ES2315684T3 - Dispositivo y procedimiento para llevar a cabo simultaneamente una determinacion de grupo sanguineo, una comprobacion serica y una prueba de deteccion de anticuerpos. - Google Patents
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Abstract
Dispositivo para la determinación simultánea, cualitativa o cuantitativa de varios analitos, en el que al menos un analito es un analito unido a célula, en una muestra líquida, en el que para la determinación se usan al menos dos clases de partículas indicadoras, de las que al menos una clase son eritrocitos, comprendiendo: - una zona de aplicación (5) para la aplicación de la muestra líquida, - una membrana porosa (2) adecuada para la penetración de componentes celulares con al menos dos zonas indicadoras sobre la membrana que pueden interaccionar con el(los) analito(s) y - al menos una región de absorción (3) sobre la membrana que absorbe el líquido después de pasar por las zonas indicadoras, en el que las zonas indicadoras se encuentran entre la zona de aplicación (5) y una región de absorción (3), en el que las direcciones de flujo desde la zona de aplicación (5) a través de las zonas indicadoras respectivas hasta la región de absorción (3) (trayectorias de flujo) son esencialmente paralelas y se presentan al menos dos trayectorias de flujo distintas, en el que la membrana comprende una primera zona indicadora que contiene un elemento de unión para la unión de un analito unido a célula y la membrana comprende una segunda zona indicadora que contiene un elemento de unión para la unión de un analito contenido en el plasma.
Description
Dispositivo y procedimiento para llevar a cabo
simultáneamente una determinación de grupo sanguíneo, una
comprobación sérica y una prueba de detección de anticuerpos.
La invención se refiere a un dispositivo para
ensayos multiparamétricos de flujo lateral-diagonal,
particularmente en los campos de la inmunohematología y serología
de infección, para la determinación cualitativa o cuantitativa
simultánea de varios analitos, en el que al menos un analito es un
analito unido a célula, en una muestra líquida, en el que para la
determinación se usan al menos dos clases de partículas indicadoras,
de las que al menos una clase son eritrocitos, que comprende una
zona de aplicación para la aplicación de la muestra líquida, una
membrana porosa adecuada para la penetración de componentes
celulares con al menos dos zonas indicadoras sobre la membrana que
pueden interaccionar con el(los) analito(s) y al menos
una región de absorción sobre la membrana que absorbe el líquido
después de pasar por las zonas indicadoras, en el que las zonas
indicadoras se encuentran entre la zona de aplicación y una región
de absorción, en el que las direcciones de flujo desde la zona de
aplicación a través de las zonas indicadoras respectivas hasta una
región de absorción (trayectorias de flujo) son especialmente
paralelas y presentan al menos dos trayectorias de flujo distintas,
en el que la membrana comprende una primera zona indicadora que
contiene un elemento de unión para la unión de un analito unido a
célula y la membrana contiene una segunda zona indicadora que
contiene un elemento de unión para la unión de un analito contenido
en el plasma.
La invención se refiere además a un
procedimiento para la determinación de varios analitos en una
muestra líquida, que comprende la aplicación de la muestra sobre la
zona de aplicación de una membrana del dispositivo según la
invención, en el que esta muestra se presenta en cantidad suficiente
para inducir que el líquido de muestra fluya en dirección a la
región de absorción a través de las zonas indicadoras y para inducir
que los analitos o sus derivados en el líquido de muestra formen un
complejo en las zonas indicadoras, particularmente para la
determinación simultánea de parámetros celulares y plasmáticos,
preferiblemente para la práctica simultánea de la determinación de
grupos sanguíneos y la prueba inversa de suero y/o el ensayo de
detección de anticuerpos, así como para la práctica simultánea de
la determinación de grupos sanguíneos y la determinación de
marcadores serológicos de infección relevantes para la transfusión,
así como para la práctica simultánea de la determinación de grupos
sanguíneos y la determinación de anticuerpos que se dirigen contra
otras células sanguíneas que no son eritrocitos, particularmente
anticuerpos antitrombocíticos y antilinfocíticos, y en el que se
usan al menos dos clases de partículas indicadoras de las cuales al
menos una clase son eritrocitos.
Para evitar riesgos de complicaciones, por
ejemplo en una transfusión, particularmente incompatibilidades de
grupos sanguíneos, contaminaciones víricas y/o bacterianas, se
realizan de forma conocida diferentes ensayos de laboratorio en
sangre de donantes y pacientes para la provisión de componentes que
sean de grupo sanguíneo serológico compatible con los receptores y
estén exentos de patógenos transmisibles conocidos. Los ensayos
serológicos respectivos incluyen generalmente la determinación de
los grupos sanguíneos en donante y receptor, particularmente de los
grupos sanguíneos de los sistemas de grupos sanguíneos AB0, Rh y
Kell, prueba inversa de suero en donante y receptor, detección de
anticuerpos de anticuerpos irregulares en donante y receptor, así
como identificación de anticuerpos en receptor en el caso de que
haya anticuerpos irregulares. La determinación de anticuerpos
contra trombocitos y/o linfocitos se lleva igualmente a cabo en el
contexto de transfusiones y trasplantes.
Los ensayos serológicos de infección en donante
comprenden de forma conocida la determinación rutinaria de
anticuerpos particularmente contra VIH-1,
VIH-1, contra HCV, contra Treponema pallidum
(sífilis), así como la determinación del antígeno de superficie de
hepatitis B (= HbsAg: Hepatitis surface Antigen).
El documento WO 97/31268 da a conocer una tira
cromatográfica para la práctica de un ensayo de unión para la
determinación cualitativa o cuantitativa de un analito en una
muestra. El documento US 4.943.522 da a conocer un procedimiento y
un dispositivo para la práctica de ensayos de par de unión
específicos como, por ejemplo, inmunoensayos.
En el diagnóstico serológico de grupos
sanguíneos, se detectan generalmente parámetros que son de
importancia especialmente en el contexto de transfusiones o la
enfermedad hemolítica neonatal (Mhn). A este respecto, se trata
entre otros de la detección de antígenos sobre la superficie de los
eritrocitos que son característicos de los grupos sanguíneos
(determinación de grupos sanguíneos). Otros sistemas de antígenos
importantes se localizan también en trombocitos, granulocitos y
linfocitos, que igualmente desempeñan un papel en transfusión y
trasplante. Por la desigualdad de antígenos de trombocitos y
granulocitos entre madre y feto, puede llegarse a cuadros clínicos
comparables a Mhn en recién nacidos. Además, se trata de la
detección de anticuerpos de grupos sanguíneos regulares
(isoaglutininas) y de la detección de anticuerpos de grupos
sanguíneos irregulares en suero o plasma.
Las isoaglutininas o anticuerpos regulares se
adquieren por todo el mundo tempranamente después del nacimiento y
corresponden a los grupos sanguíneos respectivos del sistema AB0.
Están dirigidas contra aquellos antígenos de grupos sanguíneos A o
B de que el individuo mismo carece, es decir, personas con grupo
sanguíneo A tienen anti-B, personas con grupo
sanguíneo B tienen anti-A, personas con grupo
sanguíneo 0 tienen anti-A y anti-B;
personas con grupo sanguíneo AB no tienen isoaglutininas. Los
anticuerpos regulares se citan también como "completos", porque
pueden aglutinar directamente eritrocitos en medio de NaCl.
\newpage
Los anticuerpos irregulares o aloanticuerpos se
adquieren en contraposición con las isoaglutininas mediante
inmunizaciones posteriores, sobre todo mediante transfusión o
embarazo. Por tanto, la mayoría de las personas no tienen
anticuerpos de grupos sanguíneos irregulares. Los anticuerpos
irregulares relevantes para transfusión son generalmente reactivos
al calor y pertenecen predominantemente a la clase de IgG. No son
capaces, en contraposición con los anticuerpos regulares, de
aglutinar directamente eritrocitos en medio de NaCl.
De forma conocida, para la determinación de
grupos sanguíneos se combinan los eritrocitos de la persona a
ensayar (donante o receptor) con reactivos que contienen anticuerpos
específicos de grupo sanguíneo. Habitualmente, se trata de ensayos
líquidos en los que se prepara una preparación de ensayo mediante
mezclado de una muestra que contiene eritrocitos con una muestra
que contiene anticuerpos que están dirigidos contra una
característica de grupo sanguíneo determinado. La preparación de
ensayo se incuba después durante un intervalo definido y en
condiciones definidas y después del término de la incubación, o
directamente o después de una etapa de centrifugación, se examina o
visualmente o con procedimientos ópticos una eventual aglutinación o
adsorción de los eritrocitos. La medida de punto final predominante
en la serología de grupos sanguíneos es como siempre la
hemaglutinación. Para cada uno de los grupos sanguíneos a
determinar, debe pipetearse una preparación propia, es decir, por
ejemplo la determinación de los 9 grupos sanguíneos más importantes
A, B, D, C, c, E, e, Cw y K requiere 9 preparaciones separadas
sin
el control.
el control.
Para la prueba inversa de suero, se usan de
forma conocida reactivos celulares con grupos sanguíneos AB0
conocidos (A1, A2, B, 0), que se incuban con el suero o plasma de
la persona a ensayar. Después de una etapa de centrifugación, se
examina visualmente o con procedimientos ópticos una eventual
aglutinación de los eritrocitos. Para una prueba inversa de suero
con las 4 células de ensayo citadas, deben pipetearse
convencionalmente 4 preparaciones.
Para la detección de anticuerpos irregulares, se
usan de forma conocida paneles compuestos normalmente por 2 ó 3
células de grupo sanguíneo 0, cuyo perfil antigénico combinado
contiene los antígenos más importantes, particularmente de los
sistemas de grupos sanguíneos Rh, Kell, Duffy, Kidd, MNS, P, Lewis y
Lutheran. El reactivo celular se combina con el suero o plasma de
la persona a ensayar, se incuba y después de una etapa de
centrifugación se examina visualmente o con procedimientos ópticos
una eventual aglutinación de los eritrocitos. Para la determinación
de una muestra de paciente, deben pipetearse 2 a 3
preparaciones.
Para la identificación de anticuerpos
irregulares, que se realiza generalmente después de un ensayo de
detección de anticuerpos positivo, se usan paneles compuestos por
hasta 16 células de grupo sanguíneo 0 cuyo perfil antigénico
combinado cubre los antígenos más importantes, particularmente de
los sistemas de grupos sanguíneos Rh, Kell, Duffy, Kidd, MNS, P,
Lewis y Lutheran, de modo exactamente predeterminado. El reactivo
celular se combina con el suero o plasma de la persona a ensayar,
se incuba y se examina visualmente o con procedimientos ópticos una
eventual aglutinación de los eritrocitos. Para la determinación de
una muestra de paciente, deben pipetearse hasta 16
preparaciones.
Ya que la mayoría de anticuerpos irregulares
relevantes para transfusión son de tipo IgG y por tanto incompletos,
deben reforzarse generalmente las reacciones descritas para
detección e identificación de anticuerpos para poder detectar la
hemaglutinación de punto final. El reactivo más común es a este
respecto un reactivo de anticuerpo policlonal
anti-globulina humana al que se añaden
frecuentemente anticuerpos anti-complemento
(típicamente, anti-C3d y/o
anti-C3b).
Es un procedimiento común para la detección de
anticuerpos de trombocitos el denominado ensayo MAIPA ("Monoclonal
Antibody Immobilisation of Platelet Antigens"). A este respecto,
se incuban trombocitos de ensayo con el suero a ensayar. Después de
una etapa de lavado, se incuba con un anticuerpo monoclonal, por
ejemplo de ratón, que es específico de una glucoproteína de
trombocitos determinada. Los trombocitos se lisan después y se añade
el lisado diluido a un recipiente de reacción de una placa de
microvaloración recubierto, por ejemplo, con anticuerpos de cabra
anti-ratón. El anticuerpo de cabra
anti-ratón se une al anticuerpo de ratón y al
complejo de glucoproteína de trombocito-anticuerpo
humano localizado en el mismo. El anticuerpo humano se detecta
mediante la adición de un anticuerpo de cabra
anti-IgG humana conjugado con enzima.
Con los ensayos de diagnóstico convencionales,
pueden determinarse sólo parámetros celulares o plasmáticos. Para la
determinación de los componentes sanguíneos deben separarse
fundamentalmente antes células y plasma.
Los ensayos de flujo lateral encuentran
numerosas aplicaciones hoy en día como ensayos rápidos, por ejemplo,
como ensayos de embarazo, para la determinación de marcadores de
infección o como cribado de drogas. Una disposición de ensayo de
flujo lateral está compuesta de forma conocida por un soporte sólido
al que se aplica una zona de aplicación para la muestra a examinar
y una membrana de separación sobre la que están unidos elementos de
unión, por ejemplo, anticuerpos o antígenos de captura, y sobre la
que pueden detectarse reacciones de unión, y una región de
absorción capaz de succión, que hace fluir linealmente la muestra a
examinar a través de la membrana de
separación.
separación.
Las membranas de ensayo de ensayos de flujo
lateral convencionales se describen generalmente con una separación
similar a la cromatografía. El analito de la muestra se une
específicamente a los elementos de unión fijados sobre una
membrana, que generalmente se presentan dispuestos en bandas
consecutivas o superpuestas en forma de zonas indicadoras. El
complejo de formación se visualiza mediante partículas indicadoras
que generalmente están ya presentes en la disposición deshidratadas
en una almohadilla de liberación de conjugado. La almohadilla de
liberación de conjugado está fijada entre la zona de aplicación y la
membrana. Las partículas indicadoras coloreadas prerrecubiertas
están recubiertas, por ejemplo, con un anticuerpo dirigido contra
los analitos buscados.
El formato de ensayo de flujo lateral habitual
es el denominado "ensayo de sándwich", en el que tanto la zona
indicadora como las partículas indicadoras están cubiertos con
ligandos dirigidos contra los analitos buscados, normalmente un
anticuerpo. A este respecto, el ligando (elemento de unión) está
inmovilizado en la membrana. El reactivo detector, normalmente un
anticuerpo que está unido a partículas de poliestireno coloreadas o
metales coloidales, está depositado en la almohadilla de liberación
de conjugado de manera que se puede quitar por lavado. Este
complejo de unión sirve como partícula indicadora. Después de la
aplicación de la muestra a examinar, ésta última humedece muy
rápidamente la almohadilla de liberación de conjugado, con lo que se
movilizan las partículas indicadoras. Las partículas indicadoras
migran con el frente líquido a lo largo de la membrana porosa. Un
analito localizado en la muestra se une al anticuerpo que está
acoplado a la partícula indicadora. Cuando la muestra pasa por la
zona indicadora, se inmoviliza el complejo de analito/partícula
indicadora en la zona indicadora mediante la reacción del analito
con el anticuerpo unido en la zona indicadora, lo que conduce a una
señal visible.
