 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S5) 를 얻었다.
제조예 6
유화시의 클리어 믹스의 회전수를 6,000 rpm 에서 7,500 rpm 으로 바꾼 것 이외에는, 제조예 5 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S6) 을 얻었다.
제조예 7
테트라에톡시실란의 주입량을 2.2 부에서 0.5 부로 바꾼 것 이외에는, 제조예 5 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S7) 을 얻었다.
제조예 8
유화시의 클리어 믹스의 회전수를 6,000 rpm 에서 7,500 rpm 으로 바꾼 것 이외에는, 제조예 7 과 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S8) 을 얻었다.
제조예 9
마그네타이트 입자 제조시에 있어서의 25 ％ 암모니아수 3.8 부와 혼합하는 물의 양을 100 부에서 55 부로 바꾸고, 테트라에톡시실란의 주입량을 2.2 부에서 1.2 부로 바꾼 것 이외에는, 제조예 2 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (S9) 를 얻었다.
비교 제조예 1
테트라에톡시실란의 주입량을 0.5 부에서 8.0 부로 바꾼 것 이외에는, 제조예 4 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (H1) 을 얻었다.
비교 제조예 2
테트라에톡시실란의 주입량을 1.2 부에서 12.5 부로 바꾼 것 이외에는, 제조예 9 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (H2) 를 얻었다.
비교 제조예 3
테트라에톡시실란의 주입량을 1.2 부에서 8.0 부로 바꾸고, 유화시의 클리어 믹스의 회전수를 7,500 rpm 에서 6,000 rpm 으로 바꾼 것 이외에는, 제조예 9 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (H3) 을 얻었다.
비교 제조예 4
100 부의 황산제1철을 1,000 부의 물에 용해시키고, 교반하에서 물 500 부에 수산화나트륨 28.8 부를 용해시킨 수용액을 1 시간에 걸쳐 적하 후, 교반하면서 85 ℃ 까지 승온시켜 공기를 현탁액에 분사하여 8 시간 산화시키고, 원심 분리시킴으로써 얻어진 마그네타이트 입자 2.2 부를 데칸 5.7 부 및 테트라에톡시실란 2.2 부와 혼합하여 분산액 (R-1) 을 얻었다. 분산액 (A2-1) 을 분산액 (R-1) 로 바꾼 것 이외에는, 제조예 2 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (H4) 를 얻었다.
비교 제조예 5
테트라에톡시실란의 주입량을 2.2 부에서 12.5 부로 바꾼 것 이외에는, 비교 제조예 4 와 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (H5) 를 얻었다.
비교 제조예 6
평균 입자 직경 50 ㎚ 의 마그네타이트 입자 (시그마 알드리치 재팬사 제조) 2.2 부를 데칸 5.7 부 및 테트라에톡시실란 2.2 부와 혼합하여 분산액 (R-2) 를 얻었다. 분산액 (A2-1) 을 분산액 (R-2) 로 바꾼 것 이외에는, 제조예 1 과 동일하게 하여 자성 실리카 입자 (H6) 을 얻었다.
실시예 1
이하의 조작에 의해, 자성 실리카 입자를 함유하는 시약 (항 AFP 항체 결합 자성 실리카 입자 시약), 표지 시약 (POD 표지 항 AFP 항체 시약), 화학 발광 시약 제 1 액 및 화학 발광 시약 제 2 액으로 구성되는 본 발명의 시약을 얻었다.
