PT97031B

PT97031B - Processo para a preparacao de um revelador fisico estavel a luz compreendendo uma solucao aquosa de ioes de prata

Info

Publication number: PT97031B
Application number: PT97031A
Authority: PT
Inventors: Marcus Joannes Maria Noppe; Lucas Alfons Maria Van Nuffel
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 1990-03-14
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1998-07-31
Also published as: NO303155B1; JP2848542B2; ZA911853B; FI101830B1; CA2037845A1; AU643979B2; PT97031A; IL97516A; GB9005753D0; AU7290291A; EP0446993A1; FI101830B; IE910845A1; ATE154143T1; FI911250A0; EP0446993B1; IL97516A0; JPH04220642A; US5206122A; FI911250A

Description

Antecedentes da invenção

Nos últimos anos foram introduzidos métodos em que os agregados formados entre agentes de ligação específica e substâncias ligáveis são detectados por marcação dos referidos agregados, directa ou indirectamente, com pequenas partículas metálicas, particularmente partículas de ouro. Depen dendo das circunstâncias, estas partículas podem ser detectadas, por exemplo, por exame visual directo, por técnicas microscópicas ou espectrofotométricas. Uma descrição da immunogold staining (IGS) technique, the sol particle immuno assay (SPIA) technique ou aplicações específicas e seus aperfeiçoamentos po dem encontrar-se nos pedidos de patentes norte-americanas NQs.

313 734, 4 446 238, 4 420 558 e os pedidos de patentes europeias NQs. 165 633, 165 634, 158 746, 293 947 e na série de raaN.

nuais IBRO, Wiley, Nova York, 1983, páginas 347 a 372.

Partindo de um método relativamente de.s conhecido para a marcação de antigenos de superfície de células as partículas metálicas tornaram-se hoje muito utilizadas numa variedade de problemas de detecção e/ou determinação quantitatji va. A possibilidade de exame visual directo de partículas metálicas e a vantagem de o sinal gerado ser permanente e não tender para a degradação torna-as um marcador interessante para en saios simples e rápidos. Além disso, os marcadores metálicos, de preferência, marcadores de ouro, mostram-se preferíveis rela tivamente aos marcadores de isotopos de rádio devido aos reduzi dos riscos que aqueles representam para a saúde.

Verificou-se, em seguida, que um sinal de um marcador metálico, tal como o ouro coloidal, pode aumentar significativamente submetendo os marcadores de ouro coloidal a um chamado procedimento de intensificação física. 0 efeito de um tal procedimento de intensificação física é que o sinal óptico o avermelhado típico do ouro transforma-se num sinal que varia entre castanho escuro a negro-prateado possuindo muito maior intensidade. No referido procedimento, os marcadores metálicos utilizados como marcador catalisam a redução de iões de prata presentes na solução reveladora. Isto origina uma depo sição específica de uma camada de prata metálica nas partículas de metal. As partículas de prata metálicas assim formadas catalisam, por sua vez, a redução de mais iões de prata da solução reveladora física, criando um processo auto-catalítico.

As soluções reveladoras conhecidas consistem, em geral, numa solução contendo um sal de metal solúvel tal como o nitrato de prata, um agente redutor tal como a hidro quinona, um agente tampão apropriado e, eventualmente, um complexante para ligar os iões metálicos e torná-los menos susceptíveis de redução.

Apesar da utilização destes reveladores físicos conhecidos originar um sinal aumentado, existem vários inconvenientes associados com eles. Na verdade, é bem conhecido que os iões de prata podem formar sais de prata sensíveis à luz tais como brometo de prata e cloreto de prata que são facilmente reduzidos a prata metálica sob a influência da luz, partindo

®Β»2ίΙ3·3ΙΗβ«9^ _f3^‘ de um processo auto-catalítico. Este processo não específico de auto-nucleação contribui para a ocorrência de inconvenientes com uma intensidade significativa. Pode ser fortemente perturba dor sob condições de luz intensa, por exemplo, no controlo de amostras de ensaio em microscópio óptico, ou ainda quando o pro cesso de revelação física é lento e a amostra de ensaio é expos^ ta à luz durante um período de tempo prolongado.

Consequentemente, o objectivo da presen te invenção é proporcionar um revelador físico sensível e práti co para utilização numa variedade de ensaios com base em metais, que seja estável à luz e não origine deposição não específica não desejada de partículas de metal.

A presente invenção refere-se a um reve lador físico constituído por uma solução aquosa de iões de prata, um agente redutor, um agente de dessensibilização e, se se desejar, um sistema tampão e um ou mais adjuvantes.

Proporciona-se ainda um método para a determinação qualitativa e/ou quantitativa de um ou vários componentes de um agregado formado pelo menos entre um agente de ligação específico e a sua substância ligãvel correspondente, o qual consiste na marcação de pelo menos um componente do referi do agregado com um marcador e contacto do referido agregado com um revelador físico formando-se assim, sob a influência do marcador, uma partícula de prata que pode ser determinada quantita tivamente, caracterizado pelo facto de o revelador físico ser um revelador físico de acordo com a presente invenção, constituído por uma solução de iões prata, um agente de dessensibilização e um agente redutor.

Noutro dos seus aspectos a presente invenção proporciona produtos versáteis, tais, como conjunto de ensaio adaptados para praticar os métodos referidos anteriormen te.

Na presente invenção a sensibilidade ã luz dos reveladores físicos tradicionais com base em iões de prata é contrariada pela adição de um agente de dessensibilização ao revelador. Os agentes dessensibilizantes preferidos para utilização na presente invenção são aceitadores de electrões, tais como, metil-sulfonato de 6-etoxi-l-metil-2-(3-nitrostiril) * , ~, ” — T!»_waE7j, ,,-f quinolínio conhecidos como Pinakryptol Yellow R e agentes de dessensibilização análogos.

