ES2228234B1 - Metodo para la autoejecucion del grupo sanguineo abo. - Google Patents

Abstract

Consiste en un inmunoensayo de autoejecución para la realización del grupo sanguíneo ABO de forma que la misma reacción produzca las letras del grupo. Se basa en la detección de las aglutininas y/o las sustancias de los grupos por medio de una reacción de inmunocromatografía o inmunoanálisis en tarjeta de tipo inmunogold u otras. En la región de contacto con la muestra, la membrana contiene anti-Ig humana o anticuerpos anti-sustancias de los grupos formando un complejo antígeno-anticuerpo-oro, coloidal. En la fase sólida de la membrana se inmovilizarán sustancias o anticuerpos anti-sustancias en forma de las correspondientes letras. La muestra moviliza el complejo anticuerpos-coloide y es capturado en la fase sólida visualizándose en forma de letra. Se proponen varias alternativas como la detección de aglutininas y la detección conjunta de las sustancias y aglutininas.

Description

Método para la autoejecución del grupo sanguíneo ABO.

Esta invención se refiere a métodos y dispositivos para la detección de determinantes antigénicos y anticuerpos de los grupos ABO por medio de inmunoensayos en tarjeta, de manera que la misma reacción deja un registro impreso del grupo, por tanto, la tarjeta donde se realiza es el documento del grupo y de la prueba. De esta manera se suprime la etapa intermedia y el error de transcripción de la realización a la anotación.

Es un test de autoejecución, no requiere aparatos ni instrumental, no necesita preparación ni entrenamiento y puede realizarlo cualquier persona, incluso el mismo interesado. Puede ser útil para consultorios médicos, bancos de sangre, salas de urgencias, operaciones militares y áreas subdesarrolladas.

Antecedentes de la invención

Entre 1976 y 1978 se registraron 22 muertes por reacción transfusional hemolítica atribuida a incompatibilidad "ABO". Los errores más frecuentes están en relación con el entorno del hospital. Son errores en la identificación del paciente, en su ubicación, en la identificación de la muestra y en el cambio de la unidad a transfundir. En cambio son más infrecuentes los errores en la identificación de la unidad de sangre.

Se evidencia por tanto la necesidad de un método que evite el error en la interpretación del grupo, que permita confirmar un potencial receptor del grupo ABO a la cabecera del enfermo antes de transfundir, que sea fiable, rápido, seguro, simple, barato, sin necesidad de aparatos, con medios simples, sin necesidad de someter las muestras a un pretratamiento y con resultados estabilizados para permitir la lectura retardada.

Los determinantes antigénicos de los grupos sanguíneos presentes en los hematíes, son glicoproteínas o glicolípidos. Los principales sistemas son ABO, D(Rh), Lewis, Kidd, Kell, etc.

El suero de la mayoría de las personas contiene anticuerpos, llamadas también aglutinínas, en el caso del grupo ABO, que reaccionan con antígenos de un grupo distinto del suyo. Así las personas del grupo O que presentan el antígeno H, tienen anticuerpos anti-A y anti-B; los individuos del tipo de sangre A tienen anti-B en su suero, etc.

Las sustancias de los grupos sanguíneos se diferencian en los residuos de azucares añadidos a una cadena común que a su vez dependen de unas enzimas glicosiltransferasas o enzimas A, B y H. Los antígenos H se construyen sobre extremos de cadenas de oligasacáridos precursores llamados Tipo 1 y Tipo 2. El gen H produce una fucosiltransferasa que añade fucosa a la Gal terminal de las cadenas tipo 2 mediante un enlace alfa (1-2). Los genes A y B producen enzimas glicosiltransferasas que añaden azúcares a las cadenas de oligosacáridos del antígenos H. La N-acetilgalactosaminotransferasa codificada por el gen A y la galactosaminotransferasa especificada por el gen B añaden GaINAc y Gal respectivamente al mismo residuo de Gal sobre el que actuó la transferasa del gen H mediante un enlace alfa (1-3).

La determinación del grupo ABO por métodos convencionales comprende ensayos de aglutinación y lisis de células. La aglutinación se produce al añadir los anticuerpos de los grupos, anti-A o anti-B, a los hematíes de la muestra, que es el método directo; o añadiendo suero o plasma ce la muestra a hematíes conocidos: método inverso. Se puede reforzar la aglutinación por centrifugación suave, añadiendo albúmina bovina, polivinilpirrolidona, etc. Además los anticuerpos de tipo IgM son lo suficientemente grandes para vencer las fuerzas repulsivas de los hematíes y extenderse entre los mismos.

Estas aglutinaciones se pueden producir en tubos, placas de vidrio, tarjetas con superficies impermeables, etc. Existen también métodos en tarjeta, donde el suero con los anticuerpos se seca sobre nitrocelulosa plastificada impermeable al agua y se reconstituye el suero con agua destilada.

La lisis se produce agregando el anticuerpo y complemento a la muestra de sangre. El complemento fijado en la membrana da lugar a la ruptura da la membrana celular.

La evaluación de estos ensayos requiere el juicio subjetivo de personal experimentado para distinguir la aglutinación de agregaciones inespecíficas que causan formación de racimos. Por tanto es necesario una interpretación, lectura y registro final de los resultados.