Es un formato de ensayo conocido adicional para
analitos pequeños con sólo un determinante antigénico único que no
pueden unirse simultáneamente a dos anticuerpos, el denominado
"ensayo de competición". El reactivo detector unido a la
partícula indicadora es normalmente una molécula idéntica o análoga
al analito. Las partículas indicadoras están depositadas en la
almohadilla de liberación de conjugado. Las partículas indicadoras
migran con el frente líquido a lo largo de la membrana porosa.
Cuando la muestra que contiene analito, y las partículas
indicadoras (que también contienen eficazmente analito) pasan por la
zona indicadora, se une una parte de las moléculas de analito de la
muestra y una parte de las partículas indicadoras. Cuanto más
analito se localice en la muestra, más eficaz competirá con la unión
de las partículas indicadoras y más débil será la señal.
De forma conocida, estas partículas indicadoras
son predominantemente de oro coloidal o poliestireno, que se
preparan y recubren con procedimientos conocidos por el experto. En
los formatos de ensayos de flujo lateral típicos, se determinan
indirectamente los analitos. Por determinación directa de un analito
se entiende aquí que el analito está ya unido naturalmente a la
partícula indicadora (por ejemplo, eritrocito). En el caso más
común de determinación indirecta del analito, la muestra a ensayar
contiene generalmente un componente no unido a célula, por ejemplo
plasmático, como analito y son necesarios además de la muestra a
ensayar dos componentes reactivos, a saber partículas indicadoras y
elemento de unión. En la determinación indirecta, se une el analito
en primer lugar a las partículas indicadoras disociadas de la
almohadilla de liberación de conjugado, antes de inmovilizarse
entonces en las zonas indicadoras este complejo mediante una segunda
reacción con el elemento de unión.
Con el uso de ensayos de flujo lateral
convencionales con eritrocitos como partículas indicadoras que se
han unido a los analitos a determinar, por ejemplo, antígenos
específicos de grupos sanguíneos, se disponen hasta la fecha en las
zonas indicadoras anticuerpos contra antígenos de los
correspondientes grupos sanguíneos como elementos de unión en
bandas consecutivas o superpuestas sólo en una trayectoria de flujo
como, por ejemplo, anti-A, anti-B
contra los antígenos de grupos sanguíneos A o B, o anticuerpos
contra antígenos del sistema de grupos sanguíneos Rh. A este
respecto, los ensayos de flujo lateral convencionales presentan la
desventaja de que los eritrocitos unidos a anticuerpos forman en
una muestra una barrera de flujo para los analitos a examinar
adicionales, por ejemplo, antígenos asociados a células adicionales.
Mediante la aglutinación o adsorción de células en una banda que se
encuentra proximal a la zona de aplicación de los elementos de
unión, no pueden separarse sin trabas y visiblemente analitos
adicionales, particularmente células o fragmentos celulares, en la
muestra a examinar, y no pueden en consecuencia detectarse clara ni
completamente. Esto puede conducir, por ejemplo en una persona que
es positiva del grupo sanguíneo AB Rh D positivo, a una atenuación o
eliminación de las bandas B y D, lo que podría conducir a una
interpretación errónea en el sentido del grupo sanguíneo A Rh
negativo. Hasta la fecha, por tanto, no se han podido emplear
ensayos de flujo lateral con más de una zona indicadora,
especialmente en el diagnóstico serológico de grupos sanguíneos.
Para la medida de varios parámetros de grupos sanguíneos,
particularmente celulares y plasmáticos, deben llevarse a cabo hasta
la fecha ensayos de parámetros individuales separados.
Los documentos WO97/31268 y US 6.203.757 dan a
conocer respectivamente dispositivos para la determinación
simultánea, cualitativa o cuantitativa de varios analitos.
Es objetivo de la invención superar las
desventajas indicadas con respecto al estado de la técnica,
particularmente de ensayos de flujo lateral convencionales de zonas
indicadoras o detectoras consecutivas o superpuestas para una
medida simultánea de distintos parámetros de muestra,
particularmente de parámetros celulares y plasmáticos.
Se consigue el objetivo según la invención por
un lado mediante un dispositivo para la determinación simultánea,
cualitativa o cuantitativa de uno o varios analitos, en el que al
menos un analito es un analito unido a célula, en una muestra
líquida, en el que para la determinación se usan al menos dos clases
de partículas indicadoras, de las que al menos una clase es
eritrocitos, que comprende una zona de aplicación para la aplicación
de la muestra líquida, una membrana porosa adecuada para la
penetración de componentes celulares con al menos dos zonas
indicadoras sobre la membrana que pueden interaccionar con
el(los) analito(s) y al menos una región de absorción
sobre la membrana que absorbe el líquido después de pasar por las
zonas indicadoras, en el que las zonas indicadoras se encuentran
entre la zona de aplicación y la región de absorción, caracterizado
porque las direcciones de flujo desde la zona de aplicación a
través de las zonas indicadoras respectivas de un grupo hasta la
región de absorción, que representan trayectorias de flujo, son
esencialmente paralelas y presentan al menos dos trayectorias de
flujo distintas, en el que la membrana comprende una primera zona
indicadora que contiene un elemento de unión para la unión de un
analito unido a célula y la membrana comprende una segunda zona
indicadora que contiene un elemento de unión para la unión de un
analito contenido en el plasma.
Las zonas indicadoras del dispositivo según la
invención se localizan sobre la membrana y comprenden elementos de
unión que captan o se unen a los analitos a determinar en la
muestra. En las zonas indicadoras, se detectan las reacciones de
unión entre analito y elemento de unión. Como elementos de unión
especialmente preferidos, se fijan a la membrana porosa anticuerpos
o fragmentos de anticuerpo, lectinas, antígenos o epítopos
antigénicos y/o células o fragmentos celulares. Preferiblemente,
las zonas indicadoras comprenden respectivamente un elemento de
unión contra cada analito a examinar.
En un modo de realización de la invención, se
disponen las zonas indicadoras de modo que el líquido de muestra no
atraviese más de una zona indicadora por trayectoria de flujo. Por
ejemplo, las zonas indicadoras se disponen escalonadas sobre la
membrana. La disposición de las zonas indicadoras se configura
preferiblemente a este respecto en una serie que se extiende de
proximal a distal o viceversa de manera diagonal. Son formas de
realización especiales las configuradas en forma de V, en forma de
W, M o N o en forma de V, en forma de W, M o N inversas. En una
forma de realización adicional, se escalonan las zonas indicadoras
paralelamente entre sí dispuestas en una serie lineal.
La introducción de zonas indicadoras escalonadas
hace posible por primera vez un ensayo multiparamétrico con
eritrocitos como partículas indicadoras en una disposición lateral.
La forma de realización especialmente preferida de una disposición
diagonal tiene la ventaja de que la caracterización de los
resultados puede aplicarse de forma especialmente práctica y
fácilmente legible a la disposición según la invención, ya que cada
parámetro a detectar presenta una posición X e Y definida y la
disposición del dispositivo según la invención se considera como un
sistema de coordenadas con ordenada (plano de la dirección de flujo)
y abscisa (plano de la zona de aplicación).
En un modo de realización adicional de la
invención, se disponen más de una de dichas series de zonas
indicadoras preferiblemente que se extienden respectivamente de
proximal a distal o viceversa de manera diagonal, o por ejemplo
también que se extienden en forma de V, en forma de W, M o N o en
forma de V, en forma de W, M o N inversas, escalonadas en la
dirección del flujo consecutiva y/o lateralmente, y se disponen las
zonas indicadoras de las distintas series al tresbolillo entre sí,
de modo que el líquido de muestra atraviese no más de una zona
indicadora por trayectoria de flujo, o no al tresbolillo entre sí,
de modo que el líquido de muestra atraviese más de una zona
indicadora por trayectoria de flujo. Son entonces particularmente
ventajosas más de una de dichas series de zonas indicadoras, por
ejemplo dos series de zonas indicadoras con distintas distancias a
la zona de aplicación, cuando deben determinarse en una muestra de
sangre completa parámetros celulares y plasmáticos. En un modo de
realización, por ejemplo en una preparación de ensayo con sangre
completa como muestra, se seleccionan los elementos de unión de
modo que los analitos contenidos en el plasma, por ejemplo, cada
tipo de anticuerpo que fluye a través del dispositivo desde la zona
de aplicación a la región de absorción a través de las zonas
indicadoras, se une a los elementos de unión en la serie de zonas
indicadoras dispuesta proximal a la zona de aplicación. Los
elementos de unión para la detección del analito unido a células,
por ejemplo antígenos eritrocíticos, se seleccionan por el
contrario de modo que estos se unen a los elementos de unión en la
serie de zonas indicadoras dispuesta distalmente a la zona de
aplicación. En este modo de realización preferido, se trabaja
preferiblemente con una clase adicional de partículas indicadoras
además de los eritrocitos, preferiblemente de oro coloidal o
poliestireno o eritrocitos fijados. Estas partículas indicadoras se
utilizan particularmente para hacer visibles en complejos de unión
en una zona indicadora analitos no unidos a eritrocitos, por
ejemplo, anticuerpos presentes libres en el plasma. En caso de usar,
por ejemplo, dos tipos de partículas indicadoras, de las que una no
son eritrocitos, las zonas indicadoras de ambas series pueden no
estar dispuestas al tresbolillo entre sí o consecutivamente en una
trayectoria de flujo. Es ventajosa a este respecto la disposición
en la que los analitos detectados en el plasma se detectan en las
zonas indicadoras proximales y los analitos unidos a eritrocitos se
detectan en las zonas indicadoras distales. Son un modo de
realización de la invención con más de una serie de zonas
indicadoras como se describen anteriormente, de las que los
elementos de unión de cada serie reaccionan o se unen con
eritrocitos como partículas indicadoras, las series de zonas
indicadoras dispuestas al tresbolillo entre sí o no
consecutivamente en una trayectoria de flujo.
En un modo de realización adicional y
especialmente preferido de la invención, se disponen más de una de
dichas series de zonas indicadoras, preferiblemente en una serie
que se extiende desde proximal a distal o viceversa de manera
diagonal, o por ejemplo en una serie que se extiende en forma de V,
en forma de W, M o N o en forma de V, en forma de W, M o N inversa,
o por ejemplo también en una serie que se extiende escalonada entre
sí paralela y bidireccionalmente (por ejemplo, en un ángulo de
180º) con respecto a una zona de aplicación central. Dicha
disposición es particularmente ventajosa entonces cuando deben
determinarse parámetros celulares y plasmáticos a partir de una
muestra de sangre completa.
En un modo de realización, por ejemplo en una
preparación de ensayo con sangre completa como muestra, se
seleccionan los elementos de unión de modo que los analitos
contenidos en el plasma, por ejemplo cualquier tipo de anticuerpo
que fluye por el dispositivo desde la zona de aplicación a la región
de absorción a través de las zonas indicadoras, se unan a los
elementos de unión en la serie de zonas indicadoras dispuesta sobre
un lado de la zona de aplicación. Los elementos de unión para
detectar analitos unidos a células, por ejemplo antígenos
eritrocíticos, se seleccionan por otro lado de modo que se unan a
los elementos de unión en la serie de zonas indicadoras dispuesta
sobre el lado contrario de la zona de aplicación. En este modo de
realización preferido, se trabaja preferiblemente con una clase
adicional de partículas indicadoras además de los eritrocitos,
preferiblemente de oro coloidal o poliestireno. Estas partículas
indicadoras se utilizan particularmente para hacer visibles en un
complejo de formación en una zona indicadora los analitos no unidos
a eritrocitos, por ejemplo que aparecen libres en el plasma.
En un modo de realización preferido, la zona de
aplicación comprende además dos membranas distintas de diferente
porosidad. En este modo de realización preferido, se trabaja
preferiblemente con una clase adicional de partículas indicadoras
además de los eritrocitos, preferiblemente de oro coloidal o
poliestireno. Estas partículas indicadoras se utilizan
particularmente para hacer visibles en un complejo de formación en
una zona indicadora los analitos no unidos a eritrocitos, por
ejemplo que aparecen libres en el plasma.
En un modo de realización especialmente
preferido, la zona de aplicación comprende una membrana o dos
membranas distintas de diferente porosidad. Además, una de las dos
membranas comprende una almohadilla de conjugado que está dispuesta
entre un elemento sellante y las zonas indicadoras. En este modo de
realización preferido, se trabaja preferiblemente con una clase
adicional de partículas indicadoras además de los eritrocitos,
preferiblemente de oro coloidal o poliestireno. Estas partículas
indicadoras se utilizan particularmente para hacer visibles en un
complejo de formación en una zona indicadora los analitos no unidos
a eritrocitos, por ejemplo que aparecen libres en el plasma. Esta
clase adicional de partículas indicadoras utilizada además de
eritrocitos se presenta preferiblemente secada en la almohadilla de
conjugado. Además, la almohadilla de conjugado hace que el flujo de
los eritrocitos se retarde. Esto conduce a que en la disposición
bidireccional con una zona de aplicación común individual, se
mantienen en una dirección las condiciones optimizadas para la
detección de propiedades celulares y en la otra dirección las
condiciones optimizadas para la detección de propiedades
plasmáticas.
Mediante el dispositivo según la invención, se
proporciona un ensayo de flujo lateral, particularmente para
diagnóstico serológico de grupos sanguíneos, con el que se usan
eritrocitos como partículas indicadoras y pueden determinarse en
una preparación de ensayo simultáneamente varios parámetros
celulares, particularmente antígenos eritrocíticos o epítopos
antigénicos, parámetros plasmáticos y/o propiedades de células
sanguíneas, particularmente de componentes de sangre completa, por
cada muestra a examinar. Además, se proporciona por tanto un
sistema de ensayo de fabricación lo más sencilla posible, sencillo
de manejar, particularmente con pocas series de ensayos y sin
preparación de muestra, y económico con el que pueden determinarse
simultáneamente distintos parámetros celulares y/o parámetros
plasmáticos de una muestra o varias muestras a examinar.
