CN106754947A - 一种人血型a抗原或b抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人血型a抗原或b抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用。属于生物医药领域。A/B抗原重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：a)A/B抗原的DNA片段克隆及表达载体的构建；b)A/B抗原基因重组蛋白的表达；c)A/B抗原基因重组蛋白的纯化。本发明制备的A/B重组抗原，具有稳定、灵敏等优点，突破了血型检测的条件限制，为临床急救与血液普查提供了新的思路与技术。

Description

一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体的涉及一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
ABO血型系统的检测在临床输血、器官移植、新生儿溶血检测等方面有重要意义，同时在人种学、遗传学、法医学、疾病抵抗力(或易感性)等方面都有应用价值。在输血前，一定要检查病人(受血者)和输血人(供血者)的血型，并且要进行交叉配血试验。为了保证正确的血型鉴定，卫生部在2000年发文(卫医法[2000]184号)明确规定：每位供血及受血的个体均要进行ABO血型正反定型。
人类ABO基因位于染色体9q34.1-34.2，ABO基因包含长度大小从28-688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，其中第6和第7外显子包括了77％的基因编码序列，同时也包括了91％的糖基转移酶催化区域序列。ABO基因的调控区域大约总长为18-20kb，产物是糖基转移酶，这些酶控制ABO血型抗原的生物合成。A和B等位基因编码一个长为354个氨基酸的蛋白质，ABO抗原的化学结构是糖蛋白，其血清学特异性取决于糖链末端3个糖基的结构，形成红细胞上不同的A、B凝集原，将血型分为O、A、B及AB血型。A型血红细胞上含A抗原，血清中含抗B抗体；B型血红细胞上含B抗原，血清中含抗A抗体；O型血红细胞上则没有A及B抗原，血清中含抗A及抗B抗体；AB型血红细胞上含A及B两种抗原，血清中则不含抗A及抗B抗体。A抗原和抗A抗体，B抗原和抗B抗体会发生免疫结合反应，使红细胞发生凝聚。
目前，ABO血型试验检测方法已经成熟的试验方法有血凝试验、微柱凝集试验、基因检测等方法。其中正反定型的血凝试验中用到的标准A型、B型和O型红细胞与抗A、抗B抗体，存在保存期短，保存条件较苛刻(2～8℃，避光)，且容易发生微生物污染及溶血现象等问题，这些问题容易导致血型鉴定出差错，甚至出现严重输血事故。微柱凝胶法检测时则需要特制的凝胶卡，同时需配备专用离心机，检测成本较高。除以上两种常用的方法之外，还有磁珠法。磁珠法在使用前，需进行试剂的复溶，复溶后的试剂存放时间较短，一般7天内必须使用完，而且需要专门的磁化程控振荡器。
而急救、血型普查、陈旧血液样本的检测等对血型的检测提出了更高的检验要求。所以开发更为准确、快速、简便的血型检测方法，突破传统的血型检测弊端，是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的问题，提供一种A抗原基因重组蛋白和B抗原基因重组蛋白。
本发明的另一目的是提供一种A抗原基因重组蛋白和B抗原基因重组蛋白的制备方法。
本发明采用的技术方案是：一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白，所述的人血型A抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的人血型B抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
上述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，方法如下：
1)提取人全血中的总DNA；
2)以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，分别得到A抗原PCR扩增产物或B抗原PCR扩增产物；其中，所述的特异性引物是：
上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；
下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；
上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；
下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；
PCR反应体系为：20μL体系：Mg2+1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA 100～200ng，超纯水余量；
PCR反应程序为：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，进行10个循环；94℃20s，60℃30s，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
3)将得到的A抗原PCR扩增产物和B抗原PCR扩增产物分别与质粒pMD18-T进行T克隆，得到重组质粒PMD18-T/A和PMD18-T/B；
4)将重组质粒PMD18-T/A及重组质粒PMD18-T/B分别和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，分别制得重组表达载体pUCm-4T-1/A及pUCm-4T-1/B；
5)将重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分别转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株；
6)将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，经诱导表达，纯化后，得到A抗原基因重组蛋白或B抗原基因重组蛋白。
所述的诱导表达是：将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。
所述的纯化是：将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中加入SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，上清液再加入SDS loadingbuffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得纯化的A抗原基因重组蛋白或B抗原基因重组蛋白。
本发明的有益效果为：
1.本发明，成功构建了重组表达载体pUCm-4T-1/A及pUCm-4T-1/B，并能在大肠杆菌中表达A抗原基因重组蛋白及B抗原基因重组蛋白；重组蛋白能与A抗体、B抗体血清进行反应，具有良好的反应原性，可用于血型的检测，具有制备成本低的优点。