En 1977 Horrisberger y Rosset (J. Histochem., Cytochem., 25:295-305, 1977) describen un inmunoensayo en el que usa partículas oro como marcador. Posteriormente Leuvering, Janssen, Valkiers y otros autores han ido perfeccionando estos métodos hasta llegar a los actuales inmunoensayos de flujo lateral en tarjeta.

Fundamento

Estos inmunoensayos se basan en la interacción entre reactivos y sustancias específicas con afinidad inmunológica, como por ejemplo AG/AC, biotina/avídina, etc. La sustancia diana de la muestra se une a un receptor específico que puede ser un antígeno o un anticuerpo formándose un complejo antígeno-anticuerpo, que a su vez se une a otro reactivo, aprovechando la bivalencía de las moléculas IgG que le permite reaccionar por un sitio de unión con el antígeno en solución y por otro con el antígeno fijado en la membrana o sustrato poroso.

Para la visualización del punto final se debe producir una señal visible, para ello el reactivo detector está conjugado con un trazador, generalmente oro coloidad, bien directamente o por medio de la proteína A que tiene la ventaja de establecer una unión firme con la inmunoglobulina IgG. Este reactivo receptor se absorbe en forma redisolvible en la membrana en el campo de reacción o zona próxima a la ventana de la muestra. Alternativamente se puede añadir a la reacción. El complejo antígeno-anticuerpo emigra a la fase sólida o zona de la membrana destinada a visualizar el resultado donde está inmovilizado otro anticuerpo, dirigido a un epítope diferente, que captura el complejo.

Cuando la sustancia diana es un antígeno se suele usar dos tipos de anticuerpos: a) un anticuerpo monoclonal o policlonal purificado por afinidad, conjugado con el trazador, que se encuentra redisolvible en el campo de reacción o fase líquida. También se puede disponer recubriendo bolas de material inerte o añadido a la reacción; b) el otro anticuerpo preferentemente monoclonal, dirigido a un epítope diferente, inmovilizado en otra zona o fase sólida, va a capturar y precipitar el anterior complejo antígeno/anticuerpo.

Cuando la diana es un anticuerpo se sensibiliza con oro coloidal un anticuerpo capaz de reconocer la inmunoglobulina. El complejo es capturado en la zona visible reactiva por un reactivo que suele ser el antígeno.

En este ensayo llamado de tipo sándwich se pueden invertir los papeles entre antígeno y anticuerpo, de manera que para detectar un anticuerpo se puede inmovilizar un antígeno. Se puede también detectar un anticuerpo utilizando un anticuerpo anti-humano conjugado con otro coloidal a través de la Proteína A como reactivo indicador.

Existe también el ensayo competitivo, en la cual se inmoviliza en la membrana un reactivo con una afinidad comparable por el anticuerpo inmovilizado en la membrana. La sustancia de la muestra y el antígeno auxiliar conjugado compiten por los sitios de unión al anticuerpo. Si no hay antígeno en la muestra el antígeno marcado se agrega en la reacción; en este caso la presencia de color significa resultado negativo. Si hay antígeno no se desarrolla color porque ya tiene ocupados los sitios por el antígeno de la muestra. La señal es inversamente proporcional a la cantidad de antígeno. Se usan para detectar la presencia de una sustancia por unión a dos receptores.

Opcionalmente se puede aumentar el color de la reacción con soluciones intensificadoras como una mezcla a partes iguales de una solución de hidroquinona y nitrato de plata. Se añade a la etapa foral unos 20 \muL de esta mezcla. La reacción se para lavando con agua destilada. Existen además otros inmunoensayos que refuerzan la reacción por medio la unión a enzimas o sustancias corno la biotina que se unirá firmemente con la estreptavidina. Además la estreptavidina puede acoplarse a partículas de látex. También se puede utilizar partículas de látex coloreado. Estos inmunoensayos pueden contener además un segundo o tercer complejo sin relación con el anterior. Además la primera y segunda zona pueden separarse longitudinalmente a lo largo de la membrana.

El dispositivo contiene diversos componentes como son: un estuche rígido para albergar el conjunto con aperturas o ventanas para ver el resultado de la reacción y para añadir la muestra y reactivos; un soporte sólido que consiste en una membrana alargada o tira inmunocromatográfica de material adecuado, dispuesta sobre un soporte rígido; almohadillas de material absorbente en el extremo final para drenar la muestra líquida y reactivos; y un filtro para separar los hematíes de la sangre y otros componentes. La zona reactiva y la zona de detección de la membrana se comunican por capilaridad.

Cuando se depositan unas gotas de la muestra fluida, en la zona de detección se disuelve el receptor específico uniéndose con la anticuerpo o el antígeno. Si la muestra no fluye bien se añaden además unas gotas de buffer adecuado. El complejo con el marcador difunde pasivamente, por emigración lateral por la membrana siendo capturado y precipitado en la zona de captura, produciéndose una señal.

El resto del complejo de anticuerpos conjugados avanza hasta el extremo final destinado al control de la reacción donde se encuentra inmovilizado un anticuerpo adecuado. De esta forma se puede controlar la reacción inmovilizando en una determinada zona de la membrana, reactivos que se unirán al agente conjugado con independencia de la presencia o no de la sustancia a detectar. Estos reactivos pueden ser por ejemplo Ig humanas o Proteína A.