자성 실리카 입자를 함유하는 시약의 제조 :
1 중량％ γ-아미노프로필트리에톡시실란 함유 아세톤 용액 40 ㎖ 가 들어간 뚜껑이 부착된 폴리에틸렌 병에 제조예 1 에서 제조한 자성 실리카 입자 (S1) 40 ㎎ 을 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시키고, 네오듐 자석으로 자성 실리카 입자를 집자 후, 액을 아스피레이터로 흡인 제거하였다. 이어서 탈이온수 40 ㎖ 를 첨가하여 뚜껑을 덮고, 폴리스티렌 병을 천천히 2 회 도치 교반한 후, 네오듐 자석으로 자성 실리카 입자를 집자 후, 액을 아스피레이터로 흡인 제거하여 자성 실리카 입자를 세정하였다. 이 세정 조작을 3 회 실시하였다. 이어서, 이 세정 후의 자성 실리카 입자를 2 중량％ 글루타르알데히드 함유 수용액 40 ㎖ 가 들어간 뚜껑이 부착된 폴리에틸렌 병에 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 그리고, 탈이온수 40 ㎖ 를 첨가하여 뚜껑을 덮고, 폴리스티렌 병을 천천히 2 회 도치 교반한 후, 네오듐 자석으로 자성 실리카 입자를 집자 후, 액을 아스피레이터로 흡인 제거하여 자성 실리카 입자를 세정하였다. 이 세정 조작을 3 회 실시하였다. 또한 이 세정 후의 자성 실리카 입자를 항 AFP 모노클로날 항체 (다코 재팬사로부터 구입) 를 20 ㎍/㎖ 의 농도로 함유하는 0.02 M 인산 완충액 (pH 8.7) 40 ㎖ 가 들어간 뚜껑이 부착된 폴리에틸렌 병에 첨가하고, 25 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후, 네오듐 자석으로 자성 실리카 입자를 집자 후, 항 AFP 항체 함유 인산 완충액을 제거하고, 항 AFP 항체 결합 자성 실리카 입자를 제조하였다. 이것을 1 ％ 의 우혈청 알부민 함유의 0.02 M 인산 완충액 (pH 7.0) 으로, 항 AFP 항체 결합 자성 실리카 입자 농도로서 0.5 ㎎/㎖ 의 농도로 희석시키고, 자성 실리카 입자를 함유하는 시약을 조제하여, 냉장 (2 ∼ 10 ℃) 에서 보존하였다.
표지 시약의 제조 :
항 AFP 폴리클로날 항체 (다코 재팬사로부터 구입), 서양 와사비 유래 POD (토요보사 제조) 를 사용하여, 문헌 (S·요시타케, M·이마가와, E·이시카와, 에토르 ; J. 바이오켐, Vol. 92, 1982, 1413-1424) 에 기재된 방법으로 POD 표지 항 AFP 항체를 조제하였다. 이것을 1 ％ 의 우혈청 알부민 함유의 0.02 M 인산 완충액 (pH 7.0) 으로, POD 표지 항 AFP 항체 농도로서 200 nM 의 농도로 희석시키고, 표지 시약을 조제하여, 냉장 (2 ∼ 10 ℃) 에서 보존하였다.
화학 발광 시약 제 1 액의 조제 :
루미놀의 나트륨염 [시그마 알드리치 재팬사 제조] 0.7 g 및 4-(시아노메틸티오)페놀 0.1 g 을 1,000 ㎖ 메스 플라스크에 주입하였다. 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산/수산화나트륨 완충액 (10 mM, pH 8.6) 을 용액의 용량이 1,000 ㎖ 가 되도록 주입하고, 25 ℃ 에서 균일 혼합하여 화학 발광 시약 제 1 액을 조제하였다. 측정에 사용할 때까지 냉장 (2 ∼ 10 ℃) 보존하였다.
화학 발광 시약 제 2 액의 조제 :
과산화수소 [와코 쥰야쿠 공업사 제조, 시약 특급, 농도 30 중량％] 6.6 g 을 1,000 ㎖ 메스 플라스크에 주입하였다. 탈이온수를 용액의 용량이 1,000 ㎖ 가 되도록 주입하고, 25 ℃ 에서 균일 혼합하여 화학 발광 시약 제 2 액을 조제하였다. 측정에 사용할 때까지 냉장 (2 ∼ 10 ℃) 보존하였다.
실시예 2 ∼ 9 및 비교예 1 ∼ 6
자성 실리카 입자 (S1) 을 자성 실리카 입자 (S2) ∼ (S9) 또는 (H1) ∼ (H6) 로 바꾸는 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여 본 발명의 또는 비교용의 자성 실리카 입자를 함유하는 시약, 표지 시약, 화학 발광 시약 제 1 액 및 화학 발광 시약 제 2 액으로 구성되는 본 발명의 시약을 얻었다.