2.将本发明制备的A抗原基因重组蛋白及B抗原基因重组蛋白应用于胶体金等，可以制备血型检测试纸，进行更为准确、快速、简便的血型检测，突破了传统的血型检测的弊端，可成为一种新的血型检测方法。满足急救、血型普查、陈旧血液样本的检测等对血型的检测提出的更高的检验要求。
附图说明
图1为本发明A基因与B基因的RT-PCR产物鉴定图。
图2为本发明PMD18-T/A与PMD18-T/B质粒的PCR鉴定图。
图3为本发明PMD18-T/A与PMD18-T/B质粒的酶切图。
图4为本发明pUCm-4T-1/A与pUCm-4T-1/B质粒的PCR鉴定图。
图5为本发明pUCm-4T-1/A和pUCm-4T-1/B质粒的酶切鉴定图。
具体实施方式
Trizol plus，PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒，Prime STAR PCR Mix，DL2000Marker、DL5000Marker，ligation mix连接试剂盒，BamHI、XhoI限制性内切酶，IPTG等试剂购于宝生物工程(大连)有限公司。
质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等购自OMEGA。
实施例1人血型A抗原基因重组蛋白
(一)提取人全血中的总DNA
收集4例中国汉族无偿捐血者，根据血库操作规程，采集静脉全血，运用快速盐析法，从全血白膜层抽提基因组DNA，作为DNA模板。
(二)PCR扩增
1、引物设计
根据Genbank登录号为AY845133的A抗原全基因序列，设计扩增A抗原基因DNA片段的特异性引物，在上下游引物的末端同时引入BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点，预期的扩增片段长度约为1887bp。经设计扩增A抗原基因的特异性引物如下：
上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；
下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；
PCR扩增
以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，得到A抗原PCR扩增产物。
PCR反应体系为：20μL体系：Mg2+1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA 100～200ng，超纯水余量。
PCR反应程序为：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，进行10个循环；94℃20s，60℃30s，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
2、RT-PCR产物的检测
电泳鉴定扩增片段，于2％琼脂糖凝胶上检测扩增产物，电压为10v/cm，电泳20min左右。使用DNA分子标记DL2000(TAKARA,大连宝生物)标记目的片段长度，结果如图1所示，由图1可见，扩增片段为1887bp，与预期相符。
3、PCR特异片段的回收和纯化
使用MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices试剂盒(MILLIPORE公司)对扩增产物回收和纯化。
(三)构建重组表达载体
1.进行T克隆，构建重组质粒PMD18-T/A
将鉴定正确的PCR特异片段按DNA胶回收试剂盒说明书纯化回收产物，将胶回收产物末端加A，方法：普通2×Taq酶Mix 2.5μL，胶回收产物7.5μL，混匀，72℃延伸30min，得加A后的目的片段。
加A后的目的片段与载体pMD18-T的连接反应在离心管中进行。连接反应体系为：
混匀后，16℃水浴反应2～4h或者过夜，得连接产物-重组质粒PMD18-T/A。
将5μL重组质粒PMD18-T/A转入DH5a感受态细胞中，缓慢吹打混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min，加入445μL LB液体培养基，37℃200～250r/min振荡培养1h，4000r/min离心2min，混匀；将菌液均匀地涂布于含有抗生素的LB琼脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒温箱过夜培养到单个菌落出现；挑菌，37℃300r/min振荡培养过夜。
菌液PCR筛选阳性克隆：以变浑浊的菌液为模板，PCR扩增A基因。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。
重组质粒的酶切鉴定：按照质粒抽提试剂盒(OMEGA)操作步骤进行质粒抽提，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切体系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重组质粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切产物用1％琼脂糖电泳鉴定，结果如图2和图3所示。
鉴定结果：由图2和图3可见，A基因连接至T-Vector后，经PCR及酶切鉴定后A基因长度为1887bp，得到了预期的条带。
2.构建重组表达载体pUCm-4T-1/A
将重组质粒PMD18-T/A和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，制得重组表达载体pUCm-4T-1/A。
连接反应体系：目的基因片段5.5μl，表达载体2μl，2×T4DNA Ligase Mix 7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。
重组表达载体pUCm-4T-1/A的转化和鉴定方法与T克隆步骤中的转化和鉴定的方法相同，最后测序确认，结果如图4和图5。
鉴定结果：将A基因克隆至pUCm-4T-1载体，经PCR及酶切鉴定后均得到预期的条带，重组质粒pUCm-4T-1/A中A的长度为1887bp，图4中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/A的BamHⅠ或XhoⅠ酶切产物，图5中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/A测序结果通过NCBI上Blastn同源性比对分析表明，载体中插入的基因片段大小为1887bp，与预期一致，表明重组表达载体构建成功。
(四)转化
将重组表达载体pUCm-4T-1/A转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株。
(五)诱导表达
将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。
(六)纯化