Sumario

La invención consiste en un inmunoensayo de autoejecución para realización del grupo sanguíneo ABO, de forma que la misma reacción produzca las letras del grupo. Al eliminar la intervención exterior se descarta el factor humano. Se basa en la detección de las sustancias que identifican el grupo y sus anticuerpos por medio de una reacción inmunocromatográfica en tarjeta de tipo "lateral flow" utilizando un marcador como el oro coloidal.

Descripción

La presente invención incorpora el conocido inmunoensayo en tarjeta de tipo "lateral flow" para detectar sustancias o anticuerpos en muestras líquidas, adaptándolo a la determinación del grupo ABO con el fin de evitar el error derivado de la intervención del factor humano, además de permitir un diagnostico directo, rápido y sencillo. Con este método al hacer la determinación queda impreso el grupo en la tarjeta porque la misma reacción produce o "escribe" las letras del grupo.

El ensayo se basa en la detección de las aglutininas o sustancias del grupo ABO por medio de la citada reacción de inmunocromatografía con un marcador como el oro coloidal. El resultado final producirá una o varias líneas o bandas conformando la letra o letras del grupo. La detección de las aglutininas o las sustancias de los grupos se basa en su unión a un receptor específico, formándose un complejo antígeno-anticuerpo. En la fase sólida o zona de la membrana destinada a visualizar el resultado, se inmovilizan como reactivos de captura los antígenos o sustancias de los grupos y sus anticuerpos en forma de gráficos específicos para dibujar la correspondiente letra.

Con este procedimiento se puede expresar también el grupo ABO produciendo con la reacción un signo + o - (más o menos), con letras preimpresas en las tarjetas.

La técnica preferida se refiere a un inmunoensayo con oro coloidal, aunque pueden servir otros marcadores. La detección de las sustancias del grupo incluye las sustancias que lo identifican que pueden ser también las enzimas A, B y H. La invención no se restringe a los materiales y procedimientos descritos, pudiéndose introducir modificaciones o variaciones en el procedimiento y reactivos para alcanzar el objetivo de la misma.

Detección de anticuerpos

Para la detección de aglutininas se prefiere ensayos no competitivos de tipo sándwich. Se utiliza como reactivo receptor o reactivo de unión, anticuerpos de tipo anti-Ig humana conjugados con proteína A marcada con oro coloidal o unidos directamente al marcador.

Estos reactivos se incorporan al campo de reacción en contacto con la muestra. En la zona de captura se inmovilizan sustancias de los grupos incluidos sus derivados, extractos, membranas de hematíes en polvo o incluso hematíes. Estas sustancias se fijan en diversos gráficos como se indicará más adelante.

Las membranas de hematíes se pueden obtener a partir de muestras de sangre a la que se le retira el plasma, se recogen los hematíes por centrifugación y a un volumen de eritrocitos se agregan nueve volúmenes de digitonina al 0.1% en suero salino. Las membranas resultantes se recogen y lavan por centrifugación hasta que se obtiene un grano blanco.

Detección de sustancias

Se prefiere también ensayos no competitivos de tipo sándwich. El objetivo de la detección de las sustancias de los grupos no es aislar estas sustancias sino liberarlas de la pared de los hematíes ya que como estos inmunoensayos son de una gran sensibilidad, se pueden detectar pequeñas cantidades para liberarlas se puede utilizar cualquier sustancia hemolizante. Además el 80% de las personas presentan sustancias en plasma.

Para liberar las sustancias se depositan en la cámara de muestra 100-300 \muL de la muestra (2-6 gotas) a la cámara de la muestra a testar y se le añaden una o dos gotas de agua desionizada. También se puede utilizar disolventes adecuados como diluciones acuosas de sustancias inertes de tipo DMSO o dioxane.

Se utilizará como reactivo receptor o reactivo de unión a las sustancias, anticuerpos mono policlonales, con específicidades anti-A, anti-B. Estos anticuerpos se conjugan con la proteína A marcada con oro coloidal o se pueden conjugar directamente con el marcador. Estos anticuerpos se incorporan al campo de reacción absorbidos en la membrana. Alternativamente se pueden introducir adheridas a bolas de material inerte o se añaden liofilizados y en matriz proteica a la reacción.

La captura del complejo anticuerpos/sustancias se realiza en la fase sólida en la zona de visualización del resultado, por medio de anticuerpos específicos monoclonales o policlonales purificados anti-A o anti-B inmovilizados en la forma deseada.

Como se indicó son admisibles otras combinaciones de reactivos de detección o de captura, así como modificaciones o variaciones a los procesos descritos fácilmente entendibles por un experto en estas técnicas.

Componentes del dispositivo

El dispositivo contiene: un estuche rígido para albergar el conjunto con aperturas o ventanas para añadir la muestra y reactivos y para ver el resultado de la reacción; un soporte sólido que consiste en una membrana alargada o tira inmunocromatográfica de material adecuado dispuesta sobre un soporte rígido; almohadillas de material absorbente en el extremo final para drenar la muestra líquida y reactivos y un filtro para separar los hematíes de la sangre y otros componentes.

Como se indicó el área donde se aplica la muestra está recubierta por el anticuerpo o antígeno conjugados con un marcador como el oro coloidal, con afinidad por la sustancia a testar. El área de captura tiene inmovilizado un anticuerpo para precipitar el complejo. La zona reactiva y la zona de detección de la membrana se comunican por capilaridad.