얻어진 시약을 사용하여, 이하의 방법에 의해 단시간에서의 면역 측정에 있어서의 세정성 및 감도를 평가한 결과를 표 1 에 나타낸다. 또, 사용한 자성 실리카 입자 (S1) ∼ (S9) 및 (H1) ∼ (H6) 에 대해, 이하에 나타내는 방법으로 초상자성 금속 산화물의 평균 입자 직경, 자성 실리카 입자의 평균 입자 직경, 초상자성 금속 산화물의 함유량을 측정하고, 집자성, 재분산성 및 재응집성을 평가한 결과를 함께 표 1 에 나타낸다.
＜본 발명의 시약을 사용한 단시간에서의 면역 측정에 있어서의 세정성 및 감도의 평가 방법＞
자성 실리카 입자를 함유하는 시약 0.025 ㎖ 와 1 중량％ 의 우혈청 알부민을 함유한 인산 완충액으로 조제한 AFP 농도가 2 ng/㎖ 인 표준 AFP 액 0.025 ㎖ 를 시험관에 넣어 혼합하고, 시험관 중에서 37 ℃ 에서 3 분간 반응시켜 항 AFP 항체 결합 자성 실리카 입자/AFP 복합체를 형성시켰다. 반응 후, 시험관의 외측으로부터 네오듐 자석으로 자성 실리카 입자를 10 초간 모으고, 시험관 중의 액을 아스피레이터로 제거하고, 네오듐 자석을 측면으로부터 충분히 떼어놓고, 생리 식염수 0.5 ㎖ 를 첨가하여 자성 실리카 입자를 분산시켜 집자 후, 아스피레이터로 액을 제거한 세정 조작을 3 회 실시하였다.
계속해서, 표지 시약 0.025 ㎖ 를 시험관에 주입하고, 시험관 중에서 37 ℃ 에서 3 분간 반응시켜, 항 AFP 항체 결합 자성 실리카 입자/AFP/POD 표지 항 AFP 항체 복합체를 형성시켰다. 반응 후, 시험관의 외측으로부터 네오듐 자석으로 자성 실리카 입자를 10 초간 모으고, 시험관 중의 액을 아스피레이터로 제거하고, 네오듐 자석을 측면으로부터 충분히 떼어놓고, 생리 식염수 0.5 ㎖ 를 첨가하여 자성 실리카 입자를 분산시켜 집자 후, 아스피레이터로 액을 제거한 세정 조작을 2 회 실시하였다.
마지막으로, 화학 발광 시약 제 1 액 0.07 ㎖ 와 화학 발광 시약 제 2 액 0.07 ㎖ 를 동시에 첨가하여, 37 ℃ 에서 43 초간 발광 반응시키고, 화학 발광 시약을 첨가 후 43 ∼ 45 초의 평균 발광량을 발광 검출기 [Lumat LB9507 (베르톨드 재팬사 제조)] 로 측정하였다. 또한, AFP 농도가 2 ng/㎖ 인 표준 AFP 액 대신에 AFP 농도가 0 ng/㎖ 인 표준 AFP 액을 사용하여 상기와 동일한 조작을 실시하고 백그라운드로서 사용하였다.
세정성에 대해서는, AFP 농도가 0 ng/㎖ 인 표준 용액을 사용하여 면역 측정을 실시한 경우의 평균 발광량으로부터 이하의 기준으로 판정하였다.
○ : 10,000 cps 미만
△ : 10,000 cps 이상 또한 30,000 cps 미만
× : 30,000 cps 이상
감도에 대해서는, AFP 농도가 0 ng/㎖ 와 2 ng/㎖ 인 표준 용액을 사용한 면역 측정을 실시한 경우의 발광량의 차이로부터 이하의 기준으로 판정하였다.
○ : 25,000 cps 이상
△ : 10,000 cps 이상 또한 25,000 cps 미만
× : 10,000 cps 미만
＜초상자성 금속 산화물의 평균 입자 직경의 측정 방법＞
임의의 200 개의 초상자성 금속 산화물에 대해, 주사형 전자 현미경으로 관찰하고 입자 직경을 측정하여, 그 평균값을 평균 입자 직경으로 하였다.
＜자성 실리카 입자의 평균 입자 직경의 측정 방법＞
임의의 200 개의 자성 실리카 입자에 대해, 주사형 전자 현미경으로 관찰하고 입자 직경을 측정하여, 그 평균값을 평균 입자 직경으로 하였다.