El dispositivo según la invención ofrece estas
ventajas en cualquier campo de diagnóstico médico en el que deban
determinarse simultáneamente distintos parámetros celulares y
parámetros plasmáticos, particularmente también en el campo de la
serología de grupos sanguíneos e infección, particularmente para
cualquier diagnóstico en el marco de la medicina de transfusión,
por ejemplo, para la práctica simultánea de la determinación de
grupos sanguíneos, en la que se determinan particularmente antígenos
o epítopos antigénicos unidos a eritrocitos, y la prueba inversa de
suero, en la que se determinan particularmente anticuerpos regulares
(isoaglutininas) y/o el ensayo de detección de anticuerpos, en el
que se determinan particularmente anticuerpos irregulares, así como
para la práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos
y la determinación de marcadores serológicos de infección
relevantes para la transfusión, por ejemplo, anticuerpos contra
VIH-1, VIH-2, HCV, Treponema
pallidum, así como el antígeno de superficie del virus de la
hepatitis B (HbsAg), así como para la práctica simultánea de la
determinación de grupos sanguíneos y la determinación de anticuerpos
contra otras células sanguíneas que no son eritrocitos,
particularmente anticuerpos antitrombocíticos y
antilinfocíticos.
Para ello, puede usarse sangre completa
anticoagulada o nativa en la que antes de la determinación no se
tienen que separar de modo costoso eritrocitos y fracciones de
suero o plasma entre sí. La determinación puede realizarse en un
formato manual que se realiza completamente sin aparatos (incluyendo
corriente eléctrica).
En un modo de realización preferido del
dispositivo según la invención, las zonas indicadoras comprenden
preferiblemente en una serie de zonas indicadoras dispuesta
distalmente a la zona de aplicación, anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo o lectinas que capturan o se unen a los antígenos de
grupos sanguíneos a determinar de todos los sistemas de grupos
sanguíneos concebibles, y por tanto a las células que los portan en
la muestra. Como elementos de unión preferidos, se fijan
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o lectinas contra antígenos
o epítopos antigénicos, particularmente de los sistemas de grupos
sanguíneos AB0, Rh y Kell, por ejemplo anti-A,
anti-B, anti-D y
anti-K, en las zonas indicadoras en la membrana
porosa, preferiblemente en una serie dispuesta distalmente a otras
series de zonas indicadoras.
Preferiblemente, se aplica en una zona
indicadora de esta serie de zonas indicadoras, preferiblemente en
una serie distal a todas las zonas indicadoras restantes de esta
serie, un elemento de unión de control (control = ctl) que indica
positivamente el flujo de la muestra a través de las zonas
indicadoras. El elemento de control es preferiblemente un anticuerpo
policlonal antieritrocítico.
Este modo de realización preferido del
dispositivo según la invención comprende en una serie de zonas
indicadores adicional, preferiblemente dispuesta proximal a la zona
de aplicación, antígenos o epítopos antigénicos que capturan o se
unen a anticuerpos regulares en la muestra. Como elementos de unión
preferidos, se fijan para ello a la membrana porosa antígenos o
epítopos antigénicos de grupos sanguíneos A1, A2, B, 0, por ejemplo
membranas eritrocíticas de eritrocitos de grupos sanguíneos
definidos (A1, A2, B, 0) o sustancias de grupos sanguíneos
preparadas sintéticamente. Preferiblemente, se fija un elemento de
unión de control (control = ctl) en una zona indicadora de esta
serie de zonas indicadoras, preferiblemente en una zona indicadora
situada distalmente a todas las zonas indicadoras restantes de esta
serie, que indica positivamente el flujo de muestra a través de las
zonas indicadoras. El elemento de unión de control es
preferiblemente un anticuerpo anti-IgG.
Este modo de realización preferido del
dispositivo según la invención puede comprender, en una serie
adicional de zonas indicadoras preferiblemente dispuesta proximal a
la zona de aplicación, antígenos o epítopos antigénicos que
capturan o se unen a anticuerpos irregulares o fragmentos de los
mismos en la muestra. Como elementos de unión preferidos, se fijan
para ello sobre la membrana porosa las membranas celulares de
distintas preparaciones de eritrocitos de grupo sanguíneo 0, cuyo
perfil antigénico combinado cubre aquellos antígenos que están
dirigidos contra los anticuerpos irregulares más importantes
relevantes para la transfusión. Preferiblemente, se fija un
elemento de unión de control (control = ctl) en una zona indicadora
de esta serie de zonas indicadoras, preferiblemente en una zona
indicadora situada distalmente a todas las zonas indicadoras
restantes de esta serie, que indica positivamente el flujo de
muestra a través de las zonas indicadoras. El elemento de unión de
control es preferiblemente un anticuerpo
anti-IgG.
En un modo de realización preferido adicional
del dispositivo según la invención, las zonas indicadoras comprenden
preferiblemente, en una serie de zonas indicadoras dispuesta
distalmente a la zona de aplicación, anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo o lectinas que capturan o se unen a los antígenos de
grupos sanguíneos a determinar en la determinación de grupos
sanguíneos, y por tanto a las células que los portan en la muestra.
Como elementos de unión preferidos, se fijan en las zonas
indicadoras de la membrana porosa anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo o lectinas contra antígenos o epítopos antigénicos del
sistema de grupos sanguíneos AB0, por ejemplo,
anti-A, anti-B,
anti-A y anti-B, preferiblemente en
una serie dispuesta distalmente a la zona de aplicación y a otras
series de zonas indicadoras.
Preferiblemente, se fija un elemento de unión de
control (control = ctl) en una zona indicadora de esta serie de
zonas indicadoras, preferiblemente en una zona indicadora distal a
todas las zonas indicadoras restantes de esta serie, que indica
positivamente el flujo de muestra a través de las zonas indicadoras.
El elemento de unión de control es preferiblemente un anticuerpo
policlonal antieritrocítico.
Este modo de realización preferido del
dispositivo según la invención comprende en una serie adicional de
zonas indicadoras, preferiblemente dispuesta proximal a la zona de
aplicación, membranas de trombocitos y/o linfocitos o componentes
de membrana como elementos de unión para la detección de anticuerpos
antitrombocíticos/linfocíticos.
En un modo de realización preferido adicional
del dispositivo según la invención, las zonas indicadoras
comprenden, preferiblemente en una serie de zonas indicadoras
dispuesta distalmente a la zona de aplicación, anticuerpos o
fragmentos de anticuerpo o lectinas que capturan o se unen a
antígenos de grupos sanguíneos a determinar en la determinación de
grupos sanguíneos, y por tanto a las células que los portan en la
muestra. Como elementos de unión preferidos, se fijan en las zonas
indicadoras de la membrana porosa anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo o lectinas contra antígenos o epítopos antigénicos del
sistema de grupos sanguíneos AB0, por ejemplo,
anti-A, anti-B,
anti-A y anti-B, preferiblemente en
una serie dispuesta distalmente a la zona de aplicación y a otras
series de zonas indicadoras.
Preferiblemente, se fija un elemento de unión de
control (control = ctl) en una zona indicadora de esta serie de
zonas indicadoras, preferiblemente en una zona indicadora dispuesta
distalmente a todas las zonas indicadoras restantes de esta serie,
que indica positivamente el flujo de la muestra a través de las
zonas indicadoras. El elemento de unión de control es
preferiblemente un anticuerpo policlonal antieritrocítico.
Este modo de realización preferido del
dispositivo según la invención comprende, preferiblemente en una
serie adicional de zonas indicadoras dispuesta proximalmente a la
zona de aplicación, elementos de unión para la detección de agentes
infecciosos, particularmente péptidos preparados sintéticamente o
antígenos recombinantes expresados con procedimientos de ADN
recombinante, que comprenden secuencias importantes de diagnóstico
de proteínas de superficie del marcador respectivo (detección de
anticuerpos) o anticuerpos que están dirigidos contra proteínas (de
superficie) o agentes infecciosos (detección de antígenos).
Mediante el dispositivo según la invención, ya
no tiene que pipetearse separadamente para cada determinación
individual para la determinación simultánea de parámetros celulares
y plasmáticos de una muestra, sino que en una muestra pueden
determinarse simultáneamente todos los parámetros deseados,
particularmente en la práctica simultánea de la determinación de
grupos sanguíneos y la prueba inversa de suero y/o la detección de
anticuerpos, así como en la práctica simultánea de la determinación
de grupos sanguíneos y la determinación de marcadores serológicos
de infección relevantes para la transfusión, en el que la
determinación de grupos sanguíneos puede combinarse con la
detección de cualquier marcador serológico de infección, así como en
la práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y
la determinación de anticuerpos contra otras células sanguíneas que
no son eritrocitos, particularmente anticuerpos antitrombocíticos y
antilinfocíticos.
Esto representa una excepcional racionalización
de los procedimientos de trabajo. Además de la ventaja de la
determinación simultánea de muchos parámetros serológicos, ha de
citarse aquí la omisión prácticamente completa de las preparaciones
de muestra en comparación con los ensayos convencionales. También la
lectura de los resultados representados en disposición diagonal es
esencialmente más ventajosa. Así, en el dispositivo según la
invención, pueden determinarse y leerse conjuntamente en un
dispositivo, por ejemplo, propiedades de grupos sanguíneos,
particularmente AB0 y de prueba inversa de suero y de ensayo de
detección de anticuerpos, o propiedades de grupos sanguíneos,
particularmente AB0, y otros parámetros inmunohematológicos,
particularmente anticuerpos antitrombocíticos y/o antilinfocíticos
o fragmentos de los mismos, o propiedades de grupos sanguíneos,
particularmente AB0 y marcadores serológicos de infección,
particularmente anticuerpos contra agentes bacterianos y/o víricos
o fragmentos de los mismos o antígenos o epítopos víricos o
bacterianos. El resultado bidimensional plano, así como el punto
final estable de la reacción facilitan no sólo la lectura a simple
vista sino también una lectura automatizada de los resultados con
procedimientos de análisis de imagen comunes como, por ejemplo,
cámaras CCD. Se reduce el coste de trabajo, incluso con evaluación
manual. El dispositivo según la invención conduce además a una
reducción del impacto ambiental y a efectos económicos. Incluso en
situaciones de emergencia bajo presión de tiempo, puede llevarse a
cabo en poco tiempo en un dispositivo de ensayo individual, por
ejemplo, una determinación de grupos sanguíneos AB0 completa con
prueba inversa de suero y ensayo de detección de anticuerpos de
anticuerpos irregulares, por ejemplo, una determinación de grupos
sanguíneos AB0 completa con determinación de marcadores serológicos
de infección o determinación de anticuerpos
antitrombocíticos/linfocíticos.
Desde el punto de vista de la producción
técnica, la configuración de flujo lateral-diagonal
tiene ventajas esenciales frente al estado de la técnica,
implicando por un lado un consumo considerablemente reducido de los
reactivos usados y mediante la provisión de una pluralidad de
parámetros de ensayo en un dispositivo individual que hasta ahora
debían ensayarse separadamente.
Mediante el dispositivo según la invención, se
proporciona un ensayo de flujo lateral, particularmente para
diagnóstico inmunohematológico y serológico de infección, con el que
pueden determinarse en una preparación de ensayo simultáneamente
varios parámetros celulares, particularmente antígenos o epítopos
antigénicos eritrocíticos, y/o propiedades de células sanguíneas,
particularmente componentes de sangre completa, por muestra a
examinar, en el que se usan al menos dos clases de partículas
indicadoras, de las que al menos una clase son eritrocitos. Además,
se proporciona por tanto un sistema de ensayo de fabricación lo más
sencilla posible y sencillo de manejar, particularmente con pocas
series de ensayos y sin preparación de muestra, y económico con el
que pueden determinarse simultáneamente distintos parámetros
celulares y/o parámetros plasmáticos de una muestra,
particularmente características de grupos sanguíneos, detección de
anticuerpos regulares e irregulares, anticuerpos contra trombocitos
y/o linfocitos y/o marcadores serológicos de infección,
particularmente aquellos con relevancia para la medicina de
transfusión.
La membrana del dispositivo según la invención
es una membrana porosa. Son materiales de membrana preferidos, por
ejemplo, nitrocelulosa (por ejemplo, UniSart de Sartorius, HiFlow de
Millipore, Whatman, AE99 o FF85/100 de Schleicher & Schuell),
polietileno (Lateral Flo de Porex Corporation) o nailon (Novylon de
CUNO). Preferiblemente, la membrana presenta un tamaño de poro lo
mayor posible, ya que una alta porosidad de la membrana facilita la
penetración particularmente de componentes celulares de la muestra a
determinar, por ejemplo de eritrocitos, en la estructura porosa. Es
especialmente ventajoso el uso de membranas absorbentes. Sin
embargo, el dispositivo según la invención no está limitado a estas
propiedades. Se prefieren todas las membranas con alta velocidad de
flujo capilar ("Capillary Speed"), en el que la velocidad de
flujo capilar es el tiempo que necesita una solución coloreada para
atravesar 40 mm de una membrana dada. Se prefieren especialmente
membranas cuya velocidad de flujo capilar es < 100.
En el modo de realización bidireccional con dos
membranas distintas, una membrana tiene preferiblemente una alta
velocidad de flujo capilar, preferiblemente < 100, la otra
membrana tiene preferiblemente una velocidad de flujo capilar menor,
preferiblemente > 100.
En un modo de realización preferido de la
invención, está dispuesto sobre la membrana porosa un elemento
sellante en la dirección de flujo detrás de la zona de aplicación
del dispositivo según la invención. Se aplican elementos sellantes
bi- o tridimensionales que se sitúan sobre la membrana porosa y con
los que se forma una zona de aplicación de muestra separada de la
superficie restante de la de la membrana porosa. El elemento
sellante tiene principalmente según la invención el efecto de una
barrera líquida y permite la distribución dirigida del líquido de
muestra y los reactivos de ensayo en la membrana porosa. Además, el
elemento sellante según la invención sella la zona de aplicación de
muestra para evitar una entrada de líquido indeseada en las otras
regiones de la disposición del dispositivo de flujo lateral.
Son modos de realizaciones preferidos del
elemento sellante las formas de barra o artesa o embudo. La
conformación del elemento sellante se realiza mediante procesos de
corte a partir del material usado en la fabricación del elemento
sellante. En el caso de forma de embudo o artesa, el elemento
sellante recibe un orificio interno cuyas variantes de realización
preferidas son redonda, cuadrada o rectangular, en el caso de forma
de embudo, formas que se estrechan hacia el lado inferior (lado de
contacto con la membrana) del elemento sellante.
Son materiales preferidos para el elemento
sellante materiales que no absorben agua (hidrófobos). En un modo
de realización preferido, los materiales están recubiertos por un
lado con una película adhesiva, por ejemplo un adhesivo de acrilato
sensible a la presión o autoadhesivo. Por tanto, el elemento
sellante puede adherirse directamente sobre la superficie de la
membrana porosa. Como alternativa, el elemento sellante puede unirse
a la carcasa de flujo lateral, por ejemplo adherirse, en el que en
esta forma de realización la carcasa de flujo lateral comprime la
superficie de la membrana porosa y por tanto consigue las funciones
del elemento sellante.