Os agentes redutores para utilização no presente revelador físico incluem quaisquer agentes que reduzam os iões de prata de um revelador físico na proximidade de um sí. tio activo. De preferência, os referidos agentes redutores formam soluções estáveis com os constituintes do revelador físico aperfeiçoado. Como agente redutor podem referir-se, em particular, os compostos 1,-di-hidroxibenzeno, 1,4-di-hidroxibenzeno (Hidroquinona), sulfato de 4-metilaminofenol (Metol R ), 4-aminofenol, 1,4-diaminobenzeno, 1,2-diaminobenzeno, N-(4-hidroxife nil)glicina, 2,4-diaminofenol, l-fenil-3-hidroxipirazol (Phenidone R ), ou suas misturas. Como outros adjuvantes do revelador físico aperfeiçoado podem referir-se agentes tampão, conservantes, por exemplo, anti-oxidantes ou estabilizantes orgânicos, reguladores de velocidade, bactericidas e análogos tais como, por exemplo, sulfito de sódio, bissulfito de sódio, citrato de sódio e análogos.

Os agentes de ajustamento de pH adequados são, por exemplo, ácido acético, ácido cítrico, hidróxido de sódio ou um sal de qualquer um destes ou um sistema tampão com base em tris(hidroximetil)aminometano. 0 pH do revelador fí^ sico estã, de preferência, compreendido aproximadamente entre 5 e 9, em particular, aproximadamente entre 6 e 8. Em geral o pH do revelador físico é limitado a um intervalo em que o agente de ligação específico e a correspondente substância ligável são estáveis.

Além dos iões de prata, o agente redutor e dessensibilizante, a solução reveladora física preferida inclui também um excesso de um complexante para ligar os iões metálicos e torná-los menos susceptíveis de redução. Os complexantes preferidos para utilização na presente invenção estão descritos no pedido de patente europeia NQ. 293 947 e incluem a piridina, a amino-piridina, a nicotinamida, a quinolina, o imidazol, a histidina, o benzimidazol, o pirazol, a purina e siste mas de anel heterocíclicos aromáticos semelhantes.

Um exemplo de uma forma de preparar o revelador físico desta invenção consiste em dissolver ou prepa4

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X rar uma suspensão do agente dessensibilizante numa solução aquo sa constituída por iões de prata, redutores, agentes tampão e quaisquer adjuvantes. Na solução final, a proporção de agente dessensibilizante: iões de prata está compreendida aproximadamente entre 50 g/mole e 0,5 g/mole de iões de prata, em particu lar, aproximadamente entre 50 g/mole e 5 g/mole de iões de prata, ou entre 35 g/mole e 15 g/mole de iões prata. A concentração dos iões de prata estã compreendida entre 0,001 moles/1 e 0,1 moles/1, em particular aproximadamente entre 0,005 moles/1 e 0,5 moles/1, ou entre 0,07 moles/1 a 0,3 moles/1.

Numa forma de realização preferida prepara-se o revelador físico por mistura de duas soluções estáveis e líquidas. Uma das soluções, daqui em diante referida como uma solução intensificadora, é constituída por iões de prata um agente dessensibilizante, um excesso molar de complexante re lativamente aos iões de prata e, eventualmente, um sistema tampão. Em particular, a proporção entre o excesso molar de comple xante e os iões de prata varia aproximadamente entre duas a duzentas vezes de excesso molar, de preferência aproximadamente entre vinte a cem vezes de excesso molar. A outra solução, daqui em diante referida como solução iniciadora, é constituída por um agente redutor e, eventualmente, um sistema tampão e um estabilizador anti-oxidante e/ou orgânico tal como, por exemplo, sulfito de sódio, bissulfito de sõdio e análogos. De prefe rência, a diluição das soluções intensificadoras e iniciadora é tal que a mistura de um volume igual de cada uma das soluções proporciona um revelador físico estável ã luz conforme anterior mente descrito. Nalguns casos, as soluções intensificadora e iniciadora podem ser preparadas a partir dos seus correspondentes constituintes secos por adição de uma quantidade apropriada de água. Para facilitar a preparação da solução de aumento e/ou revelador físico pode ser apropriado dissolver primeiro o agente dessensibilizante numa pequena quantidade de um solvente orgânico, tal como, Ν,Ν-dimetilformamida, Ν,Ν-dimetilacetamida e análogos e misturar a solução orgânica assim obtida com a solução aquosa que inclui os iões de prata. 0 pH da solução de aumento deve estar compreendido aproximadamente entre 5 e 9 e de preferência aproximadamente entre 6,5 e 8,5. O pH da solução

«.rf, * iniciadora deve estar compreendido entre 2 e 7 e de preferência aproximadamente entre 3,5 e 5,5.

Embora a utilização de agentes dessensjL bilizantes tais como Pinakryptol Yellow R em emulsões de halogenetos de prata seja conhecida, é surpreendente que o Pinak rytol Yellow R possa selectivamente evitar a auto-nucleação não específica numa solução reveladora física e formar uma solu ção estãvel à luz, ao mesmo tempo que não afecta, de forma adversa, a velocidade de deposição do metal no marcador. Assim, a presente invenção proporciona um aumento de várias vezes na proporção entre a velocidade de redução específica do marcador e a velocidade de auto-nucleação. Uma consequência importante é que o presente revelador físico pode reagir até ao máximo, isto é, até ao desaparecimento de todos os iões de prata, pelo que o desenvolvimento específico do marcador e a auto-nucleação, - se existir - diminuem rapidamente e param. Isto torna o procedimen to de revelação física menos dependente de parâmetros externos e de processo. Mais em particular isto significa que não é mais necessário cronometrar o processo de revelação com a finalidade de o parar quando começa o ruído de fundo originado pela deposi^ ção de um metal não específico. Com as composições da presente invenção o processo de revelação pode decorrer, até se completar, sem ser controlado.