En el dispositivo (figura 1) están distribuidos de forma secuencial una (o dos, una en cada extremo) cámaras de reacción donde se añade la muestra y el campo de detección donde se visualiza la reacción que estará formado por zonas o ventanas, en sentido horizontal, unas a continuación de otras divididas o no per tabiques. Entre la cámara para la muestra y las ventanas se colocará, un filtro para impedir el paso de los hematíes, de 0.25 \mum por ejemplo. Pueden sustituirse las dos cámaras de muestra por una sola pero con membranas diferentes, como si fueran dos o más tarjetas en una.

Estuche o envase exterior

El dispositivo se aloja en un contenedor adecuado que debe ser cómodo, de fácil manejo y seguro para proteger los materiales y reactivos de la fase sólida y evitar el vertido al ser usado. Debe ser de material inerte como cualquier variedad de plástico que pueda ser moldeado. Existen disponibles en el mercado gran variedad polietileno, polipropileno, poliacrilato, poliestireno y similares.

Cualquier diseño es apropiado siempre que se puedan integrar y alinear adecuadamente los componentes. Las dimensiones no son críticas debiendo permitir el ensamblaje de los componentes y dejar aperturas para la muestra y la visualización. Puede tener una longitud aproximadamente de 2-5 cm.

Soporte sólido o membrana

Consiste en un material adecuado para inmunocromatografia o inmunoanálisis en tarjeta como membranas o láminas de materiales inertes con afinidad adecuada y porosidad superficial suficiente para permitir la difusión pasiva en sentido lateral de los reactivos de la prueba. Se utiliza una membrana de material poroso en forma de tiras alargadas planas, delgadas, de color blanco opaco. El sustrato sólido preferido es un polímero de poliestireno o también un éster microporoso de celulosa especialmente éster nitrocelulosa de los que existen varios en el mercado. Se podrían utilizar también otros materiales microporosos y fibrosos como polímeros de hidratos de carbono naturales de gelatina, agar, agarosa, gomas, dextrano, almidones; polímeros sintéticos de nitrocelulosa, polietileno, polivinilo, poliésteres, poliamidas, poliaerilamidas, polimetacrilatos, geles hidratados, etc.

Existen múltiples membranas disponibles comercialmente. Se ofrecen también con la superficie tratada, aptas para uniones biológicas como antígeno/anticuerpo. También se pueden preparar con un tratamiento a base de sustancias con grupos carboxilo y amino. Los materiales más usados, como el nitrato de celulosa, contienen cargas negativas en la superficie debido a los grupos nitrito, con lo que se consigue una unión más específica. El tamaño de los poros es importante para la adecuada interacción entre las moléculas reactivas. Se ofrecen en varios tamaños. La selección del tamaño del poro no es critica, pudiendo variar ampliamente en un rango por ejemplo entre 2 y 10 nm. Estas membranas deben tener una capilaridad adecuada para soluciones acuosas, que a su vez depende del espesor. Cuanto mayor sea el espesor mayor es la disponibilidad del reactivo detector y de captura por tanto hay más sensibilidad pero un espesor excesivo enlentece el flujo. El espesor de la tira va a afectar a la cantidad de solución de anticuerpo que se necesita aplicar al sustrato. Puede ser de 0,5 a 1,0 mm.

En el extremo de la tira se puede colocar una banda de acetato de celulosa, algodón u otro material para que se empape con el líquido sobrante de la reacción. La membrana se corta en tiras y se montan en un soporte plástico utilizando un adhesivo adecuado. Como se indicó las dimensiones pueden modificarse dependiendo del diseño del dispositivo.

El área expuesta se puede delimitar con material plástico hidrófobo o similar colocado y sellado con la membrana. Su extensión puede ser de unos 150 mm2 (4x4 mm), pero son aceptables otras medidas. Inmovilización de los reactivos en la membrana.

Se realiza por unión covalente o absorción, recubriendo la membrana o impregnándola. La unión covalente se realiza por medio de sustancias como el glutaraldehido. Pero es preferible usar máquinas impresoras que rocían directamente la membrana. Existen máquinas disponibles de este tipo que contienen diferentes anchuras de chorro para imprimir varias líneas. Para prevenir la unión no especifica de los lugares antigénicos no ocupados se utiliza una proteína inerte o inmunológicamente no reactiva con otros componentes del ensayo como la albúmina y la caseína. Este tratamiento de bloqueo se realiza después de inmovilizar el reactivo de captura y ensamblar el dispositivo. También se facilita la incorporación de reactivos, con el recubrimiento de la superficie con azucares para cual en la zona de detección se resolubiliza el reactivo indicador que impregna el espesor del material poroso. La movilidad del reactivo se facilita tratando la región en que se aplica el reactivo con una solución acuosa de azúcar o de celulosa. Se prefiere la sucrosa pero pueden ser otros como la glucosa, lactosa o trehalosa. También se encuentran en el mercado membranas pretratadas.

El formato de estos dispositivos es bien conocido en el sector. Los expertos en este campo conocen que se pueden modificar varios componentes como la porosidad, espesor o tipo de material, etc.