Son materiales preferidos para la formación de
elementos sellantes bidimensionales cualquier forma de cinta
adhesiva o láminas adhesivas (por ejemplo, Tesa 4124 de Beiersdorf
AG, ARcare 7815 de Adhesives Research).
Son materiales preferidos para la formación de
elementos sellantes tridimensionales materiales elastoméricos
flexibles de poros cerrados o materiales de silicona flexibles con
distintos grosores de material, preferiblemente 3-5
mm (por ejemplo, caucho celular EPDM140 de Pitzner, caucho de
silicona o caucho completo, de dureza 40º o menos, de Castan).
Por la estructura según la invención, el
dispositivo según la invención es capaz de absorber muestras
líquidas que contienen células como, por ejemplo, sangre completa,
sin separar por filtrado las células. Además, el elemento sellante
permite la aplicación de grandes volúmenes de muestra sobre la
membrana porosa (zona de aplicación) sin inundar ésta. Por tanto,
el elemento sellante apoya la utilización de las propiedades
absorbentes de la membrana porosa. Además, el elemento sellante
garantiza un flujo de muestra dirigido. El dispositivo según la
invención puede funcionar bien sin embargo con o sin elemento
sellante.
Para la región de absorción (almohadilla de
absorción) del dispositivo según la invención, se prefieren
materiales mecánicamente estables, preferiblemente con capacidades
de absorción de agua de 20-30 g/100 cm^{2} (por
ejemplo, papel Wicking, de tipo 300, Schleicher und Schüll). El
contacto entre la almohadilla de absorción y la membrana de flujo
lateral del dispositivo según la invención se produce mediante
presión y superposición con la membrana porosa. La colocación
exacta de la membrana de absorción sobre la membrana se consigue
mediante la adhesión de la almohadilla de absorción con la capa de
soporte ("backing sheet") que porta la membrana de flujo
lateral.
La almohadilla de conjugado está compuesta
preferiblemente por fibra de vidrio o celulosa y tiene
preferiblemente la propiedad de retardar el flujo de eritrocitos
nativos.
En un modo de realización adicional, se aplican
los componentes del dispositivo según la invención con fines de
reforzamiento mecánico sobre un sustrato o capa de soporte. El
dispositivo según la invención puede funcionar sin embargo con o
sin capa de soporte. Se prefieren materiales mecánicamente estables
y no absorbentes de agua, preferiblemente con grosores de material
de 100 \mum o más, que están recubiertos por uno o los dos lados
con una película adhesiva, por ejemplo, un adhesivo de acrilato
sensible a la presión o autoadhesivo [por ejemplo, poliéster
W/GL-187 de 0,013 cm (0,005''), G & L]. Se fijan
sobre la capa de soporte la membrana porosa y la almohadilla de
absorción. En caso de capa de soporte adhesiva por los dos lados, se
utiliza el segundo lado adhesivo para la fijación de la pila a
superficies adicionales, por ejemplo, dentro de la carcasa de flujo
lateral.
En un modo de realización adicional, se integra
en una carcasa el dispositivo según la invención, con o sin capa de
soporte sobre la que se han aplicado los componentes del dispositivo
según la invención, mediante la que los componentes de membrana se
comprimen entre sí y la carcasa soporta la función del elemento
sellante. A este respecto, el dispositivo según la invención puede
funcionar igualmente bien sin embargo con o sin carcasa.
Es un objeto adicional de la invención el uso
del dispositivo según la invención para el análisis de sangre,
particularmente para la práctica simultánea de la determinación de
grupos sanguíneos y la prueba inversa de suero y/o la detección de
anticuerpos, y/o para la práctica simultánea de la determinación de
grupos sanguíneos y la detección de anticuerpos contra agentes
infecciosos, particularmente bacterianos y/o víricos o fragmentos
de los mismos o de antígenos de agentes infecciosos, y/o para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y la
detección de anticuerpos contra otras células sanguíneas como
eritrocitos, particularmente anticuerpos antitrombocíticos o
antilinfocíticos o fragmentos de los mismos.
El objetivo se consigue según la invención por
otro lado mediante un procedimiento para la determinación de varios
analitos o sus derivados en una muestra líquida que comprende la
aplicación de la muestra sobre la zona de aplicación de una
membrana del dispositivo según la invención, en el que esta muestra
se presenta en cantidad suficiente para inducir que el líquido de
muestra fluya en dirección a la región de absorción a través de las
zonas indicadoras y para inducir que los analitos o sus derivados en
el líquido de muestra se unan a las zonas indicadoras respectivas o
formen un complejo en las zonas indicadoras.
Un modo de realización especial del
procedimiento según la invención lleva a cabo simultáneamente una
determinación de grupos sanguíneos y prueba inversa de suero y/o
ensayos de detección de anticuerpos.
Por ejemplo, se aplica sangre completa o una
dilución de la misma a la zona de aplicación del dispositivo. Todos
los componentes penetran en la membrana porosa conducidos por el
elemento sellante y pasan durante la migración en dirección de la
almohadilla de absorción en primer lugar por la región de zonas
indicadoras de la prueba inversa de suero, que comprende fragmentos
de células A1, A2, B, 0, así como las zonas indicadoras de control
con anti-IgG/IgM. Las isoaglutininas presentes en el
suero se unen a los antígenos unidos a células correspondientes. La
IgG sérica se une al elemento de unión de control (prueba inversa de
suero: sensibilización).
Los antígenos unidos a células migran hacia
delante en la región de zonas indicadoras para la determinación de
grupos sanguíneos dispuesta distalmente a la región de zonas
indicadoras de prueba inversa de suero, en la que en cada zona
indicadora se inmoviliza un anticuerpo contra otra característica
de grupos sanguíneos (por ejemplo, anti-A,
anti-B, anti-AB). La zona indicadora
de esta región más distal a la zona de aplicación tiene, por
ejemplo, anticuerpos policlonales antieritrocíticos como elementos
de unión. En esta región de zonas indicadoras, los eritrocitos se
unen a los elementos de unión que corresponden a las características
de grupos sanguíneos respectivos. Se unen al elemento de unión de
control eritrocitos de cualquier grupo sanguíneo (determinación de
grupos sanguíneos).
En una etapa de lavado posterior, el material no
unido se aclara por lavado de la membrana. En la etapa de detección
siguiente, se hacen visibles las isoaglutininas y anticuerpos de
control inmovilizados en los elementos de unión de la serie
proximal de zonas indicadoras con la ayuda de partículas sintéticas
que están recubiertas con anticuerpo anti-IgG/IgM
(prueba inversa de suero: detección).
En otro modo de realización del procedimiento
según la invención para la determinación simultánea de grupos
sanguíneos y la prueba inversa de suero y/o el ensayo de detección
de anticuerpos, se determinan directamente las características de
grupos sanguíneos como se describe anteriormente, por otro lado, se
lleva a cabo la prueba inversa de suero y/o el ensayo de detección
de anticuerpos como ensayo de competición:
Por ejemplo, se aplica sangre completa o una
dilución de la misma sobre la zona de aplicación del dispositivo.
Todos los componentes penetran en la membrana porosa, conducidos por
el elemento sellante, y pasan durante la migración en dirección de
la almohadilla de absorción en primer lugar por la región de zonas
indicadoras de la prueba inversa de suero, que comprende fragmentos
de células A y B, así como las zonas indicadoras de control que
comprenden fragmentos de células del grupo sanguíneo 0. Las
isoaglutininas presentes en el suero se unen a los antígenos unidos
a las correspondientes células (Prueba inversa de suero:
sensibilización).
Los antígenos unidos a células migran hacia
delante en la región de zonas indicadoras para la determinación de
grupos sanguíneos dispuesta distalmente a la región de zonas
indicadoras de prueba inversa de suero, en la que en cada zona
indicadora se inmoviliza un anticuerpo contra otra característica
de grupos sanguíneos (por ejemplo, anti-A,
anti-B, anti-D). La zona indicadora
de esta región más distal a la zona de aplicación tiene por ejemplo
anticuerpos policlonales antieritrocíticos como elemento de unión.
En esta región de zonas indicadoras, los eritrocitos se unen a
elementos de unión que corresponden a las características de grupos
sanguíneos respectivos. Se unen al elemento de unión de control
eritrocitos de cualquier grupo sanguíneo (determinación de grupos
sanguíneos).
En una etapa de lavado posterior, el material no
unido se aclara por lavado de la membrana. En la etapa siguiente,
se aplica a la zona de aplicación una suspensión de distintas
partículas sintéticas que están recubiertas respectivamente con
anti-A, anti-B o
anti-H. Las partículas pueden unirse respectivamente
sólo a aquellos elementos de unión en la región de zonas
indicadoras de prueba inversa de suero que no se hayan puesto en
contacto en la etapa de sensibilización con las isoaglutininas de
suero, es decir, una banda coloreada muestra en este caso la
ausencia de la correspondiente isoaglutinina. Por ejemplo, en caso
de un grupo sanguíneo A (personas con isoaglutininas
anti-B), los fragmentos celulares de células B se
bloquean mediante las isoaglutininas, lo que conduce a que los
fragmentos celulares de células A se coloreen por la mezcla aplicada
posteriormente de partículas sintéticas mediante las partículas
anti-A presentes en la misma. Los fragmentos de
grupo sanguíneo 0 se colorean en todas las combinaciones
concebibles, ya que no se bloquean por isoaglutininas y por tanto
están siempre libres para una reacción con partículas
anti-H coloreadas, con lo que se proporciona también
un elemento de control en la variante de ensayo de competición
(prueba inversa de suero: detección).
En un modo de realización adicional del
procedimiento según la invención para la determinación de grupos
sanguíneos y la prueba inversa de suero y/o el ensayo de detección
de anticuerpos simultáneos con determinación directa de las
características de los grupos sanguíneos y determinación de la
prueba inversa de suero y/o el ensayo de detección de anticuerpos
como ensayo de competición, se procede como sigue:
Se aplica sangre completa o una dilución de la
misma sobre la zona de aplicación asimétrica del dispositivo con
dos membranas porosas distintas. Una membrana porosa presenta a este
respecto una velocidad de flujo capilar menor que la otra membrana.
En esta última, se ha aplicado sobre la membrana una almohadilla de
conjugado entre el elemento sellante y las zonas indicadoras que
contiene partículas
anti-A/anti-B/anti-H
secadas. Todos los componentes penetran ambas membranas porosas,
conducidos por el elemento sellante, lo que provoca el siguiente
comportamiento de flujo:
"Lado de sólo membrana": Todos los
componentes pasan durante la migración en la dirección de la
almohadilla de absorción asociada a la región de zonas indicadoras
de la determinación de grupos sanguíneos, en la que en cada zona
indicadora se inmoviliza un anticuerpo contra otra característica de
grupo sanguíneo (por ejemplo, anti-A,
anti-B, anti-D). La zona indicadora
de esta región más distal a la zona de aplicación tiene, por
ejemplo, anticuerpos policlonales antieritrocíticos como elemento
de unión. En esta región de zonas indicadoras, los eritrocitos se
unen a los elementos de unión que corresponden a las características
de grupos sanguíneos respectivos. En el elemento de unión de
control, los eritrocitos se unen a cualquier grupo sanguíneo.
"Lado de membrana/almohadilla de
conjugado": Todos los componentes entran en contacto con la
almohadilla de conjugado después de la penetración de la membrana y
paso del elemento sellante, con lo que los componentes celulares se
retienen o frenan y los componentes líquidos (plasma) pueden seguir
fluyendo sin trabas. Estos últimos liberan las partículas
anti-A/anti-B/anti-H
de la almohadilla de conjugado. La región de zonas indicadoras de
la prueba inversa de suero comprende fragmentos de células de los
grupos sanguíneos A y B, así como elemento de control fragmentos de
células del grupo sanguíneo 0. Las isoaglutininas presentes en el
suero se unen a los antígenos unidos a células correspondientes y
compiten por tanto por la unión de las partículas
anti-A, anti-B coloreadas. Esto
significa que las partículas pueden unirse sólo cuando no está
presente la isoaglutinina respectiva. Por ejemplo, una persona de
grupo sanguíneo A tiene isoaglutinina anti-B, lo que
conduce a que se bloqueen los fragmentos de grupo sanguíneo B en la
región de zonas indicadoras y sólo los fragmentos de grupo
sanguíneo A puedan colorearse por las partículas
anti-A coloreadas. El elemento de control, contra el
que no existen isoaglutininas, permanece por tanto siempre
desbloqueado y se colorea como bandas visibles por la mezcla de
partículas de la almohadilla de conjugado que contiene partículas
anti-H.
Un modo de realización especial adicional del
procedimiento según la invención lleva a cabo simultáneamente una
determinación de grupos sanguíneos y una determinación de
anticuerpos antitrombocíticos y/o antilinfocíticos o fragmentos de
los mismos.
Por ejemplo, para la determinación de
anticuerpos antitrombocíticos, las zonas indicadoras comprenden en
la región proximal a la zona de aplicación fragmentos de
trombocitos como elementos de unión a los que se unen -en caso de
estar presentes en la muestra- los anticuerpos antitrombocíticos
contenidos en el suero. El resto del procedimiento es como se
describe en el modo de realización anteriormente citada del
procedimiento según la invención, particularmente la determinación
de los grupos sanguíneos se realiza como se describe allí.
Un modo de realización especial adicional del
procedimiento según la invención lleva a cabo simultáneamente una
determinación del grupo sanguíneo y una determinación de marcadores
serológicos de infección relevantes para la transfusión.
Por ejemplo, para la determinación de marcadores
de infección, las zonas indicadoras de la primera región de zonas
indicadores proximal comprenden como elementos de unión péptidos
sintéticos y/o proteínas recombinantes que corresponden a las
secuencias de proteínas de agentes víricos o bacterianos
(determinación de anticuerpos contra marcadores víricos, por
ejemplo, anti-VIH-1), así como
anticuerpos que están dirigidos contra proteínas de marcadores de
infección (determinación de antígenos, por ejemplo, HbsAg). Los
anticuerpos o antígenos contenidos en el suero se unen en la
primera etapa a los correspondientes antígenos o anticuerpos. El
resto del procedimiento es como se describe en el modo de
realización anteriormente citado del procedimiento según la
invención, particularmente la determinación de los grupos
sanguíneos se realiza como se describe allí.