A proporção aumentada entre a velocidade de redução específica do marcador e a velocidade de auto-nucleação não específica pode ser explicada de várias maneiras. Pode aumentar-se a sensibilidade mantendo o marcador mais tempo em contacto com o revelador físico ou pode aumentar-se a veloci dade da revelação do marcador específico e isto sem perda da flexibilidade proporcionada por um período de tempo seguro entre o momento de revelação óptima do marcador e o momento em que começa a auto-nucleação para proporcionar um sinal de fundo aumentado. Nalguns casos, pode desenvolver-se uma combinação da velocidade global e da sensibilidade aumentadas. A velocidade e a sensibilidade podem modular-se variando a concentração e a natureza dos iões de prata, em particular, dos seus ligantes, do agente de dessensibilização, do agente redutor e/ou o pH da solução reveladora. Por exemplo, aumentando a concentração de

iões de prata e/ou aumentando o pH e/ou utilizando um agente re dutor mais forte proporciona-se um procedimento revelador mais rápido. Inversamente, o procedimento de revelação pode ser mais lento baixando a concentração em iões de prata e/ou baixando o pH e/ou utilizando um agente redutor mais fraco. A velocidade, especialmente com marcadores inferiores a 5 mm, pode ser perfe/ tamente modulada a partir de velocidades muito elevadas (10-20 segundos) até baixas (30 minutos ou mais). De preferência, o tempo de revelação é modulado entre 10 segundos a 2 minutos aproximadamente, em particular, entre 10 segundos e um minuto.

Os reveladores físicos atrãs descritos utilizam-se, de preferência, em métodos para a determinação qua litativa e/ou quantitativa de um ou vãrios componentes de um agregado formado entre, pelo menos, um agente de ligação especí fico e a sua correspondente substância ligãvel pelo que, pelo menos, um componente do referido agregado é marcado com um marcador de metal que cataliza directa ou indirectamente a redução dos iões de prata de um revelador físico.

O marcador para utilização no método de acordo com esta invenção define qualquer partícula que possa ca talizar a redução de iões metálicos, originando uma deposição das partículas de metal correspondentes no sítio do referido marcador.

Os referidos marcadores incluem metais, compostos metálicos ou polímeros, opcionalmente, revestidos ou impregnados com metais ou compostos metálicos que possam cataLi zar, directa ou indirectamente, a redução de iões metálicos na sua superfície. Como exemplos desses metais podem referir-se a prata, o ouro, o tálio, a platina, o paládio, assim como o cobre, o níquel e análogos sendo o ouro preferido. Como exemplos de compostos metálicos podem referir-se os complexos ou quelatos e sulfetos correspondentes. Os polímeros revestidos ou impregnados com metais ou compostos metálicos possuem propriedades semelhantes à dos metais ou compostos metálicos mas o conteúdo em metal, a densidade e o tamanho podem ser combinados de forma óptima. Para utilização no método preferido o marcador de ve ser seleccionado de tal forma que os agentes de ligação espe cíficos ou suas substâncias ligáveis correspondentes possam li7

χ” gar-se ao marcador, sem perda da sua afinidade para a sua parte simétrica.

Os marcadores particularmente preferidos para utilização no método de acordo com a presente invenção são (i) partículas metálicas coloidais, eventualmente, um colói. de contendo metais ou sulfetos de metais; ou (ii) quelatos de metais, especialmente, os que incorporam grupos ãcido etilenodi^ -amino-tetra-acético (EDTA) ou ãcido di-etilenotriaminopenta-acético (DTPA); ou (iii) polímeros eventualmente impregnados com metais ou sulfetos de metais, por exemplo, produtos de poli merização derivados de benzidina, tais como, por exemplo, polímeros de diaminobenzidina.

Os referidos métodos podem, conveniente mente, efectuar-se por imobilização do agente de ligação especi fico ou da correspondente substância ligável, directa ou indirectamente, num suporte sólido, contacto do suporte com um ião simétrico marcado com um marcador que cataliza a redução dos iões metálicos do revelador físico e adição do revelador físico, antes ou depois, da separação dos componentes ligados e livremente marcados, pelo que durante a reacção ou depois de um tempo de reacção adequado, as partículas de metal formadas são determinadas quantitativa e/ou qualitativamente na amostra de ensaio e/ou nas fracções derivadas para proporcionar uma indicação qualitativa e/ou quantitativa do componente ou componentes a determinar. Nalguns casos é preferível por em contacto o suporte contendo a substância ligável imobilizada com um primeiro agente ligante específico para a referida substância ligável, para formar um agregado e subsequentemente colocar em contacto o suporte que transporta o agregado assim formado, com uma segunda proteína ligante, que é específico para a referida primei ra proteína ligante, marcada com um marcador. O método assim descrito é particularmente adequado para a determinação de componentes imuno-químicos tais como haptenos, antigenos e anti-corpos.

Além disso, a presente invenção pode também utilizar-se para a determinação quantitativa e/ou qualitativa de uma substância aceitadora tal como uma proteína ou um ãcido nucleíco que é directamente imobilizado num suporte sóli8

do e ligado com o marcador referido anteriormente.

As determinações a fazer de acordo com o método preferido desta invenção podem efectuar-se de forma ho mogénea ou heterogénea. As determinações homogéneas são particu larmente simples de efectuar mas exigem uma variação mensurável do sinal perceptível relacionado com os marcadores presentes no reagente marcado ou no agregado marcado formado entre o reagente marcado e as partículas a determinar. Nos casos em que essa distinção não é possível, efectuam-se determinações heterogéneas .

As determinações homogéneas são preferi veis devido ao facto de não ser necessário separar fisicamente as espécies marcadas ligadas e não ligadas, reduzindo, assim, o número de passos necessários para efectuar o ensaio. A reacção entre o componente marcado e o correspondente componente oposto ligante origina a variação mensurável na participação da marcação ou na modulação do sinal gerando as porções necessárias para efectuar uma determinação homogénea. A distribuição dos marcadores entre as espécies ligadas e não ligadas pode ser diferenciada pela não capacidade ou pela capacidade alterada dos re feridos marcadores afectarem o sinal com eles relacionados, depois da revelação quando presentes nas espécies ligadas.