Reactivo buffer

Se utiliza un buffer para diluir la muestra para resolubilizar el reactivo conjugado desecado así como cara el transporte y lavado de reactivos. La resolubilización requiere un buffer fisiológico salino. Además debe llevar albúmina o gelatina para el bloqueo y lavado. Para. reducir la tinción de fondo y las uniones inespecíficas se utilizan surfactactes, dispersantes y detergentes, así como un pH neutro y una sal iónica. También debe contener un estabilizador de pH, un presenvante y un quelante del calcio. El pH puede estar entre 7-10. Son aceptables detergentes no iónicos a una concentración de 0.01-0.50% (p/v). Se prefieren sales de CLNa a concentraciones de 0-300 mM, preferible 50-200 mM. Como dispersantes se utilizan polímeros de alto peso molecular. Se prefiere la polivinil pirrolidona (PVP)-40 a concentración de 1.4%. Como quelante del calcio se prefiere el ácido etilendiaminotetraacítico (EDTA) a una concentración de 5-100 mM, preferiblemente 10-50 y mas 20 mM. Como estabilizador del pH se usa trizma idrocloridrico a concentración de 20-30 mM.

Se puede utilizar un buffer convencional de fosfato, MES, BIS-TRIS, CLH-TRIS, buffer citrato, buffer borato con concentraciones de 5-100 mM, preferiblemente de 5-30 mM. Se prefiere un buffer de fosfato sódico monobásico y dibásico.

Reactivo indicador

El reactivo indicador preferido es el oro coloidal. Existen en el mercado soluciones de oro coloidal. Además la preparación de la partículas de oro coloidal es bien conocida (puede verse en Frens, Nature 241, 20-1973). Se consigue de varias maneras y a través de la reducción del ácido tetraáurico al reaccionar el cloruro de oro con citrato sódico en agua produciéndose partículas de diversos tamaños. Se prefieren partículas de 15-20 nm. Estas partículas se conjugan o recubren con moléculas de anticuerpos o antígenos bien directamente o a un reactivo de unión intermedio como la proteína A o proteína G. La absorción a estas sustancias se consigue adecuando controlando las concentraciones, fuerza iónica y pH de la mezcla. Después se realiza una centrifugación diferencial o filtración para controlar el tamaño de las partículas. El método es bien conocido en el sector.

Para preparar el coloide se deben tratar las superficies de vidrio con una solución al 2% de dimetilclorosilane en cloroformo durante 30 min. Después lavar en etanol absoluto y agua destilada. Preparar 1 litro de una solución al 1% de cloruro de oro en agua. Calentar a 100º, 10 min. Añadir ácido tánico hasta el 1% y 50 ml de citrato trisódico. Hervir durante 5-10 minutos. Enfriar lentamente. Se forma un coloide de oro con partículas dispersas homogéneamente de tamaño entre 10-15 mm. Centrifugar la solución a 20.000 g durante 30 min y resuspender en buffer tris pH 8.2. Añadir seroalbumina bovina al 1% y azida sódica al 0.05%. Centrifugar dos veces y resuspender en el mismo buffer hasta alcanzar una densidad óptica final de 1.5 a 540 nm.

Para su conjugación a Proteína A (puede verse en Horisberger, 1979, Leuvering y otros), se ajusta la solución a un pH de 6.5 con CO3K2, 0.1 M. Se prepara una dilución de 1 mg/ml de proteína A en CLNa 0.005 M. A cada litro de oro coloidal se añade PEG 20.000 hasta 1%. Centrifugar en un gradiente de glicerol al 5% durante 45 minutos a 30.000 g. Descartar el sobrenadante y repetir. Resuspender en un ratio de 1/10 de la dilución inicial. Filtrar en membrana de 0.45 \mum. Ajustar a una concentración final DO de 1 con longitud de onda 540 nm con buffer fosfato con seroaloumina bovina al 1% y azida sódica al 0.05%.

Para su unión con anticuerpos se añade a un litro de oro coloidal a pH de 6, un gramo de seroalbumina bovina prediluida en 10 ml de agua destilada. Agitar 2 horas. Filtrar en membrana de 0.2 \mum. Centrifugar 45 minutos a 4º a 35.000 g. Descartar el sobrenadante. Repetir dos veces con agua destilada. Ajustar la concentración a una densidad óptica de 1 con una longitud de onda de 540 nm. Añadir a cada 100 ml glutaraldehido hasta el 1%. Mezclar 2 horas. Incubar toda la noche a 2º-5º con buffer de fosfato, pH 7.4 conteniendo 1 mg de anticuerpos policlonales purificados. Estabilizar los enlaces covalentes con 1 mg de borohidrado de sodio. Después de incubar 30 minutos en agitación. se añade solución de buffer con seroalbumina bovina-glicina a pH 8 y la mezcla se centrífuga a 5.000 g durante 45 min. Continuar con dos lavados con PBS 0.1 M a pH 8. Resuspender el precipitado final en PBS conteniendo 0.05 M trietanoiamina, con 0.2% de seroalbumina bovina y 0.1% de azida sódica ajustando a una DO de 5 con longitud de onda de 540 nm. Guardar a 2-4º.

Antígenos

Los antígenos polipeptídicos y polisacáridos de estos grupos pueden sintetizarse químicamente duplicando los determinantes antigénicos característicos. Para este inmunoensayo se utilizarán sustancias de los grupos naturales o sintéticas asequibles comercialmente. Igualmente se pueden utilizar extractos de sustancias de los grupos también asequibles en el mercado. Por otra parte se pueden aislar extractos de estas sustancias de las membranas de los hematíes.