En el procedimiento según la invención, en el
caso de los analitos a determinar, se trata particularmente de
antígenos o epítopos antigénicos de grupos sanguíneos,
preferiblemente aquellos de los sistemas de grupos sanguíneos AB0,
Rh, Kell, de anticuerpos o epítopos antigénicos dirigidos contra
antígenos de grupos sanguíneos o fragmentos de los mismos,
preferiblemente anticuerpos regulares, anticuerpos irregulares, de
anticuerpos contra agentes infecciosos, de antigénicos (de
superficie) de agentes infecciosos y/o de anticuerpos
antitrombocíticos o antilinfocíticos o fragmentos de los mismos.
Se aplica la muestra a examinar, por ejemplo
sangre completa nativa o anticoagulada o concentrado de eritrocitos
o suspensiones de eritrocitos diluidas, componentes sanguíneos o
líquidos de ensayo como suero de control o células de control, a la
zona de aplicación del dispositivo según la invención. Los
eritrocitos contenidos en la muestra, que portan el(los)
analito(s), sirven simultáneamente como partículas
indicadoras.
Se usan particularmente dos grupos de partículas
indicadoras, de las que al menos una clase son eritrocitos. Un
grupo está formado únicamente por eritrocitos para la detección
directa de analitos unidos a eritrocitos. El otro grupo está
compuesto por partículas de cualquier tipo y combinación concebibles
con las que pueden detectarse reacciones de unión, preferiblemente
partículas de oro coloidal o poliestireno o eritrocitos fijados.
A continuación, se ilustra detalladamente la
invención mediante figuras y ejemplos, sin limitarla. Se muestra
en:
La Fig. 1 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y la
prueba inversa de suero;
La Fig. 2 una vista explosiva del dispositivo
según la invención para ensayos de flujo lateral representado en la
Fig. 1;
La Fig. 3 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y la
prueba inversa de suero, realizada con un elemento sellante
tridimensional en forma de barra;
La Fig. 4 una vista explosiva del dispositivo
según la invención para ensayos de flujo lateral representado en la
Fig. 3;
La Fig. 5 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y la
prueba inversa de suero, realizada con un elemento sellante
tridimensional en forma de artesa;
La Fig. 6 una vista explosiva del dispositivo
según la invención para ensayos de flujo lateral representado en la
Fig. 5;
La Fig. 7 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos, la
prueba inversa de suero y el ensayo de detección de anticuerpos para
receptores;
La Fig. 8 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos, la
prueba inversa de suero y el ensayo de detección de anticuerpos para
donantes;
La Fig. 9 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y la
detección de marcadores de infección;
La Fig. 10 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral para la
práctica simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y la
detección de anticuerpos contra antígenos trombocíticos;
La Fig. 11 una vista en perspectiva de un
dispositivo según la invención para ensayos de flujo lateral con
flujo bidireccional para la práctica simultánea de la determinación
de grupos sanguíneos y la prueba inversa de suero;
La Fig. 12 una vista explosiva del dispositivo
según la invención para ensayos de flujo lateral representado en la
Fig. 17.
En la Fig. 1, se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo según la invención para ensayos de
flujo lateral para la práctica simultánea de la determinación de
grupos sanguíneos y la prueba inversa de suero. En el presente
ejemplo, el dispositivo está compuesto por una capa de soporte 1, la
membrana porosa 2, la almohadilla de absorción 3 y el elemento
sellante 4 bidimensional realizado en forma de barra. A este
respecto, la membrana porosa 2 está fijada sobre la capa de soporte
1 dotada de un adhesivo de acrilato sensible a la presión.
Igualmente, la almohadilla de absorción 3 está fijada sobre la capa
de soporte 1, en la que una parte de la almohadilla de absorción 3
se superpone a la membrana porosa. El elemento sellante 4 fijado
sobre el lado superior de la membrana porosa 2 separa la zona de
aplicación 5 de la superficie de membrana restante y posibilita la
distribución dirigida del líquido de muestra y los reactivos de
ensayo en la membrana porosa 2. Entre la zona de aplicación 5 y la
región de membrana porosa 2 que está en contacto con la almohadilla
de absorción 3, se dispone la región de zonas indicadoras 6. Ésta
está formada por las zonas indicadoras I-IX en
forma de punto dispuestas diagonalmente escalonadas en posiciones X
e Y definidas, comprendiendo las zonas indicadoras
I-V la región de zonas indicadoras de "prueba
inversa de suero" y las zonas indicadoras VI-IX
la región de zonas indicadoras "determinación de los grupos
sanguíneos" y estando compuesta por los siguientes elementos de
unión:
La zona indicadora V es el control (ctl) de la
prueba inversa de suero y contiene anticuerpos
anti-IgG/IgM humana. La zona indicadora IX es el
control (ctl) de la determinación de grupos sanguíneos y contiene
anticuerpos policlonales antieritrocíticos. Se localiza dispuesta
distalmente a todas las zonas indicadoras restantes.
En la Fig. 2, se muestra una vista explosiva del
dispositivo para ensayos de flujo lateral según la invención
representado en la Fig. 1, que está compuesto por los componentes
capa de soporte 1, membrana porosa 2, almohadilla de absorción 3 y
elemento sellante 4 que separa la zona de aplicación 5 del resto de
la membrana, que a su vez comprende la región de zonas indicadoras
6, compuesta por las regiones de zonas indicadoras "prueba inversa
de suero" y "determinación de grupos sanguíneos" que
contiene las zonas indicadoras I-IX dispuestas
diagonalmente escalonadas.
En la Fig. 3, se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo para ensayos de flujo lateral
según la invención para la práctica simultánea de la determinación
del grupo sanguíneo y la prueba inversa de suero. En el presente
ejemplo, los componentes del dispositivo corresponden a los
componentes del dispositivo representado en la Fig. 1 con excepción
del elemento sellante 4 fijado sobre el lado superior de la membrana
porosa 2 realizado en forma de barra tridimensional.
En la Fig. 4, se muestra una vista explosiva del
dispositivo para ensayos de flujo lateral según la reivindicación
representado en la Fig. 3, con los componentes capa de soporte 1,
membrana porosa 2, almohadilla de absorción 3 y elemento sellante 4
realizado en forma de barra tridimensional que separa la zona de
aplicación 5 del resto de la membrana, que a su vez contiene la
región de zonas indicadoras 6 compuesta por las regiones de zonas
indicadoras "prueba inversa de suero" y ``determinación de
grupos sanguíneos con las zonas indicadoras I-IX
dispuestas diagonalmente escalonadas.
En la Fig. 5, se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo para ensayos de flujo lateral
según la invención para la práctica simultánea de la determinación
de grupos sanguíneos y la prueba inversa de suero. En el presente
ejemplo, los componentes corresponden a los componentes del
dispositivo representado en la Fig. 1 con excepción del elemento
sellante 4 fijado sobre el lado superior de la membrana porosa 2
realizado en forma de artesa tridimensional.
En la Fig. 6, se muestra una vista explosiva del
dispositivo para ensayos de flujo lateral según la reivindicación
representado en la Fig. 5, con los componentes capa de soporte 1,
membrana porosa 2, almohadilla de absorción 3 y elemento sellante 4
realizado en forma de artesa tridimensional que separa la zona de
aplicación 5 del resto de la membrana, que a su vez contiene la
región de zonas indicadoras 6 compuesta por las regiones de zonas
indicadoras "prueba inversa de suero" y "determinación de
grupos sanguíneos" con las zonas indicadoras I-IX
dispuestas diagonalmente escalonadas.
En la Fig. 7, se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo para ensayos de flujo lateral
según la invención para la práctica simultánea de la determinación
de grupos sanguíneos, la prueba inversa de suero y el ensayo de
detección de anticuerpos en receptores. En el presente ejemplo, el
dispositivo está compuesto por una capa de soporte 1, la membrana
porosa 2, la almohadilla de absorción 3 y el elemento sellante 4
realizado en forma de barra bidimensional. A este respecto, la
membrana porosa 2 está fijada sobre la capa de soporte 1 dotada de
un adhesivo de acrilato sensible a la presión. Igualmente, la
almohadilla de absorción 3 está fijada sobre la capa de soporte 1,
superponiéndose una parte de la almohadilla de absorción 3 con la
membrana porosa 2. El elemento sellante 4 fijado sobre el lado
superior de la membrana porosa 2 separa la zona de aplicación 5 del
resto de la superficie de membrana y posibilita la distribución
dirigida de líquido de muestra y reactivos de ensayo en la membrana
porosa 2. Entre la zona de aplicación 5 y la región de membrana
porosa 2 que está en contacto con la almohadilla de absorción 3, se
dispone la región de zonas indicadoras 6. Ésta está formada por las
zonas indicadoras I-XII en forma de punto dispuestas
diagonalmente escalonadas en posiciones X e Y definidas,
comprendiendo las zonas indicadoras I-VIII la región
de zonas indicadoras de "prueba inversa de suero" y las zonas
indicadoras IX-XII la región de zonas indicadoras
"determinación de los grupos sanguíneos" y estando compuesta
por los siguientes elementos de unión:
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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La zona indicadora VII es el control (ctl) de la
prueba inversa de suero y el ensayo de detección de anticuerpos y
contiene anticuerpo anti-IgG/IgM humana. La zona
indicadora XII es el control (ctl) de la determinación de grupo
sanguíneo y contiene anticuerpos policlonales antieritrocíticos. Se
localiza dispuesta distalmente a todas las zonas indicadoras
restantes.
En la Fig. 8, se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo para ensayos de flujo lateral
según la invención para la práctica simultánea de la determinación
de grupos sanguíneos, la prueba inversa de suero y el ensayo de
detección de anticuerpos en donantes de sangre. En el presente
ejemplo, el dispositivo está compuesto por una capa de soporte 1,
la membrana porosa 2, la almohadilla de absorción 3 y el elemento
sellante 4 realizado en forma de barra bidimensional. A este
respecto, la membrana porosa 2 está fijada sobre la capa de soporte
1 dotada de un adhesivo de acrilato sensible a la presión.
Igualmente, la almohadilla de absorción 3 está fijada sobre la capa
de soporte 1, superponiéndose una parte de la almohadilla de
absorción 3 con la membrana porosa 2. El elemento sellante 4 fijado
sobre el lado superior de la membrana porosa 2 separa la zona de
aplicación 5 del resto de la superficie de membrana y posibilita la
distribución dirigida de líquido de muestra y reactivos de ensayo
en la membrana porosa 2. Entre la zona de aplicación 5 y la región
de membrana porosa 2 que está en contacto con la almohadilla de
absorción 3, se dispone la región de zonas indicadoras 6. Esta está
formada por las zonas indicadoras I-X en forma de
punto dispuestas diagonalmente escalonadas en posiciones X e Y
definidas, comprendiendo las zonas indicadoras I-VI
la región de zonas indicadoras de "prueba inversa de suero/ensayo
de detección de anticuerpos" y las zonas indicadoras
VII-X la región de zonas indicadoras
"determinación de los grupos sanguíneos" y estando compuesta
por los siguientes elementos de unión:
\vskip1.000000\baselineskip
La zona indicadora VI es el control (ctl) de la
prueba inversa de suero y el ensayo de detección de anticuerpos y
contiene anticuerpos anti-IgG/IgM humana. La zona
indicadora X es el control (ctl) de la determinación de grupos
sanguíneos y contiene anticuerpos policlonales antieritrocíticos. Se
localiza dispuesta distalmente a todas las zonas indicadoras
restantes.
En la Fig. 9, se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo para ensayos de flujo lateral
según la invención para la práctica simultánea de la determinación
de grupos sanguíneos y la detección de marcadores de infección. En
el presente ejemplo, el dispositivo está compuesto por una capa de
soporte 1, la membrana porosa 2, la almohadilla de absorción 3 y el
elemento sellante 4 realizado en forma de barra bidimensional. A
este respecto, la membrana porosa 2 está fijada sobre la capa de
soporte 1 dotada de un adhesivo de acrilato sensible a la presión.
Igualmente, la almohadilla de absorción 3 está fijada sobre la capa
de soporte 1, superponiéndose una parte de la almohadilla de
absorción 3 con la membrana porosa 2. El elemento sellante 4 fijado
sobre el lado superior de la membrana porosa 2 separa la zona de
aplicación 5 del resto de la superficie de membrana y posibilita la
distribución dirigida de líquido de muestra y reactivos de ensayo en
la membrana porosa 2. Entre la zona de aplicación 5 y la región de
membrana porosa 2 que está en contacto con la almohadilla de
absorción 3, se dispone la región de zonas indicadoras 6. Ésta está
formada por las zonas indicadoras I-XII en forma de
punto dispuestas diagonalmente escalonadas en posiciones X e Y
definidas, comprendiendo las zonas indicadoras I-VI
la región de zonas indicadoras de "detección de marcadores de
infección" y las zonas indicadoras VII-XII la
región de zonas indicadoras "determinación de los grupos
sanguíneos" y estando compuesta por los siguientes elementos de
unión:
\vskip1.000000\baselineskip
La zona indicadora VI es el control (ctl) de la
determinación de anticuerpos contra agentes infecciosos y contiene
anticuerpos anti-IgG/IgM humanos. La zona indicadora
XII es el control (ctl) de la determinación del grupo sanguíneo y
contiene anticuerpos policlonales antieritrocíticos. Se localiza
dispuesta distalmente a todas las zonas indicadoras restantes.
En la Fig. 10 se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo para ensayos de flujo lateral
según la invención para la práctica simultánea de la determinación
de grupos sanguíneos y la detección de anticuerpos contra antígenos
trombocíticos. En el presente ejemplo, el dispositivo está compuesto
por una capa de soporte 1, la membrana porosa 2, la almohadilla de
absorción 3 y el elemento sellante 4 realizado en forma de barra
bidimensional. A este respecto, la membrana porosa 2 está fijada
sobre la capa de soporte 1 dotada de un adhesivo de acrilato
sensible a la presión. Igualmente, la almohadilla de absorción 3
está fijada sobre la capa de soporte 1, superponiéndose una parte
de la almohadilla de absorción 3 con la membrana porosa 2. El
elemento sellante 4 fijado sobre el lado superior de la membrana
porosa 2 separa la zona de aplicación 5 del resto de la superficie
de membrana y posibilita la distribución dirigida de líquido de
muestra y reactivos de ensayo en la membrana porosa 2. Entre la
zona de aplicación 5 y la región de membrana porosa 2 que está en
contacto con la almohadilla de absorción 3, se dispone la región de
zonas indicadoras 6. Ésta está formada por las zonas indicadoras
I-IX en forma de punto dispuestas diagonalmente
escalonadas en posiciones X e Y definidas, comprendiendo las zonas
indicadoras I-III la región de zonas indicadoras de
"detección de anticuerpos contra antígenos trombocíticos" y
las zonas indicadoras IV-IX la región de zonas
indicadoras "determinación de los grupos sanguíneos" y estando
compuesta por los siguientes elementos de unión:
La zona indicadora III es el control (ctl) de la
detección de anticuerpos contra antígenos trombocíticos y contiene
anticuerpos anti-IgG/IgM humana. La zona indicadora
IX es el control (ctl) de la determinación de grupos sanguíneos y
contiene anticuerpos policlonales antieritrocíticos. Se localiza
dispuesta distalmente a todas las zonas indicadoras restantes.