Pode efectuar-se convenientemente uma determinação homogénea de acordo com procedimentos conhecidos tais como, por exemplo, a técnica de ligação competitiva. Combi. na-se a amostra contendo a substância analisada com a correspon dente parte simétrica ligante da substância analisada, um reagente marcado incluindo um marcador ligado ã substância analisa da ou um seu análogo ligante específico, e com o revelador fisi co necessário para converter o marcador na sua parte que gera o sinal. Alternativamente, pode efectuar-se uma determinação sequencial em que a amostra e o correspondente ligante da substân cia analisada são primeiro combinados e depois adiciona-se o reagente detector.

Em muitos casos não é possível efectuar determinações homogéneas. Nestes casos uma determinação heterogénea pode ser uma alternativa particularmente atractiva. Em ge ral, o sistema de determinação heterogénea inclui, pelo menos,

dois constituintes básicos e o revelador físico que se combinam simultânea ou subsequentemente, isto é, a substância analisada a ser detectada, um correspondente ligante marcado com um marca dor e o revelador físico necessário para converter um marcador na parte que gera o sinal. Se necessário, depois de um período ou períodos de incubação o reagente marcado torna-se ligado à substância ligável correspondente a ser detectada, sendo a proporção entre as espécies ligadas e as espécies não ligadas uma função da quantidade de analisado presente. As espécies ligadas e não ligadas são separadas fisicamente e determina-se a quanti. dade de marcador presente em cada uma.

Os vários meios de efectuar os passos de separação e de efectuar as reacções de ligação são conhecidos na especialidade. A referida separação pode envolver técnicas convencionais tais como, por exemplo, a utilização de um an ti-corpo de fase sólida ou de um antigeno, um segundo anti-corpo ou um segundo anti-corpo de fase sólida; ou a utilização de agentes de precipitação imuno-complexos, adsorventes e anãlogos, As reacções de ligação podem, por exemplo, incluir as chamadas técnicas de ligação competitiva, a técnica de saturação sequencial, a técnica de intercolamento e análogos.

As determinações preferidas, de acordo com o método desta invenção, são determinações heterogéneas que, em geral, se baseiam no princípio que o agregado marcado formado entre a proteína ligante específica e a substância ligável é, durante algum tempo, imobilizado de tal forma que quaisquer partículas que não tenham reagido podem ser retiradas por lavagem, e depois as partículas imobilizadas são detectadas in situ ou, se desejado, depois de se separarem em qualquer outra fase dali derivada.

Numa forma de realização particularmente preferida, a substância ligante a ser detectada, que pode e_s tar contida numa amostra de ensaio impura ou numa sua fracção derivada, purificada ou parcialmente purificada, ê imobilizada num suporte imobilizante apropriado antes da sua complexão com o agente ligante marcado, específico para a substância ligável.

A imobilização da substância ligável po de efectuar-se seguindo as técnicas habituais, por exemplo, es10

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palhando uma alíquota da amostra de ensaio num suporte imobilizante ou imergindo este na amostra de ensaio e subsequente seca gem e eventualmente remoção por lavagem do material não imobili. zado. Esta é a chamada técnica directa. Como suportes imobilizantes para esta técnica podem utilizar-se vários materiais, em geral, materiais poliméricos tais como a nitrocelulose, o eter diazobenziloximetilino (DBH) e o eter diazofeniltio (DPT), papel de celulose modificado, papel, papel ou acetato de celulose activado com brometo de cianogéneo, agarose, nylon, plásticos e análogos, que podem tomar qualquer forma que seja conveniente para o processo de determinação, por exemplo, folhas, contas, placas em forma de cunha, barras e análogos.

Coloca-se depois o suporte em contacto com o agente ligante marcado sob condições que permitam a forma ção de agregados entre o agente ligante e a substância ligãvel correspondente. Consequentemente, nos locais em que a substância ligãvel fica imobilizada, os marcadores ficam também imobilizados em quantidades proporcionais a concentração da substância ligãvel imobilizada.

Numa variante deste método permite-se primeiro que a substância ligãvel imobilizada reaja com um primeiro agente ligante que é específico dela e depois coloca-se em contacto a fase imobilizada com os marcadores ligados a um segundo agente ligante que é específico para o referido primeiro agente ligante.

Devido à falta de selectividade e especificidade do processo de imobilização como atrás descrito, o método directo utiliza-se normalmente com amostras ou fracções de ensaio relativamente puras ou purificadas. Para amostras mais complexas, o método directo é muitas vezes menos adequado uma vez que a imobilização não específica de um grande excesso de material não desejado interfere com a sensibilidade e a espe cificidade da determinação.

Para evitar este problema, que é importante relativamente ãs análises de rotina, pode utilizar-se uma técnica indirecta ou a chamada técnica de intercalamento. Nesta técnica, um agente ligante específico primário purificado ou en riquecido é imobilizado num suporte sólido. Coloca-se este em s

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contacto com a amostra de ensaio sob condições que permitam a complexação das substâncias ligáveis correspondentes, o que con sequentemente as torna imobilizadas. Depois da remoção da amostra de ensaio e lavagem do suporte, coloca-se este em contacto com uma suspensão de marcadores revestidos com agentes de ligação específicos secundários que são susceptíveis de se ligarem a sítios não complexados da substância ligável imobilizada.

caso mais directo de forma de realiza ção a que esta invenção é aplicável é o de um ambiente em fluxo constituído pela substância ligável que é imobilizada directa ou indirectamente numa fase sólida, e por uma fase líquida rela tivamente móvel na fase sólida. De acordo com a direcção do flu xo da fase líquida relativamente â fase sólida, esta fase sólida pode ser permeável ao líquido ou não permeável ao líquido. Por exemplo, pode utilizar-se uma membrana permeável como uma fase sólida, permitindo que um fluxo perpendicular de líquido passe através dessa membrana. Por outro lado, pode utilizar-se uma fase sólida não permeável em combinação com um fluxo líquido lateral.