将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得A抗原基因重组蛋白。
产物经大连宝生物检测，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2人血型B抗原基因重组蛋白
(一)提取人血中的总DNA
收集4例中国汉族无偿捐血者，根据血库操作规程，采集静脉全血，运用快速盐析法，从全血白膜层抽提基因组DNA，作为DNA模板。
(二)PCR扩增
1、引物设计
根据Genbank登录号为AY845133的B抗原全基因序列，设计扩增B抗原基因DNA片段的特异性引物，在上下游引物的末端同时引入BamHⅠ和XhoⅠ双酶切位点，预期的扩增片段长度约为188bp。经设计扩增B抗原基因的特异性引物如下：
上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；
下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；
2、PCR扩增
以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，得到B抗原PCR扩增产物。
PCR反应体系为：20μL体系：Mg2+1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA 100～200ng，超纯水余量；
PCR反应程序为：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，进行10个循环；94℃20s，60℃30s，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
3、RT-PCR产物的检测
电泳鉴定扩增片段，于2％琼脂糖凝胶上检测扩增产物，电压为10v/cm，电泳20min左右。使用DNA分子标记DL2000(TAKARA,大连宝生物)标记目的片段长度，结果如图1所示，由图1可见，扩增片段为1887bp，与预期相符。
4、PCR特异片段的回收和纯化
使用MontageTM PCR Centrifugal Filter Devices试剂盒(MILLIPORE公司)对扩增产物回收和纯化。
(三)构建重组表达载体
1.进行T克隆，构建重组质粒PMD18-T/B
将鉴定正确的PCR特异片段按DNA胶回收试剂盒说明书纯化回收产物，将胶回收产物末端加A，方法：普通2×Taq酶Mix 2.5μL，胶回收产物7.5μL，混匀，72℃延伸30min，得加A后的目的片段。
加A后的目的片段与载体pMD18-T的连接反应在离心管中进行。连接反应体系为：
混匀后，16℃水浴反应2～4h或者过夜，得连接产物-重组质粒PMD18-T/B。
将5μL重组质粒PMD18-T/B转入DH5a感受态细胞中，缓慢吹打混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min，加入445μL LB液体培养基，37℃200～250r/min振荡培养1h，4000r/min离心2min，混匀；将菌液均匀地涂布于含有抗生素的LB琼脂平板上，待菌液被吸收后置于37℃恒温箱过夜培养到单个菌落出现；挑菌，37℃300r/min振荡培养过夜。
菌液PCR筛选阳性克隆：以变浑浊的菌液为模板，PCR扩增B基因。产物用1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果。
重组质粒的酶切鉴定：按照质粒抽提试剂盒(OMEGA)操作步骤进行质粒抽提，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，酶切体系：10×buffer1μl，BamHⅠ0.5μl，XhoⅠ0.5μl，重组质粒8μl。37℃酶切1.5h，酶切产物用1％琼脂糖电泳鉴定，结果如图2和图3所示。
鉴定结果：由图2和图3可见，B基因连接至T-Vector后，经PCR及酶切鉴定后B基因长度为1887bp，得到了预期的条带。
2.构建重组表达载体pUCm-4T-1/B
将重组质粒PMD18-T/B和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，制得重组表达载体pUCm-4T-1/B。
连接反应体系：目的基因片段5.5μl，表达载体2μl，2×T4DNA Ligase Mix 7.5μl。瞬离，混匀，16℃连接过夜。
重组表达载体pUCm-4T-1/B的转化和鉴定方法与T克隆步骤中的转化和鉴定的方法相同，最后测序确认，结果如图4和图5。
鉴定结果：将B基因克隆至pUCm-4T-1载体，经PCR及酶切鉴定后均得到预期的条带，重组质粒pUCm-4T-1/B中B的长度为1887bp，图4中M：DL2000Marker。pUCm-4T-1/B的BamHⅠ或XhoⅠ酶切产物，图5中M：DL5000Marker。pUCm-4T-1/B测序结果通过NCBI上Blastn同源性比对分析表明，载体中插入的基因片段大小为1887bp，与预期一致，表明重组表达载体构建成功。
(四)转化
将重组表达载体pUCm-4T-1/B转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株。
(五)诱导表达
将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。
(六)纯化
将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，取上清液80ul，加入20ul 5×SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用1ml 8M尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，取80ul上清液加入20ul 5×SDS loading buffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得B抗原基因重组蛋白。
产物经大连宝生物检测，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
<110> 何伟
<120> 一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1887
<212> DNA
<213> A抗原基因重组蛋白
<400> 1
1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA
61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG
121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC
181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG
241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGAAGTCCC
301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG
361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG
421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT
481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCGGGAACGG GAACCCGGCC
541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA
601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC
661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC
721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG
781 CACTATCCCA CGCAGCACGT GCAGTTCTGGGTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG
841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG
901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG
961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG
1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT
1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA
1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC
1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC
1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC
1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT
1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC
1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG
1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC
1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG
1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC
1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC
1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG
1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC
1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA
<210> 2
<211> 1887
<212> DNA
<213> B抗原基因重组蛋白
<400> 2
1 ATGGAGCCCC CGGACGCACC GGCCCAGGCG CGCGGGGCCC CGCGGCTGCT GTTGCTCGCA
61 GTCCTGCTGG CGGCGCACCC AGATGCCCAG GCGGAGGTGC GCTTGTCTGT ACCCCCGCTG
121 GTGGAGGTGA TGCGAGGAAA GTCTGTCATT CTGGACTGCA CCCCTACGGG AACCCACGAC
181 CATTATATGC TGGAATGGTT CCTTACCGAC CGCTCGGGAG CTCGCCCCCGCCTAGCCTCG
241 GCTGAGATGC AGGGCTCTGA GCTCCAGGTC ACAATGCACG ACACCCGGGG CCGCAGTCCC
301 CCATACCAGC TGGACTCCCA GGGGCGCCTG GTGCTGGCTG AGGCCCAGGT GGGCGACGAG
361 CGAGACTACG TGTGCGTGGT GAGGGCAGGG GCGGCAGGCA CTGCTGAGGC CACTGCGCGG
421 CTCAACGTGT TTGCAAAGCC AGAGGCCACT GAGGTCTCCC CCAACAAAGG GACACTGTCT
481 GTGATGGAGG ACTCTGCCCA GGAGATCGCC ACCTGCAACA GCCGGAACGG GAACCCGGCC
541 CCCAAGATCA CGTGGTATCG CAACGGGCAG CGCCTGGAGG TGCCCGTAGA GATGAACCCA
601 GAGGGCTACA TGACCAGCCG CACGGTCCGG GAGGCCTCGG GCCTGCTCTC CCTCACCAGC
661 ACCCTCTACC TGCGGCTCCG CAAGGATGAC CGAGACGCCA GCTTCCACTG CGCCGCCCAC
721 TACAGCCTGC CCGAGGGCCG CCACGGCCGC CTGGACAGCC CCACCTTCCA CCTCACCCTG
781 CACTATCCCA CGGAGCACGT GCAGTTCTGG GTGGGCAGCC CGTCCACCCC AGCAGGCTGG
841 GTACGCGAGG GTGACACTGT CCAGCTGCTC TGCCGGGGGG ACGGCAGCCC CAGCCCGGAG
901 TATACGCTTT TCCGCCTTCA GGATGAGCAG GAGGAAGTGC TGAATGTGAA TCTCGAGGGG
961 AACTTGACCC TGGAGGGAGT GACCCGGGGC CAGAGCGGGA CCTATGGCTG CAGAGTGGAG
1021 GATTACGACG CGGCAGATGA CGTGCAGCTC TCCAAGACGC TGGAGCTGCG CGTGGCCTAT
1081 CTGGACCCCC TGGAGCTCAG CGAGGGGAAG GTGCTTTCCT TACCTCTAAA CAGCAGTGCA
1141 GTCGTGAACT GCTCCGTGCA CGGCCTGCCC ACCCCTGCCC TACGCTGGAC CAAGGACTCC