Las sustancias se diluyen en tampón fosfato, borato o carbonatobicarbonato a pH 8-9, a una concentración de 10 \mug/\mul. Estas sustancias se depositan en el campo de reacción en la ventana de la muestra. Para fijarlas en la membrana se puede revestir el soporte con seroalbunina bovina coNcloruro crómico u otros fijadores como fibrinogeno, polilisina, fitohemaglutinina, concanavalina A, anticuerpos, etc. Alternativamente se pueden añadir a la reacción en forma de viales. Un método sencillo es incubar durante toda la noche a temperatura ambiente y lavar con PBS-Tween 20. Son necesarios unos 40 \muL de la solución de sustancias para cubrir el campo de reacción. También se puede incorporar por medio conocidos de dispositivos de impresión.

Anticuerpos

Se utilizan anticuerpos anti-A, anti-B, anti-AB, de tipo IgG, IgM o ambos; pueden ser monoclonales o policlonales purificados y con especificidad para los determinantes de los grupos sanguíneos de manera que no reaccionen con otras sustancias o antígenos de otros grupos presentes en los hematíes. Estos anticuerpos se encuentran disponibles en el mercado. Además se pueden producir por técnicas de cultivos celulares y se purificar por afinidad empleando los correspondientes antígenos A, B y D. Existen metodologías disponibles para la purificación de los anticuerpos y para la producción de hibridomas.

Se pueden diluir en diversos medios. Se prefieren tampones fosfatos o tampón de borato sódico 0.05 M a Ph 8. Las concentraciones de los anticuerpos pueden variar entre 100 y 150 \mug por ml de solución. Usar preferiblemente 120 \mug/ml. Se aplican al soporte poroso por contacto directo con tubos capilares, bolígrafos especiales, pipetas o jeringas automáticas o con pulverizadores propulsando gases o líquidos con un propulsor miniaturizado según procesos conocidos en litografía y microelectrónica. También se pueden usar plantillas o tiras impregnadas con el anticuerpo. Para depositar un anticuerpo en una línea de unos 10 mm y 0.5 de anchura se pueden necesitar unos 20 mu de anticuerpo monoclonal de ratón.

Procedimiento

La muestra se deposita a través de la apertura o reservorio destinada a tal efecto. Se utilizarán la menor cantidad de sangre posible, unas dos o tres gotas (180 \muL). Para resolubilizar el reactivo indicador desecado se añade buffer. Son necesarias unas 10-15 gotas de buffer. Para incorporar el buffer se puede poner en el reservorio una marca que equivale a una determinada cantidad determinada de buffer, pero es preferible añadirlo con una pipeta estéril. Al añadir las gotas al reservorio contactan con el anticuerpo redisolvible. La muestra libre de hematíes fluye lateralmente a través de la almohadilla absorbente contactando el antígeno libre se une con el anticuerpo mientras los componentes no esenciales difunden a la almohadilla absorbente situada debajo.

Descripción de los dibujos

Figura 1: tarjeta estándar con los compartimentos citados: una o dos cámaras de muestra y zonas o ventanas para visualizar la reacción separadas o no por tabiques.

Figura 2: esquemas de la inmovilización de las sustancias antigénicas para el grupo O. Los reactivos están inmovilizados en las ventanas y se presentan en trazos débiles, que por supuesto no se ven.

Figura 3: esquema que presenta la disposición de las sustancias B y A para identificar los grupos A, B por la detección de aglutininas con las letras superpuestas formando un gráfico ilegible en la parte izquierda; y separadas a la derecha. La letra B redondea los ángulos formados con la línea lateral derecha de la A.

Figura 4: esquema que presenta la disposición de las sustancias B y A para identificar los grupo O por el método de detección de aglutininas y el resultado esperado: un semicírculo un una de las letras.

Figura 5: esquema que presenta la disposición de las sustancias B y A para identificar el grujo O por el método de detección de aglutininas con los resultados esperados: un gráfico ilegible y un círculo.

Figura 6: esquema del dispositivo con tres ventanas mostrando la disposición de los anticuerpos para la opción de la detección de las sustancias de los grupos A, B, AB y de aglutininas para el grupo O.

Formas de realización

Como ya se indicó, con este dispositivo se identifican las sustancias que definen el grupo ABO por medio de la detección de los antígenos del grupo o de sus anticuerpos o aglutininas, de manera que la reacción revele el grupo. Se propone una forma de realización basada preferentemente en la detección de las sustancias del grupo y otra basada en la detección de los anticuerpos. Como se indicó, es posible también identificar este grupo detectando las enzimas del grupo: enzimas A, B y E, utilizando anticuerpos anticuerpos anti-enzimas. En este caso la solución es igual que la propuesta para la detección de las sustancias o antígenos del grupo.

Detección de las aglutininas del grupo ABO

La reacción producirá las correspondientes letras en presencia de las aglutininas del grupo. Este procedimiento tiene el inconveniente de que el grupo AB quedaría en blanco y el grupo O aparecerá como un AB.

Para evitar esto se propone disponer de una tarjeta con dos ventanas, una continuación de la otra en sentido lateral. Se propone dejar también en el estuche o soporte rígido una hendidura entre las dos ventanas para poder partir la tarjeta y desechar una parte. Opcionalmente se pueden utilizar dos tarjetas con membranas separadas.