Durante a primeira fase da forma da rea lização, a fase líquida contendo o agente ligante específico marcado é posta em contacto com a substância ligável imobilizada na fase sólida. O movimento desta fase líquida relativamente à fase sólida pode ser contínuo ou descontínuo e tem que ser de tal forma que o tempo de contacto entre as fases permitam a ligação entre a substância ligável imobilizada e o agente ligante específico marcado. Contudo, este processo de ligação não neces sita de atingir o seu ponto de saturação. A queda de pressão en tre a fonte e o destino da fase líquida, que cria o fluxo, pode ser originada de várias formas. No caso de uma membrana permeável como fase sólida, pode criar-se um fluxo perpendicular colocando um lado desta membrana em contacto com um material absorvedor do fluido e aplicando a fase líquida do outro lado. No caso de uma fase sólida não permeável, pode criar-se um fluxo lateral da fase líquida por intermédio de uma bomba.

Para a segunda fase aplica-se como fase líquida um revelador físico aperfeiçoado de acordo com esta invenção. Com a finalidade de maximizar a proporção entre a velo12

cidade de redução específica do marcador e a velocidade de autc) -nucleação, pode ser apropriado manter separados os componentes do revelador físico, solução iniciadora e solução intensificado ra, até imediatamente antes da utilização. Contudo, é de notar que em comparação com a técnica anterior, podem fazer-se soluções estáveis do revelador físico por mistura da solução inicia dora e da solução intensificadora. Nalguns casos pode ser prefe rível aplicar as soluções intensificadora e iniciadora subsequentemente e formar assim o revelador físico aperfeiçoado in si tu. Tendo em vista as considerações anteriores o revelador físico da presente invenção pode facilmente ser optimizado relatjL vamente ao marcador utilizado, â sensibilidade necessária e ao tempo de contacto entre a fase sólida e o revelador físico líquido .

Numa forma de realização de fluxo prefe rida, a mistura dos dois componentes líquidos estáveis e a apli^ cação do resultante revelador físico aperfeiçoado devem ser com binadas numa operação única. Ά aplicação do revelador físico com fluxo protegido possui um efeito duplo. Inicialmente o líquido retira, por lavagem da fase sólida, todos os agentes ligantes específicos marcados remanescentes que não se ligaram ou apenas se ligaram deficientemente durante a primeira fase. Uma vez que a revelação física de um marcador é um processo progre^ sivo gradual, este material deve ser removido por lavagem da fa se sólida antes de qualquer sinal se tornar evidente. Os restan tes agentes ligantes específicos marcados ligados geram um sinal visível durante o posterior contacto com o revelador físico protegido. 0 fluxo e o volume do revelador aplicado à fase sóli da podem ser escolhidos para assegurar que o tempo de contacto é suficientemente longo para uma detecção óptima dos compostos marcados imobilizados e suficientemente curto para evitar reduções não específicas da fase sólida provocadas pela auto-nuclea ção. Normalmente, estes tempos podem ser modulados variando entre alguns segundos a vários minutos.

A detecção das partículas metálicas for madas numa determinada fase da mistura de reacção pode ocorrer utilizando várias técnicas que são conhecidas. Essas técnicas baseiam-se na quantidade e/ou propriedades físicas das partícu13 ^ιΛ r^j, z&ÍtIuíí ^•saasEsaa^ las metálicas formadas, de preferência, na dispersão e absorção das partículas metálicas. Como exemplos destas técnicas podem referir-se as técnicas espectrofotométricas tais como a densime tria, que são preferidas quando se desejam determinações quanti tativas. Contudo, tendo em consideração a alta sensibilidade ob tida, as partículas podem facilmente ser observadas visualmente, utilizando um microscópio.

Os agentes de ligação específica que se podem utilizar no método preferido de acordo com esta invenção podem ser de vária natureza mas em muitos casos são anti-corpos para antigenes específicos ou haptenos. Como um exemplo de subs tâncias ligantes específicas diferentes de anti-corpos podem re ferir-se os fagos que são eventualmente, química ou geneticamen te, adaptados para se ligarem a materiais moleculares ou célula res, lecitinas, que se ligam especificamente a glico-proteínas, proteína A de Staphylococcus aureus que se liga especificamente a imunoglobinas de várias espécies de animais e sondas de ADN ou ARN para identificação de genes. Em geral, pode-se utilizar qualquer outra interacção molecular de especificidade e afinida de suficientes. Os anti-corpos podem ser policlonais ou monoclo nais.

Tendo em atenção a sua natureza genérica, os métodos de acordo com esta invenção possuem um campo extremamente grande de aplicações. Em princípio podem aplicar-se à determinação qualitativa e/ou quantitativa de qualquer substância que possa ser marcada com o marcador atrãs referido. Por exemplo, tais substâncias incluem, sem que isso constitua uma limitação, antigenos teciduais e de superfícies celulares, subs tâncias biológicas excretadas ou derivadas de organismos vivos, particularmente, substâncias biológicas que ocorrem nos fluídos biológicos tais como a saliva, a linfa, o sangue e as suas frac ções derivadas tais como o plasma e o soro, a urina, o fluído cerebro-espinal, o fluído amniõtico e análogos. As substâncias que se podem detectar incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos tais como enzimas, hormonas, proteínas estruturais, ácidos nucleicos, vitaminas, poli-sacarideos, toxinas, alcaloides, gli coproteínas, haptenos, metabolitos, agentes farmacológicos, peq ticidas, poluentes, esterõides, e quaisquer outras moléculas pa

ra as quais exista ou possa ser sintetizado o correspondente lj. gante específico no sistema biológico.