1201 ACTCCCCTGG GCGATGGCCC CATGCTGTCG CTCAGTTCTA TCACCTTCGA TTCCAATGGC
1261 ACCTACGTAT GTGAGGCCTC CCTGCCCACA GTCCCGGTCC TCAGCCGCAC CCAGAACTTC
1321 ACGCTGCTGG TCCAAGGCTC GCCAGAGCTA AAGACAGCGG AAATAGAGCC CAAGGCAGAT
1381 GGCAGCTGGA GGGAAGGAGA CGAAGTCACA CTCATCTGCT CTGCCCGCGG CCATCCAGAC
1441 CCCAAACTCA GCTGGAGCCA ATTGGGGGGC AGCCCCGCAG AGCCAATCCC CGGACGGCAG
1501 GGTTGGGTGA GCAGCTCTCT GACCCTGAAA GTGACCAGCG CCCTGAGCCG CGATGGCATC
1561 TCCTGTGAAG CCTCCAACCC CCACGGGAAC AAGCGCCATG TCTTCCACTT CGGCACCGTG
1621 AGCCCCCAGA CCTCCCAGGC TGGAGTGGCC GTCATGGCCG TGGCCGTCAG CGTGGGCCTC
1681 CTGCTCCTCG TCGTTGCTGT CTTCTACTGC GTGAGACGCA AAGGGGGCCC CTGCTGCCGC
1741 CAGCGGCGGG AGAAGGGGGC TCCGCCGCCA GGGGAGCCAG GGCTGAGCCA CTCGGGGTCG
1801 GAGCAACCAG AGCAGACCGG CCTTCTCATG GGAGGTGCCT CCGGAGGAGC CAGGGGTGGC
1861 AGCGGGGGCTTCGGAGACGA GTGCTGA

Claims (6)

1.一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白，其特征在于，所述的人血型A抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的人血型B抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQ IDNO.2所示。
2.权利要求1所述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，方法如下：
1)提取人全血中的总DNA；
2)以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，分别得到A抗原PCR扩增产物或B抗原PCR扩增产物；其中，所述的特异性引物是：
上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；
下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；
上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCC CGGACGCACC-3'；
下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGC AGAGGCTTCG-3'；
3)将得到的A抗原PCR扩增产物和B抗原PCR扩增产物分别与质粒pMD18-T进行T克隆，得到重组质粒pMD18-T/A和pMD18-T/B；
4)将重组质粒pMD18-T/A及pMD18-T/B分别和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，连接，分别制得重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B；
5)将重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分别转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株；
6)将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，经诱导表达，纯化后，得到A抗原基因重组蛋白或B抗原基因重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)中，
PCR反应体系为：20μL体系：Mg2+ 1.5mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA 100～200ng，超纯水余量；
PCR反应程序为：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，进行10个循环；94℃20s，60℃30s，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
4.根据权利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤6)中，所述的诱导表达是：将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。
5.根据权利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤6)中，所述的纯化是：将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中加入SDS loading buffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，上清液再加入SDS loadingbuffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得纯化的A抗原基因重组蛋白或B抗原基因重组蛋白。
6.权利要求1所述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白在血型检测试剂中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1894584A (zh) * 2003-07-09 2007-01-10 麦迪奥诊断产品有限公司 同时进行血型测定、血清交叉核对和抗体检测试验的装置和方法

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NCBI GENEBANK: "basal cell adhesion molecule isoform 1 precursor [Homo sapiens]", 《NCBI》 *
NCBI GENEBANK: "Homo sapiens basal cell adhesion molecule (Lutheran blood group) (BCAM), transcript variant 1, mRNA", 《NCBI》 *

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