En la Fig. 11 se muestra como ejemplo una vista
en perspectiva de un dispositivo para ensayos de flujo lateral
según la invención con flujo bidireccional para la determinación
simultánea de la determinación de grupos sanguíneos y la prueba
inversa de suero. En el presente ejemplo, el dispositivo está
compuesto por una capa de soporte 1, una membrana porosa 2a para la
determinación de los grupos sanguíneos, una membrana porosa 2b
distinta de la membrana 2a para la prueba inversa de suero, las
almohadillas de absorción 3a y 3b, un elemento sellante 4 realizado
en forma de artesa tridimensional y una almohadilla de conjugado 6.
A este respecto, las membranas porosas 2a y 2b están fijadas sobre
la capa de soporte 1 dotada de un adhesivo de acrilato sensible a
la presión. Igualmente, las almohadillas de absorción 3a y 3b están
fijadas sobre la capa de soporte 1, superponiéndose una parte de
cada almohadilla de absorción 3a y 3b con las membranas porosas 2a y
2b. El elemento sellante 4 fijado sobre el lado superior de las
membranas porosas 2a y 2b separa las zonas de aplicación 5a y 5b
del resto de la superficie de membrana y posibilita la distribución
dirigida de líquido de muestra y reactivos de ensayo en las
membranas porosas 2a y 2b. Entre la zona de aplicación 5a y la
región de membrana porosa 2a que está en contacto con la
almohadilla de absorción 3a, se dispone la región de zonas
indicadoras 7a (determinación de grupos sanguíneos). Ésta está
formada por las zonas indicadoras I-VI en forma de
punto dispuestas diagonalmente escalonadas en posiciones X e Y
definidas, estando compuestas las zonas indicadoras de la región de
zonas indicadoras 7a por los siguientes elementos de unión:
La zona indicadora VI es el control (ctl) de la
determinación de grupos sanguíneos y contiene anticuerpos
policlonales antieritrocíticos. Se localiza dispuesta distalmente a
las zonas indicadoras I-V.
Entre la zona de aplicación 5b y la región de
membrana porosa 2b que está en contacto con la almohadilla de
absorción 3b, se dispone la región de zonas indicadoras 7b (prueba
inversa de suero). Ésta está formada por las zonas indicadoras
VII-IX en forma de punto dispuestas diagonalmente
escalonadas en posiciones X e Y definidas, estando compuestas las
zonas indicadoras de la región de zonas indicadoras 7b por los
siguientes elementos de unión:
En la Fig. 12 se muestra una vista explosiva del
dispositivo para ensayos de flujo lateral con flujo bidireccional
según la invención representado en la Fig. 11, que está compuesto
por los componentes capa de soporte 1, una membrana porosa 2a para
la determinación de grupos sanguíneos, una membrana porosa 2b
diferente de la membrana porosa 2a para la prueba inversa de suero,
las almohadillas de absorción 3a y 3b, un elemento sellante
realizado en forma de artesa tridimensional 4 y una almohadilla de
conjugado 6. La zona de aplicación de muestra se extiende sobre
ambas membranas porosas, con la zona de aplicación de muestra 5a de
la membrana 2a y la zona de aplicación de muestra 5b de la membrana
2b, y se separa por el elemento sellante 4 realizado en forma de
artesa del resto de la superficie de las membranas 2a y 2b. La
membrana 2a contiene la región de zonas indicadoras 7a con las
zonas indicadoras I-VI dispuestas diagonalmente
escalonadas de proximal a distal, mientras que la membrana 2b
contiene la región de zonas indicadoras 7b con las zonas indicadoras
VII-IX dispuestas diagonalmente escalonadas de
proximal a distal.
Las tiras de ensayo están compuestas por una
zona de aplicación, una región de zonas indicadoras y una región de
absorción. Se recortan membranas de clase Millipore HiFlow Plus 065
en tiras de un tamaño de 15 mm x 35 mm (anchura/longitud; x/y) y se
adhieren a una capa de soporte ("Backing Sheet", por ejemplo de
G&L). Se aplican puntos de 0,2 \mul cada uno diagonalmente
escalonados en la región de zonas indicadoras que se divide en la
región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero"
(dispuesta proximalmente a la zona de aplicación) y
"determinación de grupos sanguíneos" (dispuesta distalmente a
la zona de aplicación) de los distintos elementos de unión usando un
dispensador, por ejemplo, AD3200 (Biodot):
Región de zonas indicadoras "prueba inversa de
suero" - suspensiones de eritrocitos fantasma de especificación
de grupo sanguíneo A1, grupo sanguíneo A2, grupo sanguíneo B y grupo
sanguíneo 0 (preparadas a partir de concentrados de eritrocitos),
así como anticuerpos anti-IgG/IgM humana ("Goat
anti human IgG", "Goat anti human IgM", Sigma,
I-3382, I-0759) como controles;
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" - anticuerpos anti-A - clon
Birma-1 (Serologicals, TLJ0105); anticuerpos
anti-B - clon ES-4 (Serologicals,
NCA0201); anticuerpos anti-AB - clones AB6, AB26,
AB92 (Medion Diagnostics, 010062); anticuerpos antieritrocíticos
("Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC", Rockland,
209-4139).
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero" empieza
con eritrocitos fantasma de especificación de grupo sanguíneo A1 en
posición x=2,5 mm/ y=10 mm. Todos los otros elementos de unión se
dispensan iterativamente a distancias de x=2,5 mm/ y=1,5 mm de la
posición de los eritrocitos fantasma de especificación de grupo
sanguíneo A1. Los eritrocitos fantasma se dispensan en forma de
suspensiones al 0,1-0,5% (v/v) en tampón fosfato de
potasio 15 mM, pH 7,5, 10% (v/v) de metanol, los anticuerpos
anti-IgG/IgM humana en forma de mezcla 1:1 a
concentraciones de 50 \mug/ml en tampón fosfato de potasio 15 mM,
pH 7,5, 10% (v/v) de metanol.
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" empieza con el anticuerpo anti-A en
posición x=3 mm/y=20 mm. Todos los otros elementos de unión se
dispensan iterativamente a distancias de x=3 mm/y=1,5 mm de la
posición del anticuerpo anti-A. Las diluciones de
los anticuerpos se realizan en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH
7,5, 10% (v/v) de metanol) del modo siguiente: anticuerpo
anti-A 1:3, anticuerpo anti-B 1:2,
anticuerpo anti-AB 1:4, anticuerpo
anti-RBC 1:3.
Después de la dispensación de los elementos de
unión, se secan las membranas durante 20 min a 40ºC y a continuación
se mantienen a humedad ambiental constante hasta la práctica del
ensayo. En el extremo distal de la zona de aplicación, se adhiere
una almohadilla de absorción de 15x15 mm de tamaño (Schleicher &
Schüll, 300) superpuesta 3 mm con la membrana. Se separa la zona de
aplicación del resto de la membrana mediante la adhesión de una tira
adhesiva de 1-2 mm de ancho (Tesa 4124) en posición
y=5 mm a lo largo de toda la anchura de la membrana.
Se usan como muestras de sangre sangre completa
anticoagulada. Para el ensayo mismo, se aplican a la zona de
aplicación 100 \mul de sangre no diluida o diluida en tampón de
dilución 1:3 ó 1:6 (EnlisstII, Medion Diagnostics o "Diluent
1", DiaMed). Cuando la sangre ha dejado la zona de aplicación, se
lava dos veces con 100 \mul de EnlisstII para eliminar de la
membrana los eritrocitos no unidos. A continuación, se aplican a la
zona de aplicación 50 \mul de partículas de oro conjugadas con
anticuerpos anti-IgG/A/M (20 a 40 nm, Arista
Biologicals, CGIGA-0800, CGIGG-0800,
CGIGM-0800), diluidos 1:10 (v/v) en TBS, 0,08% de
gelatina, 0,5% de albúmina. En lugar de partículas de oro, pueden
usarse también partículas de poliestireno de 100 a 400 nm, por
ejemplo de Merck Eurolab France/Estapor. Cuando las partículas de
oro han dejado la zona de aplicación, se lava la membrana de nuevo
una o dos veces con 100 \mul de EnlisstII.
- (a)
- Controles: El ensayo es válido si el control anti-RBC (zona indicadora IX, región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos") muestra una señal claramente positiva (punto rojo) y si el control anti-IgG/IgM (zona indicadora V, región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero") se colorea característicamente púrpura (partículas de oro) o del color de la partícula de poliestireno usada.
- (b)
- Resultados de ensayo: Según la presencia o ausencia de los antígenos de grupos sanguíneos respectivos, aparecen en las posiciones correspondientes de la región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos" puntos rojos (positivo) o la coloración de fondo casi blanca de la membrana (negativo). Las correspondientes isoaglutininas son identificables en la región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero" mediante la púrpura característica de la partícula de oro en forma de puntos de color púrpura o del color de la partícula de poliestireno usada. En ausencia de isoaglutinina, no son identificables señales distintas del fondo en estas posiciones.
Las tiras de ensayo están compuestas por una
zona de aplicación, dos regiones de zonas indicadoras en ambos
lados de la zona de aplicación y dos regiones de absorción. Se
recortan membranas de clase Millipore HiFlow Plus 065 y HiFlow Plus
140 en tiras de un tamaño de 15 mm x 20 mm (anchura/longitud; x/y) y
se adhieren lado a lado sobre una capa de soporte ("Backing
Sheet", por ejemplo de G&L). Se aplica sobre la membrana
HiFlow Plus 140 adicionalmente una almohadilla de conjugado en la
que se han introducido con secado partículas de oro conjugadas
anti-A/anti-B/anti-H,
de modo que se localice entre el elemento sellante (tiras adhesivas)
y las zonas indicadoras. En lugar de partículas de oro, pueden
usarse también partículas de poliestireno coloreadas de 100 a 400
nm, por ejemplo de Merck Eurolab France/Estapor. Se aplican puntos
de 0,2 \mul cada uno diagonalmente escalonados en la región de
zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos", que se
localiza sobre la membrana HiFlow Plus 065, de los siguientes
elementos de unión usando un dispensador, por ejemplo AD3200
(Biodot): anticuerpos anti-A - clon
Birma-1 (Serologicals, TLJ0105); anticuerpos
anti-B - clon ES-4 (Serologicals,
NCA0201); anticuerpos anti-AB - clones AB6, AB26,
AB92 (Medion Diagnostics, 010062); anticuerpos antieritrocíticos
("Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC", Rockland,
209-4139).
De la misma manera, se aplican en la región de
zonas indicadoras "prueba inversa de suero", que se localiza
sobre la membrana HiFlow Plus 140, - suspensiones de eritrocitos
fantasma de grupo sanguíneo A, grupo sanguíneo B y grupo sanguíneo 0
(preparadas a partir de concentrados de eritrocitos).
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero" empieza
con eritrocitos fantasma de especificación de grupo sanguíneo A en
posición x=3 mm/ y=10 mm. Todos los otros elementos de unión se
dispensan iterativamente a distancias de x=3 mm/y=1,5 mm de la
posición de los eritrocitos fantasma de especificación de grupo
sanguíneo A. Los eritrocitos fantasma se dispensan en forma de
suspensiones al 0,1-0,5% (v/v) en tampón fosfato de
potasio 15 mM, pH 7,5, 10% (v/v) de metanol.
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" empieza con el anticuerpo anti-A en
posición x=2,5 mm/y=20 mm. Todos los otros elementos de unión se
dispensan iterativamente a distancias de x=2 mm/y=1,5 mm de la
posición del anticuerpo anti-A. Las diluciones de
los anticuerpos se realizan en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH
7,5, 10% (v/v) de metanol) del modo siguiente: anticuerpo
anti-A 1:3, anticuerpo anti-B 1:2,
anticuerpo anti-AB 1:4, anticuerpo
anti-RBC 1:3.
Después de la dispensación de los elementos de
unión, se secan las membranas durante 20 min a 40ºC y a continuación
se mantienen a humedad ambiental constante hasta la práctica del
ensayo. En ambos extremos distales de la zona de aplicación, se
adhiere una almohadilla de absorción de 15x15 mm de tamaño
(Schleicher & Schüll, 300) superpuesta 3 mm con la membrana. Se
separa la zona de aplicación del resto de la membrana mediante la
adhesión de una tira adhesiva de 1-2 mm de ancho
(Tesa 4124) en posición y=5 mm a lo largo de toda la anchura de
la
membrana.
membrana.
Se usan como muestras de sangre sangre completa
anticoagulada. Para el ensayo mismo, se aplican a la zona de
aplicación 100 \mul de sangre no diluida o diluida en tampón de
dilución 1:3 ó 1:6 (EnlisstII, Medion Diagnostics o "Diluent
1", DiaMed). Cuando la sangre ha dejado la zona de aplicación, se
lava dos veces con 100 \mul de EnlisstII para eliminar de la
membrana los eritrocitos no unidos.
- (a)
- Controles: El ensayo es válido si el control anti-RBC (región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos") muestra una señal claramente positiva (punto rojo) y si el control de grupo sanguíneo 0 de eritrocitos (región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero") se colorea característicamente púrpura (partículas de oro) o del color de la partícula de poliestireno usada.
- (b)
- Resultados de ensayo: Según la presencia o ausencia de los respectivos antígenos de grupos sanguíneos, aparecen en las posiciones correspondientes de la región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos" puntos rojos (positivo) o la coloración de fondo casi blanca de la membrana (negativo). Las correspondientes isoaglutininas se caracterizan en la región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero" por la falta de la banda correspondiente. En ausencia de una isoaglutinina, la correspondiente banda está coloreada característicamente.