As proteínas analisadas representativas incluem a classe de protaminas, mucoproteínas, glicoproteínas, globulinas, albuminas, escleroproteínas, fosfoproteínas, histonas, lipoproteínas, cromoproteínas e nucleoproteínas. Os exemplos de proteínas específicas são a pre-albumina, o<^-lipoproteí^ na, albumina do soro humano, oC ^-glicoproteína ácida, cC|-antitripsina, 9^-glicoproteína, transcortina, globulina ligante de tiroxina, haptoglobina, hemoglobina, mioglobina, ceruloplasmina Oé ₂-lipoproteína, of₂-macroglobulina, ^-lipoproteína, eritropoetina, transferina, hemopexina, fibrinogéneo, sendo preferidas as imoglobinas tais como IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, IgG e os seus fragmentos, por exemplo, factores complemento Fc, Fab e 2

F(ab ), prolactina, factores de coagulaçao do sangue tais como fibrinogéneo, trombina, insulina, melanotropina, sonatotropina, tirotropina, hormona estimulante dos folículos, hormona de luteinização, gonadrotopina, hormona estimulante da tiróide, lactogéneo da placenta, factor intrínseco, transcobalamina, enzimas do soro, tais como, fosfatase alcalina, desidrogenase lãcti. ca, amilase, lipase, fosfatases, colisnesterase, transaminase oxaloacética glutâmica, transaminase glutâmica pirúvica, e uropepsina, endorfinas, encefalinas, protamina, antigenos teciduais, antigenos bacterianos e antigenos virais tais como os anti genos associados à hepatite (por exemplo, HBsAg, HBcAg e HBeAg)

As amostras analíticas de haptenos representativos incluem a classe geral de fármacos, metabolitos, hormonas, pesticidas, poluentes, vitaminas e compostos orgânicos análogos. As hormonas haptênicas incluem tiroxina e tri-iodotironina. As vitaminas incluem vitaminas A,B, por exemplo, B12, C,D, E e K, ãcido fõlico e tiamina. Os fármacos incluem an tibiõticos tais como aminoglicósidos, por exemplo, gentamicina, tobramicina, amidacina, ssomicina, canamicina, e netilmicina, penicilina, tetraciclina, terramicina, cloromicetina, e actinomicetina; nucleõsidos e nucleótidos tais como difosfato de adenosina (ADP), trifosfato de adenosina (ATP), mononucleõtido da flavina (FMN), dinucleótido adenina da nicotinamida (NAD) e os seus derivados fosfato (NADP), timidina, guanosina e adenosina;

prostaglandinas; esteróides tais como estrogéneos, por exemplo, estriol e estradiol, esteróides; e outros tais como fenobarbital, fenitoína, pirimidona, etosuximida, carbamazepina, valproato, teofilina, caféina, propanolol, procaínamida, quinidina, amitriptilina, cortisol, desipramina, disopiramida, doxepina, doxorubicina, nortriptilina, metotrexato, imipramina, lidocaina, N-acetil-procainamida, anfetaminas, catecolaminas, e anti-hista minas. Outros glicósidos cardíacos e derivados de benzodiazepina, benzimidazol, piperidina, piperazina, imidazol, triazol, pj. ridazina, 1,2,4-triazinadiona ou 2,3,5,6-tetrahidro-imidazo[2,3_I-b]tiazois ou amidas, derivados de ácido hidratrópico ou trialquilaminas.

Os haptenos benzimidazol incluem tiaben dazol, fuberidazol, ciclobendazol, oxibendazol, parbendazol, cambendazol, mebendazol, fenbendazol, flubendazol, albendazol, oxfendazol, nocodazol e astemizol.

Os haptenos piperidina incluem difenoxi lato, fenoperidina, haloperidol, decanoato de haloperidol, deca noato de bromperidol, bromperidol, moperona, trifluperidol, pipamperona, piritramida, fentanil, benperidol, droperidol, benzi tramida, benzetimida, domperidona, sufentanil, carfentanil, alfentanil, dexetimida, lilenperona, difenoxina, fluspirilene, penfluidol, pimozido, lorcainido, loperamida, astemizol, cetanserina, levocabastina, cisaprido, altanserina, ritanserina, 3-[2-[4-(4-fluorobenzóil)-1-piperidinil]etil]-2,7-dimetil-4H-pirido[1,2-a]-pirimidin-4-ona, 3-[2-[4-[bis(4-fluorofenil)metileno] -1-piperidinil]etil]-2-metil-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona e 3- [2-[4-[[3-(2-furanilmetil)-3H-imidazo[4,5-b]piridin-2-il]amino]-1-piperidinil]etil]-2-metil-4H-pirido[1,2-a]pirimidin-4-ona.

Os haptenos piperizina incluem azaperona, fluanisona, lidoflazina, flunarizina, mianserina, oxatomida mioflazina, cloconizina e cinarizina.

Os exemplos de haptenos imidazol são me tronidazol, ornidazol, ipronidazol, tinidazol, isoconazol, nimo razol, miconazol, burimamida, metiamida, metomidata, enilconazol ou imazalilo, etomidato, econazol, clotrimazol, carnidazol, cimetidina, doconazol, sulconazol, parconazol, orconazol, buto16

conazol, triadiminol, tioconazol, valconazol, fluotrimazol, cetoconazol, oxiconazol, lombazol, bifonazol, oxmetidina, fentico nazol, fluconazol, tubulazol e (Z)-1-[2-cloro-2-(2,4-diclorofenil)etenil]-ΙΗ-imidazol. Os haptenos triazol incluem virazol, azaconazol, etaconazol, propiconazol, penconazol, itraconazol e terconazol.

As piridazinas hapteno incluem, por exemplo, 3-cloro-6-[3,6-di-hidro-4-(3-metilfenil)-1(2H)-piridinil]piradazina, 3-metoxi-6-[4-(3-metilfenil)-1-piperazinil]piri dazina e os compostos da publicação do Pedido da Patente Europeu Νθ. 0156433.