Como se comentó, se utiliza como reactivo detector anti-Ig humana conjugada con oro coloidal que se incorpora redisolvible a la zona contigua a la cámara de muestra. Para identificar el grupo O se emplean sustancias A y B como reactivos de captura que se inmovilizan en gráficos complementarios para dibujar una parte de una O con cada una de ellas. Estos gráficos pueden ser en forma de línea; alternas, cuadrantes alternos o semicírculos en sentido vertical u horizontal, de forma que la positividad por separado de uno sólo de ellos, producirá un gráfico ilegible. Se prefieren semicírculos en sentido horizontal (Figura 4/Figura 5).

Para producir el grupo A se fija en la ventana contigua, sustancia B en forma de letra A preferiblemente con la parte superior redondeada (Figura 3).

Para producir el grupo B se fija o inmoviliza sustancia A en forma de letra B sobre la letra A de manera que las tres líneas transversales vayan paralelas a diferentes alturas a la línea transversal de la A (Figura 3) las líneas laterales van también paralelas a las de la A. Se prefiere redondear ligeramente el ángulo recto formado por las líneas transversales y la línea lateral derecha (Figura 5).

Como es indicó estos reactivos se inmovilizan en la membrana por medio de máquinas impresoras que rocían directamente la membrana. Existen maquinas disponibles de este tipo que contienen diferentes anchuras de chorro para imprimir varias líneas.

El resultado de la superposición de estas dos letras producirá un gráfico ilegible. Para evitar la interpretación o la intervención del factor humano, objetivos de la presente invención, puede ser válido cualquier otro diseño.

Resultados esperados

El grupo O aparecerá como un círculo o redondel y una figura contigua ilegible (Figura 5). En este caso se puede separar la tarjeta por la hendidura y desechar la ventana con el gráfico ilegible. Los grupos A y B aparecerán con la correspondiente letra y con un semicírculo o arco contiguo.(Figura 4). Aunque estos dos grupos presenten un semicírculo no puede haber confusión y en todo caso el gráfico ilegible se puede tomar como un control más. Opcionalmente se puede también partir la tarjeta y desechar esta parte.

El grupo AB se obtiene por exclusión. Alternativamente se puede realizar en tarjeta aparte por el método de la determinación de sustancias que se cita a continuación. Hay que tener en cuenta la frecuencia de este grupo suele ser inferior al 5%.

Detección de las sustancias y aglutininas del grupo ABO

Con este método el grupo O, al no tener sustancia A ni B aparecerá en blanco, por lo que se propone disponer de una tarjeta o dispositivo con ventanas o zonas de visualización sucesivas, unas a continuación de otras, destinadas a las letras A, B y O. Se propone también introducir en el estuche o soporte rígido una franja más débil entre la ventana para la letra B y el O, con el fin de poder partir la tarjeta y desechar una de las partes. Opcionalmente se pueden utilizar tarjetas con membranas separadas destinándose una para los grupos A, B y AB, y otra para el grupo O. Lógicamente el orden entre el último grupo y los anteriores se puede invertir.

Los reactivos receptores se incorporan a la membrana absorbidos en forma redisolvible, en la zona contigua a la cámara de la muestra. Se utilizan anticuerpos preferentemente monoclonales anti-A y anti-B conjugados directamente con oro coloidal o a través de la proteína A. Se aplican por medio de pipetas o pulverizadores automáticos según se indicó anteriormente. Opcionalmente se pueden añadir liofilizados en viales o ampollas.

En las zonas o ventanas de captura para visualizar el resultado, se inmovilizarán anticuerpos monoclonales o policlonales purificados, anti-A y anti-B, en forma de la correspondiente letra. Se incorporan a la membrana por medio máquinas impresoras como se comentó. Ambas ventanas deben estar contiguas una a continuación de otra. Con esta parte se identifican y expresan los grupos A, B y AB.

El grupo O se realiza por medio de la detección de aglutininas, en la última ventana o en tarjeta aparte como se indicó. Para ello se utiliza como reactivo detector anti-Ig humana conjugada con otro coloidal, que se incorpora redisolvible a la zona contigua a la cámara de muestra. Como reactivos de captura se inmovilizan sustancias A y B en gráficos complementarios para dibujar una parte de una O cada una de ellas. Estos gráficos pueden ser en forma de líneas alternas, cuadrantes alternos o semicírculos en sentido vertical u horizontal, de forma que la positividad por separado de uno sólo de ellos, producirá un gráfico ilegible. Se prefieren semicírculos en sentido horizontal (Figura 4).

Resultados esperados

El grupo A producirá una A en la ventana para A y igualmente el B en la correspondiente ventana. En la parte destinada al grupo 0 los grupos A o B producirán un gráfico ilegible en forma de semicírculo. El grupo AB quedará identificado por la unión de las dos letras A y B.

Los expertos en la materia reconocerán que se admiten cambios, modificaciones o variaciones en la forma, detalles, método y dispositivo, pudiendo realizarse varias combinaciones, técnicas, adiciones u omisiones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Por tanto tales modificaciones se incluyen en las reivindicaciones de la presente invención.

Determinación del grupo ABO por medio de signos positivo o negativo

Se propone también la determinación de estos y otros grupos por medio de los signos más o menos
(+/-).

Las letras estarían impresas en las ventanas adyacentes.