Las tiras de ensayo están compuestas por una
zona de aplicación, una región de zonas indicadoras y una región de
absorción. Se recortan membranas de clase Millipore HiFlow Plus 065
en tiras de un tamaño de 20 mm x 35 mm (anchura/longitud; x/y) y se
adhieren sobre una capa de soporte ("Backing Sheet", por
ejemplo de G&L). Se aplican puntos de 0,2 \mul cada uno
diagonalmente escalonados en la región de zonas indicadoras que se
divide en regiones de zonas indicadoras "prueba inversa de
suero/detección de anticuerpos" (dispuesta proximalmente a la
zona de aplicación) y "determinación de grupos sanguíneos"
(dispuesta distalmente a la zona de aplicación), de los distintos
elementos de unión usando un dispensador, por ejemplo, AD3200
(Biodot):
Región de zonas indicadoras "prueba inversa de
suero/detección de anticuerpos" - suspensiones de eritrocitos
fantasma de especificación de grupo sanguíneo A1, grupo sanguíneo
A2, grupo sanguíneo 0, grupo sanguíneo 0 fórmula Rh
R_{1}R_{1}^{W} (célula de detección 1), grupo sanguíneo 0
fórmula Rh R_{2}R_{2} (célula de detección 2), grupo sanguíneo
0 fórmula Rh R_{1}R_{1} (célula de detección 3), así como
anticuerpos anti-IgG/IgM humana ("Goat anti human
IgG", "Goat anti human IgM", Sigma, I-3382,
1-0759) como controles; región de zonas indicadoras
"determinación de grupos sanguíneos" - anticuerpos
anti-A - clon Birma-1 (Serologicals,
TLJ0105); anticuerpos anti-B - clon
ES-4 (Serologicals, NCA0201); anticuerpos
anti-B - (clones AB6, AB26, AB92 (Medion
Diagnostics, 010062); anticuerpos antieritrocíticos ("Rabbit IgG
Fraction of anti Human RBC", Rockland,
209-4139).
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero" empieza
con eritrocitos fantasma de especificación de grupo sanguíneo A1 en
posición x=3 mm/ y=10 mm, la colocación de los eritrocitos fantasma
de especificación de grupo sanguíneo A2, B, 0 sigue iterativamente a
distancias de x=2 mm/y=1,5 mm. La colocación de los eritrocitos
fantasma de la célula de detección 1 se realiza en la posición x=11
mm/y=10 mm, la colocación de los eritrocitos fantasma de las células
de detección 2 y 3, así como de IgG/IgM humanas iterativamente a
distancias de x=2 mm/y=1,5 mm. Los eritrocitos fantasma se dispensan
en forma de suspensiones al 0,1-0,5% (v/v) en
tampón fosfato de potasio 15 mM, pH 7,5, 10% (v/v) de metanol, los
anticuerpos anti-IgG/IgM humana en forma de mezcla
1:1 en concentración de 50 \mug/ml en tampón fosfato de potasio 15
mM, pH 7,5, 10% (v/v) de
metanol.
metanol.
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" empieza con el anticuerpo anti-A en
posición x=4. mm/y=20 mm. Todos los otros elementos de unión se
dispensan iterativamente a distancias de x=4 mm/y=1,5 mm de la
posición del anticuerpo anti-A. Las diluciones de
los anticuerpos se realizan en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH
7,5, 10% (v/v) de metanol) del modo siguiente: anticuerpo
anti-A 1:3, anticuerpo anti-B 1:2,
anticuerpo anti-AB 1:4, anticuerpo
anti-RBC 1:3.
Después de la dispensación de los elementos de
unión, se secan las membranas durante 20 min a 40ºC y a continuación
se mantienen a humedad ambiental constante hasta la práctica del
ensayo. En el extremo distal a la zona de aplicación, se adhiere
una almohadilla de absorción de 20x15 mm de tamaño (Schleicher &
Schüll, 300) superpuesta 3 mm con la membrana. Se separa la zona de
aplicación del resto de la membrana mediante la adhesión de una tira
adhesiva de 1-2 mm de ancho (Tesa 4124) en posición
y=5 mm a lo largo de toda la anchura de la membrana.
Se usan como muestras de sangre completa
anticoagulada. Para el ensayo real, se aplican a la zona de
aplicación 120 \mul de sangre no diluida o diluida en tampón de
dilución 1:3 ó 1:6 (EnlisstII, Medion Diagnostics o "Diluent
1", DiaMed). Cuando la sangre ha dejado la zona de aplicación, se
lava dos veces con 120 \mul de EnlisstII para eliminar de la
membrana los eritrocitos no unidos. A continuación, se aplican a la
zona de aplicación 75 \mul de partículas de oro conjugadas con
anticuerpos anti-IgG/A/M (20 a 40 nm, Arista
Biologicals, CGIGA-0800,
CGIGG-0800, CGIGM-0800), diluidos
1:10 (v/v) en TBS, 0,08% de gelatina, 0,5% de albúmina. En lugar de
partículas de oro, pueden usarse también partículas de poliestireno
de 100 a 400 nm, por ejemplo de Merck Eurolab France/Estapor.
Cuando las partículas de oro han dejado la zona de aplicación, se
lava la membrana de nuevo una o dos veces con 120 \mul de
EnlisstII.
- (a)
- Controles: El ensayo es válido si el control anti-RBC (zona indicadora XII, región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos") muestra una señal claramente positiva (punto rojo) y si el control anti-IgG/IgM (zonas indicadoras VIII, región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero/detección de anticuerpos") se colorea característicamente púrpura (partícula de oro) o del color de la partícula de poliestireno usada. El control anti-IgG/IgM debe colorearse en cualquier caso, de modo que en una persona con grupo sanguíneo AB, que no tiene anticuerpos irregulares, la coloración de esta zona indicadora en ausencia total de otras señales de la región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero/detección de anticuerpos" confirme una práctica de ensayo correcta. La zona indicadora IV (eritrocitos fantasma de grupo sanguíneo 0) es un control negativo de isoaglutininas. Una coloración de esta zona indicadora significa que, además de isoaglutininas, deben estar presentes también anticuerpos irregulares, es decir, que al menos una de las tres zonas indicadoras V, VI, VII debe estar igualmente coloreada. Si no es el caso, el ensayo no es válido.
- (b)
- Resultados de ensayo: Según la presencia o ausencia de los antígenos de grupos sanguíneos respectivos, aparecen en las correspondientes posiciones de la región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos" puntos rojos (positivo) o la coloración de fondo casi blanca de la membrana (negativo). Las correspondientes isoaglutininas son identificables en la región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero" mediante la púrpura característica de la partícula de oro en forma de puntos de color púrpura o del color de la partícula de poliestireno usada. En ausencia de una isoaglutinina, no son identificables señales distintas del fondo en estas posiciones. En presencia de un anticuerpo irregular, son identificables una, dos o las tres zonas indicadoras con los eritrocitos fantasma de las células de detección 1, 2 ó 3 coloreados con la púrpura característica de la partícula de oro o del color de la partícula de poliestireno usada.
La configuración básica de las tiras de ensayo
corresponde a la configuración de tiras de ensayo del ejemplo 2. El
formato de la membrana Millipore HiFlow Plus 065 asciende a 15 mm x
35 mm (anchura/longitud; x/y). Las zonas indicadoras de la región
de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos"
corresponden al ejemplo 2. En la región de zonas indicadoras
"prueba inversa de suero/detección de anticuerpos", se
dispensan puntos de 0,2 \mul cada uno de los siguientes elementos
de unión usando un dispensador, por ejemplo AD3200 (Biodot):
Suspensiones de eritrocitos fantasma de
especificación de grupo sanguíneo A1, grupo sanguíneo A2, grupo
sanguíneo B, grupo sanguíneo 0, eritrocitos fantasma de una mezcla
de células de detección 1-3 (véase el ejemplo 2),
así como anticuerpos anti-IgG/IgM humana ("Goat
anti human IgG", "Goat anti human IgM", Sigma,
I-3382, I-0759) como controles.
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero/detección de
anticuerpos" empieza con eritrocitos fantasma de especificación
de grupo sanguíneo A1 en posición x=2,5 mm/y=10 mm, la colocación
de los eritrocitos fantasma de especificación de grupo sanguíneo A2,
B, 0 es iterativa a distancias de x=2 mm/y=1,5 mm. La colocación de
eritrocitos fantasma de la mezcla de células de detección
1-3 se realiza en posición x=10,5 mm/y=13 mm, la de
IgG/IgM humanas en posición x=12,5 mm/y=14,5 mm. Los eritrocitos
fantasma se dispensan en forma de suspensiones al
0,1-0,5% (v/v) en tampón fosfato de potasio 1 mM, pH
7,5, 10% (v/v) de metanol, los anticuerpos
anti-IgG/IgM humana en forma de mezcla 1:1 a
concentración de 50 \mug/ml en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH
7,5, 10% (v/v) de metanol.
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" empieza con el anticuerpo anti-A en
posición x=3 mm/y=20 mm. Todos los otros elementos de unión de la
región de zonas indicadoras se dispensan iterativamente a
distancias de x=3 mm/y=1,5 mm de la posición del anticuerpo
anti-A. Las diluciones de los anticuerpos se
realizan en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH 7,5, 10% (v/v) de
metanol) del modo siguiente: anticuerpo anti-A 1:3,
anticuerpo anti-B 1:2, anticuerpo
anti-AB 1:4, anticuerpo anti-RBC
1:3.
Después de la dispensación de los elementos de
unión, se secan las membranas durante 20 min a 40ºC y a continuación
se mantienen a humedad ambiental constante hasta la práctica del
ensayo. En los extremos distales a la zona de aplicación, se
adhiere una almohadilla de absorción de 15x15 mm de tamaño
(Schleicher & Schüll, 300) superpuesta 3 mm con la membrana. Se
separa la zona de aplicación del resto de la membrana mediante la
adhesión de una tira adhesiva de 1-2 mm de ancho
(Tesa 4124) en posición y=6 mm a lo largo de toda la anchura de la
membrana.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación de ensayo corresponde a la
preparación del ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
- (a)
- Controles: El ensayo es válido cuando el control anti-RBC (zona indicadora X, región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos") muestra una señal claramente positiva (punto rojo) y cuando el control anti-IgG/IgM (zona indicadora VI, región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero/detección de anticuerpos") se colorea característicamente púrpura (partícula de oro) o del color de la partícula de poliestireno usada. El control anti-IgG/IgM debe colorearse en cualquier caso, de modo que en una persona con grupo sanguíneo AB, que no tiene anticuerpos irregulares, la coloración de esta zona indicadora en ausencia total de otras señales de la región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero/detección de anticuerpos" confirme una práctica de ensayo correcta. La zona indicadora IV (eritrocitos fantasma de grupo sanguíneo 0) es un control negativo. Una coloración de esta zona indicadora significa que, además de isoaglutininas, deben estar presentes también anticuerpos irregulares, es decir, que al menos una de las tres zonas indicadoras V, VI, VII debe estar igualmente coloreada. Si no es el caso, el ensayo no es válido.
- (b)
- Resultados de ensayo: Según la presencia o ausencia de los antígenos de grupos sanguíneos respectivos, aparecen en las correspondientes posiciones de la región de zonas indicadoras "determinación de grupos sanguíneos" puntos rojos (positivo) o la coloración de fondo casi blanca de la membrana (negativo). Las correspondientes isoaglutininas son identificables en la región de zonas indicadoras "prueba inversa de suero" mediante la púrpura característica de la partícula de oro en forma de puntos de color púrpura o del color de la partícula de poliestireno usada. En ausencia de una isoaglutinina, no son identificables señales distintas del fondo en estas posiciones. En presencia de un anticuerpo irregular, son identificables una, dos o las tres zonas indicadoras con los eritrocitos fantasma de las células de detección 1, 2 ó 3 coloreados con la púrpura característica de la partícula de oro o del color de la partícula de poliestireno usada.
\vskip1.000000\baselineskip
Las tiras de ensayo están compuestas por una
zona de aplicación, una región de zonas indicadoras y una región de
absorción. Se recortan membranas de clase Millipore HiFlow Plus 065
en tiras de un tamaño de 15 mm x 35 mm (anchura/longitud; x/y) y se
adhieren sobre una capa de soporte ("Backing Sheet", por
ejemplo de G&L). Se aplican puntos de 0,2 \mul cada uno
diagonalmente escalonados en la región de zonas indicadoras que se
divide en la región de zonas indicadoras "detección de marcadores
de infección" (dispuesta proximalmente a la zona de aplicación)
y "determinación de grupos sanguíneos" (dispuesta distalmente a
la zona de aplicación), de los distintos elementos de unión usando
un dispensador, por ejemplo, AD3200 (Biodot):
Región de zonas indicadoras "detección de
marcadores de infección" - soluciones de antígenos recombinantes
(sífilis; TpN 15, TpN 17, TpN 47), péptidos sintéticos de secuencias
de las glucoproteínas gp-14, gp-41
(VIH-1; VIH-0) y
gp-36 (VIH-2), antígenos
recombinantes de HCV (C-100, C-200,
C33c, C22), anticuerpos monoclonales (HBsAg), así como anticuerpos
anti-IgG/IgM humana ("Goat anti human IgG",
"Goat anti human IgM", Sigma, I-3382,
I-0759) como controles; región de zonas indicadoras
"determinación de grupos sanguíneos" - anticuerpos
anti-A - clon Birma-1
(Serologicals, TLJ0105); anticuerpos anti-B - clon
ES-4 (Serologicals, NCA0201); anticuerpos
anti-AB - clones AB6, AB26, AB92 (Medion
Diagnostics, 010062); anticuerpos anti-D - clones
LDM3/ESD1 (SNBTS), anticuerpos anti-CDE - clones
MS-24/MS-201/MS
80/MS-258 (Serologicals), anticuerpos
antieritrocíticos ("Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC",
Rockland, 209-4139).
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "detección de marcadores de
infección" empieza con péptidos sintéticos de especificidad
VIH-1 (gp-14, gp-41)
en posición x=2,5 mm/ y=10 mm. Todos los otros elementos de unión
se dispensan iterativamente a distancias de x=2 mm/ y=1,5 mm de la
posición de la zona indicadora I. Los elementos de unión de las
zonas indicadoras I-V se dispensan a concentraciones
adecuadas en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH 7,5, 10% (v/v) de
metanol, los anticuerpos anti-IgG/IgM humana a una
concentración de 50 \mug/ml en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH
7,5, 10% (v/v) de metanol.
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" empieza con el anticuerpo anti-A en
posición x=2,5 mm/y=20 mm. Todos los otros elementos de unión de la
región de zonas indicadoras se dispensan iterativamente a
distancias de x=2 mm/ y=1,5 mm de la posición del anticuerpo
anti-A. Las diluciones de los anticuerpos se
realizan en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH 7,5, 10% (v/v) de
metanol) del modo siguiente: anticuerpo anti-A 1:3,
anticuerpo anti-B 1:2, anticuerpo
anti-AB 1:4, anticuerpo anti-RBC
1:3.