As 1,2,4-Triazinedionas incluem, por exemplo, 2-cloro-DC-(4-clorofenil)-4-(4,5-di-hidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2(3H)il)benzeno-acetonitrilo e os compostos da Publ. Pedido de Patente Europeia NQ. 0170316.

As trialquilaminas são, por exemplo, di-isopromina, prozapina.

Os 2,3,5,6-tetra-hidro-imidazo[2,1—b]tiazóis incluem, por exemplo, tetramisol ou levamisol.

As amidas incluem, por exemplo, closantel, ambucetamida, isopropamida, metiodeto de buzepida, dextromoramida. Um hapteno ácido hidratrópico é, por exemplo, suprofe no.

Os objectivos das determinações podem ser múltiplos. Em determinadas aplicações o revelador físico de acordo com a presente invenção utiliza-se apenas como uma ferra menta científica em aplicações de microscópio óptico e electrõnico, para melhor visualizar substâncias particulares, por exem pio, em pares histológicos, em cromatogramas, electroforetogramas, etc.. Verificou-se que o presente revelador físico é especialmente adequado para a detecção imunolõgica de antigenos em secções de células e tecidos e em amostras de base (células intactas). As sensibilidades obtidas são muito elevadas e a confi guração de marcação resultante é mais homogénea do que com os reveladores físicos da técnica anterior, especialmente, quando se aplicam marcadores ultra-pequenos tais como partículas de ou ro coloidais de aproximadamente 1 a 3 nm. Além da sua utilidade científica, o revelador físico de acordo com a presente inven17

ção tem também utilidade numa vasta gama de ensaios de diagnóstico tais como por exemplo, os seguintes: a detecção e caracterização de sub-populações de linfõcitos-T; ensaios de gravidez com base na presença de determinadas hormonas (gonadotropina co riónica) na urina, ensaios de diagnóstico para várias doenças infecciosas com origem em fungos ou bactérias, por exemplo, gonorreia e, em particular, para doenças de origem virai tais como, por exemplo, hepatite B, rubéola, poliemielite e análogos, doenças auto-imunes, por exemplo, Lupus eritematoso e doenças de deficiência imunolõgica, por exemplo, Sida; diagnóstico para doenças metabólicas, endocrinológicas e várias doenças endógenas, incluindo diagnósticos para a detecção de mal-formações congénitas de embriões com base na presença de proteínas especí ficas no fluído amniótico.

Assim, pode utilizar-se em virtualmente todas as circunstâncias para as quais as técnicas imunológicas foram concebidas no presente. Além disso, o revelador físico de acordo com a presente invenção pode também utilizar-se na deter minação e/ou detecção de substâncias aceitadoras, tais como pro teínas ou ãcidos nucleicos, que são directamente imobilizados num suporte sólido e ligados com um marcador colõidal seguindo os procedimentos descritos na Publicação da Patente Europeia NQ 0165633 e Analytical Biochemistry 145, 315-321 (1985). O referi do método inclui os passos subsequentes de colocar em contacto um suporte proteico ou de ácido nucleico, durante um determinado tempo, com uma concentração suficiente de marcador coloidal em suspensão num meio, contendo de preferência um detergente que não interfira com a proteína ou ácido nucleico ligantes tais como, por exemplo, 0,1% de detergente não iónico Tween 20, com o pH adequadamente ajustado e adicionando um revelador físi^ co, pelo que durante a reacção ou depois de um tempo de reacção adequado, as partículas de metal formadas são quantitativa e/ou qualitativamente determinadas. O revelador físico de acordo com esta invenção melhora a sensibilidade deste método sem os incon venientes associados com os reveladores tradicionais.

Os métodos de acordo com esta invenção oferecem uma estrutura que pode ser utilizada para uma grande variedade de aplicações de rotina e experimentais. Devido â sua

natureza e facilidade de processamento, os métodos são particularmente adequados para ensaios simples e rápidos qualitativos ou semi-quantitativos. Estes podem ser orientados para utilização por técnicos de laboratório experimentados assim como por pessoal médico ou para-médico não tecnicamente treinado. Os métodos podem também ser facilmente automatizados o que é um factor importante quando tem de se efectuar um grande número de de terminações idênticas, por exemplo, em bancos de sangue e laboratórios clínicos especializados.

Num outro aspecto desta invenção propor cionam-se produtos para a deposição de partículas de prata num marcador que cataliza a redução dos iões de prata de um revelador físico. Os referidos produtos incluem parte ou todos os ingredientes necessários para efectuar os métodos de ensaio como atrás descritos. Os produtos podem apresentar-se numa forma de embalagem comercial, por exemplo, como uma composição ou mistura quando os ingredientes são compatíveis, numa configuração de dispositivo de ensaio, ou como um conjunto de ensaio, isto é, uma combinação embalada de dois ou mais recipientes contendo os ingredientes necessários. Nesta configuração mais simples o pro duto é constituído por uma solução de revelador físico como anteriormente descrito. De preferência, os produtos apresentam-se como conjuntos de ensaio incluindo uma solução intensificadora e uma solução iniciadora que depois de mistura de dois volumes iguais de cada uma das soluções proporcionam um revelador físico estável à luz, como anteriormente descrito. Os conjuntos de ensaio podem ainda incluir ingredientes apropriados para métodos de ensaio específicos tais como agentes de ligação especif/ cos marcados com marcadores metálicos que catalizam a redução de iões de prata do revelador físico, agentes de ligação não marcados específicos para substâncias analisadas em conjunto com agentes de ligação marcados específicos para os referidos agentes não marcados. Obviamente, os presentes produtos podem também incluir outros reagentes adequados tais como agentes tam pão, diluentes, padrões e análogos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Materiais e métodos

1.1. Preparação de um revelador físico protegido I

Prepararam-se separadamente dois componentes líquidos deste revelador. Fez-se a solução A por dissolu ção de 17,85 g de ácido cítrico, 7,05 g de citrato de sódio, 40 g de imidazol e 1,86 g de nitrato de prata em 500 ml de ãgua. A solução B era constituída por 32,9 g de citrato de sódio, 10 g de sulfito de sódio, 0,6 de N-(p-hidroxifenil)glicina e 15,32 de ãcido cítrico em 1000 ml de ãgua.