＜자성 실리카 입자 중의 초상자성 금속 산화물의 함유량의 측정 방법＞
임의의 20 개의 자성 실리카 입자에 대해, 주사형 전자 현미경으로 관찰하고, 에너지 분산형 X 선 분광 장치에 의해 초상자성 금속 산화물의 함유량을 측정하여 그 평균값을 함유량으로 하였다.
＜자성 실리카 입자의 집자성의 평가 방법＞
1.0 ㎎ 의 자성 입자 실리카 입자를 2 ㎖ 의 이온 교환수에 분산시키고, 구내 직경 × 동체 직경 × 전체 높이 ＝ φ 10.3 ㎜ × φ 12.0 ㎜ × 35 ㎜ 의 유리 용기에 넣고, 1 ㎝ × 1 ㎝ × 1 ㎝ 의 네오듐 자석을 측면에 대고, 초기 흡광도가 20 ％ 가 될 때까지의 시간을 측정하여, 이하의 기준으로 판정하였다.
○ : 15 초 미만
△ : 15 초 이상 또한 30 초 미만
× : 30 초 이상
＜자성 실리카 입자의 재분산성의 평가 방법＞
1.0 ㎎ 의 자성 입자 실리카 입자를 2 ㎖ 의 이온 교환수에 분산시키고, 구내 직경 × 동체 직경 × 전체 높이 ＝ φ 10.3 ㎜ × φ 12.0 ㎜ × 35 ㎜ 유리 용기에 넣고, 1 ㎝ × 1 ㎝ × 1 ㎝ 의 네오듐 자석을 측면에 대고, 자성 실리카 입자를 완전하게 집자하고, 상청을 제거하고, 네오듐 자석을 측면으로부터 충분히 떼어놓고, 2 ㎖ 의 이온 교환수를 자성 실리카 입자에 분사하면서 첨가하여, 3 회의 피펫팅에 의해 혼합한 후, 10 초 이내에 현미경으로 관찰하고, 시야 내의 전체 입자수에 대한 응집된 입자수의 비율을 산출하여 이하의 기준으로 재분산성을 판정하였다.
○ : 응집 입자가 5 ％ 미만
△ : 응집 입자가 5 ％ 이상 또한 20 ％ 미만
× : 응집 입자가 20 ％ 이상
＜자성 실리카 입자의 재응집성의 평가 방법＞
3 회의 피펫팅에 의한 혼합 후, 현미경으로 관찰할 때까지의 시간을 10 초 이내에서 5 분으로 바꾸는 것 이외에는, 상기 재분산성의 평가 방법과 동일하게 하여 시야 내의 전체 입자수에 대한 응집된 입자수의 비율을 산출하여 이하의 기준으로 판정하였다.
○ : 응집 입자가 5 ％ 미만
△ : 응집 입자가 5 ％ 이상 또한 20 ％ 미만
× : 응집 입자가 20 ％ 이상
Figure 112013111873638-pct00001
산업상 이용가능성
본 발명의 자성 실리카 입자를 사용한 측정 대상 물질 측정 방법은, 자성 실리카 입자의 자기 특성 및 집자 후의 입자의 재분산성이 우수한 점에서, 간편하고 또한 단시간에 고감도로 측정 대상 물질을 측정할 수 있기 때문에, 방사 면역 측정법, 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법 및 화학 발광 면역 측정법 등의 임상 검사에 폭넓게 적용할 수 있다. 또, 본 발명의 시약은 상기 측정 방법에 사용하기에 적절한 것으로, 마찬가지로 방사 면역 측정법, 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법 및 화학 발광 면역 측정법 등의 임상 검사약으로서 사용할 수 있다.