La metodología sería similar a la descrita anteriormente pero se produce una línea vertical en lugar de una letra sobre una línea horizontal de control.

Claims (14)

1. Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmunoensayo en tarjeta de tipo "lateral flow" para detectar las sustancias que identifican el grupo de forma que la misma determinación produzca las letras del grupo utilizando para ello cualquier diseño y combinación de reactivos.

2. Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmunonoensayo según la primera reivindicación que utiliza un soporte poroso inmunocromatografico en forma de tira alargada con una o más cámaras para depositar la muestra de sangre y zonas o ventanas contiguas lateralmente para visualizar las letras del grupo. Contiene también un filtro para impedir el paso de glóbulos rojos, material absorbente para drenar los reactivos líquidos y otros elementos adecuados y necesarios para realizar un inmunoensayo por cromatografía incluido todo en un estuche o envase rígido. En el citado soporte se incorporan reactivos detectores de las sustancias que identifican el grupo sanguíneo, conjugados con un marcador y reactivos de captura inmovilizados formando gráficos específicos.

3. Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmunoensayo según la primera reivindicación, caracterizado porque el inmunoensayo se diseña para detectar las sustancias antigénicas de los grupos y sus anticuerpos específicos o aglutininas.

4. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación, caracterizado porque el reactivo detector se conjuga con un reactivo indicador como el oro coloidal u otro marcador que permita la visualización de la prueba final a simple vista.

5. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo detector se incorpora a la membrana desecado; redisolvible, lioflizado en ampollas o recubriendo perlas de látex.

6. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo detector de las aglutininas, consiste en un anticuerpo específico anti-Ig humana conjugado con la proteína A marcada con oro coloidal o conjugada directamente con el marcador.

7. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo detector de las sustancias del grupo ABO consiste en un anticuerpo específico anti-A y anti-B monoclonales o policlonales purificados, conjugados con oro coloidal directamente o a través de la Proteína A.

8. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo de captura del complejo antígeno/anticuerpo para la identificación de las aglutininas de los grupos, consiste en sustancias de los grupos A y B.

9. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la anterior reivindicación caracterizado porque las sustancias utilizadas para la captura del complejo antígeno/anticuerpo se inmovilizan en ventanas específicas dibujando semicírculos o líneas complementarias para formar un círculo y gráficos en forma de letras B y A.

10. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la segunda reivindicación caracterizado porque el reactivo de captura del complejo antígeno/anticuerpo para la identificación de los antígenos, consiste en un anticuerpo específico anti-A y anti-B monoclonal o policlonal purificado.

11. Un procedimiento para determinar el grupo sanguíneo ABO según la anterior reivindicación caracterizado porque los anticuerpo anti-A y anti-B, utilizados para la captura del complejo antígeno/anticuerpo, se inmovilizan en zonas o ventanas en forma de las letras del grupo y como reactivo de captura para la identificación de aglutininas, se inmovilizarán en las ventanas sustancias dibujando semicírculos y gráficos específicos.

12. Un procedimiento y un dispositivo basado en un inmunoensayo para determinar el grupo ABO según la primera reivindicación caracterizado porque la detección de los grupos A, B y O se realiza por medio de la detección de las aglutininas. El dispositivo contiene zonas o ventanas para la visualización del resultado dispuestas lateralmente, una al lado de la otra. Para capturar el complejo antígeno/anticuerpo se inmoviliza, en una ventana, la sustancia A en forma de semicírculo en sentido horizontal, con la parte convexa hacia abajo y la sustancia B también en forma de semicírculo completando el anterior para formar un círculo. Además para producir el grupo A se inmoviliza o fija en la ventana contigua sustancia B en forma A preferiblemente con la parte superior redondeada (Figura 3). Para producir el grupo B se fija o inmoviliza sustancia A en forma de letra B sobre la letra A de manera que las tres líneas transversales vayan paralelas a diferentes alturas a la línea transversal de la A (Figura 4); las líneas laterales van también paralelas a las de la A. Se prefiere redondear ligeramente el ángulo recto formado por las líneas transversales y la línea lateral derecha (Figura 5). Como se indicó, en la zona de detección se incorpora anti-IgG humana conjugada con el marcador.

13. Un procedimiento y un dispositivo basado en un inmunoensayo para determinar el grupo ABO según la primera reivindicación caracterizado porque la detección de los grupos A, B y AB se realiza por medio de la detección de las sustancias del grupo ABO y del grupo O por detección de las aglutininas. El dispositivo contiene zonas o ventanas para la visualización del resultado dispuestas lateralmente, una al lado de la otra. Para capturar el complejo antígeno/anticuerpo se inmoviliza, en la ventana de la izquierda, un anticuerpo anti-A dibujando una letra A y en la ventana contigua un anti-B en forma de B. En la ventana restante se disponen sustancias A y B en forma de semicírculo según la reivindicación anterior. En la zona de detección se incorpora anticuerpos anti-A, anti-B y anti-IgG humana conjugados con el marcador.

14. Un procedimiento y un dispositivo para determinar el grupo sanguíneo ABO basado en un inmunoensayo en tarjeta de tipo "lateral flow" para detectar las sustancias que identifican el grupo por medio de signos más o menos (+/-) con letras preimpresas adyacentes o adosadas. El procedimiento sería similar a lo descrito anteriormente pero se produce un signo "+" en lugar de una letra.