1.2. Preparação do revelador físico protegido II

Prepararam-se separadamente dois componentes líquidos deste revelador. Fez-se a solução A por dissolu ção de 17,85 g de ácido cítrico, 7,05 g de citrato de sódio, 40 g de imidazol, 1,86 g de nitrato de prata e 0,25 g de PinakrijD tol Yellow R dissolvidos em aproximadamente 5 ml de N,N-dimeti1-formamida. Diluiu-se a solução com água até 500 ml. A solução B era constituída por 32,9 g de citrato de sódio, 10 g de sulfito de sódio, 0,6 g de N-(p-hidroxifenil)glicina e 15,32 g de ácido cítrico em 1000 ml de água.

1.3. Método para a medição da auto-nucleação

Levaram-se os reagentes a 20QC colocando-os em banho-maria com termostato a 20QC. Misturou-se 1 ml de solução A e 1 ml de solução B num cadinho de plástico e colocaram-se num espectrofotometro a uma temperatura de 20QC controla da por termostato. Controlou-se o aumento na densidade óptica a 500 nm e registou-se continuamente.

1.4. Inspecçao visual da auto-nucleação

Efectuou-se um ensaio de controlo visual para a nucleação da prata por mistura de 1 ml de solução A e 1 ml de solução B num tubo de ensaio de polistireno transparente. Registou-se a altura em que se verificou a primeira turbidez. Este ensaio pode ser feito à luz e ao abrigo da luz.

Resultados

1. Medição da auto-nucleação

Efectuou-se o ensaio para a medição da auto-nucleação utilizando o ensaio descrito em 1.3 utilizando o reveladores físicos protegidos I e II descritos em 1.1. e 1.2. Este ensaio mostra o tempo de auto-nucleação na ausência de luz Os resultados apresentam-se nos quadros 1 e 2. Como se pode ver não existe qualquer diferença na auto-nucleação ao abrigo da luz, utilizando os reveladores físicos protegidos I e II:

Quadro 1 : Auto-nucleação no escuro para o revelador físico I

Tempo (minutos)	Densidade óptica a 500 nm
0	0.000
2	0.000
4	0.001
6	0.001
8	0.001
10	0.000
12	0.000
14	0.000
16	0.000
18	0.000
20	0.000

XSSSSWísap

Quadro 2 : Auto-nucleação no escuro para o revelador físico II

Tempo (minutos)	Densidade óptica a 500 nm
0	0.000
2	o. 000
4	0.000
6	0.000
8	0.000
10	0.000
12	0.000
14	0.000
16	0.000
18	0.000
20	0.000

2, Inspecção visual de auto-nucleação

Efectuou-se o ensaio para controlo visual da auto-nucleação utilizando o ensaio descrito em 1.4 utilizando os reveladores físicos protegidos I e II descritos em 1.1. e 1.2.. Os resultados deste ensaio apresentam-se no Quadro

3.

Quadro 3

	Revelador físico I	Revelador físico II
lâ Auto-nucleação em luz total	6 minutos	27 minutos
15 Auto-nucleação no escuro	120 minutos	120 minutos

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lâ Processo para a preparação de um revela dor físico caracterizado pelo facto de se incorporar uma solução aquosa de iões de prata, um agente dessensibilizador e um agente reduror de forma a obter-se uma concentração de iões de prata de cerca de 0,001 mol/1 a 0,1 mol/1.

- 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente dessensibilizador ser sulfonato de 6-etoxi-l-metil-2-(3-nitrostiril)quinolinio-metilo.

- 3§ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se incorporar um excesso molar de um complexante relativamente aos iões de prata.

- 4ã Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o complexante ser histidina, imidazol, ben zimidazol, pirazol, piridina, aminopiridina, nicotinamida, quinolina ou purina.

- 5ã Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente redutor ser 1,2-di-hidroxi-benzeno, 1,4-di-hidroxi-benzeno, sulfato de 4-metil-amino-fenol, 4-amino-fenol, 1,4-di-amino-benzeno, 1,2-di-amino-benzeno, N-(4-hidroxi-fenil)-glicina, 2,4-di-amino-fenol, l-fenil-3-hidroxi-pirazol ou uma sua mistura.

- 6§ Processo de acordo com a reivindicação

1, caracterizado por se misturar

a) uma solução aquosa constituída por um agente redutor e opcionalmente um sistema tampão e um ou mais adjuvantes; e

b) uma solução aquosa constituída por iões de prata, um agente dessensibilizador, um excesso molar de complexante relativa mente aos iões de prata e opcionalmente um sistema tampão e um ou mais adjuvantes.

-7aMétodo para determinar quantidade e/ou qualitativamente um ou mais componentes de um agregado formado entre pelo menos um agente de ligação específico e a sua substância ligãvel correspondente constituído pela marcação de pelo menos um componente do referido agregado com um marcador e se fazer contactar o referido agregado com um revelador físico pelo que, sob a influência do marcador, se forma uma partícula me tãlica a qual pode ser qualitativa ou quantitativamente ser determinada, caracterizado por o revelador físico utilizado ser um revelador físico preparado de acordo com as reivindicações anteriores.

Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por o marcador utilizado ser um metal, um composto metálico ou um polímero opcionalmente revestido ou impregnado com metais ou compostos metálicos.

Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os marcadores utilizados serem partículas de paládio, platina, tálio, prata ou ouro coloidais; iões de paládio, platina, tãlio, prata ou ouro quelatados ou produtos de po limerização de derivados de benzidina opcionalmente impregnados com metais ou compostos metálicos.

A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente britânico apresentado em 14 de Março de 1990, sob o NQ. 90.05.753.0.

Lisboa, 13 de Março de 1991

RESUMO