Claims (18)

  1. 평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 인 초상자성 금속 산화물을 60 ∼ 95 중량％ 함유하는 실리카 입자의 표면에 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 고정화된 자성 실리카 입자를 사용하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하는 것을 특징으로 하는 측정 대상 물질 측정 방법으로서, 하기 i), ii) 및 iii) 중 어느 하나의 측정 방법을 따르는 방법:
    i) 상기 자성 실리카 입자가 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (측정 대상 물질 결합 물질) 을 그 표면에 고정화시킨 것으로서, 상기 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 상기 자성 실리카 입자와, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질 결합 물질 (표지 측정 대상 물질 결합 물질) 을 접촉시켜, 상기 자성 실리카 입자 상에 상기 측정 대상 물질 결합 물질과 상기 측정 대상 물질과 상기 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 상기 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 상기 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 상기 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하는 측정 방법;
    ii) 상기 자성 실리카 입자가 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질을 그 표면에 고정화시킨 것으로서, 상기 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (표지 측정 대상 물질 결합 물질) 과, 상기 자성 실리카 입자를 접촉시켜, 상기 자성 실리카 입자 상에 상기 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질과 상기 표지 측정 대상 물질 결합 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 상기 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 상기 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하는 측정 방법;
    iii) 상기 자성 실리카 입자가 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질 (측정 대상 물질 결합 물질) 을 그 표면에 고정화시킨 것으로서, 상기 측정 대상 물질을 함유하는 시료와, 표지 물질에 의해 표지된 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질 (표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질) 과, 상기 자성 실리카 입자를 접촉시켜, 상기 자성 실리카 입자 상에 상기 측정 대상 물질 결합 물질과 상기 표지 측정 대상 물질 또는 그 유사 물질의 복합체 (표지 복합체) 를 형성시키고, 상기 표지 복합체를 담지한 자성 실리카 입자를 B/F 분리시켜, 상기 표지 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고, 그 결과에 기초하여 시료 중의 측정 대상 물질을 측정하는 측정 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 B/F 분리가 자성 실리카 입자의 자성을 이용하여 이루어지는 것인 측정 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성 실리카 입자의 평균 입자 직경이 1 ∼ 5 ㎛ 인 측정 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 초상자성 금속 산화물이 산화철인 측정 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 산화철이 마그네타이트, γ-헤마타이트, 마그네타이트-α-헤마타이트 중간 산화철 및 γ-헤마타이트-α-헤마타이트 중간 산화철로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 산화철인 측정 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정 대상 물질, 상기 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 상기 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 고정화되기 전의 상기 자성 실리카 입자의 표면에 글루타르알데히드, 알부민, 카르보디이미드, 스트렙토아비딘, 비오틴 및 관능기를 갖는 알킬알콕시실란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유기 화합물을 결합시켜 이루어지는 측정 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 알킬알콕시실란이 갖는 관능기가 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 및 글리시딜옥시기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기인 측정 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질에 대한 항체, 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질이 결합되는 항원, 혹은 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질에 결합되는 단백질인 측정 방법.
  12. 평균 입자 직경이 1 ∼ 15 ㎚ 인 초상자성 금속 산화물을 60 ∼ 95 중량％ 함유하는 실리카 입자의 표면에 측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 고정화된 자성 실리카 입자를 함유하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 및 제 5 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 측정 방법용 시약.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 자성 실리카 입자의 평균 입자 직경이 1 ∼ 5 ㎛ 인 시약.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 초상자성 금속 산화물이 산화철인 시약.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 산화철이 마그네타이트, γ-헤마타이트, 마그네타이트-α-헤마타이트 중간 산화철 및 γ-헤마타이트-α-헤마타이트 중간 산화철로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 산화철인 시약.
  16. 제 12 항에 있어서,
    측정 대상 물질, 측정 대상 물질의 유사 물질 또는 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 고정화되기 전의 상기 자성 실리카 입자의 표면에 글루타르알데히드, 알부민, 카르보디이미드, 스트렙토아비딘, 비오틴 및 관능기를 갖는 알킬알콕시실란으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 유기 화합물을 결합 시켜 이루어지는 시약.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 알킬알콕시실란이 갖는 관능기가 아미노기, 카르복실기, 수산기, 메르캅토기 및 글리시딜옥시기로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 종의 관능기인 시약.
  18. 제 12 항에 있어서,
    상기 측정 대상 물질과 특이적으로 결합되는 물질이 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질에 대한 항체, 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질이 결합되는 항원, 혹은 측정 대상 물질 또는 측정 대상 물질의 유사 물질에 결합되는 단백질인 시약.
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