Después de la dispensación de los elementos de
unión, se secan las membranas durante 20 min a 40ºC y a continuación
se mantienen a humedad ambiental constante hasta la práctica del
ensayo. En los extremos distales a la zona de aplicación, se
adhiere una almohadilla de absorción de 15x15 mm de tamaño
(Schleicher & Schüll, 300) superpuesta 3 mm con la membrana. Se
separa la zona de aplicación del resto de la membrana mediante la
adhesión de una tira adhesiva de 1-2 mm de ancho
(Tesa 4124) en posición y=6 mm a lo largo de toda la anchura de la
membrana.
Se usan como muestras de sangre sangre completa
anticoagulada. Para el ensayo real, se aplican a la zona de
aplicación 100 \mul de sangre no diluida o diluida en un tampón de
dilución 1:3 ó 1:6 (EnlisstII, Medion Diagnostics o "Diluent
1", DiaMed). Cuando la sangre ha dejado la zona de aplicación, se
lava dos veces con 100 \mul de EnlisstII para lavar de la membrana
los eritrocitos no unidos.
A continuación, se aplican a la zona de
aplicación 50 \mul de una mezcla de partículas de oro conjugadas
con anticuerpos anti-IgG/A/M (20 a 40 nm, Arista
Biologicals, CGIGA-0800, CGIGG-0800,
CGIGM-0800), diluidos 1:10 (v/v) en TBS, 0,08% de
gelatina, 0,5% de albúmina, así como partículas de oro conjugadas
con anticuerpo anti-HbsAg (Arista Biologicals,
ABHBS-0500) a dilución adecuada. En lugar de
partículas de oro, pueden usarse también partículas de poliestireno
de 100 a 400 nm, por ejemplo de Merck Eurolab France/Estapor. Cuando
las partículas de oro han dejado la zona de aplicación, se lava la
membrana de nuevo una o dos veces con 100 \mul de EnlisstII.
El ensayo es válido si el control
anti-RBC (zona indicadora XII, región de zonas
indicadoras "determinación de grupos sanguíneos") muestra una
señal claramente positiva (punto rojo) y si el control
anti-IgG/IgM (zona indicadora VI, región de zonas
indicadoras "detección de marcadores de infección") se colorea
característicamente púrpura (partículas de oro) o del color de la
partícula de poliestireno usada. Según la presencia o ausencia de
los antígenos de grupos sanguíneos respectivos, aparecen en las
posiciones correspondientes puntos rojos (positivo) o la coloración
de fondo casi blanca de la membrana (negativo). En presencia de
anticuerpos contra VIH-1, VIH-2,
sífilis o "Hepatitis B surface Antigen" (HBsAg), la posición
respectiva se colorea en la púrpura característica de las
partículas de oro y se identifica como puntos de color púrpura.
Cuando se usan partículas de poliestireno como partículas
indicadoras, se colorea la posición respectiva con el color de la
partícula de poliestireno usada. En el caso más frecuente, a saber
una reacción negativa de todos los marcadores de infección, se
colorean sólo los controles anti-IgG/IgM (zona
indicadora VI, región de zonas indicadoras "detección de
marcadores de infección").
La configuración básica y el formato de las
tiras de ensayo corresponden a la configuración de tiras de ensayo
del ejemplo 4. La región de zonas indicadoras se subdivide en la
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" y "detección de anticuerpos contra antígenos
trombocíticos". Se dispensan puntos de 0,2 \mul cada uno de
los siguientes elementos de unión usando un dispensador, por
ejemplo, AD3200 (Biodot):
Región de zonas indicadoras "detección de
anticuerpos contra antígenos trombocíticos" - proteínas de
membrana de trombocitos del grupo sanguíneo 0 con distintos
perfiles de antígenos HPA como HPA 1bb3aa5bb y HPA 1aa3bb5aa, así
como anticuerpos anti-IgG/IgM humana ("Goat anti
human IgG", "Goat anti human IgM", Sigma,
I-3382, I-0759) como control;
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" - anticuerpos anti-A - clon
Birma-1 (Serologicals, TLJ0105); anticuerpos
anti-B - clon ES-4 (Serologicals,
NCA0201); anticuerpos anti-AB - clones AB6, AB26,
AB92 (Medion Diagnostics, 010062); anticuerpos
anti-D - clones LDM3/ESD1 (SNBTS), anticuerpos
anti-CDE - clones
MS-24/MS-201/MS
80/MS-258 (Serologicals), anticuerpos
antieritrocíticos ("Rabbit IgG Fraction of anti Human RBC",
Rockland, 209-4139). Como alternativas a las
proteínas de membrana de trombocitos, pueden aplicarse también
antígenos recombinantes con los correspondientes tipos de
característica (perfil de antígeno HPA).
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "detección de anticuerpos contra
antígenos trombocíticos" empieza con las proteínas de membrana de
perfil de antígeno HPA 1bb3aa5bb en posición x=4 mm/ y=10 mm. Todos
los otros elementos de unión se dispensan a distancias de x=3,5 mm/
y=2 mm de la posición de la zona indicadora I. Los elementos de
unión de las zonas indicadoras I y II se dispensan a concentraciones
adecuadas en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH 7,5, 10% (v/v) de
metanol, los anticuerpos anti-IgG/IgM humana a una
concentración de 50 \mug/ml en tampón fosfato de potasio 15 mM, pH
7,5, 10% (v/v) de metanol.
La colocación de los elementos de unión de la
región de zonas indicadoras "determinación de grupos
sanguíneos" corresponde al ejemplo 4.
Después de la dispensación de los elementos de
unión, se secan las membranas durante 20 min a 40ºC y a continuación
se mantienen a humedad ambiental constante hasta la práctica del
ensayo. En los extremos distales a la zona de aplicación, se
adhiere una almohadilla de absorción de 15x15 mm de tamaño
(Schleicher & Schüll, 300) superpuesta 3 mm con la membrana. Se
separa la zona de aplicación del resto de la membrana mediante la
adhesión de una tira adhesiva de 1-2 mm de ancho
(Tesa 4124) en posición y=6 mm a lo largo de toda la anchura de la
membrana.
Se usan como muestras de sangre sangre completa
anticoagulada. Para el ensayo real, se aplican a la zona de
aplicación 100 \mul de sangre no diluida o diluida en un tampón de
dilución 1:3 ó 1:6 (EnlisstII, Medion Diagnostics o "Diluent
1", DiaMed). Cuando la sangre ha dejado la zona de aplicación, se
lava dos veces con 100 \mul de EnlisstII para lavar de la membrana
los eritrocitos no unidos.
A continuación, se aplican a la zona de
aplicación 50 \mul de una mezcla de partículas de oro conjugadas
con anticuerpos anti-IgG/A/M (20 a 40 nm, Arista
Biologicals, CGIGA-0800, CGIGG-0800,
CGIGM-0800), diluidos 1:10 (v/v) en TBS, 0,08% de
gelatina, 0,5% de albúmina. En lugar de partículas de oro, pueden
usarse también partículas de poliestireno de 100 a 400 nm, por
ejemplo de Merck Eurolab France/Estapor. Cuando las partículas de
oro han dejado la zona de aplicación, se lava la membrana de nuevo
una o dos veces con 100 \mul de EnlisstII.
El ensayo es válido si el control
anti-RBC (zona indicadora IX, región de zonas
indicadoras "determinación de grupos sanguíneos") muestra una
señal claramente positiva (punto rojo) y si el control
anti-IgG/IgM (zona indicadora III, región de zonas
indicadoras "detección de anticuerpos contra antígenos
trombocíticos") se colorea característicamente púrpura
(partículas de oro) o del color de la partícula de poliestireno
usada. Según la presencia o ausencia de los antígenos de grupos
sanguíneos respectivos, aparecen en las correspondientes posiciones
puntos rojos (positivo) o la coloración de fondo casi blanca de la
membrana (negativo). En presencia de anticuerpos contra antígenos
trombocíticos, la posición respectiva se colorea en el púrpura
característico de las partículas de oro y se identifica como puntos
de color púrpura. Cuando se usan partículas de poliestireno como
partículas indicadoras, se colorea la posición respectiva con el
color de la partícula de poliestireno usada.
Claims (25)
1. Dispositivo para la determinación
simultánea, cualitativa o cuantitativa de varios analitos, en el que
al menos un analito es un analito unido a célula, en una muestra
líquida, en el que para la determinación se usan al menos dos clases
de partículas indicadoras, de las que al menos una clase son
eritrocitos, comprendiendo:
- una zona de aplicación (5) para la aplicación
de la muestra líquida,
- una membrana porosa (2) adecuada para la
penetración de componentes celulares con al menos dos zonas
indicadoras sobre la membrana que pueden interaccionar con
el(los) analito(s) y
- al menos una región de absorción (3) sobre la
membrana que absorbe el líquido después de pasar por las zonas
indicadoras,
en el que las zonas indicadoras se encuentran
entre la zona de aplicación (5) y una región de absorción (3), en el
que las direcciones de flujo desde la zona de aplicación (5) a
través de las zonas indicadoras respectivas hasta la región de
absorción (3) (trayectorias de flujo) son esencialmente paralelas y
se presentan al menos dos trayectorias de flujo distintas, en el que
la membrana comprende una primera zona indicadora que contiene un
elemento de unión para la unión de un analito unido a célula y la
membrana comprende una segunda zona indicadora que contiene un
elemento de unión para la unión de un analito contenido en el
plasma.
2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que las zonas indicadoras están dispuestas de modo que el líquido de
muestra no atraviese más de una zona indicadora por trayectoria de
flujo.
3. Dispositivo según la reivindicación 1, en el
que las zonas indicadoras están dispuestas en una serie diagonal, en
forma de V, W, M o N o lineal.
4. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos dos series de zonas
indicadoras están dispuestas en la dirección de flujo
consecutivamente y/o lateralmente escalonadas y las zonas
indicadoras de las distintas series están dispuestas al tresbolillo
entre sí, de modo que el líquido de muestra no atraviese más de una
zona indicadora por trayectoria de flujo.
5. Dispositivo según la reivindicación 1 ó 3,
en el que al menos dos series de zonas indicadoras están dispuestas
en la dirección de flujo consecutivamente y/o lateralmente y las
zonas indicadoras de las distintas series no están dispuestas al
tresbolillo entre sí, de modo que el líquido de muestra atraviese
más de una zona indicadora por trayectoria de flujo.
6. Dispositivo según la reivindicación 1 a 3,
en el que están dispuestos al menos dos grupos de zonas indicadoras
que se encuentran partiendo de la zona de aplicación en distintas
direcciones de flujo.
7. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que las zonas indicadoras comprenden
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo o lectinas, antígenos o
epítopos antigénicos y/o células o fragmentos de célula.
8. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las zonas indicadoras comprenden
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo contra antígenos o epítopos
antigénicos de grupos sanguíneos y membranas o fragmentos de célula
de eritrocitos de grupo sanguíneo A1, A2, B y/o 0.
9. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las zonas indicadoras comprenden
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo contra antígenos o epítopos
antigénicos contra grupos sanguíneos y péptidos sintéticos,
antígenos recombinantes y/o anticuerpos o fragmentos de anticuerpo
contra marcadores infecciosos.
10. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que las zonas indicadoras comprenden
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo contra antígenos o epítopos
antigénicos de grupos sanguíneos y fragmentos de trombocitos y/o
linfocitos.
11. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que la membrana o las membranas (2)
están compuestas por polietileno, nitrocelulosa o nailon.
12. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que detrás de la zona de aplicación
(5) y delante de las zonas indicadoras sobre la membrana (2) está
dispuesto al menos un elemento sellante (4).
13. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que detrás del elemento sellante (4)
y delante de las zonas indicadoras se aplica al menos un almohadilla
de conjugado.
14. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que los componentes del dispositivo
están aplicados sobre una capa de soporte (1) para reforzamiento
mecánico.
15. Dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que los componentes del dispositivo
están integrados en una carcasa.
16. Uso del dispositivo según una de las
reivindicaciones 1 a 11 para el análisis de sangre.
17. Uso según la reivindicación 16, en el que
el análisis es una práctica simultánea de la determinación de grupos
sanguíneos y la prueba inversa de suero y/o el ensayo de detección
de anticuerpos.
18. Uso según la reivindicación 16, en el que
el análisis es una práctica simultánea de la determinación de grupos
sanguíneos y la detección de marcadores serológicos de infección o
fragmentos de los mismos.
19. Uso según la reivindicación 16, en el que
el análisis es una práctica simultánea de la determinación de grupos
sanguíneos y la detección de anticuerpos contra células sanguíneas,
particularmente anticuerpos antitrombocíticos o antilinfocíticos o
fragmentos respectivos de los mismos.
20. Procedimiento para la determinación de
varios analitos o sus derivados en una muestra líquida,
comprendiendo:
la aplicación de la muestra sobre la zona de
aplicación (5) de al menos una membrana (2) del dispositivo según
una de las reivindicaciones precedentes 1 a 15, en el que esta
muestra se presenta en suficiente cantidad para inducir que el
líquido de muestra fluya en dirección de la región de absorción (3)
a través de las zonas indicadoras, y para inducir que los analitos o
sus derivados en el líquido de muestra formen un complejo en las
zonas indicadoras, y en el que se usan al menos dos clases de
partículas indicadoras, de las que al menos una clase son
eritrocitos.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que el analito o sus derivados son antígenos o epítopos
antigénicos de antígenos de grupos sanguíneos, anticuerpos dirigidos
contra antígenos de grupos sanguíneos o fragmentos de los mismos,
anticuerpos dirigidos contra trombocitos o leucocitos o fragmentos
de los mismos o anticuerpos dirigidos contra agentes infecciosos o
fragmentos de los mismos o antígenos o epítopos antigénicos de
agentes infecciosos.
22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó
21, en el que los analitos o sus derivados comprenden antígenos o
epítopos antigénicos de los sistemas de grupos sanguíneos AB0, Rh y
Kell.
23. Procedimiento según la reivindicación 20 ó
21, en el que los analitos o sus derivados comprenden anticuerpos o
fragmentos de los mismos contra trombocitos y/o linfocitos.
24. Procedimiento según la reivindicación 20 ó
21, en el que los analitos o sus derivados comprenden anticuerpos o
fragmentos de los mismos contra agentes bacterianos y/o víricos o
antígenos o epítopos antigénicos víricos o bacterianos.
25. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 20 a 24, en el que las muestras líquidas están
compuestas por sangre completa, concentrado de células sanguíneas,
suero, plasma y/o líquido de ensayo, por ejemplo, suero de control o
células de control.
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2009
- 2009-01-08 CY CY20091100008T patent/CY1108704T1/el unknown
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